一种异养硝化复合菌剂及其应用
阅读：406发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种异养硝化复合菌剂及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种异养硝化复合菌剂及其应用，该复合菌剂由副球菌LJ2、假单胞菌YG8和假单胞菌LJ9的 种子 液复配而成，副球菌LJ2、假单胞菌YG8和假单胞菌LJ9种子液的体积比为2.5～2.7∶1.0～1.2∶1.2～1.4。该复合菌剂耐受C/N范围为0-200，在此范围内其NH4+-N去除率高于93.0％，可适应较高浓度有机物。且该复合菌剂可耐受NH4+-N浓度0-500mg·L-1，相比组成该复合菌剂的纯菌株具有更高的耐受NH4+-N能 力 ，且NH4+-N去除率都高于60.0％，说明本发明的异养硝化复合菌剂耐受NH4+-N能力较高，可适应较高浓度有机物，能够快速高效地完成异养硝化过程。，下面是一种异养硝化复合菌剂及其应用专利的具体信息内容。
1.一种异养硝化复合菌剂，其特征在于，由副球菌LJ2、假单胞菌YG8和假单胞菌LJ9的种子液复配而成，所述副球菌LJ2保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60338，所述假单胞菌YG8保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60340，所述假单胞菌LJ9保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60339；所述副球菌LJ2、假单胞菌YG8和假单胞菌LJ9种子液的体积比为2.5～2.7∶1.0～1.2∶1.2～1.4。
2.根据权利要求1所述的异养硝化复合菌剂，其特征在于，所述副球菌LJ2、假单胞菌YG8和假单胞菌LJ9种子液的体积比为2.6∶1.1∶1.3。
3.根据权利要求1或2所述的异养硝化复合菌剂，其特征在于，各菌株种子液的制备方法为：将相应的菌株接入LB培养基，30℃、150 rpm摇床培养24h，取菌悬液4000 rpm冷冻离心机中离心10min，去上清液，沉淀，菌体用无菌水洗涤，再离心去上清液，重复2-3次，用无菌水将菌悬液的OD600调至0.6-0.8，得到所述菌株的种子液。
4.根据权利要求3所述的异养硝化复合菌剂，其特征在于，所述 LB培养基的组分及配比为：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0-7.2。
5.根据权利要求1或2所述的异养硝化复合菌剂在降低水体中氨氮含量中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：将异养硝化复合菌剂和碳源加入氨氮浓度﹤500 mg·L-1的水体中，至水体中C/N比值＜200，异养硝化复合菌剂与水体的体积比为3%～15%，在温度为25℃～35℃，pH为7-8，转速为90 rpm～180 rpm的条件下振荡反应6h～7d。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述碳源为有机酸。
一种异养硝化复合菌剂及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 随着工业的发展，污水中污染物的种类日益复杂，污水对水环境产生了严重的危害。污水中含有多种含氮化合物,包括：NH4+-N、NO2--N、NO3--N等[1]，其中NH4+-N污染会导致以下四种危害：水体富营养化；影响水厂运行；影响水生生物生活；危害人类健康等。相关规划指出：将“NH4+-N”加入环境约束性指标，着力削减行业水污染中的化学需氧量和NH4+-N 排+放量。因此，污水NH4-N处理成为目前污水处理中亟待解决的问题之一。
[0003] 污水脱氮的常用方法为物化法和生物法。物化法具有占地面积小、对水质适应性强、效果较稳定等优点，但能耗及其成本较高，易造成二次污染，难以推广。生物法处理成本小、污染风险低，微生物的繁殖速度快、来源范围广且对环境的适应能力较强。传统的生物脱氮方法由氨化过程、硝化过程、反硝化过程组成，由于每个过程所需菌种和条件不同，因此脱氮需分为几个独立阶段进行，较难控制。短程硝化-反硝化省去了反硝化到亚硝化这一过程，但较难把硝化过程控制在亚硝化菌的氧化阶段。1983年，Kuenen和Robertson分离出具有异养硝化-好氧反硝化作用的Thiosphaera pantotropha，该菌在有氧条件下可同时完成硝化及反硝化过程，繁殖速度快，具有较高的脱氮效率。
[0004] 近几年，异养硝化-好氧反硝化过程的研究主要集中在其关键酶、气体代谢产物及其脱氮性能影响因三个方面。关于异养硝化-好氧反硝化菌的研究大多停留于实验室纯种培养阶段，而在实际废水脱氮处理中，实际废水水质复杂，异养硝化-好氧反硝化菌对环境中的影响因子异常敏感，难以应用成功。此外，异养硝化-好氧反硝化纯菌对有机化合物的生物降解往往会产生有毒的终端产物，抑制其菌株的生长。
[0005] 微生物菌剂一般是由多种具备降解目标污染物的微生物(即高效菌株)组成的互利共存的混合生物体，有时也会添加一些辅助菌。高效菌株一般是由污染现场或者是污水处理设施中分离而来，省去了外源菌株的驯化过程，也避免了与土著菌的竞争关系，具有较强的实用性多种高效菌株在水体中形成局部优势菌群，可抑制腐败菌和病源菌的增殖，对改善水质和提高水生生物多样性有明显的促进作用，微生物菌剂具有经济高效、低耗能、不产生二次污染的特点。
[0006] 近年来，微生物菌剂在水体修复中得到越来越多的应用，能有效地去除水体中的氮、磷、重金属及其难降解有机污染物。如：王乙震等人向受污染的南运河水体中投加微生物菌剂，结果表明：异养硝化复合菌剂对水体中有机磷农药OPPs的降解率为19.6％-62.8％。尹莉等采用自主筛选驯化的固定化菌剂，在好氧条件下对河流污水进行修复，反应
72h后，黑臭水体中CODCr、NH4+-N、TN、TP的去除率分别为56.0％、97.0％、60.0％、58.0％，黑臭水体得到有效修复。此外，微生物菌剂在脱氮方面的应用取得很好的效果。如：王杰等人以杭州市某支流河水实际水质为研究对象，向水体中添加异养硝化复合菌剂，曝气条件下，
120h内可将该水体的NH4+-N浓度降解，使水体水质达到Ⅳ类，而未添加异养硝化复合菌剂的水体则无NH4+-N降解效果。张大群等人将硝化菌、光合菌、酵母菌以1：10：1的比例复配成异养硝化复合菌剂，与化学药剂复合投加，去除北方某二级河道污水的氮、磷、CODCr，试验进行的第26天，NH4+-N去除率达到44.1％。脱氮异养硝化复合菌剂取得了一定的成效，但仍处于起步阶段，相关技术还未成熟，存在一定的问题：脱氮菌剂的研发成果与产品生产相脱离；
异养硝化复合菌剂中各菌群间的相互作用复杂，异养硝化复合菌剂去除污染物的机理研究难度加大；异养硝化复合菌剂去除河流水体中的氮，水流的冲刷容易引起异养硝化复合菌剂生物量的流失，这使得异养硝化复合菌剂投加量大、稳定性差、去除效果不明显。
72h后，黑臭水体中CODCr、NH4+-N、TN、TP的去除率分别为56.0％、97.0％、60.0％、58.0％，黑臭水体得到有效修复。此外，微生物菌剂在脱氮方面的应用取得很好的效果。如：王杰等人以杭州市某支流河水实际水质为研究对象，向水体中添加异养硝化复合菌剂，曝气条件下，
120h内可将该水体的NH4+-N浓度降解，使水体水质达到Ⅳ类，而未添加异养硝化复合菌剂的水体则无NH4+-N降解效果。张大群等人将硝化菌、光合菌、酵母菌以1：10：1的比例复配成异养硝化复合菌剂，与化学药剂复合投加，去除北方某二级河道污水的氮、磷、CODCr，试验进行的第26天，NH4+-N去除率达到44.1％。脱氮异养硝化复合菌剂取得了一定的成效，但仍处于起步阶段，相关技术还未成熟，存在一定的问题：脱氮菌剂的研发成果与产品生产相脱离；
异养硝化复合菌剂中各菌群间的相互作用复杂，异养硝化复合菌剂去除污染物的机理研究难度加大；异养硝化复合菌剂去除河流水体中的氮，水流的冲刷容易引起异养硝化复合菌剂生物量的流失，这使得异养硝化复合菌剂投加量大、稳定性差、去除效果不明显。
发明内容
[0007] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可适应较高浓度有机+ +物、具有较高耐受NH4-N能力且NH4-N去除率高的用于处理氨氮废水的异养硝化复合菌剂，还相应提供该异养硝化复合菌剂在降低水体中氨氮含量中的应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种异养硝化复合菌剂，由副球菌LJ2、假单胞菌YG8和假单胞菌LJ9的种子液复配而成，所述副球菌LJ2保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60338，所述假单胞菌YG8保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60340，所述假单胞菌LJ9保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60339；所述副球菌LJ2、假单胞菌YG8和假单胞菌LJ9种子液的体积比为2.5～2.7∶1.0～1.2∶1.2～ 1.4。
[0010] 上述的异养硝化复合菌剂，优选的，所述副球菌LJ2、假单胞菌YG8和假单胞菌LJ9种子液的体积比为2.6∶1.1∶1.3。
[0011] 上述的异养硝化复合菌剂，优选的，各菌株种子液的制备方法为：将相应的菌株接入LB 培养基，30℃、150rpm摇床培养24h，取菌悬液4000rpm冷冻离心机中离心10min，去上清液，沉淀，菌体用无菌水洗涤，再离心去上清液，重复2-3次，用无菌水将菌悬液的OD600调至0.6-0.8，得到所述菌株的种子液。
[0012] 上述的异养硝化复合菌剂，优选的，所述LB培养基的组分及配比为：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0-7.2。
[0013] 作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的异养硝化复合菌剂在降低水体中氨氮含量中的应用。
[0014] 上述的应用，优选的，所述应用包括以下步骤：将异养硝化复合菌剂和碳源加入氨氮浓度﹤500mg·L-1的水体中，至水体中C/N比值＜200，异养硝化复合菌剂与水体的体积比为1～ 15∶100，在温度为25℃～35℃，pH为7-8，转速为90rpm～180rpm的条件下振荡反应6h～ 7d。
[0015] 上述的应用，优选的，所述碳源为有机酸。
[0016] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0017] 1、本发明的异养硝化复合菌剂耐受C/N范围为0-200，在此范围内异养硝化复合菌剂的 NH4+-N去除率高于93.0％，可适应较高浓度有机物。
[0018] 2、本发明的异养硝化复合菌剂可耐受NH4+-N浓度0-500mg·L-1，相比组成该异养硝化复合菌剂的纯菌株LJ2、YG8、LJ9，该异养硝化复合菌剂具有更高的耐受NH4+-N能力，且 NH4+-N去除率都高于60.0％，说明本发明的异养硝化复合菌剂耐受NH4+-N能力较高，可适应较高浓度有机物，能够快速高效地完成异养硝化过程。
[0019] 综上，本发明的异养硝化复合菌剂在高浓度有机物含氮废水生物脱氮方面，具有巨大的应用前景。
[0020] 本发明中的副球菌LJ2、假单胞菌YG8和假单胞菌LJ9均从龙津污水处理厂采集的活性 污泥中分离筛选获得，副球菌LJ2(Paracoccus versutus LJ2)保藏于广东省微生物菌种保藏中 心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏时间为2018 年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60338；假单胞菌菌株YG8(Pseudomonas mendocina YG8)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼， 广东省微生物研究所，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60340；假 单胞菌LJ9(Pseudomonas indoloxydans LJ9)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广 州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏时间为2018年3月
21日， 保藏编号为GDMCC NO：60339。
附图说明
21日， 保藏编号为GDMCC NO：60339。
附图说明
[0021] 图1为本发明的副球菌LJ2的菌落形态图。
[0022] 图2为本发明的副球菌LJ2的透射电镜图。
[0023] 图3为本发明的副球菌LJ2的16S rDNA扩增电泳图。
[0024] 图4为本发明的副球菌LJ2的系统进化树。
[0025] 图5为本发明的副球菌LJ2的napA基因PCR扩增电泳图。
[0026] 图6为本发明的副球菌LJ2的nosZ基因PCR扩增电泳图。
[0027] 图7为本发明的假单胞菌LJ9的菌落形态图。
[0028] 图8为本发明的假单胞菌LJ9的透射电镜图。
[0029] 图9为本发明的假单胞菌LJ9的16S rRNA PCR电泳图。
[0030] 图10为本发明的假单胞菌LJ9的同源性分析。
[0031] 图11为本发明的假单胞菌LJ9功能基因napA的电泳图。
[0032] 图12为本发明的假单胞菌YG8的菌落形态图。
[0033] 图13为本发明的假单胞菌YG8的透射电镜图。
[0034] 图14为本发明的假单胞菌YG8的16S rDNA扩增电泳图。
[0035] 图15为本发明的假单胞菌YG8的系统进化树。
[0036] 图16为本发明的假单胞菌YG8 napA基因PCR扩增电泳图。
[0037] 图17为A(C/N)、B(温度)与C(转速)交互作用对菌株LJ2异养硝化脱氮性能影响的响应面图和等高线图，其中，上两幅图中的左图为A(C/N)与B(温度)交互作用对菌株 LJ2异养硝化脱氮性能影响的等高线图，上两幅图中的右图为A(C/N)与B(温度)交互作用对菌株LJ2异养硝化脱氮性能影响的响应面图；中间两幅图中的左图为B(温度)与C(转速)交互作用对菌株LJ2异养硝化脱氮性能影响的等高线图，中间两幅图中的右图为B(温度)与C(转速)交互作用对菌株LJ2异养硝化脱氮性能影响的响应面图；下两幅图中的左图为A(C/N)与C(转速)交互作用对菌株LJ2异养硝化脱氮性能影响的等高线图，下两幅图中的右图为A(C/N)与C(转速)交互作用对菌株LJ2异养硝化脱氮性能影响的响应面图。
[0038] 图18为本发明的异养硝化复合菌剂降解NH4+-N的曲线图。
[0039] 图19为混料设计等高线图及3D响应面图，其中左图为等高线图，右图为3D响应面图。
[0040] 图20为不同碳源对本发明的异养硝化复合菌剂脱氮性能的影响图。
[0041] 图21为不同C/N对异养硝化YL菌剂脱氮性能的影响图。
[0042] 图22为A(温度)、B(装量)与C(pH)交互作用对异养硝化复合菌剂异养硝化脱氮性能影响的等高线图及3D响应面图；其中，上两幅图中的左图为A(温度)与B(装量)对异养硝化复合菌剂异养硝化脱氮性能影响的等高线图，上两幅图中的右图为A(温度)与B (装量)对异养硝化复合菌剂异养硝化脱氮性能影响的3D响应面图；中间两幅图中的左图为B(装量)与C(pH)对异养硝化复合菌剂异养硝化脱氮性能影响的等高线图，中间两幅图中的右图为B(装量)与C(pH)对异养硝化复合菌剂异养硝化脱氮性能影响的3D响应面图；下两幅图中的左图为A(温度)与C(pH)对异养硝化复合菌剂异养硝化脱氮性能影响的等高线图，下两幅图中的右图为A(温度)与C(pH)对异养硝化复合菌剂异养硝化脱氮性能影响的3D响应面图。
[0043] 图23为不同NH4+-N浓度对异养硝化YL菌剂脱氮性能的影响图。
具体实施方式
[0044] 以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
[0045] 实施例：
[0046] 本实验室前期从龙津污水处理厂采集的活性污泥中分离筛选出的三株具有高效脱氮性能的好氧反硝化菌Paracoccus versutus LJ2、Pseudomonas indoloxydans LJ9、Pseudomonas mendocina YG8。通过响应面法探究菌株Paracoccus versutus LJ2脱氮性能影响因素，采用混料设计研制异养硝化YL菌剂的复配比，采用单因素法和响应面法实验探究异养硝化YL菌剂脱氮性能影响因素并测定YL菌剂耐受的NH4+-N浓度，分析其变化规律，本研究结果为异养硝化脱氮菌剂应用于含中低氮素、高浓度有机物的废水处理提供研究基础。
[0047] 材料与方法
[0048] 表1实验仪器的名称和类型
[0049]
[0050] 培养基
[0051] 表2培养基配方
[0052]
[0053] 菌种来源：本课题组前期从龙津污水处理厂采集的活性污泥中分离筛选出三株具有高效脱氮性能的反硝化菌，分别为Paracoccus versutus LJ2、Pseudomonas indoloxydans LJ9、 Pseudomonas mendocina YG8，以下表述中简称为LJ2、LJ9、YG8。复配后的异养硝化复合化菌剂命名为YL菌剂。
[0054] 上述本实施例的副球菌LJ2主要通过以下方法筛选得到：
[0055] 将从福建省龙岩市龙津污水厂采集的活性污泥100mL活性污泥加入到200mL反硝化富集培养基中，培养基中加入无菌玻璃珠。30℃，150rpm·min-1摇床震荡，连续培养5天，将以上细菌悬液以10％的接种量转接于新鲜的DM培养基中，以这种培养方式重复培养两次，得到富集的细菌悬液。
[0056] 采用10倍稀释法，将0.2mL的富集细菌悬液涂布于DM琼脂培养基中(1.5％的琼脂)，于30℃培养。挑选具有明显不同特征的细菌菌落，进行平板划线，获得单菌落。纯化的菌落再重新接种于新鲜的琼脂培养基中。将分离出的菌株培养于KNO3为唯一氮源的DM初筛培养基中进行初筛，将能存活于DM初筛培养基的菌株接种到LB斜面培养基中-4℃保存。然+ -后，测定初筛菌株NH4-N以及NO3-N去除率，得到脱氮性能较好的菌株LJ2再进行研究。
[0057] 上述本实施例的副球菌LJ2菌种鉴定过程及结果如下：
[0058] 形态学鉴定：对微生物形态结构的观察采用肉眼观察法、光学显微镜观察法及投射电子显微镜观察法。菌株LJ2在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落形态如图1所示：菌落为乳白色，边缘整齐，圆形微微隆起，表面光滑湿润，不透明。LJ-2革兰氏染色鉴定为革兰氏阴性菌。 LJ2透射电镜图如图2所示：菌体呈短杆状，无荚膜，无芽孢，无鞭毛，LJ2横直径约为0.49 μm，长度约为1.07μm。
[0059] 生理生化鉴定：细菌详细分类的典型做法是以生理生化试验的结果为基础的，本实验中菌株的生理生化特性参照文献及《伯杰明细菌鉴定手册》进行实验。测定菌株LJ2进行生理生化特性，结果见表3：LJ2的糖发酵实验均为阴性，不产酸不产气；接触酶与氧化酶实验均为阳性，初步判断LJ2与副球菌(Paracoccus versutus)的生理生化特性相符：
[0060] 表3菌株LJ2生理生化实验特性
[0061]实验名称 实验结果 实验名称 实验结果
氧化酶 + V.P -
接触酶 + 油脂水解 +
葡萄糖氧化发酵 - 乙酸氧化 -
乳糖氧化发酵 - 石蕊牛奶 产酸
尿素水解 - 吲哚实验 +
淀粉水解 - 氨基酸脱羧酶 -
甲基红 - 硝酸盐还原 -
氧化酶 + V.P -
接触酶 + 油脂水解 +
葡萄糖氧化发酵 - 乙酸氧化 -
乳糖氧化发酵 - 石蕊牛奶 产酸
尿素水解 - 吲哚实验 +
淀粉水解 - 氨基酸脱羧酶 -
甲基红 - 硝酸盐还原 -
[0062] 注：表中“+”代表阳性，有此项反应；“-”代表阴性，无此项反应。在糖发酵实验中，“o+”表示产酸产气；“+”表示产酸不产气；“-”表示不产酸不产气。
[0063] 分子生物学鉴定：本实验中菌株DNA按Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒的操作步骤提取细菌基因组DNA。16S rRNA基因的扩增和测序：细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为 5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。16S rRNA基因的相对分子量适中，序列分析的重现性极高， 16S rRNA基因是细菌的系统分类研究中最常用的方法之一。现在普遍采用16S rRNA基因作为序列分析对象鉴定细菌的种属。本实验中采用通用引物27F和1492R对菌株的16S rRNA进行PCR扩增，纯化后进行测序。
[0064] 16S rRNA基因的PCR反应体系见表4。
[0065] 表4 16S rRNA基因的PCR反应体系
[0066]10×PCR buffer 2.5μL
dNTP 0.5μL
F 0.5μL
R 0.5μL
Taq酶 0.25μL
ddH2O 20.75μL
Total 25μL
dNTP 0.5μL
F 0.5μL
R 0.5μL
Taq酶 0.25μL
ddH2O 20.75μL
Total 25μL
[0067] 16SrRNA基因PCR扩增结果如图3，片段长度1400bp左右，条带扩增位置正确。测序分析结果如图4所示：菌株LJ-2与副球菌(Paracoccus vereutus)的相似度为99％，因此判定LJ2 为一株副球菌(Paracoccus versutus)，该菌株命名为Paracoccus versutus LJ2。
[0068] 功能基因鉴定：好氧反硝化过程中，有氧条件下，周质硝酸还原酶基因(nap基因)会优先表达，NO3--N无需通过细胞膜就可以到达周质硝酸还原酶所在的活性区域，周质硝酸还原酶能够直接将NO3--N还原生成NO2--N；氧化亚氮还原酶(NOSZ)能够将NO2--N还原生成N2，在细菌的反硝化过程中也起着关键作用。所以为了进一步验证菌株的好氧反硝化功能，本实验对菌株周质硝酸还原酶基因(napA，片段长度为800bp～900bp)和氧化亚氮还原酶基因(nosZ，片段长度约为300bp)进行PCR扩增，PCR所利用的引物对分别为nap1/nap2(nap1： 5’-TCTGGACCATGG-GCTTCAACCA-3’，nap2：5’-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3’)和 nosZ-F/nosZ-R(nosZ-F：5’-CGYTGTTCMTCGACAGCCAG-3’，nosZ-R： 5’-CGSACCTTSTTGCCSTYGCG-3’)。
[0069] 16S rRNA、napA基因、nosZ基因的PCR反应程序见表5。
[0070] 表5 16S rRNA、napA基因、nosZ基因的PCR反应程序
[0071]
[0072]
[0073] LJ2菌株基因扩增片段电泳结果如图5所示：得到片段大小为700bp～1000bp左右的特异条带，大小与预测片段大小相符，因此可初步判断，该菌含有napA基因，这表明菌株LJ2 具有将NO3--N转化为NO2--N的功能。利用引物nos1/nos2对LJ2菌株基因进行扩增，扩增片段电泳结果如图6所示：得到片段大小为250bp～500bp左右的特异条带，大小与预测大小相符。因此也可判断，该菌含有nosZ基因，这表明了菌株LJ2具有将NO2--N转化为N2的功能。
[0074] 上述本实施例的假单胞菌LJ9主要通过以下方法筛选得到：
[0075] 富集培养：将采自福建省龙岩市龙津污水处理厂的活性污泥50mL加入到100mL DM培养基中，同时培养基中加入2-4颗无菌玻璃珠，以便打散泥样。30℃，150rpm摇床震荡连续培养5天。将以上细菌悬液以10％的接种量转接于新的DM培养基中，以这种方式重复培养两次，得到富集的细菌悬液。
[0076] 分离纯化：采用10倍稀释法，将0.2mL的细菌悬液涂布于DM固体培养基平板中，于 30℃培养箱培养。待平板长出单菌落，挑选具有明显不同特征的细菌菌落，进一步多次平板划线，得到纯化的单菌落。
[0077] 初筛：为了测定菌株的反硝化能力，将纯化的菌株培养于KNO3为唯一氮源的DM固体培养基平板中，将能够在平板上生长的菌落挑出完成初筛。
[0078] 复筛：初筛后的菌株接种到异养培养基与反硝化培养基中，筛选出氨氮和硝酸盐氮降解率分别为66％和96％的菌株LJ9。
[0079] 保存：本实验采用了4℃牛肉膏蛋白胨斜面保藏和甘油悬液低温冷冻保藏方法保存菌种。甘油悬液低温冷冻保藏方法：50％的甘油蒸馏水，与LB培养的菌种悬液1∶1混合，在-80℃低温保存，甘油的终浓度在25％左右。
[0080] 上述本实施例的假单胞菌LJ9菌种鉴定过程及结果如下：
[0081] 形态学鉴定：观察分离的菌株在固体平板上的单菌落形态。采用革兰氏染色法和透射电镜观察菌体形态。菌株LJ9在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上划线培养48h，如图7所示：大菌落呈圆形边缘整齐，湿润，表面光滑，乳白色半透明，小凸起。革兰氏染色鉴定该菌革兰氏阴性。菌种形态如图8透射电镜图所示：菌体呈杆状，大小为6×12.5μm，有鞭毛、无芽孢。
[0082] 生理生化鉴定：细菌详细分类的典型做法是以细菌生理生化实验结果为基础的，本实验中菌株的生理生化特性参照《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰明细菌鉴定手册》进行鉴定。
[0083] 对菌株LJ9进行多种生理生化特性鉴定，结果如表6所示：LJ9在无氧和有氧条件下都能存活，氧化酶、接触酶、淀粉水解、甲基红、油脂水解、柠檬酸盐、吲哚实验、硝酸盐还原实验为阳性，葡萄糖氧化发酵、乳糖氧化发酵、尿素水解、V.P反应、明胶液化、乙酸氧化、果胶水解、产硫化氢、绿脓菌素实验为阴性。以上结果表明：LJ9与假单胞菌的生理生化特性相似，会分泌许多胞外酶，氧化糖类，产少量酸不发酵。
[0084] 表6菌株LJ9生理生化特性
[0085] 实验名称 实验结果 实验名称 实验结果氧化酶 + 硝酸盐还原 +
接触酶 + 绿脓菌素 -
葡萄糖氧化发酵 - 吲哚实验 +
乳糖氧化发酵 - 石蕊牛奶 +
尿素水解 - 产硫化氢 -
淀粉水解 + 柠檬酸盐 +
甲基红 + 果胶水解 -
V.P - 乙酸氧化 -
油脂水解 + 明胶液化 -
有石蜡封口(无氧) + 无石蜡封口(有氧) +
接触酶 + 绿脓菌素 -
葡萄糖氧化发酵 - 吲哚实验 +
乳糖氧化发酵 - 石蕊牛奶 +
尿素水解 - 产硫化氢 -
淀粉水解 + 柠檬酸盐 +
甲基红 + 果胶水解 -
V.P - 乙酸氧化 -
油脂水解 + 明胶液化 -
有石蜡封口(无氧) + 无石蜡封口(有氧) +
[0086] 注：表3中“+”代表阳性，有此项反应；“-”代表阴性，无此项反应。在糖发酵实验中，“+”表示产酸不产气；“-”表示不产酸不产气。
[0087] 分子生物学鉴定：细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。 rRNA基因由保守区和可变区组成，其中16S rRNA基因的相对分子量适中，序列分析的重现性极高。因此，现在普遍采用16S rRNA基因作为序列分析对象对微生物进行测序分析，用于判定细菌的种属。
[0088] 细菌基因组DNA提取：细菌的基因组DNA提取使用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒具体操作步骤操作。提取菌株DNA作为PCR模板进行扩增。引物选用通用引物:上游27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游1492R:
[0089] 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，在PCR扩增仪反应。16S rRNA基因的扩增和测序：PCR 扩增体系(Total 25μl)：10×Buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，27F 0.5μl，1492R 0.5μl，模板 DNA 1μl，Taq酶0.25μl，无菌水19.75μl。
[0090] PCR反应程序设定如表7所示：
[0091] 表7
[0092]
[0093]
[0094] 总共运行35个循环，其中第35个循环在72℃下补充延伸5min。4℃保存。
[0095] PCR产物经的琼脂糖凝胶电泳检测合格后，委托上海华大基因公司完成序列测定，测序结果再进行同源性分析，得到菌株的系统发育地位。
[0096] 菌株LJ916S rRNA基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳成像结果见图9所示：PCR 产物条带较亮，通道无杂质，条带位置在1000bp以上，说明得到了16S rRNA基因目标条带。对菌株LJ9的16S rRNA基因PCR产物纯化后进行测序，得到的序列长度为1362bp，经 BLAST进行同源性分析，结果如图10所示：菌株LJ9与Pseudomonas indoloxydans菌株相似度
99％，命名为Pseudomonas indoloxydans LJ9。
99％，命名为Pseudomonas indoloxydans LJ9。
[0097] NapA功能基因的扩增：硝酸还原酶分为膜结合硝酸还原酶(Nar)和周质硝酸盐还原酶(Nap) 两类，在好氧条件下，周质硝酸盐还原酶基因优先表达，并且在无氧和有氧条件下均能发挥作用。利用引物nap1：5`-TCTGGACCATGG-GCTTCAACCA-3`，nap2:
[0098] 5’-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3’，在PCR仪上进行扩增。
[0099] PCR扩增体系(Total 25μl)：10×Buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，nap1 0.5μl，nap2 0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶0.25μl，无菌水定容至25μl。PCR反应程序设定如表8所示：
[0100] 表8
[0102] 总共运行30个循环，其中第30个循环在72℃下补充延伸10min。4℃保存。
[0103] PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，电压220V，电泳30min，凝胶成像系统成像拍照。利用引物nap1/nap2对LJ9菌株的周质硝酸盐还原酶基因进行扩增，琼脂糖凝胶电泳图如图11所示：目标条带在750bp-1000bp之间。周质硝酸盐还原酶亚基的napA基因均在870bp 左右，因此可初步判断，LJ9含有napA基因，这表明菌株LJ9具有好氧反硝化功能。
[0104] 上述本实施例的假单胞菌YG8主要通过以下方法筛选得到：
[0105] 初筛：将采自福建省龙岩市龙津污水处理厂的活性污泥，加至装有玻璃珠的富集培养基的锥形瓶中进行富集培养。富集结束后，将菌液稀释涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板。待长出单菌落，再进一步划线纯化。挑取纯化后的菌株接入灭菌的异养硝化培养基中，每隔
2d取菌液滴加格林斯试剂以确认菌株是否具有硝化活性。初步筛选出的异养硝化菌株再接种到BTB 初筛培养基上进行涂布培养，每个菌株至少2个平行样，于30℃恒温培养箱中培养。反硝化过程会使BTB培养基pH升高，从而菌落周围会产生蓝色晕圈，挑选出现蓝色晕圈的单菌落，在DM固体培养基划线分离，重复分离操作3次，待生长后挑取单菌落保存。筛选出的菌株兼具异养硝化和好氧反硝化活性。
2d取菌液滴加格林斯试剂以确认菌株是否具有硝化活性。初步筛选出的异养硝化菌株再接种到BTB 初筛培养基上进行涂布培养，每个菌株至少2个平行样，于30℃恒温培养箱中培养。反硝化过程会使BTB培养基pH升高，从而菌落周围会产生蓝色晕圈，挑选出现蓝色晕圈的单菌落，在DM固体培养基划线分离，重复分离操作3次，待生长后挑取单菌落保存。筛选出的菌株兼具异养硝化和好氧反硝化活性。
[0106] 复筛：挑取初筛得到的菌株分别接入灭菌的异养硝化和好氧反硝化培养基中，在30℃，转速150rpm的摇床震荡培养，48h后检测培养基中的氨氮和硝酸盐氮含量，筛选出氨氮和硝酸盐氮降解率高的菌株，选取该菌株进行后续脱氮性能的研究。
[0107] 上述本实施例的假单胞菌YG8菌种鉴定过程及结果如下：
[0108] 形态学鉴定：培养挑取待鉴定的菌种分别划线于牛肉膏蛋白胨平板培养基，培养48h后观察菌落形态。YG8平板菌落形态结果如图12所示：菌落表面显黄色，不透明，边缘清晰圆整，呈粘性质地。
[0110] 透射电镜形态结果如图13所示：单个细菌呈现短杆状，菌体大小为362×253nm。
[0111] 生理生化鉴定：按照《伯杰鉴定细菌学手册》进行操作，部分参照其他文献操作。细菌的生理生化反应是对细菌分类鉴定的重要依据之一。参照《伯杰鉴定细菌学手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对YG8菌株进行鉴定。鉴定结果如表9所示：YG8能够在4℃和41℃生长，在接触酶、淀粉水解、尿素水解、果胶水解、乙酸氧化等实验中均能发生反应，实验结果为阳性。经生理生化实验鉴定：YG8与Pseudomonas mendocina(假单胞门多萨菌属)相似。
[0112] 表9YG8的生理生化实验结果
[0113]检测指标 结果 检测指标 结果
接触酶 + 尿素水解 +
氧化酶 - 果胶水解 +
V.P - 乙酸氧化 +
甲基红 - 产硫化氢 -
葡萄糖发酵 -- 柠檬酸盐 +
乳糖发酵 -- 石蕊牛奶 酸性
绿脓菌素 + 硝酸盐还原 +
明胶液化 + 吲哚实验 +
淀粉水解 + 氧化发酵 ++
油脂水解 - 生长温度 4℃和41℃都生长
接触酶 + 尿素水解 +
氧化酶 - 果胶水解 +
V.P - 乙酸氧化 +
甲基红 - 产硫化氢 -
葡萄糖发酵 -- 柠檬酸盐 +
乳糖发酵 -- 石蕊牛奶 酸性
绿脓菌素 + 硝酸盐还原 +
明胶液化 + 吲哚实验 +
淀粉水解 + 氧化发酵 ++
油脂水解 - 生长温度 4℃和41℃都生长
[0114] 注：+表示阳性结果，出现反应；表示阴性结果，无该反应。葡萄糖发酵中，第一个+/-表示产酸/不产酸，第二个+/-表示产气/不产气。氧化发酵中，第一个+/-表示有氧条件下反应/不反应，第二个+/-表示无氧条件下反应/不反应。
[0115] 菌种分子生物学鉴定：提取菌株DNA作为PCR模板进行扩增。引物选用通用引物:27F： 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系(50ul)：无菌水41.5ul，Buffer 5ul，1492R 1ul，27F 1ul，taq酶0.5ul，dNTP 1ul。 PCR反应条件为:①95℃预变性3min；②95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s；③第2步循环30次；④72℃最终延伸10min，4℃保存。得到的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后，送至上海华大基因公司完成菌株16S rDNA序列测定，根据结果进行菌株同源性分析，确定菌株的系统发育地位。
[0116] NapA功能基因的扩增。硝酸还原酶分为膜结合硝酸还原酶(Nar)和周质硝酸盐还原酶 (Nap)两类，在好氧条件下，周质硝酸盐还原酶基因优先表达，并且在无氧和有氧条件下均能发挥作用。利用引物nap1：5`-TCTGGACCATGG-GCTTCAACCA-3`，nap2：5 `-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3`，在PCR仪上进行扩增。反应体系(25ul)：10×Buffer 2.5ul， dNTP 0.5ul，NAP1 0.5ul，NAP2 0.5ul，模板DNA 1ul，Taq酶0.25ul，无菌水19.75ul。PCR 条件设定：①94℃预变性10min；②94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min；③第 2步循环30次；④72℃最终延伸10min，4℃保存。得到的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化和凝胶成像系统成像拍照后，送至上海华大基因公司完成序列测定。
[0117] YG8菌株16S rDNA扩增如图14所示：PCR产物条带较亮且通道无其他杂带，位于 1000-2000bp之间，说明得到YG8的16S rDNA目标条带。菌株YG8的16S rDNA PCR产物经纯化后进行测序，测得序列长度为1294bp。根据测序结果进行菌种系统发育分析，结果如图15所示：YG8与Pseudomonas mendocina相似度100％，可判断YG8属于假单胞门多萨菌属(Pseudomonas mendocina)，命名为Pseudomonas mendocina YG8(以下简称YG8)。
[0118] 周质硝酸盐还原酶亚基基因的扩增：利用引物nap1/nap2对YG8菌株的DNA样品进行扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，扩增结果如图16所示：750-1000bp左右有清晰的特异条带，杨基先等分离的周质硝酸盐还原酶亚基基因napA为870bp，可初步判断，该菌含有napA基因，表明菌株YG8具有好氧反硝化功能。
[0119] 水质检测分析：实验常规指标的检测项目与方法如表10所示：
[0120] 表10常规指标的检测项目与方法
[0121]
[0122]
[0123] 种子液制备：将LJ2、YG8、LJ9接入到LB培养基，30℃、150rpm摇床培养24h，取菌悬液4000rpm冷冻离心机中离心10min，去上清液，沉淀菌体用无菌水洗涤，再离心去上清液，重复2-3次，用无菌水将菌悬液的OD600调至0.6-0.8，作为LJ2、YG8、LJ9的种子液。
[0124] 响应面法优化菌株LJ2脱氮性能影响因素
[0125] NH4+-N浓度为100mg·L-1，pH为7.5，接种量为3％，在前期单因素实验得到的结果基础上，选取A(C/N)、B(温度)、C(转速)为优化因素，Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken design设计实验，菌株LJ2中各因素(C/N、温度、转速)及其水平如表11所示。将LJ2种子液接入到装量为100mL的异养硝化培养基中，最后测定体系中的NH4+-N含量。
[0126] 表11响应面实验因素和水平因素对照表
[0127]
[0128] 异养硝化菌剂混合初探及组合比例优化
[0129] 功能菌混料初探：NH4+-N浓度为200mg·L-1，C/N为15，pH为7，混合菌株初探设计如表12所示。将各菌株的种子液以表4的比例接入到装量为100mL的异养硝化培养基中，30℃、 150rpm摇床中培养48h，以上各个实验处理重复3次，每隔6h测定一次体系中的NH4+-N含量。
[0130] 表12混合菌株初探设计
[0131]
[0132] 混料设计确定菌剂复配比：NH4+-N浓度为200mg·L-1，C/N为15，pH为7，接种量为 5％，选取A(LJ2)、B(LJ9)、C(YG8)为优化因素，三株菌种子液接种体积的边界值均设定为0-
5mL，采用Design-Expert 8.0.6软件中Mixture混料设计实验,YL菌剂中各因素(LJ2、 LJ9、YG8)及其水平如表13所示。根据混料设计安排实验，将各菌株种子液按实验设计的配比接入到装量为100mL的异养硝化培养基中，30℃、150rpm摇床下培养48h，以上各个实验处理重复3次，每6h测定一次体系中的NH4+-N含量。
5mL，采用Design-Expert 8.0.6软件中Mixture混料设计实验,YL菌剂中各因素(LJ2、 LJ9、YG8)及其水平如表13所示。根据混料设计安排实验，将各菌株种子液按实验设计的配比接入到装量为100mL的异养硝化培养基中，30℃、150rpm摇床下培养48h，以上各个实验处理重复3次，每6h测定一次体系中的NH4+-N含量。
[0133] 表13混料设计实验因素和水平因素对照表
[0134]
[0135] 碳源对YL菌剂异养硝化性能的影响
[0136] 碳是微生物生命活动中不可或缺的能源，因为碳是微生物的重要组成元素之一，为微生物正常的生长、分裂提供物质基础。即微生物的生长需要碳源，在细菌的呼吸过程中，碳源是氧气的电子供体。碳源的类型既影响微生物的生长，又影响其硝化活性。
[0137] 为了探求不同碳源对YL菌剂的影响，将YL菌剂按照以上实验得到的最佳复配比接入到装量为100mL的不同碳源异养硝化培养基中，碳源分别为NaKC4H4O6、CH3COONa、 Na3C6H5O7、C4H4Na2O4、C6H12O6，NH4+-N浓度为200mg·L-1，C/N为15，pH为7，30℃、 150rpm摇床中培养48h，以上各个实验处理重复3次，测定不同碳源条件下，反应体系中 YL菌剂的OD600值、pH值及NH4+-N含量。
[0138] C/N对YL菌剂异养硝化性能的影响
[0139] C/N是影响YL菌剂NH4+-N去除效果的关键因素，主要影响菌株在生长与合成之间的关系，对菌株的代谢活动影响很大。C/N较低，无法满足微生物的生长所需，进而降低脱氮效果，而C/N达到一定程度时，微生物不能全部利用，进而产生一部分碳源的浪费。
[0140] NH4+-N浓度为200mg·L-1，pH为7，碳源为CH3COONa，通过改变碳源含量调节C/N，将各菌株的种子液按YL菌剂最佳复配比接入到装量为100mL的不同C/N异养硝化培养基中，选择C/N为10、20、30、50、100、150、200，30℃，150rpm摇床培养48h，以上各个实验处理重复3次，测定体系中YL菌剂的OD600值、pH值及NH4+-N含量。
[0141] 响应面法优化YL菌剂异氧硝化脱氮性能的影响因素
[0142] 温度在微生物生长代谢活动存在至关重要的影响，温度影响菌体细胞膜的流动性、完整性，影响菌体内蛋白质等生物大分子的功能和结构,温度过高会使蛋白质变性、菌体内的酶失活，而温度过低则会抑制酶的活性。pH影响微生物细胞膜蛋白、胞外水解酶的活性、膜通透性及营养物质的解离与吸收。在污水处理中，只有充分考虑pH对处理方法的影响，选择合适的pH值范围，才能达到最好的处理效果。装量与液体培养基的富氧速率成正比关系，培养基的富氧速率对好氧反硝化菌LJ2、YG8、LJ9至关重要。
[0143] NH4+-N浓度为200mg·L-1，pH为7，C/N为20，碳源为CH3COONa，选取A(温度)、B(装量)、C(pH)为优化因素，采用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken design设计实验,YL菌剂各因素(温度、装量、pH)及其水平如表14所示。将各菌株的种子液按最佳复配比接入到异养硝化培养基中，150rpm摇床中培养48h，以上各个实验处理重复3次，测定体系中的+NH4-N含量。
[0144] 表14响应面实验因素和水平因素对照表
[0145]
[0146] NH4+-N浓度对YL菌剂脱氮性能的影响
[0147] NH4+-N浓度对异养硝化复合菌剂菌群的生长至关重要。NH4+-N浓度过低，不能满足菌株生长的需要；NH4+-N浓度过高，又会导致对细胞的生长产生毒害作用，同时会通过底物抑制硝化反应中关键酶的活性，从而影响异养硝化细菌的硝化活性。
[0148] 碳源为CH3COONa，C/N为20，pH为7.5，将各菌株的种子液按最佳复配比接入到装量为60mL的不同NH4+-N浓度异养硝化培养基中，NH4+-N浓度分别200、300、500、800、1000mg·L-1，35℃、150rpm摇床中培养7d，以上各个实验处理重复3次，每隔1d测定一次体系中的NH4+-N含量，第7d测定OD600值、pH值、COD值、TN含量。
[0149] 2.实验结果与分析
[0150] 响应面法优化菌株LJ2脱氮性能影响因素
[0151] 响应面实验模型分析
[0152] 好氧反硝化菌LJ2脱氮性能影响因素优化实验结果如表15所示，利用Design-Expert 8.0.6 响应面软件，对表7中的数据进行二次拟合，得到NH4+-N去除率(Y1)的回归方程:
[0153] Y1＝100-25.01A+1.44B+1.55C-2.13AB-14.10AC-5.5BC-29.36A2-36.26B2-20.74C2
[0154] 回归方程方差分析结果如表16所示：实验模型极显著(p<0.01)，A(C/N)及A2(C/N)、 B2(温度)、C2(转速)对菌株LJ2异养硝化脱氮性能的影响极显著(p<0.01)，其他项影响均不显著(p>0.05)，各因素对菌株LJ2异养硝化脱氮影响程度大小依次为C/N>转速>温度。模型相关系数R2为0.9463，该模型方程可以解释94.6％的响应值(菌株LJ2的NH4+-N去除率)变化；修正模型相关系数R2(adj)为0.8773，R2与R2(adj)的差异在0.2以内，模型预测值和真实值之间的相关性较高，方程模型可信度较高，回归方程拟合度好，可用该模型对菌株LJ2 的C/N、温度、转速之间的互作关系进行分析。
[0155]
[0156]
[0157]
[0158] 响应面结果分析
[0159] 通过对应的响应面图和等高线图可以评价实验因素对菌株LJ2 NH4+-N去除率的两两交互作用，以及确定各个因素的水平范围。等高线图的形状可以反映出交互作用的强弱大小，一般情况下，椭圆形表示交互作用显著，而圆形表示交互作用不显著。
[0160] A(C/N)与B(温度)对菌株LJ2 NH4+-N去除率的互作影响如图17的上两幅图所示：由图17上图右图的三维响应图可以看出，C/N或温度升高，菌株LJ2的NH4+-N去除率先上升后下降；整体响应面较为陡峭，C/N的响应值变化率大于温度的响应值变化率，说明C/N 对菌株LJ2脱氮性能影响较大。从图17上图左图的等高线图可以看出，等高线为椭圆形，当转速一定时，C/N与温度的互作影响对菌株LJ2的NH4+-N去除率影响显著。以上结果表明：转速一定时，菌株LJ2异养硝化脱氮的C/N范围为40-100，温度范围为27.5-32.5℃。
[0161] B(温度)与C(转速)对菌株LJ2 NH4+-N去除率的互作影响如图17的中间两幅图所示：由图17中图右图的三维响应面图可以看出，温度或转速升高，菌株LJ2的NH4+-N去除率先上升后下降；整体响应面较为陡峭，转速的响应值变化率大于温度的响应面变化率，说明转速对菌株LJ2脱氮性能影响较大。从图17中图左图的等高线图可以看出，等高线为圆形，当 C/N一定时，温度与转速的互作影响对菌株LJ2的NH4+-N去除率影响不显著。以上结果表明： C/N一定时，菌株LJ2异养硝化脱氮的温度范围为27.5-32.5℃，转速范围为125-200rpm。
[0162] A(C/N)与C(转速)对菌株LJ2 NH4+-N去除率的互作影响如图17的下两幅图所示：由+图17下图右图的三维响应面可以看出，C/N或转速升高，菌株LJ2的NH4-N去除率先上升后下降；整体响应面较为陡峭，C/N的响应值变化率大于转速的响应值变化率，说明C/N 对菌株LJ2脱氮性能影响较大。从图17下图左图的等高线图可以看出，等高线为椭圆形，当温度一定时，C/N与转速的互作影响对菌株LJ2的NH4+-N去除率影响显著。以上结果表明：温度一定时，菌株LJ2异养硝化脱氮的C/N范围为40-100，转速范围为125-200rpm。
[0163] 根据Design Expert 8.0.6软件的优化选择功能，模型预测的菌株LJ2最佳异养硝化脱氮条件为：C/N为100，温度为30℃，转速为150rpm，菌株LJ2的NH4+-N去除率预测值为100.0％。经验证可得，在此条件下，菌株LJ2的NH4+-N去除率为100.0％，预测值与验证值一致，模型预测结果可靠。
[0164] 菌剂中功能菌混合初探及组合比例优化
[0165] 功能菌混料初探：三株菌混料初探培养体系中的NH4+-N含量变化如图18所示：相比 YL菌剂的菌株，YL菌剂的NH4+-N去除率有所提升。各个菌株组合在36h NH4+-N去除率基本都达到了最大，其中LJ2+LJ9组合的NH4+-N去除率达到98.9％，LJ2+YG8组合的NH4+-N 去除率达到84.1％，LJ2+LJ9+YG8组合的NH4+-N去除率为77.4％，LJ9+YG8组合的NH4+-N 去除率为62.3％。以上结果表明三株好氧反硝化菌组合表达出了良好的脱氮性能，能够进行共生培养。
[0166] 功能菌组合比例的确定
[0167] (1)混料设计模型分析：
[0168] 利用Design Expert 8.0.6响应面软件，对表17混料设计结果中的数据进行二次拟合，得到NH4+-N去除率(Y2)的回归方程：
[0169] Y2＝4.01A+3.30B+4.14C+1.20AB-0.064AC-1.85BC+10.46ABC
[0170] 回归方程方差分析结果如表18所示：实验模型极显著(p<0.01),AB(LJ2与LJ9)、BC (LJ9与YG8)及其ABC(LJ2、LJ9、YG8)对YL菌剂NH4+-N去除速率的影响极显著(p <0.01)，其他项影响均不显著(p>0.05)。模型相关系数R2＝0.9472，说明该模型方程可以解释94.7％的响应值(YL菌剂NH4+-N去除速率)变化；修正相关系数R2(Adj)＝0.9121，R2与 R2(Adj)的差异在0.2以内，预测值与真实值之间的相关性较高，方程模型可信度较高，回归方程拟合度好，可用该模型对YL菌剂中不同功能菌混合设计比例作用关系进行分析。
[0171]
[0172]
[0173]
[0174] (2)结果分析
[0175] 混料设计等高线图及3D响应面图如图19所示：从三维响应面图可以看出，三维响应面图呈球面，表明菌株LJ2、YG8、LJ9的混合比例对YL菌剂NH4+-N的去除具有互作影响；从等高线图可以看出，图中存在“红色顶点”，说明YL菌剂的菌群比例在实验设计范围内 NH4+-N去除速率存在最大值，A(LJ2)占主导因素，当菌株LJ2的配比为52.0％时NH4+-N 去除速率最大。以上实验结果表明：当菌株LJ2:LJ9:YG8＝2.6:1.1:1.3时，YL菌剂的脱氮效果最好。
[0176] 碳源对YL菌剂异养硝化性能的影响结果
[0177] 不同碳源对YL菌剂NH4+-N的去除以及菌株的混合生长具有重要影响，结果如图20所示：以CH3COONa、Na3C6H5O7、C4H4Na2O4为碳源时，YL菌剂OD600为1.25、0.68、0.76， pH为8.7、8.31、8.44，NH4+-N去除率为100.0％、87.2％、85.3％。实验结果表明：以有机酸为碳源时，YL+
菌剂的脱氮效果较好。其中，CH3COONa的OD600为1.25，NH4 -N去除率达到100.0％，选择其为YL菌剂的最佳碳源。而碳源为C6H12O6时，YL菌剂基本没有增长， NH4+-N含量基本没有降低。
这说明相对于有机酸，糖类不适合YL菌剂的菌群生长与脱氮，可能是因为有机酸可以直接参与TCA循环，而糖类需要先转化为有机酸再被利用。
菌剂的脱氮效果较好。其中，CH3COONa的OD600为1.25，NH4 -N去除率达到100.0％，选择其为YL菌剂的最佳碳源。而碳源为C6H12O6时，YL菌剂基本没有增长， NH4+-N含量基本没有降低。
这说明相对于有机酸，糖类不适合YL菌剂的菌群生长与脱氮，可能是因为有机酸可以直接参与TCA循环，而糖类需要先转化为有机酸再被利用。
[0178] 不同异养硝化复合菌剂对碳源的利用情况也不尽相同。如：吴敏制备生物脱氮菌剂，其最佳碳源为C4H4Na2O4，在此碳源条件下异养硝化复合菌剂的NH4+-N去除率最高达到 89.72％；呼婷婷在研究不同碳源对以Acinetobacter sp.Y1和Penicillium sp.L1组成的异养硝化复合菌剂菌群生长情况影响时，将两株菌分别脱氮时的最佳碳源C12H22O11和Na3C6H5O7以1：1的摩尔比混合，异养硝化复合菌剂的生长状态最好。
[0179] C/N对菌剂异养硝化性能的影响结果
[0180] C/N不断上升，YL菌剂的OD600、pH及NH4+-N去除率如图21所示：不同C/N对YL 菌剂的NH4+-N去除性能影响显著，当C/N为20时，YL菌剂菌群的生长情况较好，OD600为0.92，pH为+ +8.64，NH4 -N去除率最大达到99.9％。C/N为30和50时，YL菌剂的NH4 -N 降解效率都保持在一个较高的水平，NH4+-N去除率高于99.0％。当C/N为100时，YL菌剂菌群OD600下降至0.089，对NH4+-N的降解效率下降至93.8％，这说明碳源已超过菌体所需的量，对菌株的生长产生了一定的抑制作用。总体来说，YL菌剂对C/N的适应范围较宽， NH4+-N去除率都高于93.0％，综合考虑其生长及耐受性，选择C/N为20为YL菌剂的C/N。
[0181] 相比已报道的微生物菌剂，本研究中的异养硝化YL菌剂可耐受C/N较高，范围较宽。如：洪利研究C/N对脱氮CM菌剂生长情况影响结果表明：当C/N<20时，OD600<1.00；C/N 为20时，异养硝化复合菌剂的OD600最大达到1.23；C/N为40时，异养硝化复合菌剂的OD600下降至0.97，因此C/N为20时，CM菌剂生长情况最好。呼婷婷研究不同C/N对由Acinetobacter sp.Y1、Penicillium sp.L1组成的脱氮菌剂NH4+-N去除的影响，结果表明：C/N范围21-42 内，异养硝化复合菌剂NH4+-N去除率高于90.0％。本研究中的异养硝化YL菌剂在C/N为 0-
200范围内的NH4+-N去除率高于93.0％，可适应较高浓度有机物。
200范围内的NH4+-N去除率高于93.0％，可适应较高浓度有机物。
[0182] 2.5响应面法优化异养硝化YL菌剂脱氮性能影响条件
[0183] (1)响应面模型分析
[0184] 利用Design-Expert 8.0.6响应面软件，对表19YL菌剂条件优化结果中的数据进行二次拟合，得到NH4+-N去除率(Y3)的回归方程:
[0185] Y3＝75.51-0.57A-17.23B+20.20C-3.84AB-0.97AC-6.82BC+0.82A-5.35B-27.23C[0186] 回归方程方差分析结果如表20所示：本实验模型极显著(p<0.01)，B(装量)、C(pH) 及其C2(pH)对YL菌剂异养硝化脱氮极显著(p<0.01)，其他项影响均不显著(p>0.05)，各因素对YL菌剂异养硝化脱氮性能的影响程度大小依次为pH>装量>温度。其中，模型相关系数R2＝0.9341，说明该模型方程可以解释93.4％的响应值(YL菌剂NH4+-N去除率)变化；修正模2 2 2
型相关系数R (Adj)＝0.9121，模型R与R (Adj)的差异在0.2以内，表明二次方程模型预测值和真实值之间存在较高的相关性，方程模型可信度较高，可用该模型对YL菌剂影响条件(温度、装量、pH)下的NH4+-N去除率进行预测和分析。
型相关系数R (Adj)＝0.9121，模型R与R (Adj)的差异在0.2以内，表明二次方程模型预测值和真实值之间存在较高的相关性，方程模型可信度较高，可用该模型对YL菌剂影响条件(温度、装量、pH)下的NH4+-N去除率进行预测和分析。
[0187]
[0188]
[0189] (2)结果分析
[0190] A(温度)与B(装量)对YL菌剂NH4+-N去除率的互作影响如图22的上两幅图所示：由图22上图右图的三维响应面可以看出，温度升高或装量降低，YL菌剂的NH4+-N去除率上升；从图22上图左图的等高线可以看出，等高线为横线，当pH一定时，温度与装量的互作影响对YL菌剂NH4+-N去除率不显著。以上结果表明：当pH一定时，YL菌剂异养硝化脱氮的温度较广为25-35℃，装量范围为60-100mL。
[0191] B(装量)与C(pH)对YL菌剂NH4+-N去除率的互作影响如图22的中间两幅图所示：由图22中图右图的三维响应面可以看出，pH或装量升高，YL菌剂的NH4+-N去除率增大；整体响应面较为陡峭，pH的响应值变化率大于装量的响应值变化率，说明pH对YL菌剂脱氮性能影响较大。从图22中图左图的等高线可以看出，等高线为椭圆形，当温度一定时，装量与pH的互作影响对YL菌剂NH4+-N去除率显著。以上结果表明：当温度一定时，YL菌剂异养硝化脱氮的装量范围为60-100mL，pH范围为7-8。
[0192] A(温度)与C(pH)对YL菌剂NH4+-N去除率的互作影响如图22的下两幅图所示：由图22下图右图的三维响应面可以看出，温度或pH升高，YL菌剂的NH4+-N去除率增大；整体响应面较为平缓。从图22下图左图的等高线图可以看出，等高线为椭圆形，当装量一定时，C/N与+
转速的互作影响对YL菌剂NH4-N去除率显著。以上结果表明：当装量一定时， YL菌剂异养硝化脱氮的温度范围为25-35℃，pH范围为7-8。
转速的互作影响对YL菌剂NH4-N去除率显著。以上结果表明：当装量一定时， YL菌剂异养硝化脱氮的温度范围为25-35℃，pH范围为7-8。
[0193] 根据Design-Expert 8.0.6响应面软件的优化选择功能，模型预测的YL菌剂最佳异养硝化脱氮条件为温度为35℃、装量为60mL、pH为7.5。YL菌剂的NH4+-N去除率预测值为+97.7％。经验证可得，在此条件下，YL菌剂的NH4-N去除率达到98.5％，预测值与验证值基本一致，模型预测结果可靠。
[0194] NH4+-N浓度对YL菌剂异养硝化性能的影响结果
[0195] 在不同初始NH4+-N浓度下，YL菌剂的生长曲线如图23所示：NH4+-N浓度为200、300、 -1500mg·L 时，生长状况良好，YL菌剂OD600分别达到1.216、1.311、1.433，pH分别达到 8.98、
8.75、8.91。当NH4+-N浓度达到800mg·L-1时，YL菌剂菌株基本不生长，OD600为0.093， pH为
7.46。说明YL菌剂生长较适合的初始NH4+-N浓度范围为0-500mg·L-1。
8.75、8.91。当NH4+-N浓度达到800mg·L-1时，YL菌剂菌株基本不生长，OD600为0.093， pH为
7.46。说明YL菌剂生长较适合的初始NH4+-N浓度范围为0-500mg·L-1。
[0196] 在不同初始NH4+-N浓度下，YL菌剂培养7天，其实验结果如图23所示：初始NH4+-N 浓度为200mg·L-1，YL菌剂的NH4+-N、TN及COD去除率依次为99.9％、95.0％、79.0％。随着NH4+-N浓度的提高，YL菌剂的NH4+-N、TN及COD去除率逐渐降低，初始NH4+-N 浓度提高至500mg·L-1时，YL菌剂的NH4+-N和TN去除率分别为63.3％、60.0％，COD去除率为31.5％；初始NH4+-N浓度提高至800mg·L-1时，YL菌剂的NH4+-N、TN去除率仅为6.4％、 6.2％，说明NH4+-N浓度过高抑制YL菌剂菌株的生长代谢及其异养硝化脱氮性能。
[0197] 相比YL菌剂中所用到的纯菌，YL菌剂表现出了良好的NH4+-N耐受能力。YL菌剂中的菌株LJ2耐受NH4+-N浓度为300mg·L-1，NH4+-N浓度为400mg·L-1时，其NH4+-N去除率低于20％；YL菌剂中的菌株YG8耐受NH4+-N浓度为500mg·L-1，与YL菌剂一致，但其 NH4+-N去除率仅为56.0％；YL菌剂中的菌株LJ9耐受NH4+-N浓度为400mg·L-1，当NH4+-N 浓度提高至
500mg·L-1时，NH4+-N去除率低于20％。纯菌耐受NH4+-N浓度能力有限，YL 菌剂中各个菌株可协同效用、优势互补，使其脱氮效果显著提高。
500mg·L-1时，NH4+-N去除率低于20％。纯菌耐受NH4+-N浓度能力有限，YL 菌剂中各个菌株可协同效用、优势互补，使其脱氮效果显著提高。
[0198] 异养硝化YL菌剂相比一般菌株，其耐受NH4+-N能力、异养硝化脱氮性能具有明显优势。如：吴建江等人在研究菌株Pseudomonas sp.XS76异养硝化脱氮性能时，菌株XS76能耐+ -1 +受 NH4-N浓度约为420mg·L 。黄菲菲研究不同NH4-N浓度对菌株Acinetobacte sp.HY2和 Pseudomonas putida LY1的NH4+-N去除影响，NH4+-N浓度为50mg·L-1时，菌株HY2的NH4+-N 去除率最高为74.0％，菌株LY1的NH4+-N去除率最高为64.0％。陈赵芳等人分离出的异养硝化菌株Acinetobacter sp.YY4，NH4+-N浓度100mg·L-1时NH4+-N去除率最高为100.0％；随着 + + + -1 +
NH4-N浓度不断上升，菌株YY4的NH4-N去除率不断下降；而NH4-N浓度为500mg·L 时NH4 -N去除率下降至30.0％。与上述菌株相比，YL菌剂可耐受NH4+-N浓度为0-500mg·L-1，且在此范围内YL菌剂的NH4+-N去除率高于63.0％。
NH4-N浓度不断上升，菌株YY4的NH4-N去除率不断下降；而NH4-N浓度为500mg·L 时NH4 -N去除率下降至30.0％。与上述菌株相比，YL菌剂可耐受NH4+-N浓度为0-500mg·L-1，且在此范围内YL菌剂的NH4+-N去除率高于63.0％。
[0199] 以上所述，仅是本申请的较佳实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
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