普鲁兰酶嵌合体以及编码它们的多核苷酸
阅读：597发布：2020-05-08
专利汇可以提供普鲁兰酶嵌合体以及编码它们的多核苷酸专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及具有普鲁兰酶活性的杂合多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。，下面是普鲁兰酶嵌合体以及编码它们的多核苷酸专利的具体信息内容。
1.一种具有普鲁兰酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的成熟多肽；或
(b)SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:11的成熟多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有100％序列一致性。
3.如权利要求1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有100％序列一致性。
4.如权利要求1所述的多肽，该多肽由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的成熟多肽组成。
5.如权利要求1所述的多肽，该多肽由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:11的成熟多肽组成。
6.如权利要求4或5所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:9的氨基酸34至861或SEQ ID NO:11的氨基酸34至861。
7.一种组合物，该组合物包括如权利要求1-6中任一项所述的多肽。
8.根据权利要求7所述的组合物，该组合物包括一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、以及蛋白酶。
9.根据权利要求7和8中任一项所述的组合物，该组合物包括这些酶：普鲁兰酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及蛋白酶；或普鲁兰酶、α-淀粉酶以及蛋白酶；或普鲁兰酶、葡糖淀粉酶以及α-淀粉酶；或普鲁兰酶以及β-淀粉酶。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中该α-淀粉酶选自：i)变体嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，与在SEQ ID NO:13中阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代I181*+G182*+N193F；或ii)与SEQ ID NO:13的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中该α-淀粉酶选自：i)变体嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，与在SEQ ID NO:13中阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；或ii)与SEQ ID NO:13的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。
12.根据权利要求9所述的组合物，其中该α-淀粉酶选自：i)变体嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，与在SEQ ID NO:13中阐述的野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；或ii)与SEQ ID NO:13的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少
93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。
13.根据权利要求9所述的组合物，其中该α-淀粉酶选自：i)具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶变体，与在SEQ ID NO:14中阐述的杂交微小根毛霉α-淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代G128D+D143N；或ii)具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶变体,其与SEQ ID NO:14的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性。
14.根据权利要求9所述的组合物，其中该葡糖淀粉酶选自：i)变体草酸青霉菌葡糖淀粉酶，与在SEQ ID NO:15中阐述的野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代K79V；或ii)与SEQ ID NO:15具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少
93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体草酸青霉菌葡糖淀粉酶。
15.根据权利要求9所述的组合物，其中该葡糖淀粉酶选自：i)变体草酸青霉菌葡糖淀粉酶，与在SEQ ID NO:15中阐述的野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代P2N+P4S+P11F+T65A+K79V+Q327F；或ii)与SEQ ID NO:15具有至少85％、至少
90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体草酸青霉菌葡糖淀粉酶。
16.根据权利要求9所述的组合物，其中该葡糖淀粉酶选自：i)在SEQ ID NO:16中阐述的血红密孔菌葡糖淀粉酶；或ii)与SEQ ID NO:16具有至少85％、至少90％、至少91％、至少
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的血红密孔菌葡糖淀粉酶。
17.根据权利要求9所述的组合物，其中该葡糖淀粉酶选自：i)在SEQ ID NO:17中阐述的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶；或ii)与SEQ ID NO:17具有至少85％、至少90％、至少91％、至少
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶。
18.根据权利要求9所述的组合物，其中该葡糖淀粉酶选自：i)密粘褶菌葡糖淀粉酶变体，与在SEQ ID NO:18中阐述的野生型密粘褶菌葡糖淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代S95P+A121P；或ii)与SEQ ID NO:18具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的密粘褶菌葡糖淀粉酶变体。
19.根据权利要求9所述的组合物，其中该蛋白酶选自：i)在SEQ ID NO:19中阐述的激烈热球菌蛋白酶氨基酸序列；或ii)与SEQ ID NO:19具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的激烈热球菌蛋白酶。
20.根据权利要求9所述的组合物，其中该蛋白酶选自：i)变体橙色嗜热子囊菌蛋白酶，与在SEQ ID NO:20中阐述的野生型橙色嗜热子囊菌蛋白酶氨基酸序列相比，该变体包括取代A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；或与SEQ ID NO:20具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少
98％、至少99％序列一致性的变体橙色嗜热子囊菌蛋白酶。
21.根据权利要求7-8和10-20中任一项所述的组合物，其中该组合物包括普鲁兰酶和葡糖淀粉酶以及任选地α-淀粉酶，并且其中该普鲁兰酶选自与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有100％序列一致性的多肽，并且该葡糖淀粉酶选自i)密粘褶菌葡糖淀粉酶变体，与在SEQ ID NO:18中阐述的野生型密粘褶菌葡糖淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代S95P+A121P；或ii)与SEQ ID NO:18具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体，并且该α-淀粉酶选自：i)具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶变体，与在SEQ ID NO:14中阐述的杂交微小根毛霉α-淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代G128D+D143N；或ii)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体。
22.根据权利要求9所述的组合物，其中该组合物包括普鲁兰酶和葡糖淀粉酶以及任选地α-淀粉酶，并且其中该普鲁兰酶选自与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有100％序列一致性的多肽，并且该葡糖淀粉酶选自i)密粘褶菌葡糖淀粉酶变体，与在SEQ ID NO:18中阐述的野生型密粘褶菌葡糖淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代S95P+A121P；或ii)与SEQ ID NO:18具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体，并且该α-淀粉酶选自：i)具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶变体，与在SEQ ID NO:
14中阐述的杂交微小根毛霉α-淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代G128D+D143N；或ii)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少
94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体。
23.根据权利要求1-6中任一项所述的多肽用于由含淀粉材料生产糖浆和/或发酵产物的用途。
24.根据权利要求23所述的用途，其中该淀粉材料是经糊化或未经糊化的淀粉材料。
25.一种由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；
(b)在葡糖淀粉酶存在下使液化材料糖化，并且
(c)用发酵生物进行发酵；
其中在如权利要求1-6中任一项所述的多肽的存在下进行步骤(a)和/或步骤(b)。
26.一种由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；并且(b)用发酵生物进行发酵，
其中使用至少葡糖淀粉酶和如权利要求1-6中任一项所述的多肽进行步骤(a)。
27.根据权利要求26所述的方法，其中在步骤(a)中添加α-淀粉酶。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中同时进行糖化和发酵。
29.一种由含淀粉材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；(b)在葡糖淀粉酶存在下使液化材料糖化，其中在步骤(b)的过程中存在如权利要求1-6中任一项所述的多肽。
30.根据权利要求25-27和29中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料选自：西米、豆类、树薯、谷类、马铃薯、甘薯、木薯、以及全谷粒、或其任何混合物。
31.根据权利要求28所述的方法，其中该含淀粉材料选自：西米、豆类、树薯、谷类、马铃薯、甘薯、木薯、以及全谷粒、或其任何混合物。
32.根据权利要求30中所述的方法，其中豆类是豌豆，和/或谷类选自玉米，买罗高粱，稻，黑麦，大麦，高粱和小麦。
33.根据权利要求31中所述的方法，其中豆类是豌豆，和/或谷类选自玉米，买罗高粱，稻，黑麦，大麦，高粱和小麦。
34.根据权利要求25-27和29中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料是玉米。
35.根据权利要求28所述的方法，其中该含淀粉材料是玉米。
36.根据权利要求25-27和29中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料是小麦。
37.根据权利要求28所述的方法，其中该含淀粉材料是小麦。
38.根据权利要求25-27和29中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料是大麦。
39.根据权利要求28所述的方法，其中该含淀粉材料是大麦。
40.根据权利要求25-27和29中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料是稻。
41.根据权利要求28所述的方法，其中该含淀粉材料是稻。
42.一种编码如权利要求1-6中任一项所述的多肽的多核苷酸。
43.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求42所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽在表达宿主内产生的一个或多个控制序列。
44.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求42所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列。
45.一种产生如权利要求1-6中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求44所述的宿主细胞。
46.如权利要求45所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。
47.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，包括如权利要求1-6中任一项所述的多肽。
普鲁兰酶嵌合体以及编码它们的多核苷酸
[0002] 本申请含有计算机可读形式的序列表，将该序列表通过引用结合在此。
[0003] 发明背景发明领域
[0004] 本发明涉及普鲁兰酶嵌合体、编码这些普鲁兰酶嵌合体的多核苷酸、产生这些嵌合体的方法以及使用这些嵌合体的方法。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞并且涉及包括这些普鲁兰酶的组合物。
[0005] 相关技术描述
[0006] 淀粉通常由约80％支链淀粉和20％直链淀粉组成。支链淀粉是分支多糖，其中直链α-1,4D-葡萄糖残基由α-1,6糖苷键连接。支链淀粉被α-淀粉酶部分地降解，水解1,4-α-糖苷键以产生支链和直链低聚糖。支链淀粉被α-淀粉酶的延长降解导致所谓的α-极限糊精的形成，α-极限糊精不易被α-淀粉酶进一步水解。支链低聚糖可以被去分支酶水解为直链低聚糖。剩余的支链低聚糖可以被葡糖淀粉酶解聚为D-葡萄糖，将直链低聚糖水解为D-葡萄糖。
[0007] 可攻击支链淀粉的去分支酶被分成两类：分别是异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)和普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1,6-D-支链糖苷键，并可通过异淀粉酶不能攻击支链淀粉的特性以及通过它们对于α-极限糊精的有限作用而与普鲁兰酶相区别。
[0008] 本领域众所周知在淀粉转化过程中添加异淀粉酶或普鲁兰酶。普鲁兰酶是具有支链淀粉6-葡聚糖-水解酶活性(EC 3.2.1.41)的淀粉去分支酶，该酶催化支链淀粉中α-1,6-糖苷键的水解，从而释放具有还原碳水化合物端的麦芽三糖。通常，普鲁兰酶与α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶组合使用。
[0009] 普鲁兰酶在本领域中是已知的。US 6,074,854和US 5,817,498披露了来自脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)的普鲁兰酶。WO 2009/075682披露了衍生自嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullolyticus)的普鲁兰酶。
[0010] 本发明提供了与亲本普鲁兰酶相比，具有普鲁兰酶活性并且显示出改善的热活性和/或热稳定性的多肽(普鲁兰酶嵌合体)。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明涉及选自下组的具有普鲁兰酶活性的多肽，该组由以下各项组成：
[0013] (a)与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％序列一致性的多肽或与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少93％序列一致性的多肽；
[0014] (b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列具有至少85％一致性或由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:12的成熟多肽编码序列具有至少93％一致性；
[0015] (c)(a)或(b)的多肽的具有普鲁兰酶活性的片段。
[0016] 特别地，与亲本普鲁兰酶相比，根据本发明的普鲁兰酶具有改善的热活性和/或热稳定性。
[0017] 在第二方面，本发明涉及包含本发明的多肽的组合物。
[0018] 本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体；重组表达载体；重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。
[0020] 在又一个方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物的方法，包括以下步骤：
[0021] (a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；
[0022] (b)在葡糖淀粉酶存在下使液化材料糖化；并且
[0023] (c)用发酵生物进行发酵；
[0024] 其中在本发明的多肽的存在下进行步骤(a)和/或步骤(b)。
[0025] 在另一个方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
[0026] (a)在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；并且[0027] (b)用发酵生物进行发酵，
[0028] 其中使用至少葡糖淀粉酶和本发明的多肽进行步骤(a)。
[0029] 在又一个方面，本发明涉及由含淀粉材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；(b)在葡糖淀粉酶存在下使液化材料糖化，其中在步骤(b)的过程中存在如权利要求1-3中任一项所述的普鲁兰酶。
[0030] 定义
[0031] 普鲁兰酶：术语“普鲁兰酶”意指是具有支链淀粉6-葡聚糖-水解酶活性(EC 3.2.1.41)的淀粉去分支酶，该酶催化支链淀粉中α-1,6-糖苷键的水解，从而释放具有还原碳水化合物端的麦芽三糖。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序确定普鲁兰酶活性。在一个方面中，当在最适温度下测试时，本发明的多肽具有至少60％、至少70％、至少
80％、至少90％、至少95％或至少100％的SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的成熟多肽的普鲁兰酶活性。
80％、至少90％、至少95％或至少100％的SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的成熟多肽的普鲁兰酶活性。
[0032] 等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0033] 结合结构域：术语“碳水化合物结合结构域”意思指酶的介导该酶与碳水化合物底物的结合的区域。
[0034] 催化结构域：术语“催化结构域”意指酶的含有该酶的催化机构的区域。在一个实施例中，催化结构域包括SEQ ID NO:1的氨基酸363至862或由其组成。在另一个实施例中，催化结构域包括SEQ ID NO:3的氨基酸323至821或由其组成。在另一个实施例中，催化结构域包括SEQ ID NO:9的氨基酸363至861或由其组成。在另一个实施例中，催化结构域包括SEQ ID NO:11的氨基酸330至828或由其组成。
[0035] cDNA：术语“cDNA”意指可以通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
[0036] 嵌合体：术语“嵌合体”意指包括氨基酸或来自不同亲本普鲁兰酶的亚基的混合物的普鲁兰酶多肽。在一个实施例中，嵌合体是起源于两种亲本普鲁兰酶的两个片段之间的融合物。嵌合体相当于杂合体。在一个实施例中，嵌合体或杂合体可以例如是融合到具有SEQ ID NO:3的普鲁兰酶的C-末端片段的具有SEQ ID NO:1的普鲁兰酶的N-末端片段。融合物可以是起源于两种亲本普鲁兰酶的两个片段之间的简单融合物，然而，在一些实施例中，融合物可以在两种亲本片段之间的界面中产生经改组的氨基酸序列。融合应当优选在这些亲本普鲁兰酶之间的同源性区域中进行。同源区应当至少为4个氨基酸。
[0037] 编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0038] 控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
[0039] 表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0040] 表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
[0041] 片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽或催化结构域；其中该片段具有普鲁兰酶活性。在一个实施例中，片段包含至少499个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:9的氨基酸363至861)。在另一个实施例中，片段包含至少499个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:11的氨基酸330至828)。
[0042] 高严格条件：术语“高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5×SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精子DNA以及50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
[0043] 宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
[0044] 改进的特性：术语“改善的特性”意指与杂合体相关的与亲本相比得到改善的特征。此类改进的特性包括但不限于pH稳定性、热活性、和热稳定性。在具体实施例中，改进的特性是热活性。在另一个具体实施例中，改进的特性是热稳定性。在一个实施例中，本发明的杂合普鲁兰酶具有这两种改进的特性。
[0045] 改进的热活性：通过在67℃/55℃下使用里氏测定(Lintner assay)测量活性比或者通过在选自50℃至80℃的范围的设定温度下，在pH 5.0下使用PAHBAH测定来测量普鲁兰酶活性并且确定最适温度，如实例中所述测量热活性。根据本发明的改进的热活性意指杂合酶具有高于亲本酶的最适温度或在67℃下相比于在55℃下对于杂合酶的相对活性高于对于任一亲本酶。
[0046] 改进的热稳定性：通过如实例6所述在5.0或4.3(TSA，热转移测定)下测量熔融温度Tm，如实例中所述测量热稳定性。根据本发明的改进的热稳定性意指相比于亲本普鲁兰酶，杂合普鲁兰酶具有更高的熔融温度Tm。
[0047] 异淀粉酶：术语“异淀粉酶”意指淀粉去分支酶活性(E.C.3.2.1.68)，该活性水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1,6-D-支链糖苷键，并可通过异淀粉酶不能攻击支链淀粉，及通过对于α-极限糊精的有限作用与支链淀粉酶相区别。异淀粉酶可以按本领域的技术人员熟知的有效量添加。异淀粉酶可以单独添加或连同普鲁兰酶一起添加。
[0048] 分离的：术语“分离的”意指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括：(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其天然相关联的一种或多种或所有天然存在的成分中去除的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于在自然界中发现的那种物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量(例如，宿主细胞中的重组体产量；编码该物质的基因的多个拷贝；以及比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)而修饰的任何物质。
[0049] 低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
[0050] 成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面中，基于预测SEQ ID NO:9的氨基酸1至33是信号肽的SignaIP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)，成熟多肽是SEQ ID NO:9的氨基酸34至861。在另一个实施例中，基于预测SEQ ID NO:11的氨基酸1至33是信号肽的SignaIP(尼尔森等人，1997，蛋白质工程10:1-6)，成熟多肽是SEQ ID NO:11的氨基酸34至861。本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
[0051] 成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有普鲁兰酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面中，基于预测SEQ ID NO:10的核苷酸1至99编码信号肽的Signal P程序(Nielsen(尼尔森)等人，1997，同上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:10的核苷酸100至2586。在另一个方面中，基于预测SEQ ID NO:12的核苷酸1至99编码信号肽的Signal P程序(Nielsen(尼尔森)等人，1997，同上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:12的核苷酸100至2586。
[0052] 中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
[0053] 中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
[0054] 核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包括一个或多个控制序列。
[0055] 可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下配置，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列放置在适当位置处，以使得控制序列指导编码序列的表达。
[0056] 亲本或亲本普鲁兰酶：术语“亲本”或“亲本普鲁兰酶”意指如下普鲁兰酶，对该普鲁兰酶进行改变以产生本发明的酶杂合体(嵌合体)。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
[0057] 序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。
[0058] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
[0059] (一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
[0060] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
[0061] (一致的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
[0062] 子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5’端和/或3’端缺少的多核苷酸，其中该子序列编码具有普鲁兰酶活性的片段。在一个方面，子序列包含至少编码根据本发明所述的片段的多核苷酸。
[0063] 变体：术语“变体”意指具有普鲁兰酶活性的、在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸替代；缺失意指占据一个位置的氨基酸的去除；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
[0064] 非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精子DNA以及50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
[0065] 非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
[0066] 发明详述
[0067] 具有普鲁兰酶活性的杂合多肽
[0068] 诸位发明人已经发现，起始自两种或更多种亲本普鲁兰酶，通过制备杂合普鲁兰酶可获得具有更高的热活性和/或更高的热稳定性的改进的普鲁兰酶。在一个实施例中，一种亲本普鲁兰酶是披露为SEQ ID NO:1的那一种。SEQ ID NO:1衍生自描述于EP 0063909A1中的、作为普鲁兰酶生产者的嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)NCIMB 11639。SEQ ID NO:1的序列可以在WO 2009/075682中作为SEQ ID NO:4发现。另一种亲本普鲁兰酶是披露于SEQ ID NO:3中的那一种。具有SEQ ID NO:3的普鲁兰酶衍生自从在丹麦收集的腐植质样品中分离的脱支芽孢杆菌菌株。
[0069] 具体而言，通过结合融合到具有SEQ ID NO:3的普鲁兰酶的C-末端片段的具有SEQ ID NO:1的普鲁兰酶的N-末端片段获得根据本发明的杂合普鲁兰酶。根据本发明，杂合普鲁兰酶中至少一部分催化结构域应当衍生自包含于SEQ ID NO:3的催化结构域。融合物可以是起源于两种亲本普鲁兰酶的两个片段之间的简单融合物，然而，在一些实施例中，融合物可以在两种亲本片段之间的界面中产生经改组的氨基酸序列。融合应当优选在这些亲本普鲁兰酶之间的同源性区域中进行。同源区应当至少为4个氨基酸。
[0070] 在实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少
93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:9的成熟多肽至少60％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:9的成熟多肽至少70％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或
100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:9的成熟多肽至少80％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少
99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:9的成熟多肽至少90％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少
98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:9的成熟多肽至少
95％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少
85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:9的成熟多肽至少100％的普鲁兰酶活性。
93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:9的成熟多肽至少60％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:9的成熟多肽至少70％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或
100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:9的成熟多肽至少80％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少
99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:9的成熟多肽至少90％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少
98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:9的成熟多肽至少
95％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少
85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:9的成熟多肽至少100％的普鲁兰酶活性。
[0071] 在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:9的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。
[0072] 在实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有普鲁兰酶活性的片段。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:9的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:9的氨基酸34至861或由其组成。
[0073] 在实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:11的成熟多肽至少60％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:11的成熟多肽至少70％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:
11的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少
99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:11的成熟多肽至少80％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:11的成熟多肽至少90％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:11的成熟多肽至少95％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或
100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:11的成熟多肽至少100％的普鲁兰酶活性。
96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:11的成熟多肽至少70％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:
11的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少
99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:11的成熟多肽至少80％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:11的成熟多肽至少90％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:11的成熟多肽至少95％的普鲁兰酶活性。在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或
100％的序列一致性的多肽，这些多肽具有SEQ ID NO:11的成熟多肽至少100％的普鲁兰酶活性。
[0074] 在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:11的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。
[0075] 在实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有普鲁兰酶活性的片段。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:11的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:11的氨基酸34至861或由其组成。
[0076] 在另一个实施例中，本发明涉及具有普鲁兰酶活性的多肽，该多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸在中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下，与(i)SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。在实施例中，该多肽已经被分离。
[0077] 在另一个实施例中，本发明涉及具有普鲁兰酶活性的多肽，该多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸在中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下，与(i)SEQ ID NO:12的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。在实施例中，该多肽已经被分离。
[0078] 可以使用SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的多肽或其片段来设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆对来自不同属或种的菌株的具有普鲁兰酶活性的多肽进行编码的DNA。具体而言，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少
25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。
典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。
本发明涵盖此类探针。
25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。
典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。
本发明涵盖此类探针。
[0079] 可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有普鲁兰酶活性的多肽的DNA对由这类其他株系制备的基因组DNA或cDNA库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。
[0080] 出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在非常低到非常高严格条件下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQ ID NO:10；(ii)SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互互补体；或(iv)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。
[0081] 出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在非常低到非常高严格条件下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQ ID NO:12；(ii)SEQ ID NO:12的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互互补体；或(iv)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。
[0082] 在另一个实施例中，本发明涉及具有普鲁兰酶活性的多肽，该多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
[0083] 在另一个实施例中，本发明涉及具有普鲁兰酶活性的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:12的成熟多肽编码序列具有至少93％，至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
[0084] 在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:9的成熟多肽的变体。在实施例中，引入SEQ ID NO:9的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:11的成熟多肽的变体。在实施例中，引入SEQ ID NO:11的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0085] 这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。
[0086] 保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(H.Neurath)和R.L.希尔(R.L.Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术出版社，纽约中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
[0087] 可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
[0088] 可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的普鲁兰酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基酸。在此披露为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的亲本普鲁兰酶包括若干必需氨基酸，如果包括在片段中组合形成杂合体，这些必需氨基酸应当保持在根据本发明的杂合普鲁兰酶中。SEQ ID NO:1中的必需氨基酸包括D553、E582以及D667。SEQ ID NO:3中的必需氨基酸包括D513、E542以及D627。
[0089] 可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5，223，409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
[0090] 可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
[0091] 杂合普鲁兰酶多肽可融合在另一多肽的区域的N-末端或C-末端。
[0092] 该杂合普鲁兰酶多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
[0093] 融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括裂解位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被裂解，从而释放出这两个多肽。裂解位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-
381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(Drug Discovery World)4:35-48。
381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(Drug Discovery World)4:35-48。
[0094] 亲本酶
[0095] 在一个方面中，该亲本是描述于EP 0063909A1中的嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌NCIMB 11639，例如具有SEQ ID NO:1的普鲁兰酶或其成熟多肽。
[0096] 在另一个方面中，该亲本是脱支芽孢杆菌，例如具有SEQ ID NO:3的普鲁兰酶或其成熟多肽。
[0097] 将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
[0098] 这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
[0099] 可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，见上文)。
[0100] 催化结构域
[0101] 在一个实施例中，本披露还涉及与SEQ ID NO:9的氨基酸363至828具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的催化结构域。在一个方面中，这些催化结构域包括的氨基酸序列与SEQ ID NO:9的氨基酸363至828具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
[0102] 该催化结构域优选地包括SEQ ID NO:9的氨基酸363到828或其等位基因变体或由其组成；或为其具有普鲁兰酶活性的片段。
[0103] 在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:11的氨基酸363至828具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的催化结构域。在一个方面中，这些催化结构域包括的氨基酸序列与SEQ ID NO:11的氨基酸363至828具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
[0104] 该催化结构域优选地包括SEQ ID NO:11的氨基酸363到828或其等位基因变体或由其组成；或为其具有普鲁兰酶活性的片段。
[0105] 在另一个实施例中，本披露还涉及在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下(如上所定义)与(i)SEQ ID NO:10的核苷酸或(ii)(i)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的催化结构域(萨拉布鲁克等人，1989，同上)。
[0106] 在另一个实施例中，本披露还涉及由与SEQ ID NO:10的核苷酸1087到2484具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸所编码的催化结构域。
[0107] 编码该催化结构域的多核苷酸优选地包括SEQ ID NO:10的核苷酸1087至2484或由其组成。
[0108] 在另一个实施例中，本披露还涉及SEQ ID NO:10的氨基酸1087至2484的催化结构域变体，这些变体在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入。在一个方面中，引入SEQ ID NO:10的氨基酸1087至2484的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。
[0109] 在另一个实施例中，本发明还涉及由在非常高严格条件(如以上所定义)下与(i)SEQ ID NO:12的核苷酸1087到2484、或(ii)(i)的全长补体杂交的多核苷酸所编码的催化结构域(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上文)。
[0110] 在另一个实施例中，本方面还涉及由与SEQ ID NO:12的核苷酸1087到2484具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸所编码的催化结构域。
[0111] 编码该催化结构域的多核苷酸优选地包括SEQ ID NO:12的核苷酸1087至2484或由其组成。
[0112] 在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:12的氨基酸1087至2484的催化结构域变体，这些变体在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入。在一个方面中，引入SEQ ID NO:12的氨基酸1087至2484的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。
[0113] 多核苷酸
[0114] 本发明还涉及编码本发明的杂合多肽或杂合催化结构域的多核苷酸，如在此所述。在实施例中，编码本发明的杂合多肽或杂合催化结构域的多核苷酸已经被分离。
[0115] 用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA，或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods and Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。
[0116] 编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“实质上类似”于该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最优pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预期用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。
[0117] 核酸构建体
[0118] 本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
[0119] 该多核苷酸可以按各种方式操纵以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
[0120] 该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
[0121] 用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
[0122] 用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子，以及NA2-tpi启动子(修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。其他启动子描述于美国专利号6,011,147中。
[0123] 在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
[0124] 控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
[0125] 用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
[0126] 用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
[0127] 用于酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文描述。
[0128] 该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加该基因的表达。
[0129] 适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。
[0130] 该控制序列还可以是前导子，对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导子。
[0131] 用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
[0132] 适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
[0133] 控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
[0134] 用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
[0135] 对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。
[0136] 控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可以包括对于该编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
[0137] 用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
[0138] 用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0139] 对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯(Romanos)等人，1992，描述了其他有用的信号肽编码序列。
[0140] 该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化裂解或自动催化裂解前肽而被转化成活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
[0141] 在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
[0142] 还可能希望地是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
[0143] 表达载体
[0144] 本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
[0145] 重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。
[0146] 载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
[0147] 该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
[0148] 细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
[0149] 选择性标记可以是在WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面中，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
[0150] 载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
[0151] 对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10，000个碱基对、400至10，000个碱基对、以及800至10，000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一个方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
[0152] 对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”是指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。
[0153] 细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
[0154] 用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。
[0155] 在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:
9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO
00/24883披露的方法完成。
9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO
00/24883披露的方法完成。
[0156] 可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
[0157] 用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
[0158] 宿主细胞
[0159] 本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
[0160] 该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
[0161] 原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。
[0162] 细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
[0163] 细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
[0164] 细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
[0165] 将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，
2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满
(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)
65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满
(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)
65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
[0167] 宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。
[0168] 该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所描述来定义。
[0169] 酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
[0170] 真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、右旋糖酐、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
[0171] 丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。
[0172] 例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌 、女王杜香金 孢子菌
(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、太瑞斯梭孢壳霉、长绒毛栓菌、韩国白腐菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、太瑞斯梭孢壳霉、长绒毛栓菌、韩国白腐菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
[0173] 可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于EP 238023、约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:
147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。
147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。
[0174] 产生方法
[0175] 本发明还涉及产生本发明的杂合多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该杂合多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并且可任选地(b)回收该多肽。
[0176] 这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
[0177] 可以使用本领域已知的对于该杂合普鲁兰酶多肽是特异性的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
[0179] 可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：层析法(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、以及尺寸排阻层析)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
[0180] 在替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。
[0181] 发酵液配制品或细胞组合物
[0182] 本发明还涉及包括本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包括在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
[0183] 如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞进行酶的表达)并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
[0184] 在实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物。
[0185] 在一个方面中，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
[0187] 该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
[0188] 在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶组分，例如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
[0189] 可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。
[0190] 酶组合物
[0191] 本发明还涉及包括本发明的多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这种多肽。术语“富含”指示该组合物的普鲁兰酶活性已经增加，例如，富集因子为至少1.1。
[0192] 这些组合物可以包括本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包括多种酶活性，如根据本发明的杂合普鲁兰酶以及一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。优选地，包括于组合物中的这些酶活性选自如根据本发明的杂合普鲁兰酶以及一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、以及蛋白酶。在一个具体实施例中，该组合物包括普鲁兰酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及蛋白酶。在另一个具体实施例中，该组合物包括普鲁兰酶、α-淀粉酶以及蛋白酶。在另一个具体实施例中，该组合物包括普鲁兰酶、葡糖淀粉酶以及α-淀粉酶。在另一个具体实施例中，该组合物包括普鲁兰酶、以及β-淀粉酶。
[0193] 在具体实施例中，该组合物包括本发明的杂合普鲁兰酶以及α-淀粉酶。优选地是细菌α-淀粉酶，其在液化过程中使用的温度下典型地是稳定的。在优选的实施例中，该α-淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是成熟野生型或其成熟变体。该成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是在重组产生过程中天然地截短的。例如，与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3相比较，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是截短的，因此其具有约491个氨基酸。优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与披露于WO 99/19467中的SEQ ID NO:3以及在此的SEQ ID NO:13阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于位置181和182的缺失的双缺失并且进一步包括N193F取代(也被表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体中的S239的位置处具有取代。在优选的实施例中，该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：
[0194] I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
[0195] I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
[0196] I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
[0197] I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3进行编号)。
[0198] 在另一个优选的实施例中，该α-淀粉酶是衍生自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉的α-淀粉酶，优选WO2013/006756中SEQ ID NO:7以及在此的SEQ ID NO:14中所示的α-淀粉酶，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，特别是G128D+D143N。
[0199] 在另一个具体实施例中，该组合物包括本发明的杂合普鲁兰酶以及蛋白酶。在优选的实施例中，该蛋白酶是在WO 2003/048353中披露为SEQ ID NO:2的橙色嗜热子囊菌金属蛋白酶的变体，或具有WO 2011/072191中SEQ ID NO:2以及在此的SEQ ID NO:20的氨基酸1-177，具有以下突变：
[0200] D79L+S87P+A112P+D142L；
[0201] D79L+S87P+D142L；或
[0202] A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
[0203] 在另一个实施例中，该蛋白酶来源于热球菌属的细菌菌株，例如激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株(pfu蛋白酶)。
[0204] 在实施例中，该蛋白酶是在美国专利号6,358,726-B1中示为SEQ ID NO:1的蛋白酶。在另一个实施例中，该蛋白酶是在WO 2012/088303中示为SEQ ID NO:13以及在此的SEQ ID NO:19的蛋白酶。
[0205] 在另一个具体实施例中，该组合物包括本发明的杂合普鲁兰酶以及葡糖淀粉酶。在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自青霉属的菌株，尤其是草酸青霉菌菌株，特别是在WO
2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。在优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，该变体具有使用成熟多肽(SEQ ID NO:2的氨基酸22-616，以及在此的SEQ ID NO:15)进行编号的K79V取代，并且描述于WO 2013/036526中。在优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是在WO
2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的氨基酸22-616，以及在此的SEQ ID NO:15的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，该变体具有K79V取代以及以下取代中的一个或多个：P2N、P4S、P11F、T65A、Q327F，特别是在WO2013/053801中描述的P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F。
2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。在优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，该变体具有使用成熟多肽(SEQ ID NO:2的氨基酸22-616，以及在此的SEQ ID NO:15)进行编号的K79V取代，并且描述于WO 2013/036526中。在优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是在WO
2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的氨基酸22-616，以及在此的SEQ ID NO:15的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，该变体具有K79V取代以及以下取代中的一个或多个：P2N、P4S、P11F、T65A、Q327F，特别是在WO2013/053801中描述的P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F。
[0206] 在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自密孔菌属(Pycnoporus)的菌株，尤其是血红密孔菌菌株，特别是在WO 2011/066576中披露为SEQ ID NO:2、4或6的血红密孔菌葡糖淀粉酶。在优选的实施例中，该酶组合物包括如WO2011/066576中SEQ ID NO:6的氨基酸19-573以及在此的SEQ ID NO:16所示的葡糖淀粉酶。
[0207] 在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自粘褶菌属(Gloeophillum)的菌株，尤其是密粘褶菌菌株，特别是在WO 2011/068803中披露为SEQ ID NO:18的密粘褶菌葡糖淀粉酶。在尤其优选的实施例中，该酶组合物包括在WO2011/068803中SEQ ID NO:18的氨基酸18-576以及在此的SEQ ID NO:18所示的密粘褶菌葡糖淀粉酶，并且具有以下取代中的一个或多个：S95P、A121P，尤其是S95P+A121P，使用成熟多肽(SEQ ID NO:18的第18-576位)进行编号。
[0208] 在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自粘褶菌属的菌株，尤其是篱边粘褶菌菌株，特别是在WO 2011/068803中披露为SEQ ID NO:2的氨基酸18-573以及在此的SEQ ID NO:17的成熟的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶。
[0209] 在具体实施例中，该组合物包括普鲁兰酶和葡糖淀粉酶以及任选地α-淀粉酶，并且其中该普鲁兰酶选自与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽，并且该葡糖淀粉酶选自i)密粘褶菌葡糖淀粉酶变体，相比于WO 2011/068803中SEQ ID NO:18的氨基酸18-576以及在此的SEQ ID NO:18中阐述的野生型密粘褶菌葡糖淀粉酶氨基酸序列，该变体包括取代S95P+A121P；或ii)与WO 2011/068803中SEQ ID NO:18的氨基酸18-576以及在此的SEQ ID NO:18具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体，并且该α-淀粉酶选自i)具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶变体，相比于WO 2013/
006756中SEQ ID NO:7以及在此的SEQ ID NO:14中阐述的杂交微小根毛霉α-淀粉酶氨基酸序列，该变体包括取代G128D+D143N；或ii)与WO 2013/006756中SEQ ID NO:7以及在此的SEQ ID NO:14的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体。
006756中SEQ ID NO:7以及在此的SEQ ID NO:14中阐述的杂交微小根毛霉α-淀粉酶氨基酸序列，该变体包括取代G128D+D143N；或ii)与WO 2013/006756中SEQ ID NO:7以及在此的SEQ ID NO:14的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体。
[0210] 这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。可以根据本领域已知的方法将变体稳定化。
[0211] 这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。
[0212] 本发明的酶组合物可以处于任何适于使用的形式，例如像除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物、或作为酶的来源的宿主细胞(例如，木霉属宿主细胞)。
[0213] 该酶组合物可以是干粉或颗粒、非尘颗粒、液体、稳定化的液体或稳定化的受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶组合物进行稳定化。
[0214] 以下给出了本发明的普鲁兰酶和组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。
[0215] 使用杂合普鲁兰酶的方法-工业应用
[0217] 杂合普鲁兰酶可用于淀粉过程，尤其是淀粉转化、特别是淀粉液化(参见例如，美国专利号3,912,590、EP 252730以及EP 063909、WO 99/19467以及WO 96/28567，这些专利全部通过引用结合在此)。还考虑的是用于淀粉转化目的的组合物，其除本发明杂合普鲁兰酶之外，还可包含葡糖淀粉酶(AMG)和α-淀粉酶。
[0220] 在一个实施例中，本发明涉及根据本发明的多肽用于由含淀粉材料生产糖浆和/或发酵产物的用途。在一个实施例中，该淀粉材料可以是经糊化的。在另一个实施例中，该淀粉材料是未经糊化的。
[0221] 淀粉加工
[0222] 天然淀粉由室温下不溶于水的微观颗粒组成。加热水性淀粉浆料时，颗粒膨胀并且最后破裂，将淀粉分子分散至溶液中。在高达约50℃至75℃的温度下，膨胀可以是可逆的。然而，在更高温度下，开始不可逆膨胀，称为“糊化”。在此“糊化(gelatinization)”过程中，粘度有显著地增加。有待加工的颗粒状淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，优选地至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯，或它可以为含更粗糙的淀粉的材料，这些材料包括(例如，经碾磨的)全谷物，全谷物包含非淀粉部分，如胚芽残留物和纤维。该原材料(如全谷物)可以例如经过碾磨减少粒度，以便展开结构并且允许进一步加工。在干式碾磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所。干式和湿式碾磨两者是本领域中众所周知的淀粉加工法并且可以用于本发明的方法中。用于减少该含淀粉材料的粒度的方法为本领域的普通技术人员所已知。
[0223] 由于典型工业过程中的固体水平为30％-40％，因此不得不稀释或“液化”淀粉以使其能够被适当加工。在当前商业做法中，粘度的这种降低主要通过酶法降解来实现。
[0224] 在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶的存在下进行液化。在实施例中，在液化过程中还存在植酸酶。在实施例中，在液化期间，还存在降粘酶例如木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。
[0225] 在液化过程中，α-淀粉酶将长链淀粉降解为支链以及线性的较短单元(麦芽糊精)。液化可以作为一个三步热浆料方法进行。将浆料加热至60℃-95℃之间(例如70℃-90℃，例如77℃-86℃、80℃-85℃、83℃-85℃)并且添加α-淀粉酶以开始液化(稀释)。
[0226] 在实施例中，可以将浆料在95℃-140℃(例如，105℃-125℃)之间喷射蒸煮约1-15分钟，例如约3-10分钟，尤其是5分钟左右。然后，将浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多的α-淀粉酶，以获得最终水解(二次液化)。在pH 4.5-6.5下，典型地在5与6之间的pH下进行喷射蒸煮过程。可以例如在喷射蒸煮之前，将α-淀粉酶以单一剂量添加。
[0227] 在70℃-95℃之间，例如80℃-90℃，例如85℃左右，将液化过程进行约10分钟至5小时，典型地是1-2小时。pH在4与7之间，例如在5.5与6.2之间。为了确保这些条件下最佳的酶稳定性，可以任选地添加钙(以提供1-60ppm游离钙离子，例如约40ppm游离钙离子)。如此处理之后，液化淀粉将典型地具有10-15的“右旋糖当量”(DE)。
[0228] 通常，液化和液化条件在本领域是熟知的。
[0229] 在下面的“α-淀粉酶”部分中披露了α-淀粉酶的实例。
[0230] 可以使用本领域熟知的条件，用产碳水化合物源的酶，具体是葡糖淀粉酶或β-淀粉酶以及任选地去分支酶(例如异淀粉酶或支链淀粉酶)进行糖化。例如，全部糖化步骤可以持续从约24至约72小时。然而，常见地在30℃-65℃之间的温度(典型地约60℃)下进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在一个同时糖化和发酵过程(SSF)中，在发酵期间进行完全糖化。典型地在20℃-75℃的范围内的温度(例如，25℃-65℃和40℃-70℃，典型地60℃左右)下，并且在约4与5之间的pH下，一般在约pH 4.5下进行糖化。
[0231] 糖化步骤和发酵步骤可以依序或同时进行。在实施例中，糖化和发酵是同时进行的(称为“SSF”)。然而，通常，在30℃至65℃、典型地约60℃的温度下执行一个预糖化步骤约30分钟至2小时(例如，30至90分钟)，随后在被称为同时糖化和发酵(SSF)的发酵期间进行一个完全糖化。pH通常在4.2-4.8之间，例如，pH 4.5。在一个同时糖化和发酵(SSF)过程中，没有糖化的保持阶段，而实际上是，酵母和酶一起添加。
[0232] 在典型糖化过程中，通过添加葡糖淀粉酶以及去分支酶，如异淀粉酶(美国专利号4,335,208)或普鲁兰酶，来将液化期间产生的麦芽糊精转化成右旋糖。添加葡糖淀粉酶以及去分支酶之前使温度降低至60℃。糖化过程进行24-72小时。在添加糖化酶之前，使pH降低至低于4.5，同时维持高温(高于95℃)，以便使液化α-淀粉酶失活。此过程减少了称为“潘糖前体”的短低聚糖的形成，这种短低聚糖不能通过去分支酶来适当水解。正常地，约
0.2％-0.5％的糖化产物是分支三糖潘糖(Glc pα1-6Glc pα1-4Glc)，它不能由普鲁兰酶降解。如果糖化过程中仍然存在得自液化步骤的活性淀粉酶(即未变性)，潘糖的量可以高至
1％-2％，这是高度不希望的，因为它显著降低了糖化产率。
0.2％-0.5％的糖化产物是分支三糖潘糖(Glc pα1-6Glc pα1-4Glc)，它不能由普鲁兰酶降解。如果糖化过程中仍然存在得自液化步骤的活性淀粉酶(即未变性)，潘糖的量可以高至
1％-2％，这是高度不希望的，因为它显著降低了糖化产率。
[0233] 其他发酵产物可以在本领域的普通技术人员熟知的、适于所讨论的发酵生物的条件和温度下发酵。
[0234] 可以通过本领域熟知的方法(例如，通过蒸馏)回收发酵产物。在下面的“酶”部分中披露了产碳水化合物源的酶的实例。
[0235] 在具体实施例中，本发明的方法在将含淀粉材料转化为糖/糊精之前进一步包含以下步骤：
[0236] (x)减少该含淀粉材料的粒度；并且
[0237] (y)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。
[0238] 在实施例中，将该含淀粉材料碾磨，以减少粒度。在实施例中，该粒度被减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过一个具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。
[0239] 该水性浆料可以包含含淀粉材料的从10-55wt.％干固体(DS)，优选25-45wt.％干固体(DS)，更优选30-40wt.％干固体(DS)。
[0240] 常规淀粉转化过程如液化以及糖化过程描述于例如美国专利号3,912,590、EP 252730以及EP 063909中，这些专利通过引用结合在此。
[0241] 在实施例中，转化方法将淀粉降解为较低分子量的碳水化合物成分，如糖或脂肪替代物，该方法包括一个脱支步骤。
[0242] 当将淀粉转化为糖时，淀粉被解聚。这类解聚过程由例如一个预处理步骤以及两个或三个连续过程步骤组成，即，液化过程、糖化过程并且取决于所需最终产物，任选的异构化过程。
[0243] 当所需的最终糖产物是例如高果糖糖浆时，右旋糖糖浆可被转化为果糖。糖化过程之后，将pH值增加至6-8范围内的值，例如pH 7.5，并且通过离子交换除去钙。然后，使用例如固定化葡萄糖异构酶将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。
[0244] 发酵产物的生产
[0245] 可发酵的糖类(例如，糊精类、单糖类，尤其是葡萄糖)由酶法糖化产生。这些可发酵的糖类可进一步纯化和/或转化成有用的糖产物。另外，这些糖可在微生物发酵过程中用作发酵进料来产生最终产物，如醇(例如，乙醇以及丁醇)、有机酸(例如，丁二酸，3-HP以及乳酸)、糖醇(例如，甘油)、抗坏血酸中间物(例如，葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸)、氨基酸(例如，赖氨酸)、蛋白质(例如，抗体及其片段)。
[0246] 在实施例中，液化过程步骤期间获得的可发酵的糖用于产生醇，并且尤其是乙醇。在乙醇生产中，通常使用SSF过程，其中糖化酶以及发酵生物(例如，酵母)一起添加，并且然后在30℃-40℃温度下执行。
[0247] 发酵中所使用的生物取决于所需最终产物。典型地，如果乙醇是所需最终产物，则将酵母用作发酵生物。在一些优选实施例中，产乙醇微生物是酵母，并且尤其是酵母属如酿酒酵母菌株(美国专利号4,316,956)。各种酿酒酵母是可商购的并且这些包括(但不局限于)FALI(弗莱希曼酵母(Fleischmann's Yeast))、SUPERSTART(奥泰公司(Alltech))、FERMIOL(帝斯曼公司(DSM Specialties))、RED STAR(乐斯福公司(Lesaffre))以及Angel醇酵母(天使酵母公司(Angel Yeast Company)，中国(China))。这些方法中所使用的起始酵母的量是在合适时间内有效产生商业上有效量乙醇的量(例如，在小于72小时内从具有25％-40％之间DS的底物产生至少10％乙醇)。酵母细胞总体上以约104至约1012、并且优选
7 10
地从约10至约10 活酵母计数/mL发酵液的量来供应。在将酵母添加至醪液之后，使它典型地经受发酵约24-96小时，例如，35-60小时。温度在约26℃-34℃之间，典型地约32℃，并且pH是从pH 3-6，例如，约pH 4-5。
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地从约10至约10 活酵母计数/mL发酵液的量来供应。在将酵母添加至醪液之后，使它典型地经受发酵约24-96小时，例如，35-60小时。温度在约26℃-34℃之间，典型地约32℃，并且pH是从pH 3-6，例如，约pH 4-5。
[0248] 除了发酵微生物(例如，酵母)以外，发酵还可包括营养物以及额外酶，这些额外酶包括植酸酶。酵母在发酵中的使用在本领域中是熟知的。
[0249] 在另外的实施例中，如本领域中已知的，适当发酵微生物的使用可产生发酵最终产物，包括例如甘油、1,3-丙二醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐、2-酮基-L-古洛糖酸、丁二酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更具体地说，当乳酸是所需最终产物时，可使用一种乳酸杆菌属种(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是所需最终产物时，可使用大肠杆菌；并且当2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸是所需最终产物时，柠檬泛菌可用作发酵微生物。以上列举的列表只是实例并且本领域技术人员知道可用于获得所需最终产物的许多发酵微生物。
[0250] 用于由含未经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法
[0251] 本发明涉及在含淀粉材料没有糊化(即，没有蒸煮)的情况下从含淀粉材料生产发酵产物的方法(通常被称为“粗淀粉水解”方法)。可在不使包含含淀粉材料以及水的水性浆料液化的情况下生产发酵产物如乙醇。在一个实施例中，本发明的方法包括：在低于初始糊化温度下、优选地在α-淀粉酶和/或产碳水化合物源的酶的存在下将(例如碾磨的)含淀粉材料(例如颗粒状淀粉)糖化，以产生可以通过适合的发酵生物发酵成发酵产物的多种糖。在此实施例中，所希望的发酵产物例如乙醇是从未经糊化的(即，未蒸煮)、优选地经碾磨的谷粒如玉米中产生的。
[0252] 因此，在一个方面中，本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物的方法，这些方法包括：使用产碳水化合物源的酶以及发酵生物，在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度下将含淀粉材料同时糖化和发酵。糖化和发酵还可以是分开的。因而，在另一个方面中，本发明涉及生产发酵产物的过程，包括以下步骤：
[0253] (i)在低于起始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；并且
[0254] (ii)使用发酵生物进行发酵；
[0255] 其中使用至少葡糖淀粉酶和根据本发明的杂合普鲁兰酶进行步骤(i)。
[0256] 在一个实施例中，在步骤(i)中添加α-淀粉酶。在另一个实施例中，步骤(i)和(ii)同时进行。
[0257] 在一个实施例中，还存在蛋白酶。蛋白酶可以是任何酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。发酵之后，可以任选地例如通过蒸馏来回收发酵产物(例如乙醇)。典型地，在发酵期间存在一种或多种淀粉酶如葡糖淀粉酶、和/或其他产碳水化合物源的酶、和/或一种或多种α-淀粉酶。葡糖淀粉酶以及其他产碳水化合物源的酶的实例包括使原料淀粉水解的葡糖淀粉酶。一种或多种α-淀粉酶的实例包括酸性α-淀粉酶如酸性真菌α-淀粉酶。发酵生物的实例包括酵母例如，酿酒酵母的菌株。术语“初始糊化温度”指淀粉的糊化发生的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50℃与75℃之间开始糊化；糊化的准确温度依赖于具体的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可根据植物种类、植物种类的具体品种、以及生长条件而变化。在本发明的上下文中，给定的含淀粉材料的初始糊化温度是使用古林斯坦(Gorinstein)和李(Lii)，1992，淀粉(Starch/ )44(12):461-466所描述的方法，使5％的淀粉颗粒丧失双折射的温度。在开始该方法之前，可以制备具有10-55w/w％干固体(DS)、优选25-45w/w％干固体、更优选30-40w/w％干固体的含淀粉材料(例如颗粒状淀粉)的浆料。该浆料可以包括水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水。
由于本发明的方法是在低于该初始糊化温度下进行的并且因此没有发生显著的粘度增加，所以如果希望的话，可以使用高水平的釜馏物。在实施例中，水性浆料含有从约1至约
70vol.％、优选地15-60vol.％、尤其是从约30至50vol.％的水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水，或其组合等。含淀粉材料可优选地通过干式或湿式碾磨来减少粒度至0.05至3.0mm，优选地0.1-0.5mm而制备。在经受本发明的方法之后，含淀粉材料中至少
85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或优选地至少99％的干固体被转化成可溶的淀粉水解产物。本发明此方面中的方法是在低于初始糊化温度的温度下进行的，意味着温度典型地在30℃-75℃之间、优选地在45℃-60℃之间的范围内。在优选的实施例中，该方法在从25℃至40℃，如从28℃至35℃，如从30℃至34℃，优选地约32℃的温度下进行。
在实施例中，执行该方法以使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如低于6w/w％，如低于约3w/w％，如低于约2w/w％，如低于约1w/w％，如低于约0.5w/w％，或低于0.25w/w％，如低于约0.1w/w％。通过简单地采用调整量的酶和发酵生物就可以实现这样的低水平的糖。
本领域的普通技术人员可容易地确定有待使用的酶和发酵生物的剂量/数量。还可以选择酶和发酵生物的所采用的量以在发酵液中维持低麦芽糖浓度。例如，麦芽糖水平可保持低于约0.5w/w％，如低于约0.2w/w％。本发明的方法可以在从约3与7之间、优选地从pH 3.5到
6、或更优选地从pH 4到5的pH下进行。在实施例中，发酵进行6至120小时，尤其24至96小时。
由于本发明的方法是在低于该初始糊化温度下进行的并且因此没有发生显著的粘度增加，所以如果希望的话，可以使用高水平的釜馏物。在实施例中，水性浆料含有从约1至约
70vol.％、优选地15-60vol.％、尤其是从约30至50vol.％的水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水，或其组合等。含淀粉材料可优选地通过干式或湿式碾磨来减少粒度至0.05至3.0mm，优选地0.1-0.5mm而制备。在经受本发明的方法之后，含淀粉材料中至少
85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或优选地至少99％的干固体被转化成可溶的淀粉水解产物。本发明此方面中的方法是在低于初始糊化温度的温度下进行的，意味着温度典型地在30℃-75℃之间、优选地在45℃-60℃之间的范围内。在优选的实施例中，该方法在从25℃至40℃，如从28℃至35℃，如从30℃至34℃，优选地约32℃的温度下进行。
在实施例中，执行该方法以使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如低于6w/w％，如低于约3w/w％，如低于约2w/w％，如低于约1w/w％，如低于约0.5w/w％，或低于0.25w/w％，如低于约0.1w/w％。通过简单地采用调整量的酶和发酵生物就可以实现这样的低水平的糖。
本领域的普通技术人员可容易地确定有待使用的酶和发酵生物的剂量/数量。还可以选择酶和发酵生物的所采用的量以在发酵液中维持低麦芽糖浓度。例如，麦芽糖水平可保持低于约0.5w/w％，如低于约0.2w/w％。本发明的方法可以在从约3与7之间、优选地从pH 3.5到
6、或更优选地从pH 4到5的pH下进行。在实施例中，发酵进行6至120小时，尤其24至96小时。
[0258] 由含经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法
[0259] 在这一方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物、尤其是乙醇的方法，这些方法包括：液化步骤，以及依序地或同时地进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物的方法，这些方法包括以下步骤：
[0260] (a)在α-淀粉酶存在下，使含淀粉材料液化；或
[0261] (b)使用葡糖淀粉酶使在步骤(a)中获得的液化材料糖化；
[0262] (c)用发酵生物进行发酵；
[0263] 其中在根据本发明的普鲁兰酶的存在下进行步骤(a)和/或步骤(b)。
[0264] 在实施例中，在液化之前、期间和/或之后，添加蛋白酶，如酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。在实施例中，金属蛋白酶来自嗜热子囊菌属(Thermoascus)菌株，例如，橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670。在另一个实施例中，蛋白酶是细菌蛋白酶，特别是来源于热球菌属菌株的蛋白酶，更特别是来自披露于US 6,358,726中的激烈热球菌。在实施例中，葡糖淀粉酶来源于曲霉属的菌株，例如，黑曲霉或泡盛曲霉、踝节菌属的菌株，尤其是埃默森踝节菌；或阿太菌属的菌株，尤其是罗氏阿太菌；栓菌属的菌株，例如，瓣环栓菌；粘褶菌属的菌株，例如，篱边黏褶菌或密粘褶菌；或其混合物。糖化步骤(b)以及发酵步骤(c)可依序或同时进行。当该方法作为依序糖化和发酵过程来执行时，普鲁兰酶和/或金属蛋白酶可在糖化和/或发酵期间添加，并且当步骤(b)与(c)同时执行时(SSF过程)，在发酵之前或期间添加。普鲁兰酶和/或金属蛋白酶还可有利地在液化之前(预液化处理)，即在步骤(a)之前或期间，和/或在液化之后(液化后处理)，即在步骤(a)之后添加。普鲁兰酶最有利地在液化之前或期间，即在步骤(a)之前或期间添加。发酵产物，如尤其是乙醇，可以可任选地在发酵之后，例如通过蒸馏来回收。发酵生物优选地是酵母，优选地是酿酒酵母菌株。在具体实施例中，本发明的方法在步骤(a)之前进一步包括以下步骤：
[0265] x)优选地通过碾磨(例如，使用锤磨机)来减小含淀粉材料的粒度；
[0266] y)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。
[0267] 在实施例中，粒度是小于#7筛，例如#6筛。#7筛通常用于常规现有技术过程中。水性浆料可含有从10-55，例如25-45以及30-40的w/w％干固体(DS)的含淀粉材料。将浆料加热至高于糊化温度并且可添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在实施例中，在步骤(a)中经受α-淀粉酶之前可以喷射蒸煮该浆料以进一步使该浆料经糊化。在实施例中，液化可作为三步骤热浆料方法来执行。在pH 4-6、优选地4.5-5.5下，将浆料加热至60℃-95℃之间、优选地70℃-90℃之间、如优选地80℃-85℃之间，并且任选地连同普鲁兰酶和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶一起添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在实施例中，然后，可将浆料在95℃-140℃、优选地100℃-135℃、如105℃-125℃之间的温度下喷射蒸煮约1-15分钟、优选地约3-10分钟、尤其是约5分钟。浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多α-淀粉酶变体以及任选地普鲁兰酶变体和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶，以完成水解(二次液化)。通常在pH 4.0-6、特别是在从4.5至5.5之间的pH下进行液化过程。可使用本领域熟知的条件来进行糖化步骤(b)。例如，全部糖化过程可以持续从约24到约72小时，然而，通常仅在介于30℃到65℃之间的温度下，典型地约60℃下进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵过程(SSF过程)中，在发酵期间进行完全糖化。糖化典型地在从20℃-75℃、优选地从40℃-
70℃，典型地约60℃的温度下并且在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行。在发酵产物，尤其是乙醇的生产中最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)方法，在该方法中，该糖化不存在保持阶段，意味着发酵生物(如酵母)和酶可以一起添加。SSF可典型地在从25℃至40℃、如从28℃至35℃、如从30℃至34℃、优选地约32℃的温度下执行。在实施例中，发酵进行6至120小时，尤其24至96小时。
70℃，典型地约60℃的温度下并且在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行。在发酵产物，尤其是乙醇的生产中最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)方法，在该方法中，该糖化不存在保持阶段，意味着发酵生物(如酵母)和酶可以一起添加。SSF可典型地在从25℃至40℃、如从28℃至35℃、如从30℃至34℃、优选地约32℃的温度下执行。在实施例中，发酵进行6至120小时，尤其24至96小时。
[0268] 含淀粉材料
[0269] 可以在本发明的方法中使用任何适合的含淀粉起始材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适于在本发明的方法中使用的含淀粉起始材料的实例包括大麦、豆类、树薯(cassava)、谷物、玉米、买罗高梁(milo)、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、木薯(tapioca)、小麦以及全谷物或其任何混合物。该含淀粉材料还可以是一种蜡质或非蜡质类型的玉米和大麦。在优选的实施例中，该含淀粉材料是玉米。在优选的实施例中，该含淀粉材料是小麦。
[0270] 发酵产物
[0271] 术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物的发酵方法或过程生产的产品。发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；以及激素。在优选的实施例中，该发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即，可饮用的酒精；或工业乙醇，或可消费醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、奶制品工业(例如，发酵的奶制品)、皮革工业及烟草工业所使用的产品。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒、或清淡啤酒。在优选的实施例中，该发酵产物是乙醇。
[0272] 啤酒制造
[0273] 普鲁兰酶变体还可用于啤酒制造过程以及类似发酵中；普鲁兰酶典型地将在淀粉糖化(mashing)过程期间添加。该过程大致上类似于如上所述的碾磨、液化、糖化以及发酵过程。
[0274] 以釜馏物加工淀粉浆料
[0275] 碾磨的含淀粉材料与水以及回收的稀釜馏物合并以产生水性浆料。浆料可包含15至55％ds w/w之间(例如20％至50％、25％至50％、25％至45％、25％至40％、20％至35％以及30％-36％ds)。在一些实施例中，回收的稀釜馏物(逆流)在约10至70％v/v(例如10％至60％、10％至50％、10％至40％、10％至30％、10％至20％、20％至60％、20％至50％、20％至
40％以及还有20％至30％范围内)。
40％以及还有20％至30％范围内)。
[0276] 一旦经碾磨的含淀粉材料与水以及逆流合并，不调整浆料中的pH。此外，在将植酸酶以及任选地α-淀粉酶添加至浆料之后，不调整pH。在实施例中，浆料的pH是在约pH 4.5至小于约6.0范围内(例如pH 4.5至5.8、pH4.5至5.6、pH 4.8至5.8、pH 5.0至5.8、pH 5.0至5.4、pH 5.2至5.5以及pH5.2至5.9)。取决于添加至浆料的稀釜馏物的量以及包含稀釜馏物的材料的类型，浆料的pH可在约pH 4.5与5.2之间。例如，稀釜馏物的pH可在pH3.8与pH 4.5之间。
[0278] 在一些实施例中，将植酸酶添加至浆料。在其他实施例中，除了植酸酶以外，将α-淀粉酶添加至浆料。在一些实施例中，将植酸酶以及α-淀粉酶依序添加至浆料。在其他实施例中，同时添加植酸酶以及α-淀粉酶。在一些实施例中，将包含植酸酶以及任选地α-淀粉酶的浆料孵育(预处理)约5分钟至约8小时(例如，5分钟至6小时、5分钟至4小时、5分钟至2小时以及15分钟至4小时)的时间。在其他实施例中，在约40℃至115℃(例如，45℃至80℃、50℃至70℃、50℃至75℃、60℃至110℃、60℃至95℃、70℃至110℃、70℃至85℃以及77℃至86℃)范围内的温度下孵育浆料。
[0279] 在其他实施例中，在比含淀粉材料的淀粉糊化温度低约0℃至约30℃(例如，0至25℃、0至20℃、0至15℃、0至10℃以及0至5℃)的温度下孵育浆料。在一些实施例中，温度是低于约68℃、低于约65℃、低于约62℃、低于约60℃以及低于约55℃。在一些实施例中，温度是高于约45℃、高于约50℃、高于约55℃以及高于约60℃。在一些实施例中，在低于淀粉糊化温度的温度下孵育包含植酸酶以及α-淀粉酶的浆料被称为主要(1°)液化。
[0280] 在一个实施例中，经碾磨的含淀粉材料是玉米或高粱。浆料包含25％至40％DS，pH在4.8至5.2范围内，并且浆料与植酸酶以及任选地α-淀粉酶在60℃至75℃范围内的温度下孵育5分钟至2小时。
[0281] 当前，据信用于液化过程的可商购的微生物α-淀粉酶总体上不能足够稳定地在高于约80℃的温度下、在小于pH 5.6的pH水平下使用全谷粒从干式碾磨过程中产生液化淀粉底物。许多可商购的α-淀粉酶的稳定性在低于约4.0的pH下降低。
[0282] 在另外的液化步骤中，在约4.0至5.5的pH下，孵育或预处理的含淀粉材料经历比含淀粉材料的淀粉糊化温度(例如，70℃至120℃、70℃至110℃以及70℃至90℃)高的温度增加，如约0℃至约45℃，持续约2分钟至约6小时的一段时间(例如，2分钟至4小时、90分钟、140分钟以及90至140分钟)，更优选地1小时与2小时之间。温度可通过常规高温喷射蒸煮系统来增加一段较短时间，例如，1至15分钟。然后，淀粉可进一步在从约75℃至95℃(例如，80℃至90℃以及80℃至85℃)范围内的温度下水解约15至150分钟(例如，30至120分钟)的时间。在优选的实施例中，pH在这些过程步骤期间未调整，并且液化醪液的pH在约pH 4.0至pH
5.8(例如pH 4.5至5.8、pH 4.8至5.4以及pH 5.0至5.2)范围内。在一些实施例中，将第二剂量的热稳定的α-淀粉酶添加至二次液化步骤，但是在其他实施例中没有额外剂量的α-淀粉酶。
5.8(例如pH 4.5至5.8、pH 4.8至5.4以及pH 5.0至5.2)范围内。在一些实施例中，将第二剂量的热稳定的α-淀粉酶添加至二次液化步骤，但是在其他实施例中没有额外剂量的α-淀粉酶。
[0283] 可在孵育以及液化步骤之后进行本领域中熟知的糖化以及发酵步骤。
[0284] 蒸馏
[0285] 任选地，在发酵之后，可例如通过蒸馏以及任选地随后进行一个或多个过程步骤来萃取醇(例如，乙醇)。
[0286] 在一些实施例中，通过在此提供的方法来生产的乙醇的产率是至少8％、至少10％、至少12％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％以及至少18％(v/v)以及至少
23％v/v。根据在此提供的方法来获得的乙醇可用作例如燃料乙醇、饮用乙醇，即可饮用的酒精，或工业乙醇。
23％v/v。根据在此提供的方法来获得的乙醇可用作例如燃料乙醇、饮用乙醇，即可饮用的酒精，或工业乙醇。
[0287] 副产物
[0289] 关于如何完成液化、糖化、发酵、蒸馏以及回收乙醇的进一步细节是本领域技术人员熟知的。
[0290] 根据在此提供的方法，糖化以及发酵可同时或单独地执行。
[0291] 发酵生物
[0292] 术语“发酵生物”是指适于生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，例如酵母和丝状真菌。适合的发酵生物能够将可发酵糖(如阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖或木糖)直接或间接地发酵(即，转化)为所希望的发酵产物。
[0293] 发酵生物的实例包括真菌生物，例如酵母。优选酵母包括酵母属的菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母；毕赤酵母属的菌株，特别是树干毕赤酵母，例如树干毕赤酵母CBS 5773或巴斯德毕赤酵母；假丝酵母属的菌株，特别是阿拉伯糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans)、博伊丁假丝酵母、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、休哈塔假丝酵母、萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)、假热带假丝酵母(Candida tropicalis)或产朊假丝酵母。其他发酵生物包括汉逊酵母属的菌株，特别是异常汉森酵母或多形汉逊酵母；克鲁弗酵母属的菌株，特别是脆壁克鲁弗酵母或马克斯克鲁弗酵母(Kluyveromyces marxianus)；以及裂殖酵母属的菌株，特别是粟酒裂殖酵母。
[0294] 优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属的菌株，特别是大肠杆菌；发酵单胞菌属的菌株，特别是运动发酵单胞菌；发酵杆菌属的菌株，特别是棕榈科发酵杆菌(Zymobactor palmae)；克雷伯菌属的菌株，特别是产酸克雷伯菌；明串珠菌属的菌株，特别是肠膜状明串珠菌；梭菌属的菌株，特别是丁酸梭菌；肠杆菌属的菌株，特别是产气肠杆菌；以及高温厌氧杆菌属的菌株，特别是高温厌氧杆菌BG1L1(应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotech.)77:61-86)、产乙醇高温厌氧杆菌(Thermoanarobacter ethanolicus)、产甲烷高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter mathranii)或热解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)。乳杆菌属的菌株也被预期，如谷氨酸棒状杆菌R、嗜热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidaisus)和嗜热葡糖苷酶土芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的菌株。
[0295] 在实施例中，该发酵生物是C6糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。
[0296] 在实施例中，该发酵生物是C5糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。
[0297] 在一个实施例中，将该发酵生物添加至发酵培养基中，这样使得每mL的发酵培养基的活发酵生物(如酵母)计数在从105至1012个的范围内，优选从107至1010个，尤其是约5x 107个。
[0298] 酵母是用于乙醇发酵的优选发酵生物。优选的是酵母属的菌株，尤其是酿酒酵母种的菌株，优选是对高水平的乙醇(即，直到例如约10、12、15或20vol.％或更多的乙醇)耐受的菌株。
[0299] 在实施例中，利用C5的酵母是披露于WO 2004/085627中的酿酒酵母菌株。
[0300] 在实施例中，发酵生物是WO 2010/074577(内达尔科(Nedalco))中关注的C5真核微生物细胞。
[0301] 在实施例中，发酵生物是披露于US 2008/0014620中的能够直接将木糖同分异构化为木糖的经转化C5真核细胞。
[0302] 在实施例中，发酵生物是披露于WO 2009/109633中的C5糖发酵细胞。
[0303] 可商购的酵母包括LNF SA-1、LNF BG-1、LNF PE-2和LNF CAT-1(可获得自巴西的TM TMLNF)，RED STAR 和ETHANOL RED 酵母(可获得自富酶泰斯/乐斯富(Fermentis/
Lesaffre)，美国)，FALI(可获得自弗莱施曼酵母(Fleischmann’s Yeast)，美国)，SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可获得自乙醇技术(Ethanol Technology)，威斯康星州(WI)，美国)，BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物产品集团(NABC-North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州(GA)，美国)，GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德AB公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼食品配料部(DSM Specialties))。
Lesaffre)，美国)，FALI(可获得自弗莱施曼酵母(Fleischmann’s Yeast)，美国)，SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可获得自乙醇技术(Ethanol Technology)，威斯康星州(WI)，美国)，BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物产品集团(NABC-North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州(GA)，美国)，GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德AB公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼食品配料部(DSM Specialties))。
[0304] 能够从可发酵糖生产所希望的发酵产物的发酵生物优选在精确条件条件下以具体生长速率生长。当将该发酵生物引入进/添加至发酵培养基中时，接种的发酵生物经过多个阶段。不出现原始生长。此时期称为“停滞期”并且可以被认为是适应时期。在称为“对数期”的接下来的阶段过程中，生长速率逐渐增加。在最大生长期间后，速率停止并且发酵生物进入“静止期”。在另外的时间段后，发酵生物进入“死亡期”，其中活细胞的数目下降。
[0305] 发酵
[0306] 基于例如植物材料的种类、可获得的可发酵糖、一种或多种发酵生物和/或所希望的发酵产物确定发酵条件。本领域的普通技术人员可以容易地确定适合的发酵条件。发酵可以在常规使用的条件下进行。优选的发酵过程是厌氧过程。
[0307] 例如，发酵可以在高达75℃，例如40℃-70℃之间，如50℃-60℃之间的温度下进行。然而，还已知的是细菌具有低至室温左右(20℃左右)的显著较低的最适温度。适合的发酵生物的实例可以发现于上面的“发酵生物”部分中。
[0308] 对于使用酵母生产乙醇，发酵可以持续24至96小时，特别是持续35至60小时。在实施例中，在20℃至40℃，优选26℃至34℃之间，特别是32℃左右的温度下进行发酵。在实施例中，pH是从pH 3至6，优选pH 4至5左右。
[0309] 其他发酵产物可以在本领域的普通技术人员已知的、适于所讨论的发酵生物的温度下发酵。
[0310] 典型地在3与7之间的范围内的pH，优选从pH 3.5至6，如pH 5左右下进行发酵。发酵典型地持续6-96小时。
[0311] 本发明的方法可以作为分批过程或作为连续过程进行。发酵可以在超滤系统中进行，其中将渗余物在固体、水和发酵生物的存在下保持在再循环之下，并且其中渗透物是包含所希望的发酵产物的液体。同样考虑的是在具有超滤膜的连续膜反应器中执行的方法/工艺，并且其中将渗余物在固体、水和一种或多种发酵生物的存在下保持在再循环之下，并且其中渗透物是包含发酵产物的液体。
[0312] 发酵后，可以将发酵生物与发酵的浆料分开并再循环。
[0313] 发酵培养基
[0314] 短语“发酵培养基(fermentation media)”或“发酵培养基(fermentation medium)”是指进行发酵的环境并且包括发酵底物，即被一种或多种发酵生物代谢的碳水化合物来源。
[0315] 发酵培养基可以包括针对一种或多种发酵生物的其他营养素和一种或多种生长刺激剂。营养素和生长刺激剂被广泛地用于发酵领域中并且包括氮源，例如氨；维生素以及矿物质或其组合。
[0316] 回收
[0317] 继发酵之后，可以将发酵产物与发酵培养基分开。可以将发酵培养基蒸馏以提取所希望的发酵产物或可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物。可替代地，可以通过汽提回收发酵产物。回收方法在本领域中是熟知的。
[0318] 酶
[0319] 下面描述的一种或多种酶和多肽有待以“有效量”用于本发明的方法中。
[0320] α-淀粉酶
[0321] 可以使用任何α-淀粉酶，例如真菌、细菌或植物源的。在优选的实施例中，该α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加，在3至7、优选从3.5至6或更优选从4-5的范围内的pH下具有最适活性的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)。
[0322] 细菌α-淀粉酶
[0323] 用于在本发明中使用的α-淀粉酶可以是一种细菌α-淀粉酶，例如来源于芽孢杆菌属。在优选的实施例中，该芽孢杆菌属α-淀粉酶来源于解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可以来源于其他芽孢杆菌属物种。
[0324] α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶、WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶和WO99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列都通过引用而结合在此)。在实施例中，该α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5所示的任何序列分别具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性程度的酶。
[0325] 芽孢杆菌α-淀粉酶还可以是变体和/或杂合体，尤其是在任何以下各项中所述的变体和/或杂合体：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO99/19467、WO 00/60059、以及WO 02/10355(所有文献都通过引用而结合在此)。具体的α-淀粉酶变体披露于美国专利号6,093,562、6,187,576和6,297,038中(通过引用而结合在此)并且包括具有以下改变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体：在位置R179至G182处的一个或两个氨基酸的缺失，优选披露于WO 96/23873中的双缺失-参见例如第20页，第1-10行(通过引用而结合在此)，优选与披露于WO 99/19467的SEQ ID NO:3阐述的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于δ(181-182)的双缺失，或使用WO 99/19467(该参考文献通过引用而结合在此)中的SEQ ID NO:3进行编号的氨基酸R179和G180的缺失。在优选的实施例中，该α-淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是成熟野生型或其成熟变体。该成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是在重组产生过程中天然地截短的。例如，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是截短的，因此其具有约491个氨基酸(与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3相比较)。优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与披露于WO 99/19467中的SEQ ID NO:3阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于位置181和182的缺失的双缺失并且进一步包括N193F取代(也被表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体中的S239的位置处具有取代。在优选的实施例中，该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：
[0326] I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
[0327] I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
[0328] I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
[0329] I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3进行编号)。
[0330] 细菌杂合α-淀粉酶
[0331] 该α-淀粉酶可以是杂合α-淀粉酶，例如包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:4中)的445个C-末端氨基酸残基和来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:5中)的37个N-末端氨基酸残基的α-淀粉酶，该α-淀粉酶具有以下取代中的一个或多个(尤其是全部)：
[0332] G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌进行编号)。还优选的是具有以下突变(或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)中的一个或多个的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V以及Q264S和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5进行位置编号)。
[0333] 真菌α-淀粉酶
[0334] 真菌α-淀粉酶包括来源于曲霉属的菌株的α-淀粉酶，例如白曲霉、黑曲霉和米曲霉α-淀粉酶。
[0335] 优选的酸性真菌α-淀粉酶是与在WO 96/23874中示为SEQ ID NO:10的氨基酸序列的成熟部分展现出高度一致性，即至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性的α-淀粉酶。
[0336] 另一种优选的酸性α-淀粉酶来源于黑曲霉的菌株。在优选的实施例中，该酸性真菌α-淀粉酶是在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在主入藏号P56271下披露为“AMYA_ASPNG”并且描述于WO 89/01969(实例3-通过引用而结合)中的黑曲霉α-淀粉酶。
[0337] 其他野生型α-淀粉酶包括来源于亚灰树花菌属(Meripilus)和根毛霉属的菌株，优选大型亚灰树花菌或微小根毛霉的菌株的那些(WO2004/055178，将其通过引用结合在此)。
[0338] 在优选的实施例中，该α-淀粉酶来源于白曲霉(金子(Kaneko)等人，1996，发酵与生物工程杂志(J.Ferment.Bioeng.)81:292-298：“编码来自白曲霉的酸稳定的α-淀粉酶的基因的核苷酸序列的分子克隆和测定(Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachii)”；并且进一步被披露为EMBL：#AB008370)。
[0339] 该真菌α-淀粉酶还可以是包含淀粉结合结构域(SBD)和α-淀粉酶催化结构域的野生型酶或其变体。
[0340] 真菌杂合α-淀粉酶
[0341] 在优选的实施例中，该真菌酸性α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的实例包括披露于WO 2005/003311、美国专利申请公开号2005/0054071(诺维信公司)和WO 2006/069290(诺维信公司)(通过引用而结合在此)中的α-淀粉酶。杂合α-淀粉酶可以包括α-淀粉酶催化结构域(CD)和碳水化合物结合结构域/模块(CBM)(例如淀粉结合结构域(SBD))以及任选地接头。
[0342] 杂合α-淀粉酶的实例包括披露于WO 2006/069290中的实例的表1至5中的那些，包括具有催化结构域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD的变体(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:100)、具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:101)、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(将其在美国申请号11/316,535的表5中披露为氨基酸序列SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:96的组合)或作为WO 2006/069290的表5中的V039、以及具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌α-淀粉酶(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:102)。其他杂合α-淀粉酶列于美国申请号11/316,535和WO2006/069290(将其通过引用而结合在此)的实例4的表3、4、5以及6中。
[0343] 在优选的实施例中，该α-淀粉酶是衍生自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉的α-淀粉酶，优选WO 2013/006756中SEQ ID NO:7中所示的α-淀粉酶，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，特别是G128D+D143N。
[0344] 杂合α-淀粉酶的其他实例包括披露于美国专利申请公开号2005/0054071中的那些，包括披露于第15页上表3中的那些，例如具有白曲霉接头和淀粉结合结构域的黑曲霉α-淀粉酶。
[0345] 其他α-淀粉酶与任何上述α-淀粉酶展现出高度的序列一致性，即与上面披露的成熟酶序列展现出至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性。
[0346] 商用α-淀粉酶产品
[0347] 包括α-淀粉酶的优选的商用组合物包括MYCOLASETM(DSM)、BANTM、TERMAMYLTMSC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETMX、LIQUOZYMETMSC和SANTMSUPER、SANTMEXTRA L(诺维信公司)以及CLARASETML-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETMFRED、SPEZYMETMAA、SPEZYMETMALPHA、SPEZYMETMDELTA AA、GC358、GC980、SPEZYMETMCL和SPEZYMETM RSL(杜邦工业生物科学(DuPont Industrial Biosciences))，以及来自黑曲霉的称作SP288的酸性真菌α-淀粉酶(可获得自诺维信公司，丹麦)。
[0348] 产碳水化合物源的酶(糖化酶)
[0349] 术语“产碳水化合物源的酶”包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成器)、β-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶(两种麦芽糖生成器)并且还包括α-葡糖苷酶、异淀粉酶和支链淀粉酶。产碳水化合物源的酶能够产生可以所讨论中一种或多种发酵生物用作能源的碳水化合物，例如，当在用于生产发酵产物(例如乙醇)的本发明的方法中使用时。产生的碳水化合物可以被直接或间接地转化为所希望的发酵产物，优选乙醇。可以使用产碳水化合物源的酶的混合物。共混物包括以下混合物，这些混合物包括至少葡糖淀粉酶以及α-淀粉酶，尤其是酸性淀粉酶，甚至更优选的是酸性真菌α-淀粉酶。
[0350] 在常规的淀粉到乙醇的方法(即，包括液化步骤)中，可以如EP 140410中定义该比例，尤其是当同时进行糖化和发酵时。
[0351] 葡糖淀粉酶
[0352] 术语“葡糖淀粉酶”(1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的酶。
[0353] 该葡糖淀粉酶的添加量可以为0.001到10AGU/g DS，优选地从0.01到5AGU/g DS，例如为约0.1、0.3、0.5、1或2AGU/g DS，尤其是0.1至0.5AGU/g DS或0.02-20AGU/g DS，优选地0.1-10AGU/g DS。
[0354] 葡糖淀粉酶可以来源于任何适合的来源，例如来源于微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌源的，选自下组，该组由以下各项组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(博埃尔(Boel)等人，1984，欧洲分子生物学学会杂志3(5):1097-1102)，或其变体，例如披露于WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中的那些(来自诺维信，丹麦)；披露于WO 84/02921中的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(哈塔(Hata)等人，1991，农业、生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)55(4):941-949)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(陈(Chen)等人，1996，蛋白质工程(Prot.Eng.)9:499-505)；D257E和D293E/Q(陈等人，1995，蛋白质工程8:575-582)；N182(陈等人，1994，生物化学杂志(Biochem.J.)301:275-281)；二硫键，A246C(费艾洛伯(Fierobe)等人，1996，生物化学35:8698-8704；以及在位置A435和S436中引入Pro残基(李(Li)等人，1997，蛋白质工程(Prot.Eng.)10:1199-1204)。
[0355] 其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(以前命名为罗尔伏革菌)葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和长坂(Nagasaka)等人，1998，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)50:323-330)，踝节菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于Talaromyces duponti、埃默森踝节菌(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利登记号32,153)以及嗜热踝节菌(美国专利号4,587,215)。
[0356] 在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自青霉属的菌株，尤其是草酸青霉菌菌株，特别是在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。在优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，该变体具有使用成熟多肽(SEQ ID NO:2的氨基酸22-616)进行编号的K79V取代，并且描述于WO2013/036526中。在优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的氨基酸22-616的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，该变体具有K79V取代以及以下取代中的一个或多个：P2N、P4S、P11F、T65A、Q327F，尤其是在WO 2013/053801中描述的P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F。
[0357] 在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自密孔菌属(Pycnoporus)的菌株，尤其是血红密孔菌菌株，特别是在WO 2011/066576中披露为SEQ ID NO:2、4或6的血红密孔菌葡糖淀粉酶。在优选的实施例中，该酶组合物包括如WO2011/066576中SEQ ID NO:6的氨基酸19-573所示的葡糖淀粉酶。
[0358] 在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自粘褶菌属的菌株，尤其是密粘褶菌菌株，特别是在WO 2011/068803中披露为SEQ ID NO:18的密粘褶菌葡糖淀粉酶。在尤其优选的实施例中，该酶组合物包括在WO 2011/068803中SEQ ID NO:18的氨基酸18-576所示的密粘褶菌葡糖淀粉酶，并且具有以下取代中的一个或多个：S95P、A121P，尤其是S95P+A121P，使用成熟多肽(SEQ ID NO:18的第18-576位)进行编号。
[0359] 在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自粘褶菌属的菌株，尤其是篱边粘褶菌的菌株，特别是在WO 2011/068803中披露为SEQ ID NO:2的氨基酸18-573的成熟的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶。
[0360] 细菌葡糖淀粉酶包括来自以下各项的葡糖淀粉酶：梭菌属(特别是嗜热解淀粉梭菌(C .thermoamylolyticum) (EP 135138)和嗜热解硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831))，瓣环栓菌(Trametes cingulata)，纸质厚孢孔菌(Pachykytospora papyracea)以及大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)，全部披露于WO 2006/069289中；或披露于PCT/US 2007/066618中的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)；或其混合物。可以在本发明中使用杂合葡糖淀粉酶。杂合葡糖淀粉酶的实例披露于WO 2005/045018中。具体实例包括披露于实例1的表1和4中的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用结合在此)。
[0361] 该葡糖淀粉酶可以与任何上述葡糖淀粉酶具有高度序列一致性，即与上述成熟酶序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性。
[0362] 可商购的葡糖淀粉酶组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTMSUPER，SANTMEXTRA L，TM TM TM TM TMSPIRIZYME PLUS，SPIRIZYME FUEL，SPIRIZYME B4U，SPIRIZYME ULTRA 和AMG E(来自诺维信公司，丹麦)；OPTIDEXTM300，GC480TM和GC147TM(来自杜邦工业生物科学(DuPont Industrial Biosciences)，美国)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自DSM)；G-ZYMETMG900，G-ZYMETM和G990Zr(来自杜邦工业生物科学)。
[0363] 能以0.02-20AGU/g DS、优选0.1-10AGU/g DS、尤其是1-5AGU/g DS之间、例如0.1-2AGU/g DS、例如0.5AGU/g DS或以0.0001-20AGU/g DS的量、优选0.001-10AGU/g DS、尤其是0.01-5AGU/g DS之间、例如0.1-2AGU/g DS的量添加葡糖淀粉酶。
[0364] β-淀粉酶
[0365] β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)是传统地给予外切作用的麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷键水解。麦芽糖单位以逐步方式依次从非还原链末端去除，直到该分子被降解，或在支链淀粉的情况下，直到到达分支点。释放的麦芽糖具有β端基异构构型，因此名称为β-淀粉酶。
[0366] β-淀粉酶已经从多种植物和微生物中分离(福格蒂(Fogarty)和凯利(Kelly)，1979，工业微生物学进展(Progress in Industrial Microbiology)15:112-115)。这些β-淀粉酶的特征在于具有从40℃至65℃范围内的最适温度并且具有从4.5至7范围内的最适pH。来自大麦的可商购β-淀粉酶是来自丹麦的诺维信公司的NOVOZYMTMWBA和来自美国的杜邦工业生物科学的SPEZYMETMBBA 1500。
[0367] 麦芽糖淀粉酶
[0368] 淀粉酶还可以是麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶，EC3.2.1.133)，其催化α-构型的直链淀粉和支链淀粉水解为麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的麦芽糖淀粉酶可商购自诺维信公司。麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048、4,604,355和6,162,628中，将其通过引用而结合在此。
[0369] 能以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加麦芽糖淀粉酶。
[0370] 植酸酶
[0371] 可以在本发明的方法中使用任何植酸酶。植酸酶是通过特异性水解肌醇与磷之间的酯键来降解植酸盐和/或植酸的酶。植酸酶活性被认为在许多成分中具有磷和离子可用性。在一些实施例中，植酸酶能够从肌醇六磷酸盐(例如，植酸)释放至少一种无机磷酸盐。可以根据其对植酸盐分子上的水解开始处的磷酸酯基团的特异性位置的偏好对植酸酶进行分组(例如，3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26))。植酸酶的实例是肌醇-六磷酸(hexakiphosphate)-3-磷酸水解酶。
[0372] 植酸酶可以获得自微生物，例如真菌和细菌生物。例如，植酸酶可以获得自丝状真菌，如曲霉属(例如，无花果曲霉、烟曲霉、黑曲霉及土曲霉)，枝孢属(Cladospirum)，毛霉属(例如，梨形毛霉)，毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)，青霉属(例如，大麦青霉(P.hordei)(ATCC号22053))、桧状青霉(P.piceum)(ATCC号10519)或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC号48944)，踝节菌属(例如，嗜热踝节菌)，嗜热丝孢菌属(WO 99/49740)以及木霉属(例如，里氏木霉)。
[0373] 在实施例中，该植酸盐降解酶获得自酵母(例如，Arxula adeninivorans、异常毕赤酵母、许旺酵母)，革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌、克雷伯菌属、假单胞菌属)和革兰氏阳性细菌(例如，芽孢杆菌属，例如枯草芽孢杆菌)。
[0374] 该植酸酶可以获得自柠檬酸杆菌属、肠杆菌属或隔孢伏革菌属。
[0375] 在实施例中，该植酸酶来源于布丘菌属(Buttiauxiella spp.)，例如乡间布丘菌(B.agrestis)、布里纳氏布丘氏菌(B.brennerae)、费拉格布丘氏菌(B.ferragutiase)、伽瓦尼布丘氏菌(B.gaviniae)、伊查德氏布丘氏菌(B.izardii)、诺基亚布丘氏菌(B.noackiae)以及瓦姆波德布丘氏菌(B.warmboldiae)。在一些实施例中，该植酸酶是披露于WO 2006/043178或美国申请号11/714,487中的植酸酶。
[0376] 在一个优选实施例中，该植酸酶与美国申请号12/263,886的SEQ ID NO:31中阐述的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％以及至少99％序列一致性。
[0377] 可商购的植酸酶是NATUPHOS(BASF)、RONOZYME P(诺维信公司)、PHYZYME(丹尼斯克公司，范恩尼姆(Verenium))以及FINASE(AB酶公司(AB Enzymes))。用于确定微生物植酸酶活性的方法和植酸酶单位的定义披露于恩格伦(Engelen)等人，1994，AOAC国际杂志(Journal of AOAC International)77:760-764中。该植酸酶可以是野生型植酸酶或其活性变体或活性片段。
[0378] 支链淀粉酶
[0379] 普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41，普鲁兰6-葡聚糖-水解酶)是去分支酶，其由它们在例如支链淀粉(amylopectin)和普鲁兰(pullulan)中水解α-1,6-糖苷键的能力表征。
[0380] 普鲁兰酶可以是根据本发明的杂合普鲁兰酶，以及此外可以添加任何其他的普鲁兰酶，优选细菌普鲁兰酶，优选来源于芽孢杆菌属的菌株，尤其是来源于脱支芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、淀粉脱支芽孢杆菌或嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的菌株。
[0381] 根据本发明有用的确切考虑的普鲁兰酶包括在WO 01/151620(通过引用结合在此)中披露为序列号4的脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶以及披露为WO2008/024372(通过引用结合在此)的序列2、4和6的来自脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶。
[0382] 根据本发明有用的确切考虑的普鲁兰酶包括来自美国专利号4,560,651(通过引用结合在此)中披露的淀粉脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶、WO01/151620(通过引用结合在此)中披露为SEQ ID NO:2的普鲁兰酶以及来自WO 01/151620(通过引用结合在此)中披露为SEQ ID NO:6的嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌以及还有描述于FEMS微生物学通讯(FEMS Mic.Let.)(1994)115，97-106中的普鲁兰酶。
[0383] 根据本发明的普鲁兰酶可以按有效量添加，该有效量包括从1-100微克/g DS之间，尤其是从10-60微克/g DS的优选范围。普鲁兰酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定法描述于下文的“材料与方法”-部分中。
[0384] 在优选的实施例中，以1-100微克酶蛋白/g DS之间，优选10-60微克酶蛋白/g DS之间的量使用普鲁兰酶。
[0385] 适合的可商购普鲁兰酶产品包括PROMOZYME D、PROMOZYMETMD2(诺维信公司，丹麦)、OPTIMAX L-1000、OPTIMAX L-300(杜邦工业生物科学)以及AMANO 8(安能满公司(Amano)，日本)。
[0386] 蛋白酶
[0387] 可以在糖化、发酵、同时糖化和发酵过程中添加蛋白酶。该蛋白酶可以是任何蛋白酶。在优选的实施例中，该蛋白酶是微生物源的，优选真菌或细菌源的酸性蛋白酶。酸性真菌蛋白酶是优选的，但是也可以使用其他蛋白酶。
[0388] 适合的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即由在低于pH 7的酸性条件下水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。
[0389] 在优选的实施例中，该蛋白酶来源于热球菌属的细菌菌株，例如激烈热球菌的菌株(pfu蛋白酶)。特别地，该蛋白酶是在美国专利号6,358,726-B1中示为SEQ ID NO:1的蛋白酶。在另一个实施例中，该蛋白酶是在WO2012/088303中示为SEQ ID NO:13的蛋白酶。
[0390] 酸性真菌蛋白酶可以来源于曲霉属、假丝酵母属、革盖菌属、内座壳属(Endothia)、Enthomophtra、耙齿菌属、毛霉属、青霉属、根霉属、小核菌属以及球拟酵母菌属。具体而言，该蛋白酶可以来源于棘孢曲霉(WO95/02044)、泡盛曲霉(林田(Hayashida)等人，1977，农业、生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)42(5)，927-933)、黑曲霉(参见例如，快禅(Koaze)等人，1964，日本农业、生物学与化学(Agr.Biol.Chem.Japan)28:216)、斋藤曲霉(参见例如，吉田(Yoshida)，1954，日本农业、化学与社会学杂志(J.Agr.Chem.Soc.Japan)
28:66)、或米曲霉，如pepA蛋白酶；以及来自米黑毛霉或微小毛霉的酸性蛋白酶。
28:66)、或米曲霉，如pepA蛋白酶；以及来自米黑毛霉或微小毛霉的酸性蛋白酶。
[0391] 该蛋白酶可以是中性或碱性蛋白酶，如来源于芽孢杆菌属的菌株的蛋白酶。具体蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌并且具有作为登录号P06832可在Swissprot数据库获得的序列。这些蛋白酶与披露于Swissprot数据库中的氨基酸序列(登录号P06832)可以具有至少90％序列一致性，例如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特别是至少
99％一致性。
99％一致性。
[0392] 该蛋白酶与WO 2003/048353中披露为SEQ ID NO:1的氨基酸序列可以具有至少90％序列一致性，例如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或特别是至少
99％一致性。
99％一致性。
[0393] 该蛋白酶可以是选自下组的木瓜蛋白酶样蛋白酶，该组由以下各项组成：EC 3.4.22.*内的蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)，例如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC 3.4.22.7(萝蘼蛋白酶(asclepain))、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶)、EC 3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)以及EC 3.4.22.30(木瓜蛋白酶Q(caricain))。
[0394] 在实施例中，该蛋白酶是来源于曲霉属的菌株(例如米曲霉)的蛋白酶制剂。在另一个实施例中，该蛋白酶来源于根毛霉属的菌株，优选是米黑根毛霉。在另一个实施例中，该蛋白酶是蛋白酶制剂，优选是来源于曲霉属的菌株(例如米曲霉)的蛋白质分解制剂和来源于根毛霉属的菌株(优选米黑根毛霉)的蛋白酶的混合物。
[0395] 天冬氨酸蛋白酶描述于例如蛋白水解酶手册(Handbook of Proteolytic Enzymes)中，由A.J.巴雷特(Barrett)、N.D.罗林斯(Rawlings)和J.F.沃森纳(Woessner)编辑，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥，1998，第270章。天冬氨酸蛋白酶的实例包括例如披露于以下各项中的那些：贝尔卡(Berka)等人，1990，基因96:313；贝尔卡等人，1993，基因125:195-198；和戈米(Gomi)等人，1993，生物科学、生物科技与生物化学
(Biosci.Biotech.Biochem.)57:1095-1100，将其通过引用而结合在此。
(Biosci.Biotech.Biochem.)57:1095-1100，将其通过引用而结合在此。
[0396] 该蛋白酶还可以是金属蛋白酶，将其定义为选自下组的蛋白酶，该组由以下各项组成：
[0397] (a)属于EC 3.4.24的蛋白酶(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)；
[0398] (b)属于以上手册的M组的金属蛋白酶；
[0399] (c)尚未指定族的金属蛋白酶(指定：族MX)，或属于族MA、MB、MC、MD、ME、MF、MG、MH中的任一种的金属蛋白酶(如在以上手册的第989-991页所定义)；
[0400] (d)其他家族的金属蛋白酶(如以上手册的第1448-1452页所定义)；
[0401] (e)具有HEXXH基序的金属蛋白酶；
[0402] (f)具有HEFTH基序的金属蛋白酶；
[0403] (g)属于家族M3、M26、M27、M32、M34、M35、M36、M41、M43或M47中的任一种的金属蛋白酶(如以上手册的第1448-1452页所定义)；
[0404] (h)属于M28E家族的金属蛋白酶；以及
[0405] (i)属于家族M35的金属蛋白酶(如以上手册的第1492-1495页所定义)。
[0406] 在其他具体实施例中，金属蛋白酶是其中肽键上的亲核攻击由被二价金属阳离子活化的水分子介导的水解酶。二价阳离子的实例是锌、钴或锰。可以通过氨基酸配体将金属离子保持在适当位置。配体的数目可以是五、四、三、二、一或零。在具体实施例中，数目是二或三，优选是三。
[0407] 对于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶的起源没有限制。在实施例中，将该金属蛋白酶分类为EC 3.4.24，优选EC 3.4.24.39。在一个实施例中，该金属蛋白酶是酸稳定的金属蛋白酶，例如真菌酸稳定的金属蛋白酶，如来源于嗜热子嚢菌属的菌株，优选橙色嗜热子囊菌的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶(分类为EC 3.4.24.39)。在另一个实施例中，该金属蛋白酶来源于曲霉属的菌株，优选米曲霉的菌株。
[0408] 在一个实施例中，该金属蛋白酶与WO 2010/008841的SEQ ID NO:1(橙色嗜热子囊菌金属蛋白酶)的氨基酸-178至17、-159至177或优选氨基酸1至177(成熟多肽)具有至少80％、至少82％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％的序列一致性程度；并且该金属蛋白酶具有金属蛋白酶活性。在具体实施例中，该金属蛋白酶由与如上所述的SEQ ID NO:1具有一定一致性程度的氨基酸序列组成。
[0409] 橙色嗜热子囊菌金属蛋白酶是适于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶的优选实例。在优选的实施例中，该蛋白酶是在WO 2003/048353中披露为SEQ ID NO:2的橙色嗜热子囊菌金属蛋白酶的变体，或具有WO 2011/072191中SEQ ID NO:2的氨基酸1-177，具有以下突变：
[0410] D79L+S87P+A112P+D142L；
[0411] D79L+S87P+D142L；或
[0412] A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
[0413] 另一种金属蛋白酶来源于米曲霉并且包括披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:11的序列，或其氨基酸-23-353；-23-374；-23-397；1-353；1-374；1-397；177-353；177-374；或177-397，以及披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:10。
[0414] 另一种适于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶是包括WO 2010/008841的SEQ ID NO:5的米曲霉金属蛋白酶，或作为分离的多肽的金属蛋白酶，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少约80％、至少82％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％一致性程度；并且该多肽具有金属蛋白酶活性。在具体实施例中，该金属蛋白酶由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。
[0415] 在具体实施例中，金属蛋白酶具有这样一种氨基酸序列，该氨基酸序列与橙色嗜热子囊菌或米曲霉金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177相差四十个、三十五个、三十个、二十五个、二十个或相差十五个氨基酸。
[0416] 在另一个实施例中，金属蛋白酶具有这样一种氨基酸序列，该氨基酸序列与这些金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177相差十个、或相差九个、或相差八个、或相差七个、或相差六个、或相差五个氨基酸，例如，相差四个、相差三个、相差两个、或相差一个氨基酸。
[0417] 在具体实施例中，该金属蛋白酶a)包括以下各项或b)由以下各项组成
[0418] i)WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177的氨基酸序列；
[0419] ii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23-353、-23-374、-23-397、1-353、1-374、1-397、177-353、177-374或177-397的氨基酸序列；
[0420] iii)WO 2010/008841的SEQ ID NO：5的氨基酸序列；或
[0421] i)、ii)和iii)的具有蛋白酶活性的序列的等位基因变体或片段。
[0422] WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177或WO 2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23-353、-23-374、-23-397、1-353、1-374、1-397、
177-353、177-374或177-397的片段是具有自这些氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施例中，片段包含至少75个氨基酸残基、或至少100个氨基酸残基、或至少125个氨基酸残基、或至少150个氨基酸残基、或至少160个氨基酸残基、或至少165个氨基酸残基、或至少170个氨基酸残基、或至少175个氨基酸残基。
177-353、177-374或177-397的片段是具有自这些氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施例中，片段包含至少75个氨基酸残基、或至少100个氨基酸残基、或至少125个氨基酸残基、或至少150个氨基酸残基、或至少160个氨基酸残基、或至少165个氨基酸残基、或至少170个氨基酸残基、或至少175个氨基酸残基。
[0423] 在另一个实施例中，该金属蛋白酶与另一种蛋白酶组合，该蛋白酶是例如真菌蛋白酶，优选是酸性真菌蛋白酶。
[0424] 可商购产品包括 ESPERASETM、FLAVOURZYMETM、NOVOZYMTMFM 2.0L及iZyme Ba(可获得自诺维信公司，丹麦)以及来自美国的杜邦工业生物科学的GC106TM和SPEZYMETMFAN，以及来自DSM的
[0425] 本发明通过以下编号的段落来进一步说明。
[0426] 段落[1]一种具有普鲁兰酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：
[0427] (a)与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％序列一致性的多肽或与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少93％序列一致性的多肽；
[0428] (b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列具有至少85％一致性或由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:12的成熟多肽编码序列具有至少93％一致性；
[0429] (c)(a)或(b)的多肽的具有普鲁兰酶活性的片段。
[0430] 段落[2]如段落1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
[0431] 段落[3]如段落1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
[0432] 段落[4]如段落1-3中任一项所述的多肽，该多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
[0433] 段落[5]如段落1-3中任一项所述的多肽，该多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:12的成熟多肽编码序列具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
[0434] 段落[6]如段落1所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的成熟多肽或者由其组成。
[0435] 段落[7]如段落1所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:11的成熟多肽或者由其组成。
[0436] 段落[8]如段落6或7所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:9的氨基酸34至861或SEQ ID NO:11的氨基酸34至861。
[0437] 段落[9]一种组合物，该组合物包括如段落1-8中任一项所述的多肽。
[0438] 段落[10]根据段落9所述的组合物，该组合物包括一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、以及蛋白酶。
[0439] 段落[11]根据段落9和10中任一项所述的组合物，该组合物包括这些酶：普鲁兰酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及蛋白酶；或普鲁兰酶、α-淀粉酶以及蛋白酶；或普鲁兰酶、葡糖淀粉酶以及α-淀粉酶；或普鲁兰酶以及β-淀粉酶。
[0440] 段落[12]根据段落11所述的组合物，其中该α-淀粉酶选自：i)变体嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，与在SEQ ID NO:13中阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代I181*+G182*+N193F；或ii)与SEQ ID NO:13的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体。
[0441] 段落[13]根据段落11所述的组合物，其中该α-淀粉酶选自：i)变体嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，与在SEQ ID NO:13中阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；或ii)与SEQ ID NO:13的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体。
[0442] 段落[14]根据段落11所述的组合物，其中该α-淀粉酶选自：i)变体嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，与在SEQ ID NO:13中阐述的野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；或ii)与SEQ ID NO:13的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体。
[0443] 段落[15]根据段落11所述的组合物，其中该α-淀粉酶选自：i)具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶变体，与在SEQ ID NO:14中阐述的杂交微小根毛霉α-淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代G128D+D143N；或ii)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体。
[0444] 段落[16]根据段落11所述的组合物，其中该葡糖淀粉酶选自：i)变体草酸青霉菌葡糖淀粉酶，与在SEQ ID NO:15中阐述的野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代K79V；或ii)与SEQ ID NO:15具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体。
[0445] 段落[17]根据段落11所述的组合物，其中该葡糖淀粉酶选自：i)变体草酸青霉菌葡糖淀粉酶，与在SEQ ID NO:15中阐述的野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代P2N+P4S+P11F+T65A+K79V+Q327F；或ii)与SEQ ID NO:15具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体。
[0446] 段落[18]根据段落11所述的组合物，其中该葡糖淀粉酶选自：i)在SEQ ID NO:16中阐述的血红密孔菌葡糖淀粉酶；或ii)与SEQ ID NO:16具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的葡糖淀粉酶。
[0447] 段落[19]根据段落11所述的组合物，其中该葡糖淀粉酶选自：i)在SEQ ID NO:17中阐述的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶；或ii)与SEQ ID NO:17具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的葡糖淀粉酶。
[0448] 段落[20]根据段落11所述的组合物，其中该葡糖淀粉酶选自：i)密粘褶菌葡糖淀粉酶变体，与在SEQ ID NO:18中阐述的野生型密粘褶菌葡糖淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代S95P+A121P；或ii)与SEQ ID NO:18具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体。
[0449] 段落[21]根据段落11所述的组合物，其中该蛋白酶选自：i)在SEQ ID NO:19中阐述的激烈热球菌蛋白酶氨基酸序列；或ii)与SEQ ID NO:19具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的蛋白酶。
[0450] 段落[22]根据段落11所述的组合物，其中该蛋白酶选自：i)变体橙色嗜热子囊菌蛋白酶，与在SEQ ID NO:20中阐述的野生型橙色嗜热子囊菌蛋白酶氨基酸序列相比，该变体包括取代A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；或与SEQ ID NO:20具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体蛋白酶。
[0451] 段落[23]根据段落9-22中任一项所述的组合物，其中该组合物包括普鲁兰酶和葡糖淀粉酶以及任选地α-淀粉酶，并且其中该普鲁兰酶选自与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽，并且该葡糖淀粉酶选自i)密粘褶菌葡糖淀粉酶变体，与在SEQ ID NO:18中阐述的野生型密粘褶菌葡糖淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代S95P+A121P；或ii)与SEQ ID NO:18具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体，并且该α-淀粉酶选自：i)具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶变体，与在SEQ ID NO:14中阐述的杂交微小根毛霉α-淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代G128D+D143N；或ii)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体。
[0452] 段落[24]根据段落1-8中任一项所述的多肽用于由含淀粉材料生产糖浆和/或发酵产物的用途。
[0453] 段落[25]根据段落12所述的用途，其中该淀粉材料是经糊化或未经糊化的淀粉材料。
[0454] 段落[26]一种由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
[0455] (a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；
[0456] (b)在葡糖淀粉酶存在下使液化材料糖化，并且
[0457] (c)用发酵生物进行发酵；
[0458] 其中在如段落1-8中任一项所述的多肽的存在下进行步骤(a)和/或步骤(b)。
[0459] 段落[27]一种由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
[0460] (a)在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；并且[0461] (b)用发酵生物进行发酵，
[0462] 其中使用如段落1-8中任一项所述的至少葡糖淀粉酶以及多肽进行步骤(a)。
[0463] 段落[28]根据段落27所述的方法，其中在步骤(a)中添加该α-淀粉酶。
[0464] 段落[29]根据段落26-28所述的方法，其中同时进行糖化和发酵。
[0465] 段落[30]一种由含淀粉材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；(b)在葡糖淀粉酶存在下使液化材料糖化，其中在步骤(b)的过程中存在如段落1-8中任一项所述的普鲁兰酶。
[0466] 段落[31]根据段落26-30中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料选自：大麦、豆类、树薯、谷物、玉米、买罗高梁、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、木薯、小麦以及全谷物或其任何混合物。
[0467] 段落[32]一种编码如段落1-8中任一项所述的多肽的多核苷酸。
[0468] 段落[33]一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如段落31所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽在表达宿主内产生的一个或多个控制序列。
[0469] 段落[34]一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如段落32所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列。
[0470] 段落[35]一种产生如段落1-8中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养如段落33所述的宿主细胞。
[0471] 段落[36]如段落35所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。
[0472] 段落[37]一种全培养液配制品或细胞培养组合物，包括如段落1-8中任一项所述的多肽。
[0473] 本发明进一步通过以下实例进行描述，这些实例不应被解释成限制本发明的范围。
[0474] 材料和方法
[0475] α-淀粉酶活性(KNU(T))
[0476] 可以使用马铃薯淀粉作为底物来确定淀粉分解活性。此方法是基于由酶分解改性的马铃薯淀粉，并且该反应随后是将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合。最初形成微黑蓝色，但淀粉分解过程中蓝色变弱并且然后逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准品比较。
[0477] 将一个Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU(T))定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和pH 5.6下)糊精化5260mg淀粉干物质Merck可溶性淀粉(Merck Amylum solubile)的酶量。
[0478] 葡糖淀粉酶活性测定(AGU)
[0479] 可以按葡糖淀粉酶单位(AGU)来测量葡糖淀粉酶活性。
[0480] Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。
[0481] 可以使用自动分析仪系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，由此使存在的任何α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β-D-葡萄糖特异性反应，形成NADH，在340nm下使用光度计测定该NADH作为原始葡萄糖浓度的量度。
[0482] AMG孵育： 底物： 麦芽糖23.2mM
缓冲液： 乙酸盐0.1M
pH： 4.30±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
酶工作范围： 0.5AGU/mL至4.0AGU/mL
缓冲液： 乙酸盐0.1M
pH： 4.30±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
酶工作范围： 0.5AGU/mL至4.0AGU/mL
[0483]颜色反应：
GlucDH： 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD： 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
pH： 7.60±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
GlucDH： 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD： 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
pH： 7.60±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
[0484] 普鲁兰酶活性(NPUN)的确定
[0485] 相对于诺维信普鲁兰酶标准品测量NPUN中的内切-普鲁兰酶活性。一个普鲁兰酶单位(NPUN)定义为在标准条件下(0.7％红色普鲁兰(redpullulan)(麦格酶公司(Megazyme)，pH 5，40℃，20分钟)每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。使用红色普鲁兰以NPUN/ml测量该活性。
[0486] 将1ml稀释的样品或标准品在40℃下孵育2分钟。添加0.5ml 2％红色普鲁兰、0.5M KCl、50mM柠檬酸(pH 5)并混合。将这些管在40℃下孵育20分钟并且通过添加2.5ml 80％乙醇终止。将这些管在室温下静置10-60分钟，随后以4000rpm离心10分钟。然后在510nm处测量上清液OD并且使用标准品曲线计算活性。
[0487] 糖谱和溶解的干固体的确定
[0488] 通过HPLC确定淀粉水解物的糖组成并且将葡萄糖产率随后计算为DX。通过测量折射率而确定淀粉水解物的溶解的(可溶性)干固体的°BRIX。
[0489] 实例
[0490] 实例1：嵌合体普鲁兰酶变体的构建
[0491] 将来自枯草芽孢杆菌菌株的、携带来自嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的基因组DNA(芽孢杆菌-17840(NCBI)(NCIMB11639保藏17.02.1981，源自希勒勒丹麦(Denmark)的土壤)(SEQ ID NO:1)(EP 063909)和来自环境样品的脱支
芽孢杆菌(芽孢杆菌-18489(NCBI))(SEQ ID NO:3)在三重启动子系统(如WO 99/43835所述)的控制下使用 组织试剂盒(马歇雷-纳高公司(MACHEREY-NAGEL)根据其程
序进行分离，所述三重启动子系统由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、和包括稳定序列的苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。将编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)的基因与普鲁兰酶基因盒(描述于例如戴德瑞奇森
(Diderichsen)，B.；波尔森(Poulsen)，G.B.；约根森(Joergensen)，S.T.；“枯草芽孢杆菌的一种有用的克隆载体”(A useful cloning vector for Bacillus subtilis)质粒(Plasmid)30:312(1993))相关联，并且用作选择标记物。
芽孢杆菌(芽孢杆菌-18489(NCBI))(SEQ ID NO:3)在三重启动子系统(如WO 99/43835所述)的控制下使用 组织试剂盒(马歇雷-纳高公司(MACHEREY-NAGEL)根据其程
序进行分离，所述三重启动子系统由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、和包括稳定序列的苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。将编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)的基因与普鲁兰酶基因盒(描述于例如戴德瑞奇森
(Diderichsen)，B.；波尔森(Poulsen)，G.B.；约根森(Joergensen)，S.T.；“枯草芽孢杆菌的一种有用的克隆载体”(A useful cloning vector for Bacillus subtilis)质粒(Plasmid)30:312(1993))相关联，并且用作选择标记物。
[0492] 上述菌株的基因组分别包含编码SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的普鲁兰酶基因。
[0493] 这些基因组DNA用作采用下面的引物进行PCR扩增的模板。
[0494] JPUL-006 PCRfrag1
[0495] 正向引物：SEQ NO:5
[0496] 反向引物：SEQ NO:6
[0497] 模板：具有SEQ ID NO:1的芽孢杆菌属基因组
[0498] JPUL-008 PCR frag1
[0499] 正向引物：SEQ NO:5
[0500] 反向引物：SEQ NO:7
[0501] 模板：具有SEQ ID NO:1的芽孢杆菌属基因组
[0502] 将PCR片段在0.7％琼脂糖凝胶中分离并且通过凯杰凝胶提取试剂盒(Qiagen Gel extraction kit)回收，并且然后使用第一PCR片段作为正向大引物和反向引物(SEQ NO:8)、使用含有SEQ ID NO:3普鲁兰酶基因的枯草芽孢杆菌基因组作为模板进行第二轮PCR扩增。
[0503] 将生成的具有普鲁兰酶基因与芽孢杆菌属基因组侧翼区的PCR片段和CAT基因整合到枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组中。
[0504] 枯草芽孢杆菌菌株携带具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列(表示为P6)的基因以及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列(表示为P8)的基因。将它们的基因组DNA分离以确认它们具有相应的DNA序列(分别为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12)。
[0505] 实例2：普鲁兰酶测定
[0506] 红色普鲁兰测定(麦格酶公司(Megazyme))
[0507] 底物溶液
[0508] 0.1g红色普鲁兰(麦格酶(megazyme)S-RPUL)
[0509] 0.75ml 2M乙酸钠，pH 5.5
[0510] 14.25ml H2O
[0511] 将10μl的酶样品与80μl的底物溶液混合，并且在设定温度(例如55℃、60℃、65℃)下孵育20min。将50μl的乙醇添加至反应混合物并且在3500rpm下离心10min。
[0512] 小心地取出上清液并且确定吸光度A510。
[0513] PAHBAH普鲁兰测定
[0514] 底物溶液
[0515] 0.15g BH4普鲁兰
[0516] 25ml 50mM乙酸钠缓冲液，pH 5.5
[0517] PAHBAH溶液
[0518] 0.0552g乙酸铋(III)
[0519] 0.2g PAHBAH
[0520] 0.5g酒石酸钠钾，四水化合物
[0521] 10ml 500mM NaOH
[0522] 将10μl的酶样品与110μl的底物溶液混合，并且在设定温度(例如55℃、60℃、65℃)下孵育20min。将40μl的PAHBAH溶液添加至反应混合物，在50℃下孵育另外的20min，并且确定吸光度A405。
[0523] 里氏可溶性蜡质淀粉测定
[0524] 底物溶液
[0525] 0.2g里氏蜡状玉米淀粉
[0526] 2.5ml 2M乙酸钠
[0527] 97.5ml H2O
[0528] 将5μl的酶样品与110μl的底物溶液混合，并且在设定温度(例如55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)下孵育20min。将100μl的0.15％I2/1.5％KI溶液添加至反应混合物，并且确定吸光度A610。
[0529] 实例3：热活性的评估
[0530] 将在实例1中构建的芽孢杆菌克隆在220rpm、37℃下在24孔或96孔MTP中发酵，该MTP含有TB-gly培养基(13.3g/L BactoTM胰蛋白胨，26.6g/L BactoTM酵母提取物D,4.4g/L甘油)，该培养基含有6mg/L氯霉素，并且在不同温度下通过里氏可溶性淀粉测定测量普鲁兰酶活性。
[0531] 热活性(淀粉测定)
[0532] 编号 67℃/55℃之比P6 63％
P8 80％
SEQ ID NO:1普鲁兰酶 47％
SEQ ID NO:3普鲁兰酶 38％
P8 80％
SEQ ID NO:1普鲁兰酶 47％
SEQ ID NO:3普鲁兰酶 38％
[0533] 实例4：芽孢杆菌属菌株的发酵
[0534] 在220rpm、37℃下，在回转式摇床上的500ml带挡板烧瓶中发酵枯草芽孢杆菌菌株，这些烧瓶含有100ml TB-gly(添加有6mg/l氯霉素)。离心培养物(20000x g，20min)，并且小心地从沉淀慢慢倒出上清液。将上清液通过0.45μm过滤单元过滤以除去剩余的芽孢杆菌属宿主细胞。
[0535] 实例5：普鲁兰酶的纯化
[0536] 通过β-环糊精亲和柱并且随后通过阴离子交换柱层析进行普鲁兰酶的纯化。纯化之后，将普鲁兰酶针对20mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)进行透析并且浓缩。
[0537] 实例6：酶热稳定性测定
[0538] 将纯化的酶用50mM乙酸钠(pH 5.0或4.3)稀释至0.5mg/ml并与等体积的用Milli-Q水稀释的SYPRO Orange(英杰公司(Invitrogen))混合。将三十微升的混合物溶液转移至LightCycler 480多孔板96(LightCycler 480Multiwell Plate 96)(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))并将板密封。
[0539] TSA的设备参数：
[0540] 仪器：LightCycler 480实时PCR系统(罗氏应用科学部(Roche Applied Science))
[0541] 扫描速率：0.02℃/秒
[0542] 扫描范围：37℃-96℃
[0543] 扫描速率：1.26℃/min
[0544] 积分时间：0.5秒
[0545] 激发波长465nm
[0546] 发射波长580nm
[0547] 将获得的荧光信号标准化进0和1的范围内。将解链温度(Tm)定义为标准化值最接近0.5时的温度。
[0548]
[0549]
[0550] 实例7：温度活性测定
[0551] 在50℃-80℃的范围内、pH 5.0下使用减少的普鲁兰作为底物，通过PAHBAH测定进行普鲁兰酶的活性测定。普鲁兰酶SEQ ID NO1和NO3，以及P8的最适温度分别是大约62℃、62℃和65℃。
[0552] 温度(℃) P8 SEQ NO:1 SEQ NO:350 59.8％ 64.7％ 77.7％
53 71.1％ 74.1％ 86.7％
56 81.1％ 85.8％ 94.4％
59 88.4％ 90.3％ 98.0％
62 97.7％ 100.0％ 100.0％
65 100.0％ 99.5％ 84.6％
68 97.4％ 87.6％ 32.7％
71 94.4％ 60.4％ 5.8％
74 44.2％ 17.9％ 3.6％
77 14.4％ 9.7％ 3.4％
80 11.9％ 8.1％ 3.8％
53 71.1％ 74.1％ 86.7％
56 81.1％ 85.8％ 94.4％
59 88.4％ 90.3％ 98.0％
62 97.7％ 100.0％ 100.0％
65 100.0％ 99.5％ 84.6％
68 97.4％ 87.6％ 32.7％
71 94.4％ 60.4％ 5.8％
74 44.2％ 17.9％ 3.6％
77 14.4％ 9.7％ 3.4％
80 11.9％ 8.1％ 3.8％
[0553] 实例8：淀粉糖化中P8普鲁兰酶杂合酶的比较实例
[0554] 进行酿造实例，其中将P8(SEQ ID NO:11)与商用普鲁兰酶产品NovozymR26062(来自嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的普鲁兰酶，可获得自诺维信公司)进行对比。在设置于温控水浴中的烧杯中连续搅拌完成淀粉糖化。每个烧杯含有50g干净并且经碾磨的麦芽和200mL在54℃下的预热水。将三毫升的22g/L CaCl2溶液同样添加至每个淀粉糖化烧杯中。
[0555] 试验中淀粉糖化方案。加热速率被设定为1℃/min。
[0556] 温度(℃) 保持时间(min)54 20
64 40
72 20
78 40
95* 10
64 40
72 20
78 40
95* 10
[0557] *在95℃下的步骤是灭活步骤，用以终止任何剩余的酶活性
[0558] 所使用的酶浓度为对于JPUL-008每烧杯1.5mg酶蛋白以及对于NovozymeR26062对应于每杯185μL产物的当量酶蛋白剂量。在不同保持温度下将普鲁兰酶添加至每个杯中，即通过在54℃、64℃、72℃或78℃下进行添加以测试两种普鲁兰酶，并且与无外源普鲁兰酶的对照相比较。根据表X完成淀粉糖化。淀粉糖化之后，将每个杯中的内容物用去离子水调整至300g，并且在糖分析之前通过Whatman滤纸进行过滤。在带有RI检测器的Dionex ICS-5000上进行糖分析。简而言之，分离发生在保护柱和两个BioRad Aminex HPX-87H(300x
7.8mm)柱上，都保持在60℃下。该程序长40min，具有在0.4mL/min的流动下使用50mM H2SO4的等度洗脱谱。相对果糖、葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖的标准量化峰。使用葡萄糖标准曲线量化DP4+部分。
7.8mm)柱上，都保持在60℃下。该程序长40min，具有在0.4mL/min的流动下使用50mM H2SO4的等度洗脱谱。相对果糖、葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖的标准量化峰。使用葡萄糖标准曲线量化DP4+部分。
[0559] 结果
[0560] 本发明的杂合普鲁兰酶，P8，相比于NovozymR26062在去除更高的分子量的DP4+部分方面更有效。当在72℃下进行酶添加时，这种效果更为显着，其中据信P8增加的热稳定性产生最大的影响。然而，除了在78℃下之外，在所有温度下都可见DP4+部分从P8中改进性减少，其中两种酶似乎都已经失活。从可发酵糖数据清楚可见，普鲁兰酶的添加在较低温度下最为有效。据信这部分是由于酶和底物之间更久的接触时间，并且部分是由于具有低于普鲁兰酶热稳定性的麦芽酶与普鲁兰酶的协同作用。
[0561] 可发酵糖(DP1-DP3)和DP4+的、来自不同温度下添加普鲁兰酶的结果。
[0562]
[0563] 在此描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
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