技术领域
[0001] 本
发明属于皮肤修复技术领域，具体涉及一种皮肤外用组合物及其用途。
背景技术
[0002] 皮肤为人体最大的器官，
覆盖于人体表面，具有保护、感觉、调节体温等功能，其构造由上而下，依次为表皮层(epidermis)、真皮层(dermis)及
皮下组织(hypodermis)。一般人随着年纪的增长，皮肤老化的表征会渐渐出现，皮肤老化的原因可分为内因性及外因性。
[0003] 内因性的老化是指身体自然的老化过程，包括随着年纪的增长，
角质干细胞会逐渐减少，造成基底层细胞紊乱、玻尿酸减少、以及保湿因子流失；荷尔蒙(例如皮脂腺) 的分泌下降会减缓整体皮肤的新陈代谢，最终使得皮肤缺乏张
力及弹性；真皮层的
纤维母细胞(fibroblast)的机能衰退，而逐渐停止制造
胶原蛋白及弹性蛋白，使得真皮层的结缔组织进入退化阶段，造成皮肤松弛、缺乏线条，甚至产生皱纹；真皮层结缔组织的退化会影响皮肤的储
水功能，导致皮肤干燥及缺水；以及，表皮层及真皮层逐渐萎缩，导致表皮防御力下降且容易产生伤口，或者造成血管弹性变差，容易造成皮下出血。
[0004] 外因性的老化则因皮肤直接与外界环境
接触，受到外在因素(例如日晒、污染、自由基伤害及抽烟)的刺激而造成的老化现象，包括细胞的更新与修复受到抑制、皮肤的保护功能变差、以及黑色素沉淀。其中，造成皮肤老化的首要因素即为日光曝晒所造成的紫外线损伤，日光可
加速皮肤的老化速度5至10倍。一般日常生活中所接触的紫外线，主要为长波紫外线及紫外线中的中波紫外线(UVB)，长时间接触中波紫外线，会刺激真皮层的纤维母细胞产生胶原蛋白酶(collagenase)而分解胶原蛋白，造成胶原蛋白
密度降低及弹性蛋白变性，使皮肤失去弹性；黑色素细胞的功能退化而导致肤色不均匀；以及，皮肤产生过多的自由基而导致晒斑及不平整的老人斑形成，甚至造成各种皮肤癌。
[0005] 目前，已有许多
预防及修复皮肤老化的方法，包括胞外支持基质补充疗法、施打肉毒杆菌、以及物理性的剥脱性
治疗。其中，胞外支持基质补充疗法包括于皮肤表面擦拭胶原蛋白、弹力素、粘多醣、玻尿酸、维他命E等，然而因这些分子的结构太大，故无法被皮肤有效吸收、进入真皮层，且于体内维持时间通常不超过九个月，故治疗效果有限。施打肉毒杆菌虽可改善皮肤松弛的老化现象，但该效果通常仅能维持3至6个月，且容易造成上眼睑下垂、表情僵硬怪异，或是
注射部位的肌肉无力等
副作用。至于物理性的剥脱性治疗，虽可去除老化角质，刺激新生皮肤增生，但容易产生创伤、皮肤恢复缓慢、术后并发症多等副作用。有关皮肤老化的另一治疗趋势为
细胞疗法，主要是使用干细胞来改善受损皮肤组织。
[0006] 干细胞(stem cells,SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分
化成多种功能细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称之为“万用细胞”。从功能上说，干细胞被定义为具有自我复制能力和产生分化细胞能力的细胞。更准确的说，干细胞既能产生和其亲代细胞相同的子代细胞(自我复制)，又能产生分化潜能有限的子代细胞(分化细胞)。干细胞可以在
机体生命过程中无限期分裂，并在合适的条件或给予恰当的条件后，能分化产生多种不同的细胞类型。人体表皮干细胞的减少，再生能力降低，表皮细胞的死亡脱落、功能减退等，随着日积月累皮肤出现斑点、皱纹增多等衰老的迹象。
[0007] 干细胞来源的外泌体是干细胞在静息或缺
氧应激、辐照、氧化损伤等刺激下分泌产生的细胞外囊泡，可通过选择性的转运
蛋白质、mRNA、microRNA来充当干细胞与已分化细胞的
信号分子。现有研究已证明间充质干细胞外泌体在减少心肌梗死面积，减轻肢体缺血，增进
伤口愈合，改善移
植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease，GVHD)，减少肾损伤，促进肝再生，减轻
视网膜损伤以及改善软骨和
骨再生等方面具有重要作用。外泌体是细胞间信息交流的重要载体，且外泌体特性与其来源的细胞有关，因此干细胞外泌体的功能与其干细胞的功能密切相关。外泌体内含有多种生长因子及细胞因子，如血管内皮生长因子、干细胞因子等，具有重要的生理学应用。
[0008] 然后，但是由于间充质干细胞外泌体提取存在提取率低、液态化不便于保存等诸多缺点，导致
现有技术中缺乏含有间充质干细胞外泌体的护肤品，在皮肤修复领域的应用尚属空白。
发明内容
[0009] 为克服现有技术中的不足，本发明提供了一种新的皮肤外用组合物及其制备方法和用途。
[0010] 本发明提供了一种皮肤外用组合物，其特征在于，包含间充质干细胞外泌体冻干粉，其中，所述间充质干细胞外泌体冻干粉中至少含有纤连蛋白25.0～35.0ng/g、血管内皮细胞生长因子5.0～14.5ng/g、纤维芽细胞生长因子5.5～15.5ng/g、上皮细胞生长因子5.0～10.0 ng/g、
肝细胞生长因子25.0～30.0ng/g、转化生长因子7.5～17.5ng/g、1-
磷酸鞘
氨醇0.5～5ng/g、神经酰胺-1-磷酸0.5～5ng/g；优选的，所述间充质干细胞外泌体冻干粉中至少含有纤连蛋白30.0ng/g、血管内皮细胞生长因子12.0ng/g、纤维芽细胞生长因子12.5ng/g、上皮细胞生长因子8.0ng/g、肝细胞生长因子26.0ng/g和转化生长因子12.5ng/g、1-磷酸鞘氨醇 4ng/g、神经酰胺-1-磷酸3ng/g。
[0011] 进一步的，上述皮肤外用组合物中，所述间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法如下，包括以下步骤：
[0012] S1收集：收集间充质干细胞，得到间充质干细胞单细胞悬液；优选的，所述的间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或肌肉间充质干细胞。
[0013] S2培养：将上述间充质干细胞单细胞悬液接种到培养基中进行培养；
[0014] S3提取：将上述含间充质干细胞的培养基进行提取获得间充质干细胞外泌体提取液；
[0015] S4冻干：将上述间充质干细胞外泌体提取液冻干，即得。
[0016] 进一步的，其中，步骤S2中所述的细胞培养方法包括以下步骤：
[0017] a.将收集得到的间充质干细胞单细胞悬液置于37℃、体积分数为4％～8％CO2
培养箱中培养，细胞融合达80％-95％后传代，收集第3-5代细胞作为培养细胞；优选的，所述CO2的体积分数为5～6.5％；细胞融合为90％；细胞为第4代细胞；
[0018] b.选取培养细胞中处于对数生长期的细胞，加入无血清培养基DMEM/F12，培养 48～96h，每天收集上清液，并更换新鲜的培养基，将收集培养的上清液用于外泌体的提取；优选的，所述培养时间为72h。
[0019] 进一步的，其中，步骤S3中所述的提取步骤具体包括：
[0020] a.将步骤S2中收集的上清液在4～6℃下，以10000～15000r/min离心20～30min，留上清液，弃去沉淀；
[0021] b.将a步骤所得上清液在4～6℃下，以15000～30000r/min离心60～80min，留上清液，弃去沉淀；
[0022] c.将b步骤所得上清液在4～6℃下，以10000～15000r/min离心60～80min，弃去上清液，保留沉淀，即得间充质干细胞外泌体提取液。
[0023] 进一步的，其中，步骤S4中所述的冻干方法包括以下步骤：
[0024] a.加入冻干保护剂：向上述间充质干细胞外泌体提取液加入冻干保护剂，并调节pH 值为6.5；所述冻干保护剂每100ml中含有如下组分：
抗坏血酸0.3～0.5g，右旋糖苷2.5～3.0g，海藻糖2g，抗冻蛋白混合物1～20g、叔丁醇10～20ml；优选的，所述的抗冻蛋白混合物为抗冻糖蛋白(AFGP)、I型抗冻蛋白(AFP I)和II型抗冻蛋白(AFP II)混合物，三者
质量比为2:1:1；
[0025] b.进行冻干：冻干压强为10～30pa，
温度为-25～-30℃，时间为10～12h。
[0026] 进一步的，上述任一项皮肤外用组合物，其特征在于，还含有
化妆品中可接受的载体，至少包括抗
氧化剂、稳定剂、增
溶剂、色素、香料中的两种或两种以上。
[0027] 进一步的，所述皮肤外用组合物的剂型为溶液、乳液、凝胶、乳霜、洗剂、粉剂、肥皂、含
表面活性剂的清洁剂、油剂中的任意一种。
[0028] 进一步的，所述的皮肤外用组合物为化妆水、面膜精华液、乳液、啫喱、乳霜、精油、清洁乳、清洁
泡沫、清洁水或喷雾剂。
[0029] 进一步的，所述皮肤外用组合物为化妆水，其特征在于，间充质干细胞外泌体提取液泌体冻干粉5.0～8.0％，甘油1％，多元醇类A 3～5％，甜菜
碱0.5％，泛醇0.8％，
甘草酸二
钾0.05～0.1％，其他活性成分A 0.11～1.0％，聚乙二醇-3 1.0～1.5％，表面活性剂A 0.25～0.3％，
防腐剂A 0.01～0.25％，黄原胶0-0.15％，香料0.03％，余量为纯化水；其中，所述的多元醇类A为丁二醇、1,2-戊二醇和双丙甘醇中的一种或多种；所述其他活性成分A为尿囊素、烟酰胺和透明质酸钠中的一种或多种；所述表面活性剂A为羟乙基
纤维素、聚山梨醇酯-20和PEG-40氢化
蓖麻油中的一种或多种；所述防腐剂A为羟苯甲酯和/或苯氧
乙醇。
[0030] 进一步的，所述的皮肤外用组合物为面膜精华液，包含下述重量百分比的组分：间充质干细胞外泌体冻干粉5.0～8.0％，甘油1％，多元醇类B 3～5％，泛醇0.8％，
甘草酸二钾0.05～0.1％，尿囊素0.2～0.3％，其他活性成分B 0.5-2.0％，表面活性剂B 0.05-3.6％，防腐剂B 0.25-0.45％，黄原胶0.2-0.4％，香料0.05％，并添加氨甲基丙醇，所述氨甲基丙醇的含量以调节所述面膜精华液pH值至5.5-7为准，余量为纯化水；所述的多元醇类B为丁二醇和/或1,3-丙二醇；所述其他活性成分B为烟酰胺、抗坏血酸磷酸酯钠、生育酚乙酸酯和透明质酸钠中的一种或多种；所述表面活性剂B为羟乙基纤维素、异
硬脂酸异丙酯、聚甘油-2油酸酯和聚甘油-10油酸酯中的一种或多种；所述防腐剂B为羟苯丙酯、羟苯甲酯或苯氧乙醇中的一种或多种。
[0031] 进一步的，所述的皮肤外用组合物为乳液，包含下述重量百分比的组分：间充质干细胞外泌体冻干粉5.0～8.0％，甘油1％，1,3-丙二醇3-5％，泛醇1％，生育酚乙酸酯0.5％，其他活性成分C 0.1-2.0％，聚二甲基
硅氧烷0.5-2％，乳化剂A165 0.5-2％，异硬脂酸异丙酯0.5％，油类C 0.2-3％，鲸蜡硬脂醇0.8％，防腐剂C 0.1％，黄原胶0.5％，EDTA-2Na 0.1％，并添加三乙醇胺，所述三乙醇胺的含量以调节所述乳液的pH值至5.5-7为准，余量为纯化水；其中，所述其他活性成分C为甘草酸二钾、烟酰胺和氢化聚异丁烯中的一种或多种；
所述油类C为矿油和/或异十六烷；所述防腐剂C为羟苯甲酯和/或羟苯丙酯。
[0032] 本发明还提供上述任一项皮肤外用组合物在制备修复损伤皮肤的皮肤外用组合物中的用途。
[0033] 本发明还提供上述任一项皮肤外用组合物在制备促进皮肤新陈代谢或抗衰老的皮肤外用组合物中的应用。
[0034] 有益效果
[0035] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0036] 1.本发明提供的方法制备的间充质干细胞外泌体，不含有培养基成分和细胞组分，避免了外来添加剂对人体和皮肤的伤害，避免了皮肤发生过敏的潜在危害。
[0037] 2.纯化制备成冻干粉后产品性质更加稳定，以便更加长久地发挥其
生物活性；且采用本方法制备的冻干粉中活性细胞因子含量更高，对于建立皮肤屏障以及修复皮肤损伤的效果更好。
[0038] 3.本发明采用的冻干保护剂制备的冻干粉，未加入本领域常用的胎
牛血清和DMSO。不仅避免了动物病原对于干细胞污染的可能性，也避免使用DMSO等具有细胞毒性物质对于细胞造成的不可逆转的损伤，对于干细胞的冻存具有显著意义。
[0039] 4.本发明采用了新型冻干保护剂中含有以下几类关键成分：
[0040] 海藻糖(Trehalose)是由两个
葡萄糖分子以a,a,1,1-糖苷键构成非还原性糖，自身性质非常稳定，海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境，表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。和自然界中如
蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、
疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂。
[0041] 另一类重要的冻干保护剂为抗冻蛋白。最为常用的即是抗冻糖蛋白(AFGP)、I型抗冻蛋白(AFP I)和II型抗冻蛋白(AFP II)。本发明前期实验通过不断摸索和实践，发现三者合理的组合用量能够显著地提高冻干保护和冻干粉的复溶效果，能够用于替代具有细胞毒的DMSO。
[0042] 5.本发明的冻干粉与其他美容类产品组合使用，可加速皮肤细胞的新陈代谢，恢复基底细胞抗氧化及再生能力，防止皮肤老化，增加皮肤弹性和饱满度，缩小毛孔，提升光泽。长期使用可获得极高的皮肤改善效果。
具体实施方式
[0043] 下面通过
实施例对本发明做进一步具体说明。
[0044] 实施例1人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉的制备
[0045] 1.1收集人体脐带间充质干细胞
[0046] a.收集健康人体脐带，对脐带作进一步清洗，再用无菌手术剪将脐带切割分为细小组织；b.剪碎后的细小组织通过加入适当浓度的胰酶、胶原酶等消化脐带组织
块3小时，以分化出单核细胞，收集分化出的单核细胞用无血清培养基进行贴壁培养，获得脐带间充质干细胞。
[0047] 1.2进行细胞培养
[0048] 将收集得到的间充质干细胞单细胞悬液置于37℃、体积分数为6.5％CO2培养箱中培养，细胞融合达90％后传代，收集第4代细胞作为培养细胞；b.选取培养细胞中处于对数生长期的细胞，加入无血清培养基DMEM/F12，培养72h，每天收集上清液，并更换新鲜的培养基，将收集培养的上清液用于外泌体的提取。
[0049] 1.3间充质干细胞外泌体的提取
[0050] a.将收集的上清液在4～6℃下，以12000r/min离心20min，留上清液，弃去沉淀；b. 将a步骤所得上清液在4～6℃下，以28000r/min离心60min，留上清液，弃去沉淀；c.将 b步骤所得上清液在4～6℃下，以12000r/min离心70min，弃去上清液，保留沉淀，即得间充质干细胞外泌体提取液。
[0051] 1.4将提取液冻干
[0052] a.先加入冻干保护剂，并调节pH值为6.5；所述冻干保护剂每100ml中含有如下组分：抗坏血酸0.3～0.5g，右旋糖苷2.5～3.0g，海藻糖2g，抗冻蛋白混合物1～20g、叔丁醇10～20ml，其中所述的抗冻蛋白混合物为抗冻糖蛋白(AFGP)、I型抗冻蛋白(AFP I)和II型抗冻蛋白(AFP II)混合物，三者质量比为2:1:1；b.然后进行冻干：冻干压强为20pa，温度为-25℃，时间为10h。
[0053] 实施例2
[0054] 一种含有间充质干细胞外泌体冻干粉的化妆水，其特征在于，包含下述重量百分比的组分：间充质干细胞外泌体冻干粉(实施例1制得)5.0％，甘油1％，多元醇类A 3％，甜菜碱0.5％，泛醇0.8％，甘草酸二钾0.1％，其他活性成分A 1.0％，聚乙二醇-3 1.5％，表面活性剂A 0.3％，防腐剂A 0.2％，黄原胶0.15％，香料0.03％，余量为纯化水；其中，所述的多元醇类A为丁二醇；所述其他活性成分A为尿囊素、烟酰胺和透明质酸钠的混合物，三者质量为1:1:1；所述表面活性剂A为羟乙基纤维素和PEG-40氢化蓖麻油的混合物，二者质量比为1:1；所述防腐剂A为羟苯甲酯。按照本领域常规方法制备成化妆水。
[0055] 实施例3
[0056] 一种含有间充质干细胞外泌体冻干粉的面膜精华液，其特征在于，包含下述重量百分比的组分：间充质干细胞外泌体冻干粉(实施例1制得)6.0％，甘油1％，多元醇类 B 3％，泛醇0.8％，甘草酸二钾0.05％，尿囊素0.3％，其他活性成分B 1.0％，表面活性剂B
3.0％，防腐剂B 0.3％，黄原胶0.2％，香料0.05％，并添加氨甲基丙醇，所述氨甲基丙醇的含量以调节所述面膜精华液pH值至5.5-7为准，余量为纯化水；所述的多元醇类B为1,3-丙二醇；所述其他活性成分B为烟酰胺和透明质酸钠的混合物，二者质量比为1:1；所述表面活性剂B为羟乙基纤维素、异硬脂酸异丙酯和聚甘油-2油酸酯的混合物，三者质量比为1:1:1；
所述防腐剂B为羟苯丙酯。按照本领域常规技术手段制备成面膜精华液。
[0057] 实施例4
[0058] 一种含有间充质干细胞冻干粉外泌体润肤乳液，其特征在于，间充质干细胞冻干粉 (实施例1制得)8.0％，甘油1％，1,3-丙二醇3％，泛醇1％，生育酚乙酸酯0.5％，其他活性成分C 1.0％，聚二甲基硅氧烷1.5％，乳化剂A165 2％，异硬脂酸异丙酯0.5％，油类C 1.5％，鲸蜡硬脂醇0.8％，防腐剂C 0.1％，黄原胶0.5％，EDTA-2Na 0.1％，并添加三乙醇胺，所述三乙醇胺的含量以调节所述乳液的pH值至5.5-7为准，余量为纯化水；其中，所述其他活性成分C为甘草酸二钾、烟酰胺和氢化聚异丁烯中的混合物，三者质量比为1:1:1；所述油类C为异十六烷；所述防腐剂C为羟苯甲酯。按照本领域常规技术手段制备成乳液。
[0059] 实施例5冻干保护剂的比较
[0060] 实验一：冻干时间的比较
[0061] 1)配方一(采用实施例1的冻干保护剂配方)：所述冻干保护剂每100ml中含有如下组分：抗坏血酸0.3～0.5g，右旋糖苷2.5～3.0g，海藻糖2g，抗冻蛋白混合物1～20g、叔丁醇10～20ml，其中所述的抗冻蛋白混合物为抗冻糖蛋白(AFGP)、I型抗冻蛋白(AFP I)和II型抗冻蛋白(AFP II)混合物，三者质量比为2:1:1；
[0062] 2)配方二：所述冻干保护剂每100ml中含有如下组分：抗坏血酸0.3～0.5g，人
白蛋白0.2～0.5ml，右旋糖苷2.5～3.0g，海藻糖2g，甘氨酸0.02～0.04g，精氨酸0.05～ 0.15g，叔丁醇10～20ml；
[0063] 3)配方三：所述冻干保护剂每100ml中含有如下组分：DMSO10ml和胎牛血清10ml。
[0064] 分别采用配方一和配方二进行冻干，其余步骤相同，分别制备冻干粉，对二者进行比较，发现二者性能差异如下：
[0065]
[0066]
[0067] 由上表可知，采用新型冻干保护剂制备的冻干粉，在没有胎牛血清以及DMSO的存在下，能缩短冻干时间，并且达到较低水分含量，说明能够保存的更加持久，并且复溶后也能得到和传统液态一样的干细胞外泌体。
[0068] 实施例6-直接涂抹
[0069] 1.1对患者分组
[0070] 招募志愿者120名，均为女性，年龄25-50岁，分为2组。其中实验组60名，其中有疤痕者25名，有面部细纹者35名；对照组60名，其中有疤痕者25名，有面部细纹者35名。
[0071] 1.2实验方法
[0072] 实验组：每日早晚洁面后在面部涂抹实施例4制备的护肤乳液，用量以均匀涂满面部并略有湿润感为宜(约使用0.5～1)，每日2次，使用周期为20天；
[0073] 阳性对照组：采用市售抗皱乳液，每日早晚洁面后在面部涂抹，用量以均匀涂满面部并略有湿润感为宜0.3～1.0ml，每日2次，使用周期为20天。
[0074] 1.3实验结果
[0075] 观察实验组志愿者肌肤，疤痕好转者达到22名，面部细纹抚平者达到33名，总有效率达到92％。由此可见，本发明抚痕、修复损伤皮肤的效果较好。
[0076] 实施例7-与水光针联合使用
[0077] 1.1对患者分组
[0078] 招募志愿者60名，均为女性，年龄25-50岁，分为2组。其中实验组30名，均有面部细纹；对照组30名，均有面部细纹。
[0079] 1.2实验方法
[0080] 实验组：将本发明实施例3制备的面膜精华液与水光针按照1:1的比例混合，例如 2ml的精华液与2ml的水光针混合，制备成
混合液后，涂抹皮肤，每日2次，使用周期为60天；
[0081] 阳性对照组：采用市售水光针涂抹皮肤，每日2次，使用周期为25天每日2次，使用周期为60天。
[0082] 1.3实验结果
[0083] 观察实验组志愿者肌肤，面部细纹抚平者达到25名，皮肤变的滋润有光泽总有效率达到83.3％。由此可见，本发明确实有用促进皮肤新陈代谢、抗衰老、抗皱的效果。
