一种多粘类芽孢杆菌及其菌剂和制备与应用
阅读：1024发布：2020-06-25
专利汇可以提供一种多粘类芽孢杆菌及其菌剂和制备与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种多粘类芽孢杆菌菌株Paenibacillus polymyxa DP-11及其菌剂和制备与应用。本发明提供的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11，保藏于中国普通 微 生物 菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.5214，本发明提供的微生物菌剂，活性成分为Paenibacillus polymyxa DP-11。利用本发明提供的菌株和微生物菌剂，可以显著增强 农作物 对于枯萎病的抗病性，提高农作物品质，特别是改善苦瓜对于枯萎病的抗病性，增产效果明显，增产幅度为11.11％-17.59％。，下面是一种多粘类芽孢杆菌及其菌剂和制备与应用专利的具体信息内容。
1.一种多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.5214。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，其利用含有权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11生产得到，其活性成分为权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述的微生物菌剂还包括硅藻土、SDS和木质素磺酸钠。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，以重量百分比计，所述微生物菌剂包括所述硅藻土10-12％、SDS 1.2-2.4％、木质素磺酸钠2-4％以及多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11 84.6-87.8％。
5.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11或权利要求2-4任一项所述微生物菌剂在防治作物枯萎病和/或植物促生领域中的应用，所述作物优选为苦瓜。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11或所述微生物菌剂中的活性成分DP-11为200亿-400亿CFU/g。
7.一种防治作物枯萎病的方法，其特征在于，将权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11或权利要求2-4任一项所述的微生物菌剂加入到土壤中。
8.权利要求2-4任一项所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，其通过包括如下步骤的制备方法得到：
(1)一级种子培养：将权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-
11接种于培养基中培养，得到一级种子液；
(2)二级种子培养：将步骤(1)得到的一级种子液按照3％-5％体积比的接种量接入肉汤培养基中培养，得到二级种子液；
(3)发酵培养：将步骤(2)得到的二级种子液按照5％-20％体积比的接种量接种于固体发酵培养基中培养。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中一级种子培养的温度为30-
35℃，培养时间为20-30h；步骤(2)二级培养的温度为30-35℃，培养时间为2-4d。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中培养时间为72-144h，固体发酵培养基以重量份计包括：甜高粱秸秆粉15-25份，麸皮20-30份，米糠5-15份，豆粕粉15-25份，淀粉10-20份，麦饭石3-8份，酵母粉0.5-2份，碳酸钙2-4份，硫酸镁0.3-0.8份，磷酸二氢钾0.5-2份，硫酸锰0.3-0.8份。
一种多粘类芽孢杆菌及其菌剂和制备与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种多粘类芽孢杆菌，具体涉及一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)以及利用该多粘类芽孢杆菌生产的微生物菌剂，以及所述多粘类芽孢杆菌与菌剂在防治农作物枯萎病和/或植物促生领域中的应用。
背景技术
[0002] 农作物枯萎病是一种世界性土传病害，主要由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)侵染引起。其中，以蔬菜瓜类枯萎病危害最为严重，且一旦发病，难以根除，随着连作年份增加，枯萎病日趋严重。近年来，随着我国设施农业的发展，设施蔬菜瓜类作物面积不断增加，加之常年连作，土壤中病原菌积累量不断增加，蔬菜瓜类枯萎病发生越来越普遍，危害越来越重。一般病株率10％～20％，严重地块达50％～80％，甚至可造成绝产，已成为阻碍我国蔬菜瓜类生产发展的重要因素。
[0003] 目前，蔬菜瓜类枯萎病的防治措施主要是抗病品种的选育和化学防治。抗病品种选育和利用是农作物枯萎病防治最经济有效的防治措施，但由于抗病品种选育周期长，且枯萎病病原的转化型类型众多、生理小种分化频繁，生产上至今尚无高效稳定的抗病品种大面积推广；化学防治是目前生产上最常用的防治手段，但是由于化学防治容易产生环境污染、“3R”和“3致”等生产和食品安全问题，因此其应用在蔬菜瓜果生产上受到一定的限制。生物防治因其环境兼容性良好、防治效果良好已成为枯萎病防治的有效途径，但是，目前有关生物防治的相关产品和技术在实际生产中的应用尚不成熟。
[0004] 苦瓜是重要的保健蔬菜之一，在我国广泛种植，具有较高的经济效益，一般亩收益可达6000～8000元，最高可达万元以上。但是随着种植面积的不断增大，且普遍存在重茬连作现象，苦瓜枯萎病菌数量逐年积累，苦瓜枯萎病害发生和危害日趋严重，加之，由于化肥农药的不合理施用，导致土壤微生态环境恶化、土壤中碳/氮比失调，农药化肥残留、病虫抗药性等一系列困扰苦瓜生产的问题，严重影响了苦瓜种植的经济效益和社会效益。苦瓜枯萎病是典型的植物土传病害，土壤微生态环境和气候条件是影响苦瓜正常生长和枯萎病发生的重要生态因子，适宜的土壤微生态环境和气候条件也是苦瓜优质高产和彰显质量风格特色的决定性因素。但气候条件具有不确定性和不可控性，生产中只有适应性利用之，因此，对土壤微生态的调节和利用便成为苦瓜枯萎病防控的重要策略，尤其在缺乏稳定的高抗品种的苦瓜生产中，可通过调节土壤微生态功能来保障苦瓜的健康生长和有效控制枯萎病的发生为害。研发以作物健康生长为中心、以土壤微生态调控为基础、以抗耐病品种选育为保障的可有效防控连作地苦瓜枯萎病危害的综合治理关键技术，并大面积推广应用，可真正实现化肥农药减量使用的现代农业发展要求，对提高苦瓜产量、保障苦瓜质量和维持苦瓜种植业的可持续发展具有重要意义。
发明内容
[0006] 具体而言，本发明提供了如下技术方案：
[0007] 一方面，本发明提供了一种多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.5214。
[0008] 第二方面，本发明还提供了一种微生物菌剂，其利用含有以上所述的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11生产得到，其活性成分为以上所述的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11。
[0010] 优选的，以重量百分比计，所述微生物菌剂包括所述硅藻土10-12％、SDS 1.2-2.4％、木质素磺酸钠2-4％以及多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11 84.6-
87.8％。
87.8％。
[0011] 第三方面，本发明还提供了以上所述的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11或以上所述微生物菌剂在防治作物枯萎病和/或植物促生领域中的应用。
[0012] 优选的，所述作物优选为苦瓜。
[0013] 优选的，所述多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11或所述微生物菌剂中的活性成分DP-11为200亿-400亿CFU/g。
[0014] 第四方面，本发明还提供了一种防治作物枯萎病的方法，将以上所述的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11或以上任一项所述的微生物菌剂加入到土壤中。
[0015] 第五方面，本发明还提供了以上任一项所述的微生物菌剂的制备方法，其通过包括如下步骤的制备方法得到：
[0017] (2)二级种子培养：将步骤(1)得到的一级种子液按照3％-5％体积比的接种量接入肉汤培养基中培养，得到二级种子液；
[0019] 优选的，步骤(1)中一级种子培养的温度为30-35℃，培养时间为20-30h。
[0020] 优选的，步骤(2)二级培养的温度为30-35℃，培养时间为2-4d。
[0021] 优选的，步骤(3)中培养时间为72-144h，固体发酵培养基以重量份计包括：甜高粱秸秆粉15-25份，麸皮20-30份，米糠5-15份，豆粕粉15-25份，淀粉10-20份，麦饭石3-8份，酵母粉0.5-2份，碳酸钙2-4份，硫酸镁0.3-0.8份，磷酸二氢钾0.5-2份，硫酸锰0.3-0.8份。
[0022] 本发明中提供的多粘类芽孢杆菌为Paenibacillus polymyxa DP-11，是从中国河南省信阳市鸡公山金镶玉竹(Phyllostachys heteroclada)的根际土壤中分离出来的，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏编号为CGMCC No.5214，保藏日期为2011年09月05日。
[0023] 本发明所取得的有益效果是：利用本发明提供的菌株和微生物菌剂，可以显著增强农作物对于枯萎病的抗病性，提高农作物品质，特别是改善苦瓜对于枯萎病的抗病性，增产效果明显，增产幅度为11.11％-17.59％。
[0024] 下面结合各个具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行详细说明。
具体实施方式
[0025] 如上所述，本发明提供了一种多粘类芽孢杆菌及其菌剂和制备与应用。
[0026] 其中，本发明所用到的培养基的配方如下：
[0028] 营养肉汤(NB)：胰蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1L，25℃，pH 7.2～7.5。
[0029] 固体发酵培养基：以重量份计，甜高粱秸秆粉20份，麸皮25份，米糠10份，豆粕粉20份，淀粉15份，麦饭石5份，酵母粉1份，碳酸钙3份，硫酸镁0.5份，磷酸二氢钾1份，硫酸锰0.份；料水比1:1.1(W/V，g/L)，pH 9.0～10.0，0.15MPa高压灭菌60min后备用。
[0031] 表1本发明所用原料和仪器及厂家
[0032]
[0033]
[0034] 实施例一
[0035] 本发明提供的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11为革兰氏阳性菌，杆状，内生孢子生成细菌，菌株的最佳生长条件为30-32℃，pH值为7.2，并通过形态学分类法和16S rRNA基因序列分析以及生物学微生物自动分析系统鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。该菌株的16S rRNA序列已提交GenBank数据库，登录号为NJ570759。
[0036] 通过以上鉴定结果，确认菌株DP-11为多粘类芽孢杆菌菌株，将其命名为多粘类芽孢杆菌菌株DP-11(Paenibacillus polymyxa DP-11)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0037] 实施例二
[0038] 利用上述Paenibacillus polymyxa DP-11生产微生物菌剂
[0039] (一)种子发酵液的制备
[0040] 将斜面保存的Paenibacillus polymyxa DP-11菌株接入NA液体培养基中，于30℃、170r/min下振荡培养24h，制成一级种子液。
[0041] 然后以3％体积比的接种量将一级种子液接种至NB培养基中于30℃、170r/min条件下振荡培养3d制作二级种子液。
[0042] 其中，二级种子液中有效活菌的含量测定采用稀释平板法，计算公式如下：
[0043] 活菌含量(cfu/mL)＝每个平板菌落数×稀释倍数稀释/涂布的菌液体积(mL)[0044] 根据公式测得DP-11的二级种子液有效活菌含量均达到108cfu/ml以上才能作为固体发酵的接种剂。
[0045] (二)固体发酵
[0046] 将液体二级种子分别以5％、10％、15％和20％(V/V)的接种量接种于固体发酵培养基中充分混匀，以6cm的厚度平摊于灭菌的浅盘中，置于发酵架上，室温30℃～32℃条件下发酵72h，镜检芽胞形成率，得到DP-11固体发酵物。
[0047] 其中，活性菌株DP-11的固体发酵结果如表2所示。
[0048] 表2结果表明，3个发酵时间的组合试验中，菌株DP-11二级种子液接种量为15％时，其芽胞形成率均显著高于其他接种量的组合，其中，接种量为15％，发酵时间为72h时，芽胞形成率为97.23％，显著高于其他组合，本研究选择接种量15％，发酵时间72h为菌株DP-11的固体发酵条件。
[0049] 表2不同接种量和发酵时间对DP-11固体发酵效果的影响
[0050]
[0051]
[0052] 注：同列数字后不同大写字母表示显著差异(p≤0.05)，其中从A到D代表的差异的显著性依次增加。
[0053] 实施例三
[0054] 利用实施例二得到的微生物菌剂作为活性成分，同时筛选其他载体和表面活性剂，制备可湿性微生物粉体菌剂(即为可湿性菌粉)。
[0055] 分别以白炭黑、高岭土、硅藻土、膨润土、滑石粉为载体填料，以SDS、木质素磺酸钠、吐温60和D425为表面活性剂按照一定的比例与DP-11固体发酵物装入混合搅拌机中，充分混合，测定湿润时间，悬浮率和芽孢含量以及吸附容量。
[0056] 通过测定不同载体填料以及表面活性剂对DP-11固体发酵物的不同影响，筛选出最适宜的载体填料以及最合适的表面活性剂，然后将其按照最佳的配比，将筛选出的载体填料以及表面活性剂同DP-11固体发酵物进行混合，化验，包装，即为可湿性菌粉。
[0057] 其中，参照《中华人民共和国国家标准》对不同的制剂进行测定。润湿时间测定参照GB/T 5451-2001，悬浮率测定参照GB/T 14825-2006，水分测参照GB/T 1600-2001，贮存实验参照GB/T19136-2003的方法进行。采用平板菌落计数法，测定芽孢含量。
[0058] (一)填料的筛选
[0059] 分别选择白炭黑、高岭土、硅藻土、膨润土、滑石粉等5种不同载体做填料，其中白炭黑、高岭土、硅藻土、膨润土、滑石粉与DP-11固体发酵物的重量比均为10％，比较不同填料对可湿性菌粉理化性质的影响。综合考虑不同润湿时间、吸附容量和价格等因素，确定制作可湿性菌粉的最适填料。其中，测定结果见表3。
[0060] (二)表面活性剂的筛选
[0061] 在实施例二得到的固体发酵物中分别添加一定量的SDS、木质素磺酸钠、吐温60和D425等助剂制得不同的制剂。然后测定不同制剂的悬浮率，润湿时间以及芽孢含量。其中，测定结果见表4。
[0062] (三)原粉贮藏稳定性测定
[0063] 称取DP-11可湿性菌粉50g，即DP-11固体发酵物同硅藻土、SDS以及木质素磺酸钠的混合物，其中以重量百分比计算，DP-11的含量为85％，硅藻土的含量为10％、SDS的含量为2％、木质酸磺酸钠的含量为3％，置于(4±2)℃和室温条件下存放，每隔30d测定样品的活菌数量，测定时长360d，明确可湿性菌粉存放360d期间活菌数量的变化。
[0064] 其中测定结果如下所示：
[0065] (1)填料的筛选结果
[0066] 不同的填料对可湿性菌粉的理化性质具有一定的影响。对于固体菌粉，选择吸附容量适宜的填料即可。表3结果表明，白炭黑吸附容量最大且流动性最大，其次为硅藻土，但是DP-11与白炭黑混合在室温下贮藏30d后，可湿性菌粉中活菌数量明显下降，表明白炭黑与菌株DP-11的生物相容性较差，且白炭黑价格偏高，因此本研究选择硅藻土作为填料。
[0067] 表3填料对制剂性能的影响
[0068]
[0069] (2)表面活性剂的筛选结果
[0070] 由于大部分分散剂(表面活性剂)具有一定程度的润湿作用、大部分润湿剂具有一定程度的分散作用，因此本实验对表面活性剂的悬浮作用和润湿作用同时考察。结果如表4所示。以表面活性剂SDS为分散剂，制剂的悬浮率最高，达到84％，但其润湿时间较其他材料长，为21s，以木质素磺酸钠作润湿剂，制剂的湿润性能最优，但其悬浮率较SDS低，二者的芽胞含量明显高于其他试剂，故选择SDS与木质素磺酸钠复配作为本研究的分散剂。
[0071] 表4不同表面活性剂对制剂性能的影响
[0072]表面活性剂 悬浮率(％) 润湿时间(s) 芽胞含量(×109cfu/g)
SDS 84 21 4.85
木质素磺酸钠 76 10 4.36
吐温60 34 17 3.91
D425 74 18 3.14
SDS 84 21 4.85
木质素磺酸钠 76 10 4.36
吐温60 34 17 3.91
D425 74 18 3.14
[0073] (3)DP-11可湿性菌粉贮藏稳定性测定结果
[0074] 表5结果表明，在室温贮藏条件下，DP-11可湿性菌粉中的活菌数量明显低于冷藏条件。在室温环境下贮藏360d后，其活菌数量为原粉的59.6％，而在冷藏条件(4±2)℃下保存360d，其活菌数量为原粉的80.6％，分别下降了40.4％和19.4％。分析其原因可能是由于低温下，菌体以芽胞的形式处于休眠状态，生理代谢缓慢。因此，DP-11可湿性菌粉应在低温条件下保存为宜。
[0075] 表5不同贮藏天数内DP-11可湿性菌粉中活菌数
[0076]
[0077] (4)活性菌株DP-11原粉的芽胞含量测定结果
[0078] 以硅藻土为载体、以SDS与木质素磺酸钠复配为分散剂，分别混入活性菌株DP-11菌粉后，其中以重量计算，DP-11的含量为85％，硅藻土的含量为10％、SDS的含量为2％、木质酸磺酸钠的含量为3％，，经过混合搅拌、干燥后，获得DP-11可湿性菌粉。检测结果表明，DP-11接种剂中活菌含量为200亿-400亿cfu/g。
[0079] 实施例四
[0080] 将实施例三制备的可湿性菌粉(可湿性接种剂)与基础肥料混合，用于验证对于苦瓜枯萎病的防治效果。其中，可湿性菌粉以重量百分比计，包括Paenibacillus polymyxa DP-11 85％，硅藻土10％，SDS 2％以及木质素磺酸钠3％。
[0081] 将可湿性接种剂按照质量比为1：200的比例混入基肥中，穴施或陇施后，施少量水培土固根。其中，基肥为喜满地牌复合肥，其添加量为50公斤/亩。可有效防治苦瓜生长早中期枯萎病的发生。其中，针对不同批次在广西南宁的检测结果见表6-表9。处理组和空白组分别设置三组重复组，其中，空白组不添加可湿性菌粉。表6和表7的结果为采用以上配方处理组和空白组苦瓜枯萎病的发病率的比较结果。
[0082] 为了防止中后期枯萎病的发生，可在苦瓜初花期，将可湿性接种剂按照质量体积比1：200的比例将接种剂溶于液体肥料中沟灌使用。其中，液体肥料采用葛林美公司的“纽翠绿”富碳腐植酸全效液体肥。以对苦瓜枯萎病菌具有拮抗活性，并具有良好促生作用的微生物菌株制成活性菌株孢子含量大于200亿个/克的微生物接种剂可湿性粉剂。表8的结果为采用以上配方得到的处理组和空白组苦瓜枯萎病的发病率的比较结果，表9为通过以上不同批次和不同处理方式(即固体基肥和液体追肥)处理组和空白组苦瓜平均产量的比较结果。
[0083] 注意：在穴施时，穴的深度应该适当，不宜过深，以5～8cm为宜；定植时，尽量减少对定植苗根系的伤害。
[0084] 表6处理组和空白组苦瓜枯萎病的发病率比较(2016.4.27，广西南宁)[0085]
[0086]
[0087] 表7处理组和空白组苦瓜枯萎病的发病率比较(2016.5.9，广西南宁)[0088]
[0089] 表8处理组和空白组苦瓜枯萎病的发病率比较(2016.5.23，广西南宁)[0090]
[0091] 表9处理组和空白组苦瓜平均产量比较(2016.4.27～2016.5.23，广西南宁)[0092]
[0093]
[0094] 从表6-表8的结果可以看出，采用本发明的可湿性菌粉处理的苦瓜，枯萎病的发病率最高降低了18.28％，产量最高增加了17.59％。综上所述，以生防细菌DP-11为活性菌株、硅藻土为载体、SDS与木质素磺酸钠复配为分散剂，采用固体发酵制成活菌含量为200亿cfu/g的可湿性接种剂。该接种剂可显著增强苦瓜对枯萎病的抗病性，提高苦瓜品质，增产效果明显，苦瓜枯萎病的平均防治效果为78.63％，增产效果为11.11％～17.59％。
[0095] 同时，在以上配方的基础上，通过调整微生物菌剂各成分的重量百分比，将硅藻土在微生物菌剂中的质量分数控制在10-12％，将SDS在微生物菌剂中的质量分数控制在1.2-2.4％，将木质素磺酸钠在微生物菌剂中的质量分数控制在2-4％以及将多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DP-11固体发酵物的质量分数控制在84.6-87.8％，可以起到同实施例四相同或相似的技术效果。本发明所提供的菌株以及微生物菌剂可以用于防治作物的枯萎病
[0097]
[0098]
[0099]
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