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一种创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法

阅读：91发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于番茄生物技术和转基因技术领域，公开一种通过基因编辑创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法。本发明通过设计SISGR1基因的编辑靶位点，构建pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA表达载体，利用农杆菌介导法转化到果实低番茄红素含量的番茄材料中，通过抗生素筛选获得阳性T0代转基因番茄植株；T0代自交获得T1代植株，从T1代中筛选不含有外源转基因成份但SISGR1基因发生纯合突变且果实番茄红素含量高的植株，即为高番茄红素材料。本方法可以显著地提高番茄果实中番茄红素的含量，在番茄高品质分子育种中具有良好的应用前景。，下面是一种创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种通过基因编辑创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，其特征在于：在SISGR1基因（如SEQ ID NO.1所示）的第一个外显子和第二个外显子上设计两个gRNA靶位点，第一个gRNA靶位点的序列为：5’-TCTAAGCTCAACAATGAACA-3’，SEQ ID NO.2所示；第二个gRNA靶位点的序列为：5’-AGAACATATACACTGACTCA-3’，SEQ ID NO.3所示。
2.一种通过基因编辑创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，其特征在于，该创制方法包括以下步骤：
（1）通过酶切-连接，将两个gRNA，如SEQ ID NO.2所示和SEQ ID NO.3所示；整合到已构建好的植物表达载体pCGR1301-CRISPR/Cas9中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA载体；
（2）将pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA表达载体导入农杆菌中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌；
（4）以含SISGR1基因的低番茄红素含量的番茄为材料，用pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌侵染其外植体的下胚轴组织；
（5）诱导愈伤组织，经卡纳霉素抗性筛选，得到转基因阳性植株；
（6）获得阳性转基因株系后，经基因靶位点PCR扩增、测序、外援基因插入分析和突变体表型验证为阳性的纯合株系，即为完全丧失SISGR1功能且无外援基因插入的果实高番茄红素含量的番茄材料突变体。
3.根据权利要求2所述的一种通过基因编辑创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的CRISPR/Cas9骨架载体为pCGR1301。
4.根据权利要求2所述的一种通过基因编辑创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的农杆菌为根瘤杆菌GV3101。
5.根据权利要求2所述的一种通过基因编辑创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的检测靶位点突变的PCR引物为：SISGR-F：5’-GGCTCTTAAATAAACTTCTTCC-3’，如SEQ ID NO.4所示；SISGR-R：5’-TACGCAACCTTAGTCCTACCT-
3’，如SEQ ID NO.5所示。
6.权利要求1 5任一项所述的一种通过基因编辑技术创制果实高番茄红素含量的番茄~
材料的方法，所创制的果实高番茄红素含量的番茄材料在番茄育种中的应用。

说明书全文

一种创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种通过基因编辑系统对抑制番茄红素提高的基因进行编辑、创制果实高番茄红素含量的番茄突变体材料的方法。

背景技术

[0002] 番茄(Solanum lycopersicum)是重要的蔬菜和经济作物，在世界范围内广受欢迎。我国是鲜食番茄第一大生产国，也是加工番茄的第三大生产国，在世界番茄市场中具有举足轻重的地位。近年来，由于经济原因及品质问题，我国番茄酱的出口量大幅减少，加工番茄栽培面积也萎缩严重。番茄红素(lycopene)含量是衡量番茄果实品质的重要指标，番茄的红色就是因它而来。作为一种功能性天然色素，番茄红素主要应用于食品添加剂、天然着色剂、化妆品等行业。番茄红素具有独特的理化性质和抗癌、抗氧化、增强免疫力、预防心血管疾病等多种生理功能。目前，番茄红素已经被世界粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)及联合国食品添加剂委员会(JECFA)认定为A类营养素。但动物和人体不能合成番茄红素，食物是唯一获取来源。目前市场上至少85％的番茄红素是来自番茄或番茄制品，这些制品中番茄红素的含量从42mg/kg到365mg/kg不等，番茄加工副产物中亦含有丰富的番茄红素。提高番茄中番茄红素的含量有着重要的意义。

[0003] 目前，通过传统回交的方法将一个低番茄红素含量的自交系改良成高番茄红素含量的自交系，一般需要至少7代才能转育成功，包括1代杂交，至少5代的回交和1次自交，按一年种植2代计算，至少需要3年半的时间才能完成。基因靶向编辑技术(gene targeted editing)是一种可以在全基因组水平对DNA序列进行改造编辑的遗传操作技术。CRISPR/Cas9基因编辑技术是继TALEN基因编辑技术之后又一重大突破。该技术通过RNA指导Cas9核酸酶对靶向基因进行特定DNA编辑。CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率更高，Cas9系统的载体构建与使用也更加便捷，并已应用在各物种中，是目前使用广泛的基因编辑技术。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种通过基因编辑创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，以克服现有技术创制高番茄红素番茄耗时耗力的不足。

[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一、一种通过基因编辑创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，在SISGR1基因(如SEQ ID NO.1所示)的第一个外显子和第二个外显子上设计两个gRNA靶位点，第一个gRNA靶位点的序列为：5’-TCTAAGCTCAACAATGAACA-3’，SEQ ID NO.2所示；第二个gRNA靶位点的序列为：5’-AGAACATATACACTGACTCA-3’，SEQ ID NO.3所示。

[0006] 二、一种通过基因编辑创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，该创制方法包括以下步骤：(1)通过酶切-连接，将两个gRNA，如SEQ ID NO.2所示和SEQ ID NO.3所示；整合到已构建好的植物表达载体pCGR1301-CRISPR/Cas9中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA载体；(2)将pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA表达载体导入农杆菌中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌；(4)以含SISGR1基因的低番茄红素含量的番茄为材料，用pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌侵染其外植体的下胚轴组织；(5)诱导愈伤组织，经卡纳霉素抗性筛选，得到转基因阳性植株；(6)获得阳性转基因株系后，经基因靶位点PCR扩增、测序、外援基因插入分析和突变体表型验证为阳性的纯合株系，即为完全丧失SISGR1功能且无外援基因插入的果实高番茄红素含量的番茄材料突变体。进一步设计优化，所述步骤(2)中的CRISPR/Cas9骨架载体为pCGR1301。进一步设计优化，所述步骤(3)中的农杆菌为根瘤杆菌GV3101。进一步设计优化，步骤(5)中所述的检测靶位点突变的PCR引物为：SISGR-F：5’-GGCTCTTAAATAAACTTCTTCC-3’，如SEQ ID NO.4所示；SISGR-R：5’-TACGCAACCTTAGTCCTACCT-3’，如SEQ ID NO.5所示。

[0007] 三、一种通过基因编辑技术创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，所创制的果实高番茄红素含量的番茄材料在番茄育种中的应用。

[0008] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明通过设计SISGR1突变靶位点，构建pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA表达载体，利用农杆菌介导法导入含有SISGR1基因的低番茄红素含量的自交系材料中，以卡纳霉素抗性标记筛选获得阳性转基因植物；经基因测序和表型观察确定的纯合突变且不含外源基因插入的株系，即为完全丧失SISGR1功能、番茄红素含量高的番茄突变体。本发明可以显著提高番茄果实中番茄红素的含量，在番茄高品质分子育种中具有良好的应用前景。附图说明

[0009] 图1为SISGR1基因的结构和CRISPR/Cas9基因编辑sgRNA靶位点的信息，其中E1-E4为1-4号外显子；图2为T0代植株SISGR1基因编辑的测序结果，与野生型相比，有3个单株发生了突变，其中单株2为突变纯合体。

具体实施方式

[0010] 实施例一：(1)将控制番茄果实番茄红素含量的基因SISGR1进行序列分析，利用CRISPR-Plant在线设计工具，根据CRISPR/Cas9技术设计靶位点的原则，将两个靶位点分别设计在第一个外显子和第二个外显子上，两个靶点序列间距为260bp；第一个gRNA靶位点的序列为：5’-TCTAAGCTCAACAATGAACA-3’；(位于SEQ ID NO.1中自5’端第222～241位)；第二个gRNA靶位点的序列为：5’-AGAACATATACACTGACTCA-3’；(位于SEQ ID NO.1中自5’端第502～521位)实施例二、创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法：(1)通过酶切-连接，将两个gRNA整合到已构建好的植物表达载体pCGR1301-CRISPR/Cas9中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA载体；(2)将pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA表达载体导入农杆菌中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌；(3)以低番茄红素含量的番茄(含SISGR1基因)为材料，用pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌侵染其下胚轴组织；(4)诱导愈伤组织，经卡纳霉素抗性筛选，得到转基因阳性植株；(5)获得阳性转基因株系T0代后，提取基因组DNA，在靶位点的两侧设计引物，对目的片段进行PCR扩增，纯化PCR扩增产物后进行测序，根据测序结果筛选纯合突变体，并检测T0代突变体果实的番茄红素含量进行验证；收取T0代突变体植株自交种子，即T1代，再筛选T1代植株中不含外源基因插入的株系；经基因靶位点测序、外援基因插入分析和突变体表型验证为阳性的纯合株系，即为完全丧失SISGR1功能且无外援基因插入的高番茄红素含量的突变体。

[0011] 实施例三、基于CRISPR/Cas9技术创制高番茄红素含量的突变体在番茄育种中的应用。具体的，选择所述SISGR1纯合突变且无外援基因插入的高番茄红素含量的番茄突变体为材料，通过杂交等育种技术进行高番茄红素含量的番茄育种；(1)SISGR1基因序列如SEQ ID NO.1所示(2629bp)；其中，SISGR1基因的编码序列(CDS)由SEQ ID NO.1中自5’端第189位～305位碱基、第406位～579位碱基、第1698位～1865位碱基、第2033位～2392位碱基组成；(2)中所述的CRISPR/Cas9骨架载体为pCGR1301；步骤(3)中所述的农杆菌为根瘤杆菌GV3101。

[0012] 实施例四、实践操作，将两个靶位点分别设计在第一个外显子和第二个外显子上，两个靶点序列间距为260bp；第一个gRNA靶位点的序列为：5’-TCTAAGCTCAACAATGAACA-3’；(位于SEQ ID NO.1中自5’端第222～241位)；第二个gRNA靶位点的序列为：5’-AGAACATATACACTGACTCA-3’；(位于SEQ ID NO.1中自5’端第502～521位)；通过酶切-连接的方式连接到构建好的植物表达载体pCGR1301-CRISPR/Cas9中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA重组载体；将连接正确的pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA质粒转化农杆菌GV3101，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌；以野生型番茄M82的下胚轴为外植体进行农杆菌介导转化，诱导愈伤组织，经卡纳霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因阳性单株3个，分别为单株1、单株2、单株3。进行转基因番茄中SISGR1基因突变体的检测：根据目的基因，在两个gRNA序列上游和下游分别设计引物，引物序列分别为：SISGR-F：5’-GGCTCTTAAATAAACTTCTTCC-3’；SISGR-R：5’-TACGCAACCTTAGTCCTACCT-3’。分别提取所获得的3个转基因阳性植株和野生型植株M82的基因组DNA。以上述DNA为模板进行PCR反应，PCR反应体系：DNA模板1μL，Pfu PCR MasterMix(2×)12.5μL，引物SISGR-F 1μL，引物SISGR-R
1μL，ddH2O 9.5μL；PCR反应程序：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃延伸5分钟。PCR产物回收纯化，进行测序。通过测序结果判断突变为纯合突变还是杂合突变。3个转基因阳性单株中，单株1和单株3均为杂合突变，单株2为纯合突变(图2)。将获得的纯合突变单株2种植于温室，当果实成熟时检测果实番茄红素含量，单株2果实番茄红素的含量明显高于野生型M82果实番茄红素的含量(表1)。然后，将单株2的T0代植株进行自交，获得了T1代的种子。为了在T1代中获得不含外源转基因片段的个体，通过PCR方法扩增T1代植株中的CRISPR/Cas9载体序列(正向引物：5’-
cttcatcaagagacagctggtg-3’如SEQ ID NO .6所示；反向引物：5’-
cttagggtcccagtccttcttt-3’如SEQ ID NO.7所示)。结果发现，本实施例单株2的T1代植株中1/4的植株(33/127)不含外源转基因Cas9片段。

[0013] 表1单株2与野生型M82间果实番茄红素含量比较随后，检测SISGR1的突变是否稳定遗传到不含外源转基因成份的T1植株中。利用相同的引物(SISGR-F：5’-GGCTCTTAAATAAACTTCTTCC-3’和SISGR-R：5’-
TACGCAACCTTAGTCCTACCT-3’)PCR扩增SISGR1基因片段。然后对PCR产物进行测序，将测序结果与野生型SISGR1基因进行序列比对，检测在sgRNA靶区位置存在的碱基突变(如图2中的单株2)，说明CRISPR/Cas9产生的突变可以从T0代稳定地遗传到T1代。不含外源转基因成份且SISGR1发生纯合突变的T1代植株即为新的高番茄红素材料。

[0014] 本发明方法中，从构建CRISPR/Cas9载体，将其转化到低番茄红素含量的M82下胚轴中，再生获得T0代转基因番茄植株这段过程需要6个月，T0代植株进行自交，获得了T1代的种子所需时间为4个月，对T1代进行筛选需时为1个月，完成整个过程需11个月，即1年以内完成了高番茄红素新材料的创制，大大缩短了改良过程。

[0015] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

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