【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、塩ストレスにより誘導される新規チオニン遺伝子に関する。 本発明の遺伝子は、植物の塩ストレス耐性を向上させるのに有用である。

【０００２】

【従来の技術】植物は通常の育成環境下においても、常にストレスを受けている。 このようなストレスには、
塩、乾燥、高温、低温、強光、空気汚染等のさまざまなものが含まれるが、農業生産の観点から最も問題となっているのは、塩害及び乾燥である。 塩害は元々塩分の高い地域のみならず、潅漑を行なうことによりそれまで問題のなかった農地においても発生し問題となっている。
現在、全耕地の１０％以上が何らかの塩害を受けているといわれている。 また人口増加に追い付くための食料生産増加を行なうには、現在では塩害などによる耕作不適当土壌とされている土地での農業生産が必要になるとの見方もある。 従って、このような塩害に耐性を有する植物を見出すことは、将来起り得ると考えられる食料危機などを考慮すると非常に重要なことである。

【０００３】一方、チオニン遺伝子は、トマト、オオムギ、コムギ、バレイショ、トウガラシなどの種々の植物において単離されている。 また、ニコチアナ（Nicotian
a)属に属する植物であるNicotiana tabacum L. W38の花特異的チオニン遺伝子も単離されている(Molecular & G
eneral Genetics (1992), 234, 89-96) 及びNicotiana
sylvestris; Plant Science (1996), 118, 185-194) 。
しかしながら、塩ストレスにより誘導されるチオニン遺伝子は知られていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的は、植物の塩ストレスに対する耐性を向上させる効果を有する新規遺伝子を提供することである。

【０００５】本願発明者らは、鋭意研究の結果、耐塩性のNicotiana excelsior 及びNicotiana paniculataから、塩ストレスにより誘導される新規なチオニン遺伝子を見出し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１、２又は３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子又は該遺伝子とアミノ酸基準で７０％以上の相同性を有し、植物体の塩ストレス耐性を向上させる効果を有する遺伝子を提供する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本願発明者らは、Nicotiana 属の植物について、塩および乾燥ストレス耐性のスクリーニングを行い (Plant Physiology (1995), 108, 106)、 N
icotiana excelsiorおよびNicotiana paniculataを塩ストレス耐性種として選抜した（育種学雑誌、第４６巻、
別冊２号、１８８ページ）。 その耐性程度は、海水の約半分の塩濃度（250mM NaCl）溶液を潅水しても生育が可能な程である。

【０００８】そして、これらの耐塩性Nicotiana 属植物に対し、塩ストレスを加えた状態と、加えない状態のそれぞれにおけるｃＤＮＡライブラリーを作製し、これらをいわゆるディファレンシャルスクリーニング法によりスクリーニングして塩ストレスにより誘導されるチオニンｃＤＮＡを単離することに成功した。 Nicotiana exce
lsior 由来の２種類のチオニンｃＤＮＡの塩基配列及びその対応アミノ酸配列を配列表の配列番号１及び２に、
Nicotiana paniculata由来のチオニンｃＤＮＡの塩基配列及びその対応アミノ酸配列を配列表の配列番号３に示す。

【０００９】配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子は、本発明の範囲に含まれる。 すなわち、これらのアミノ酸をコードしているコード領域である１ｎｔ〜２３７ｎｔ（配列番号１）（「ｎｔ」は第何番目のヌクレオチドという意味である）、３３ｎｔ〜３
４７ｎｔ（配列番号２）及び４８ｎｔ〜３６５ｎｔ（配列番号３）の領域の塩基配列を有する遺伝子は本発明の範囲内に含まれる。 なお、１つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在するので、配列番号１〜３に記載された塩基配列とは異なる塩基配列を有する遺伝子であっても、配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子は当然本発明の範囲内に含まれる。

【００１０】さらに、一般に生理活性を有するポリペプチドにおいて、少数のアミノ酸が置換され、欠失され、
挿入され又は付加されても、そのポリペプチドの生理活性が維持される場合があることは当業者にとって周知である。 従って、配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列であって、少数のアミノ酸が置換され、欠失され、挿入され又は付加されたものであって、配列番号１〜３に示されるそれぞれのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であって、植物の塩ストレス耐性を向上させる効果を有する遺伝子も本発明の範囲に含まれる。 上記７０％以上の相同性は、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上である。 なお、このような、相同な遺伝子は、例えば周知の部位特異的突然変異法（Nucleic Acid Research,
Vol. 10, No. 20, p6487-6500, 1982) 等により容易に作製することができる。 なお、ここで「塩ストレス耐性を向上させる」とは、該遺伝子を導入しない場合に比べて、より高い塩濃度下において生育が可能になることを意味する。

【００１１】本発明の遺伝子は、本発明により塩基配列が特定されたので、耐塩性を示すNicotiana excelsior
又はNicotiana paniculataの緑葉組織からのｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製し、このｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いる、周知のＲＴ−ＰＣＲ法により容易に調製することができる。

【００１２】これまでに国内外で行われてきた、いわゆる耐塩性植物についての研究から、耐塩性植物を、非ストレス条件から塩ストレス条件に移すと新たな遺伝子の発現が誘発され、これらの遺伝子の産物が塩ストレス耐性に役立っていることが知られている。 これらの事実から、今回得られた遺伝子がコードするチオニンタンパク質は、植物に水分ストレス耐性を付与する機能があると考えられる。 そこで、この遺伝子の発現を制御することにより、植物の塩ストレス耐性を改良する事ができる。

【００１３】植物に遺伝子を導入して形質転換を行なう方法は既に確立されており、植物の形質転換用の発現ベクターも市販されている。 従って、本発明の遺伝子は、
これらの公知の発現ベクターのクローニング部位に挿入後、周知の方法により植物に導入することができる。 好ましい方法として、アグロバクテリウム属細菌を用いた方法を挙げることができ、この方法により双子葉植物も単子葉植物も形質転換が可能である。 アグロバクテリウム属細菌を用いた双子葉植物の形質転換法としては、リーフディスク法及びプロトプラスト法（大野哮司(1986)
ベクターの開発−Ｔｉプラスミド、現代化学増刊５「植物バイオテクノロジー」、山田康之、岡田吉美編、p.19
7-213)の第２０７〜２１２頁、及び参考文献２（内宮博文(1989)トランスジェニック植物、「植物遺伝情報の交換」、秀潤社、岡田吉美ら編p261-276）が周知であり、
また、アグロバクテリウム属細菌を用いた単子葉植物の形質転換方法は例えばＷＯ９４／００９７７号公報に記載されている。

【００１４】本発明の遺伝子により形質転換される植物は、特に限定されるものではないが、好ましい植物の例としてダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト及びタバコを挙げることができ、なかでも、ダイズ、トウモロコシが好ましい。

【００１５】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。 もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

【００１６】 実施例１ ＜植物材料の生育＞ Nicotiana excelsiorおよびNicotiana paniculataは、
温室内で培養土に播種し発芽させた。 本葉４枚程度まで生育した時点で、バーミキュライトとハイドロボールの混合物（体積比１：１）を詰めた、直径約１０ｃｍの黒色ビニールポットに移植した。 その後は、人工気象機内に移し（１２時間日長、摂氏２３℃、相対湿度７０
％）、１日あたり１００ｍＬの１／４希釈ホーグランド溶液を潅水した。 塩ストレス処理区植物には、２５０ｍ
Ｍ塩化ナトリウムを含む１／４希釈ホーグランド溶液を１日１００ｍＬ潅水した。

【００１７】 実施例２ ＜mRNAの抽出＞ Nicotiana excelsior およびNicotiana paniculata緑葉組織からの全RNA 抽出はOstremらの方法（Ostrem et a
l., Plant Physiology 84,1270-1275(1987)）に従って行ったが、実施にあたり以下の点を改良した。

【００１８】１）磨砕した植物体を抽出用緩衝液とフェノールと共に行なう振盪を氷上で１時間行った。

【００１９】２）遠心後の上清をクロロホルムと共に行う振盪を氷上で行った。 poly(A) ⁺ -RNAの精製はQuickPre
p mRNA purification Kit （Pharmacia 社製）を使用し、製造者の手引き書に従って行った。

【００２０】 実施例３ ＜Nicotiana excelsior チオニンcDNAの単離＞ 塩ストレスをかけたN. excelsior緑葉cDNAライブラリーの作製は、実施例２でストレス処理をした植物から抽出、精製したpoly(A) ⁺ RNA を鋳型として、TimeSaver cD
NA Synthesis Kit（Pharmacia 社製）、クローニングベクターにはλZAPII （Stratagene）を使用して行った。
宿主細胞として XLI-Blue を使用した。

【００２１】cDNAライブラリーのスクリーニングは、ディファレンシャルスクリーニング法により行った。 以下にその詳細な手順を述べる。

【００２２】スクリーニングを行うための溶菌プラークは、Stratagene社の手引き書に従って行った。 プラークが出現した寒天培地からのプラークリフトはナイロン膜のHybond N ⁺ (Amersham社製）を用いた。 一枚の寒天培地から２回ずつプラークリフトを行った。 こうして作製したスクリーニング用ナイロン膜の変性は、 Amersham社の手引き書に従って行った。 スクリーニングに用いた³²
P 標識プローブは以下のようにして作製した。 実施例２
で得たpoly(A) ⁺ -RNA 50-100ng を30μｌの滅菌水に溶解して、プライマー（宝酒造）1 μｌを加え、65℃で１０
分間置いた。 その後室温まで冷却し、そこにRNse阻害剤を1 μｌ、MMLV逆転写酵素添付の５Ｘ緩衝液（宝酒造）
を5 μｌ、dATP・dGTP・dTTP溶液（各10mM）を5 μｌ、
³² P-dCTP（Amersham社）を1 μｌ（10 mCi）、蒸留水を
6 μｌ加え、よく混合した後に、MMLV 逆転写酵素（宝酒造）を1 μｌ加えた。 この反応液を３７℃で１時間反応させた後にスピンカラムを用いて、遊離の³² P-dCTPを除いた。 プローブは、ストレス処理した植物と、ストレス処理していないコントロール植物から調製したpoly
(A) ⁺ -RNAについて、それぞれ作製した。 ２組作製したナイロン膜のうち１組をコントロールプローブで、もう１
組をストレスプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。 ハイブリダイゼーションは製造者の手引き書に記載されている標準的な条件で16時間行なった。 洗浄は、300 mM NaCl 、30 mM trisodium citrate 、0.1% S
DSを用いて65℃で20分間2 回行い、続いて75 mM NaCl、
7.5 mM trisodium citrate、0.1% SDSを用いて65℃で20
分間 2回行った。 コントロール区とストレス処理区の結果を比較し、ストレス処理区で強いシグナルを示す陽性クローンを得た。 得られたクローンに含まれる挿入cDNA
断片は、Stratagene社の手引き書に従って行って、pBlu
escript プラスミドにサブクローニングした。

【００２３】得られた陽性クローンの塩基配列決定は、
DNA シーケンサーModel 373A（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、反応にはTaq Dye Terminator Cyc
le Sequencing Kit （アプライドバイオシステムズ社製）を使い、製造者の手引き書に従って行った。

【００２４】得られた塩基配列の解析は、GENETYX-MAC
ver.8 （ソフトウェア開発）により行った。 その結果、
配列表１および２に示す２種のcDNA、NeTHI1、NeTHI2を得た。

【００２５】 実施例４ ＜Nicotiana paniculataチオニンcDNAの単離＞ Nicotiana paniculata からのチオニンcDNAの単離は実施例３と同様に行ったが、ライブラリー作製にはZAP cD
NA synthesis kit（Stratagene社製）をもちいて行った。 ライブラリー作製およびプローブ作製には実施例２
で N. paniculataから得たpoly(A) ⁺ -RNAを用いて行った。 その結果、配列表３に示すcDNA、NpTHI1を得た。

【００２６】

【発明の効果】本発明により、植物の塩ストレスに対する耐性を向上させることができる新規な遺伝子が提供され、その塩基配列も決定された。 従って、本発明は各種植物の耐塩性向上に有効であり、ひいては農業生産に貢献するものである。

【００２７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：456 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Nicotiana excelsior 性質：チオニンのcDNA （NeTHI1） 配列の特徴 1..240 CDS 配列 CTC TTT GTT GCC TAT GAG GTG CAA GCT AGA GAA TGC GCA AGA GAA ATT 48 Leu Phe Val Ala Tyr Glu Val Gln Ala Arg Glu Cys Ala Arg Glu Ile 1 5 10 15 TTC ACT GGA CTA TGC ATT ACC AAT CCA CAA TGC AGA AAA GCT TGT ATC 96 Phe Thr Gly Leu Cys Ile Thr Asn Pro Gln Cys Arg Lys Ala Cys Ile 20 25 30 AAA GAG AAA TTT ACT GAT GGT CAT TGT AGC AAA ATC CTC AGA AGG TGT 144 Lys Glu Lys Phe Thr Asp Gly His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys 35 40 45 CTA TGC ACT AAG CCA TGC ACA GGA GCT GAA ACT TTA GCT GAG GAA GCA 192 Leu Cys Thr Lys Pro Cys Thr Gly Ala Glu Thr Leu Ala Glu Glu Ala 50 55 60 ACA ACT TTG GCT GCA GCT TTG CTT GAA GAA GAG ATA ATG GAT AAC 237 Thr Thr Leu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met Asp Asn 65 70 75 TAATTAGAGA TTAGAATAAA TTAAGGATGG AGAGTCACAC ATAATAAAGT TTCTACCTTT 297 CTTAAAAGTG TAGCTAATGT TGTGTTTTAA TTGGCTTTTA GTAGCCTTTT ATTACACTTT 357 AAATAAGTGT GGCACTTCAA CCCTTTGTGC AATCTTGCAC TAAGTTTATT CGTGTACTTT 417 TAATGAAAAT CACCTTCTAT GGTTTTTGTT TAAAAAAAA 456

【００２８】配列番号：２ 配列の長さ：566 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Nicotiana excelsior 性質：チオニンのcDNA （NeTHI2） 配列の特徴 33..350 CDS 配列 TTCCTATCCT TTTTTACTCA TTCAAAGTAA CT ATG GCT CGC TCC GTG TGC TTC 53 Met Ala Arg Ser Val Cys Phe 1 5 ATG GCA TTT GCT ATC TTG GCA GTG ATG CTC TTT GTT GCC TAT GAT GTG 101 Met Ala Phe Ala Ile Leu Ala Val Met Leu Phe Val Ala Tyr Asp Val 10 15 20 GAA GCT AAA GAT TGC AAA ACA GAA AGC AAT ACA TTC CCT GGA ATA TGC 149 Glu Ala Lys Asp Cys Lys Thr Glu Ser Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys 25 30 35 ATT ACC AAA CCA CCA TGC AGA AAA GCT TGT ATC AAA GAG AAA TTT ACT 197 Ile Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Lys Glu Lys Phe Thr 40 45 50 55 GAT GGT CAT TGT AGC AAA ATC CTC AGA AGG TGT CTA TGC ACT AAG CCA 245 Asp Gly His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro 60 65 70 TGT GTG TTT GAT GAG AAG ATG ATC AAA ACA GGA GCT GAA ACT TTA GCT 293 Cys Val Phe Asp Glu Lys Met Ile Lys Thr Gly Ala Glu Thr Leu Ala 75 80 85 GAG GAA GCA ACA ACT TTG GCT GCA GCT TTG CTT GAA GAA GAG ATA ATG 341 Glu Glu Ala Thr Thr Leu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met 90 95 100 GAT AAC TAATTAGAGA TTAGAATAAA TTAAGGATGG AGAGTCACAC ATAATAAAGT 397 Asp Asn 105 TTCTACCTTT CTTAAAAGTG TAGCTAATGT TGTGTTTTAA TTGGCTTTTA GTAGCCTTTT 457 ATTACACTTT AAATAAGTGT GGCACTTCAA CCCTTTGTGC AATCTTGCAC TAAGTTTATT 517 CGTGTACTTT TAATGAAAAT CACCTTCTAT GGTTTTTGTT TAAAAAAAA 566

【００２９】配列番号：３ 配列の長さ：558 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Nicotiana paniculata 性質：チオニンのcDNA （NpTHI1） 配列の特徴 48..368 CDS 配列 GTTTTATTAT TATTAATTCT TATCTTTTTT ACTCATTCAA AGAAACT ATG GCT CGC 56 Met Ala Arg 1 TCC TTG TGC TTC ATG GCA TTT GCA GTC TTG GCA ATG ATG CTT TTT GTT 104 Ser Leu Cys Phe Met Ala Phe Ala Val Leu Ala Met Met Leu Phe Val 5 10 15 GCC TAT GAG GTG CAA GCT AAG AGT ACT TGC AAA GCA GAA AGC AAT ACA 152 Ala Tyr Glu Val Gln Ala Lys Ser Thr Cys Lys Ala Glu Ser Asn Thr 20 25 30 35 TTC CCT GGA TTA TGC ATT ACC AAA CCA CCA TGC AGA AAA GCT TGT CTC 200 Phe Pro Gly Leu Cys Ile Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Leu 40 45 50 AGT GAG AAA TTT ACT GAT GGA AAA TGT AGC AAA ATC CTC AGA AGG TGC 248 Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly Lys Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys 55 60 65 ATT TGC TAC AAG CCA TGT GTA TTT GAT GGA AAG ATG ATC CAA ACA GGA 296 Ile Cys Tyr Lys Pro Cys Val Phe Asp Gly Lys Met Ile Gln Thr Gly 70 75 80 GCT GAA AAT TTG GCC GAG GAA GCA GAA ACT TTG GCT GCA GCT TTG CTT 344 Ala Glu Asn Leu Ala Glu Glu Ala Glu Thr Leu Ala Ala Ala Leu Leu 85 90 95 GAA GAA GAG ATG ATG GAT AAC TAATTAGAGA TTATAAGAAA TTAAGGATGA 395 Glu Glu Glu Met Met Asp Asn 100 105 AGTGTCACAC ATAATAAAGT GCTGCCTTTC TTAAAAGTGT AGCTAATGTT GTGTTCTTAT 455 TGGCTTTTAG TAGCCGTTTG TTACACTTTA AATAAGTGTG GCACATCAAT CCTTTGTTAC 515 TTTTAATGAA AATGATCTTC TATGGTCTTT GTTTAAAAAA AAA 558