【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は化粧品への保湿剤等に有用なトレハロースを、原生動物であるユーグレナの培養物より製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トレハロースは、カビ、酵母、キノコ、
海藻類、イワヒバ類などの植物、昆虫等天然物中に広く存在する二糖類であり、Ｄ−グルコース分子その還元基どうしでα−α結合した化合物である。 トレハロースは甘味料、保存剤、保湿剤等の目的で医薬品、食品、化粧品等の原料として用いられている。 特に化粧品の分野では保湿剤としての利用に注目されている。

【０００３】トレハロースの製造法としては、リゾクトニア（ Rhizoctonia )属に属する微生物を、培地にバリダマイシンまたはその誘導体を添加したした培地で培養する方法（特開平３−１３００８４号）、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属またはアルスロバクター属の微生物を、シュクロースまたはマルトースを主炭素源とする液体培地で培養する方法（特開平５−２１１８８２号）、補糖用炭素源として蔗糖を用いてコネリ型細菌を培養する方法、およびβ−
ラクタム抗生物質を添加した後に補糖用の炭素源として蔗糖を用いてコネリ型細菌を培養して得る方法（特開平６−３１１８９１号）等の微生物の発酵による方法が知られている。

【０００４】また、マルトースからマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを用いて生成する方法（特公昭６３−６０９９８号）、α−グルコースにシゾフィラム（ Schzophyllum )属、アガリカス( Agar
icus )属、プルロータス(Pleurotus)属、リフィラム( Lyo
phyllum )属、グリフォラ( Grifola )属より選ばれる微生物由来のトレハロースホスホリラーゼを作用させてトレハロースを得る方法等の酵素を使用する方法も知られている。

【０００５】しかしながら、上述の方法ではトレハロースの産生量が少なく、作業が繁雑であり、大量生産も困難である。 また、微生物による方法に関しては、使用されている微生物の安全性が確立されておらず、化粧品原料のように高度に安全性が求められる場合には、複雑な操作と大規模な設備を用いた精製が必要となり、実情にあわない。

【０００６】一方ユーグレナは生化学的研究に繁用されている原生動物であり、安定した大量培養が可能であること、人体および環境に対して安全であることが確立されている。 その実際的な利用についても、栄養源として利用される他、不飽和脂肪酸の製造（特開昭６１−１７
７９９０号）、化粧品の材料となる油脂の産生（特開昭６３−１１９４０７号、特開昭１１９４０９号）、スクアレン類の産生（特開平７−１１５９８１号）、ベータ１，３−グルカンの産生（特開昭６３−７１１９２号、
特開平１−３７２９７号）等様々な提案がされている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、トレハロースを安価にかつ大量に得る方法を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、ユーグレナに属する原生動物を培養し、培養菌体を塩ストレスおよび／または浸透圧ストレス下に置いた後に菌体からトレハロースを抽出する、トレハロースの製造法を提供する。

【０００９】ユーグレナがその菌体内に養分摂取の方式とは無関係に貯蔵多糖としてβ−１，３−グルカンからなる不溶性炭水化物であるパラミロンを蓄積することは従来より知られている。 本発明者らは、このパラミロンを蓄積したユーグレナに属する原生動物に対して塩ストレスをかけることにより、トレハロースが得られることをはじめて見い出し本願発明を完成した。

【００１０】なお、本明細書において「塩ストレス」とは細胞を塩分を高濃度とした環境下へ置くことをいう。
高濃度の塩分により細胞内への水分吸収阻害、細胞内水分の外部への流出、細胞内へ侵入した塩による物質代謝阻害および生育に必要な他のイオンの吸収阻害等が生じる。

【００１１】また、「浸透圧ストレス」とは細胞を塩以外の主として可溶性有機物の高濃度環境下におくことをいう。 塩ストレスの場合と同様に、細胞内への水分吸収阻害、水分の外部流出など細胞生育阻害が生じる。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明に用い得るユーグレナは池や沼などの淡水中に広く分布しており、これらを利用してもよく、あるいは天然に存するこれらユーグレナに属する原生動物をストレプトマイシン処理、紫外線処理、
温度処理などの方法で変異させた変異株、変種なども使用できる。 ユーグレナとしては、通常の葉緑体を有する株であっても葉緑体欠損株であってもよい。 特に好ましいユーグレナはユーグレナ・グラシリスおよびその変異株、例えばユーグレナ・グラシリスＺ株、ＳＭ−ＺＫ株等である。 これらの変異株およびそれらの入手方法については、例えば北岡正三郎著「ユーグレナ−生理と生化学」（株式会社学会出版センター発行）第２３８〜２３
９頁に記載されている。

【００１３】ユーグレナの培養に用いる培地は通常の培養に使用されるいずれの培地を用いてもよく、光独立栄養培地であっても光従属栄養培地、あるいは従属栄養培地であってもよい。 具体的にはクレマー−マイヤーズ(C
ramer−Myers)培地(Arch,Mikrobiol., 17 ,384-402(195
2)）、ハットナー(Hutner)培地(Methods Enzymol., 23 ,1
43-162(1971))、コーレン−ハットナー(Koren−Hutner)
培地(J.Protozool., 14 ,Suppl.,17(1967))等の培地が公知である。 さらに培地には炭素源としてグルコース、澱粉加水分解物、糖蜜加水分解物、グルタミン酸、酢酸、
エタノール、メバロン酸、ラノステロール、エルゴステロール、ファルネソール、ゲラニオール、各種脂肪酸
(Ｃ ₃ 〜Ｃ ₁₈ )及び各種脂肪アルコール(Ｃ ₃ 〜Ｃ ₁₈ )などが用いられる。 窒素源としては硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、第二リン酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムなどの無機窒素源、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニンなどのアミノ酸又はペプトン、酵母エキス、コーン・スチーブ・リカーなどの有機窒素源が用いられる。 無機塩としてはカリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛、ナトリウム、
銅、ニッケル、などの無機塩が用いられる。 その他ビタミンＢ ₁ 、ビタミンＢ ₁₂などの微量栄養素を添加して培養するが、必要に応じて、その他の栄養源が添加できる。 またＳＭ−ＺＫ株等の葉緑素を有さない変異株を除いて、炭素源を使用しない光独立培地を用いたユーグレナの光合成による培養も可能である。

【００１４】ユーグレナの培養は通常液体培地で静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などにより行なわれるが嫌気条件下で培養してもよい。 又適当な好気条件下で培養後、嫌気条件下で培養してもよい。 ユーグレナの培養は２０〜３０℃で行なう。 ２６〜３０℃で最も良好な生育が認められる。 培地のpＨは培地の組成にもよるがpＨ２
〜８であり、pＨ２〜５で良好な生育を示す。 培養は光照射下または暗黒下のいずれか及び光照射下と暗黒下の条件を組合せて行なう。 培養時には１分間当り５０〜１
２０回の振盪を行なってもよいが、１分間当り９０〜１
０５回の振盪で最も生育が良好となる。

【００１５】上記条件にてユーグレナを３〜７日間培養すれば生育の定常期に到達し、培養液１リットル当り最大で約３０g(湿重量)のユーグレナを得ることができる。 ユーグレナは培地の炭素源にかかわりなく細胞内に貯蔵多糖としてパラミロンを蓄積する。 本願発明の方法において、ユーグレナを増殖させた後、培養菌体を塩ストレスおよび／または浸透圧ストレス下に置く。 培養菌体をかかるストレス環境下に置くと、菌体内に蓄積されたパラミロンよりトレハロースが合成される。 これはユーグレナがパラミロンからストレスに対する適合溶質としてトレハロースを生成し、菌体内に蓄積してストレスに適応するためであると考えられる。

【００１６】本願発明の方法に用いる塩ストレス負荷物質としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。 好ましくは塩化ナトリウムである。 塩ストレスは、適当な緩衝液に細胞を懸濁させ、
ここへ予め決定しておいた濃度となるようにストレス負荷物質を添加して負荷する。 緩衝液としては例えばリン酸緩衝液が好適に用いられる。 トレハロースの合成量は塩の濃度に依存して増加するため、塩濃度は高い程好ましいが、塩濃度が高くなりすぎると細胞周囲の浸透圧が上がりすぎて、ユーグレナの細胞が破裂する。 本願発明の方法において、塩ストレス負荷物質の好ましい濃度は２００ｍＭである。

【００１７】本願発明の方法に用いる浸透圧ストレス負荷物質としては、ブドウ糖、シュークロース、果糖、乳糖、デキストリン、ソルビトール、マンニトール、グリセリン等が挙げられる。 特に好ましくはソルビトールおよびシュークロースである。 浸透圧ストレスの場合にも塩ストレスと同様に適当な緩衝液へ細胞を懸濁させ、所定濃度の負荷物質を溶解させればよい。 浸透圧ストレスをかける場合にも細胞内のトレハロース量は負荷物質の濃度と相関して増加するが、浸透圧により細胞が破裂しない濃度とする必要がある。 本願発明の方法において、
浸透圧ストレス負荷物質の好ましい濃度は２００ｍＭである。

【００１８】本願発明の方法において、ユーグレナをストレス条件下に置く時間は、１〜３時間、好ましくは約２時間である。 ２時間程ストレス条件下におくことによってトレハロースの生成量がほぼ定常状態に達する。

【００１９】ストレスを負荷した後、菌体をすみやかに遠心分離等によって回収し、適当な方法により細胞を破壊させて菌体内の内容物を抽出する。 抽出には従来から公知の精製水、エタノール、グリセリン、１,３−ブチレングリコール等を単独、もしくは併用して用いればよい。 さらに超音波処理や細胞をすりつぶす等の物理的な力を併用してもよい。 トレハロースは熱に対して比較的安定であるため、抽出温度を高く設定してもよい。 抽出後、濾過あるいは遠心分離等によって抽出物から細胞残渣を取り除く。

【００２０】得られた菌体抽出物には、トレハロースのほか、パラミロン等の多糖類やスクアレン類等の脂質が含まれている。 ユーグレナ菌体自体の安全性はすでに確立されており、抽出物をそのまま食品あるいは化粧品用添加剤として用いても差し支えない。 特にグリセリンおよび１，３−ブチレングリコールは単独でも保湿剤、増量剤、感触改良剤として用いられているものであり、抽出物をそのまま添加しても問題はない。 特にクリーム剤等、透明性が必要とされない製品に添加する場合には有用である。 したがって本発明の範囲には、トレハロースを含有する菌体抽出物も含まれる。

【００２１】精製トレハロースが必要な場合には、得られた菌体抽出物より公知の方法を用いて精製すればよい。 トレハロースの精製法としては高濃度のエタノールで抽出する方法、イオン交換樹脂にて分離精製する方法等が知られている。

【００２２】

【実施例】以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。 実施例１ユーグレナ・グラシリスＺ株を使用してトレハロースを製造した。 コーレン−ハットナー培地へユーグレナ・グラシリスＺ株を２０００ルックスの光照射下２６℃で振とう培養（９０〜１２０回転／分）を４日間行った。 得られたユーグレナを回収し、１５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）にて２回洗浄、さらに同液で懸濁したものをストレス条件下に置いた。 塩ストレス負荷剤としては塩化ナトリウムを用いた。 菌体懸濁液へそれぞれ５
０、１００、２００ｍＭとなるようＮａＣｌを添加した。 また、浸透圧ストレスとしてはソルビトール５０ｍ
Ｍ、シュークロース５０ｍＭとなるようそれぞれ添加した。 各ストレス負荷剤を添加したユーグレナおよび非添加緩衝液に懸濁した対照のユーグレナを２時間、２６
℃、蛍光灯下に静置した。

【００２３】２時間後、遠心分離（５００×ｇ、３分）
によって菌体を回収し、その湿重量を測定した。 回収した菌体へ８０％エタノール水溶液を添加し、１分間激しく撹拌して菌体よりトレハロースを含む抽出液を得た。
１０００×ｇ、３分間の遠心分離にて細胞残渣を除いた。 得られた上清をエバポレーターで乾固させ、トリメチルシリル試薬（無水ピリジン／ヘキサメチルジシラザン／トリメチルクロロシラン＝１．２５／０．２５／
０．１２５）を加え、７５℃で４５分間インキュベートして試験溶液を得た。 この試験溶液についてガスクロマトグラフィーを用い、以下の条件によってトレハロースを定量した。

【００２４】カラム：ＳＥ−３０、初期温度：１８０
℃、最終温度：２８０℃、昇温速度：４℃／分、キャリアーガス：Ｎ ₂ （流量５０ｍｌ／分）、内部標準：シュークロース。 菌体の湿重量に対するトレハロースの量（重量％）を以下の表に示す：

【００２５】

【表１】

【００２６】 実施例２塩ストレスによるトレハロースの生成量の経時変化を調べた。 実施例１と同様にして得たユーグレナの菌体へ、
５０、１００および２００ｍＭの濃度のＮａＣｌを添加して、３０分、６０分、１２０分および１８０分後のトレハロースの生成量を調べた。 ストレスの負荷時間以外の他の条件は実施例１と同じである。 結果を表２に示す。

【００２７】

【表２】

【００２８】

【発明の効果】ユーグレナは安価かつ容易に大量に増殖させることができ、安全性も確立されている原生動物である。 したがって、本発明の方法によって安価かつ大量にトレハロースを得ることができる。 本発明の方法により得られるトレハロースあるいはトレハロースを含有する菌体抽出物は、甘味料、保存剤、保湿剤等として化粧品、食品、医薬品等の分野で用いられる。

フロントページの続き (72)発明者 近藤 智裕 大阪府堺市学園町１ (72)発明者 川浦 清治 大阪府大阪市中央区道修町１丁目７番11号 岩瀬コスファ株式会社内 (72)発明者 松田 憲雄 大阪府大阪市中央区道修町１丁目７番11号 岩瀬コスファ株式会社内