技术领域
[0001] 本
发明涉及
植物病害鉴定技术领域，特别涉及一种辣椒苗期疫病抗性的浸根接种鉴定方法。
背景技术
[0002] 辣椒疫病在我国的发生危害日益严重，已成为影响辣椒生产的主要病害之一。该病由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici L.)引起，是以孢子囊在
土壤、田间病残体上越冬，借助雨
水或
灌溉水传播病害。辣椒疫病是游动孢子侵染根部引起病害。
幼苗期发病，多从茎基部开始染病，病部出现水渍状软腐，病部以上倒伏。定植后染病，
叶片软腐脱落，茎产生暗绿色病斑，果实发病为水渍状不规则形病斑，果肉软腐。该病害发病周期短，流行速度迅猛，成为辣椒生产上的毁灭性病害，给辣椒产业带来严重的经济损失。一般病株率为20-30％，严重时达80％以上。
[0003] 抗病品种的选育和推广是控制辣椒疫病的主要手段。准确评价品种的抗性显得尤其重要。多年的抗性鉴定方法研究工作表明：病害调查分级标准是抗病鉴定的的重要环节，有的方法分级标准是依据发病面积占植株面积的百分比来划分，如离体叶片接种法，存在发病面积小且不规则的问题；离体接种法，如以叶片或果实作为鉴定材料，忽略了系统抗性反应，且接种时
环境控制尤其是湿度控制要求严格。灌根法是目前最常用的辣椒疫病鉴定方法，但该方法需要大量的孢子，而现有的采用固体培养基培养疫霉菌，大量繁殖疫霉菌的工作量太大，不适于大量材料的筛选，为大规模抗疫病育种材料的筛选带来了不便。
[0004] 因此，建立一套大规模、稳定、准确、简易，最大限度体现出辣椒品种真实抗病性的人工抗病性鉴定方法是一个亟待解决的技术问题。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种辣椒苗期疫病抗性的浸根接种鉴定方法，从而克服
现有技术的上述
缺陷。
[0006] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0007] 一种辣椒苗期疫病抗性的浸根接种鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0008] (1)辣椒苗准备：选取饱满的辣椒
种子消毒催芽处理，然后单粒点播在盛有育苗基质的穴盘内，选取健康完整的辣椒苗用于接种；
[0009] (2)孢子悬浮液制备：将辣椒疫霉菌菌种接种在燕麦固体培养基上进行培养，在25℃下恒温暗培养7d，然后在28℃光照/25℃暗交替培养7d，诱导产生孢子囊，用无菌水冲洗菌体，在4℃放置30min获得孢子悬浮液，通过无菌水稀释，配制成一定浓度的孢子悬浮液，用于接种；
[0010] (3)接种：步骤(1)的辣椒苗生长到一定时期后，用无菌水冲洗干净根部，除去育苗基质，然后用吸水纸拭去表面的水分。50ml锥形瓶内加入孢子悬浮液30ml，每个锥形瓶内插入6棵苗，孢子悬浮液浸泡辣椒苗的根部和茎基部。接种后将植株置于
温度28℃光照16h，25℃黑暗8h的植物
培养箱内，在侵染期间锥形瓶内水缺少时，补充无菌水；
[0011] (4)病情调查与评价：接种后，待出现辣椒疫病发病症状后，选择适宜时间调查每株苗发病情况，按幼苗病情级别进行病情指数调查，进行抗性评价。
[0012] 苗期辣椒疫病分级标准如下：0级—无症状；1级—幼苗根茎部轻微水浸状病斑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；2级—幼苗根茎部水浸状病斑2cm-3cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；3级—幼苗根茎部水浸状病斑超过3cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；4级—幼苗根茎部水浸状病斑大面积蔓延，除生长点外全部落叶或植株萎蔫；5级—植株枯死。
[0013] 病情指数＝∑(各级病株数×相对级值)/(调查总株数×最高级值)×100
[0014] 疫病抗性评价标准：免疫(I)病情指数＝0；高抗(HR)0<病情指数≦10；抗病(R)10<病情指数≦30；中抗(MR)30<病情指数≦50；感病(S)50<病情指数≦70；高感(HS)病情指数>70。
[0015] 优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)的辣椒种子消毒催芽处理包括：将辣椒种子用52～55℃的温水浸种30min，10％的
次氯酸钠溶液浸泡5min，清水冲洗后浸种催芽，
播种于穴盘内，育苗基质为蛭石、草炭和土壤(1：2：1)，经高温
蒸汽灭菌(134℃，30min)备用。
[0016] 优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)的燕麦固体培养基的制作方法为：将燕麦片20g，水1000ml，煮沸30min，双层纱布过滤去渣，上清液补足水至1000ml，加入琼脂20g，煮至琼脂溶化，121℃下高压灭菌20min。
[0017] 优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)接种孢子悬浮液的浓度为10个游动孢子/mL。
[0018] 优选地，上述技术方案中，所述步骤(3)辣椒苗生长到一定时期是指5～6片真叶期。
[0019] 优选地，上述技术方案中，所述步骤(4)的适宜调查时间为接种后第5d。
[0020] 本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
[0021] (1)对病菌的需求量非常小，解决了大量培养菌的耗时耗
力问题，尤其适合大规模的辣椒育种材料的简便快速筛选。本发明中接菌浓度仅10个游动孢子/mL，与灌根法接种疫霉菌浓度1000个游动孢子/mL相比，接菌浓度大大降低。
[0022] (2)苗期浸根接种法发病适中且均匀一致，更符合辣椒疫病真实抗性。浸根接种法将根部和茎基部置于孢子悬浮液中浸泡，符合自然发病情况，每株辣椒苗均匀带菌，发病均匀一致。因此，浸根接种法发病稳定，对品种的抗性鉴定更准确。
[0023] (3)病情指数分级标准科学，易掌握。本发明的苗期接种时期是5～6真叶期，叶片数量有限，病情分级符合辣椒幼苗疫病发病过程，各等级病害特征明显，因此用感病叶片数量来进行疫病苗期分级，得到的结果更可靠，实际应用中非常易于操作和掌握。
[0024] 接种环境要求小，易于操作。浸根法中裸露根部直接浸泡在孢子悬浮液中，没有土壤环境的干扰，也不需要控制环境湿度。
附图说明
[0025] 图1为
实施例中的辣椒育苗图，左边是抗病品种ICPN21-03，右边是感病品种B16144。
[0026] 图2为接种示意图，左侧是用无菌水冲洗去除育苗基质的根部，右侧是幼苗的根部和茎基部通过浸泡在孢子悬浮液中进行接种。
[0027] 图3为实施例中抗感病品种对比图，5～6真叶期的辣椒苗在接菌浓度10个游动孢子/mL下，观察接种后第5d的染病情况，左一和左二是抗病品种ICPN21-03，右一和右二是感病品种B16144。
[0028] 图4为实施例中接种条件对比图，左边是抗病品种ICPN21-03，右边是感病品种B16144，分别在接菌浓度1000、300、100、30、10个游动孢子/mL，寄主苗龄1～2、3～4、5～6、7～8、9～10真叶期，调查时期3、5、7、9d。
具体实施方式
[0029] 下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。
[0030] 以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、
试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
[0031] 实施例
[0032] 一种辣椒苗期疫病抗性的浸根接种鉴定方法，该方法按如下步骤进行：
[0033] 辣椒苗准备：
[0034] 选取辣椒品种35份(表1)。上述品种通过商业途径或科研途径(引进于种子资源库)获得，但是本发明并不局限于上述品种。
[0035] 将辣椒苗播种前进行种子消毒处理，选取饱满的种子，用52～55℃的温水浸种30min，边浸泡边搅拌，10％的次氯酸钠溶液浸泡5min，边浸泡边搅拌，清水冲洗后用清水浸泡48h，将种子从清水中捞出，用纱布包好保湿催芽，待种子露白后，单粒点播在盛有育苗基质的穴盘内。育苗基质为蛭石、草炭和土壤(1：2：1)，经高温蒸汽灭菌(134℃，30min)处理。
按照常规的土肥水管理及病虫害控制措施培育和管理辣椒，期间不使用任何药剂，选取健康完整的辣椒苗用于接种。
[0036] 孢子悬浮液制备：
[0037] 将保存的辣椒疫霉菌接种在燕麦固体培养基上，在25℃下恒温暗培养3d，白色菌丝充分生长繁殖布满整个培养基表面，继续培养4d，然后在28℃光/25℃暗交替培养7d，诱发孢子囊，用无菌水冲洗菌体，4℃放置30min即可用于接种获得孢子悬浮液，用血球计数板在
显微镜观察计数，将其配制成浓度为10个游动孢子/mL的孢子悬浮液。
[0038] 燕麦培养基配方：燕麦片20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
[0039] 燕麦培养基制作过程：将燕麦片20g，水1000ml，煮沸30min，双层纱布过滤去渣，滤液补足水至1000ml，加入琼脂20g，煮至琼脂溶化，分装到锥形瓶，121℃下高压灭菌20min，冷却备用。
[0040] 辣椒苗接种：
[0041] 选取步骤(1)中种植的健康完整的辣椒苗，接种时期为5～6真叶期。用无菌水冲洗干净根部，除去育苗基质，然后用吸水纸拭去表面的水分。50ml锥形瓶内加入孢子悬浮液30ml，每个锥形瓶内插入6棵苗，孢子悬浮液浸泡辣椒苗的根部和茎基部。接种后将植株置于温度28℃光照16h，25℃黑暗8h的植物培养箱内，在侵染期间锥形瓶内水缺少时，补充无菌水。
[0042] 上述品种各接种30棵苗以上，三次重复，以
水处理为对照。
[0043] 病情调查与评价：
[0044] 接种第5d，调查每株苗发病情况，按幼苗病情级别进行病情指数调查，进行抗性评价。
[0045] 苗期辣椒疫病分级标准如下：0级—无症状；1级—幼苗根茎部轻微水浸状病斑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；2级—幼苗根茎部水浸状病斑2cm-3cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；3级—幼苗根茎部水浸状病斑超过3cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；4级—幼苗根茎部水浸状病斑大面积蔓延，除生长点外全部落叶或植株萎蔫；5级—植株枯死。
[0046] 病情指数＝∑(各级病株数×相对级值)/(调查总株数×最高级值)×100
[0047] 疫病抗性评价标准：免疫(I)病情指数＝0；高抗(HR)0<病情指数≦10；抗病(R)10<病情指数≦30；中抗(MR)30<病情指数≦50；感病(S)50<病情指数≦70；高感(HS)病情指数>70。
[0048] (5)辣椒种质资源的抗病性鉴定
[0049] 应用本发明建立的浸根接种鉴定法，对本研究室保存的35个辣椒种质资源进行了疫病抗性鉴定。
[0050] 表1辣椒浸根接种法疫病抗性鉴定
[0051]
[0052]
[0053] 结果表明，接种5d表现为辣椒疫病典型症状，不同抗性品种呈现明显不同。根据病情指数与抗病性的关系对35个品种进行抗性(表1)，其中鉴定为高抗(HR)的仅一个品种，抗(R)疫病品种11个，中抗(MR)品种6个，感病(S)品种12个，高感品种(HS)5个。说明采用浸根法可以将不同辣椒品种进行很好的疫病抗性划分。试验结果与大田调查数据基本一致。
[0054] 对比例1接种菌液浓度
[0055] 比较接种菌液浓度，接种菌液浓度分别为10个游动孢子/mL、30个游动孢子/mL、100个游动孢子/mL、300个游动孢子/mL、1000个游动孢子/mL。辣椒品种选用抗病品种ICPN21-03和感病品种B16144，生长至5～6真叶期，在接种后第5d调查病情。
[0056] 结果表明，辣椒苗期疫病发病率及病情指数随着接种菌液浓度的增大而显著升高。由表2可知，在较高接种菌液浓度1000、300和100个游动孢子/mL处理下，抗病品种的病情指数分别为76.15、51.98和35.94，发病过重，抗性材料变为感病或中抗，不能真实的反映品种的抗性水平。感病品种病情指数在三个浓度下无显著差异，发病一直很重。在接种菌液浓度为10或30个游动孢子/mL时，抗病品种的病情指数分别为16.11和9.32，感病品种的病情指数分别为83.85和73.37，能够真实反映材料本身的抗病性，且抗病品种与感病品种的病情指数差异显著，能明显区分抗感品种，而接种菌液浓度在10个游动孢子/mL时，用菌量更少。因此在苗期人工接种鉴定中，适宜的接种菌液浓度确定为10个游动孢子/mL。
[0057] 表2接种菌液浓度对鉴定效果的影响
[0058]
[0059] 对比例2接种寄主苗龄
[0060] 辣椒苗在1～2、3～4、5～6、7～8、9～10真叶期，进行浸根法最佳接种时期的对比。辣椒品种选用抗病品种ICPN21-03和感病品种B16144，接种浓度10个游动孢子/mL，在接种后第5d调查病情。
[0061] 结果表明，接种寄主苗龄的选择对疫病接种效果影响较大(表3)，随着苗龄的增长，植株的抗病力增强，发病时间增加。1～2、3～4、5～6、7～8、9～10真叶期的病情指数差异显著。其中发病效果最好的是5～6真叶期，接种5d后抗感病品种的的发病率分别为40.76％和100.00％，病情指数分别为9.32和73.37，发病率和病情指数大小适中，真实反映了材料本身的抗病性。1～2真叶期的抗感病品种明显萎蔫或枯死，其对照水处理偶有出现茎基部腐烂的症状，干扰了病情指数调查。出现这种情况可能是苗龄过小，茎基部没有木质化，经受不住多天液体浸泡。1～2、3～4真叶期的抗病品种的病情指数分别为59.93和
30.60，7～8、9～10真叶期的感病品种病情指数分别为61.06和46.29，不能反映材料的真实抗性水平。在7～8、9～10真叶期，苗龄过大，植株抵抗病害的能力较强，侵染
进程和发病时间较长。此外，9～10真叶期的过大苗龄有向生殖生长转变。因此最佳接种苗龄为5～6真叶期为宜。
[0062] 表3寄主苗龄对鉴定效果的影响
[0063]
[0064] 对比例3病情调查时期
[0065] 分别在接种后第3d、5d、7d、9d调查病情，对比接种后病情指数调查时期。辣椒品种选用抗病品种ICPN21-03和感病品种B16144，辣椒生长至5～6真叶期，接种浓度10个游动个孢子/mL。
[0066] 结果表明，在10个游动孢子/mL处理下，辣椒幼苗疫病发病率及病情指数随着处理时间的延长而升高，各处理间差异显著(表3)。接种3d后，感病品种叶片多为可恢复性萎蔫，感病品种的发病率和病情指数分别为81.39％和27.76，发病太轻，不能真实的反映品种的抗性水平。接种7d后，抗病品种的植株多为可恢复性或不可恢复性萎蔫，发病率和病情指数分别为87.45％和31.84，感病品种的植株是明显萎蔫或枯死的状态，发病重，不能真实的反映品种的抗性水平。接种9d后，抗感病品种都表现为明显萎蔫或枯死，发病过重。接种5d后，不萎蔫、可恢复性萎蔫、不可恢复性萎蔫、落叶明显、枯死的植株都存在，抗病品种与感病品种的病情指数分别为9.32和73.37，差异显著，易区分抗感品种，能真实的反映品种的抗性水平。因此适宜的病情调查时期为接种后第5d。
[0067] 表4调查时期对鉴定效果的影响
[0068]
[0069] 对比例4接种方法对比
[0070] 分别采用灌根法、果实接种法和浸根法进行接种。辣椒品种选用抗病品种ICPN21-03和感病品种B16144。
[0071] 灌根法：第6片真叶展平期，辣椒苗在育苗基质中培养，接种前浇透水，距每一植株茎基部1-1.5cm处注入3mL浓度为1000个游动孢子/mL的孢子悬浮液，接种期间保持土壤湿度近饱和状态。接种后第7d第一次调查，第14d第二次调查。
[0072] 果实接种法：选取健康完整青果期的辣椒果实，先后用无菌水和酒精冲洗，用灭菌刀片在果实上切去直径7mm表皮，从准备好的菌盘上切割边长5mm的菌饼，将菌饼有菌丝的一面紧贴在果实伤口上。
铁盘内垫上双层湿
滤纸，放上果实，保鲜膜
覆盖铁盘以保湿。接种后第3d第一次调查，第5d第二次调查。
[0073] 结果表明，采用三种方法接种可以有效区分抗感病品种，抗病品种ICPN21-03和感病品种B16144的发病率和病情指数都有显著差异(表4)。比较3种接种方法，发病最快且严重的为果实接种法，接种第3d即表现为菌丝扩散，出现水浸状病斑，第3d的抗病品种的病情指数和发病率分别为19.70和70.98％，显著高于其它方法。果实接种法发病重于其它两种方法。第一次调查时，浸根法(5d)的抗病品种和感病品种的病情指数分别与灌根法(7d)无显著差异，与鉴定寄主抗感情况相一致，但抗感病品种的发病率显著高于灌根法。第二次调查时，浸根法(7d)的抗病品种的病情指数和发病率显著高于灌根法(14d)。说明浸根法可用于疫病鉴定，具有发病快、发病整齐的特点。
[0074] 浸根法仅10个游动孢子/mL的孢子悬浮液浓度就可以达到接种需求，与灌根法1000个游动孢子/mL相比，菌量需求大大降低。果实接种法是离体接种，要求湿度严格控制，灌根法在接种期间要适时浇水，保持土壤湿度近饱和状态。浸根法根部裸露在菌液中，没有土壤环境的干扰，利于发病，且不需要控制湿度。与灌根法和果实接种法相比，本研究建立的接种方法具有菌量需求小，对接种环境要求小等优点，适于大批量育种材料的抗性筛选。
[0075] 表5接种方法的比较
[0076]
[0077] 虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和
修改，因此本发明的保护范围由
权利要求书及其等同形式所限定。
