【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は，ストレスに対する改善効果を有する甲殻類用飼料に関する。 詳細にはこの発明は飼育環境の変化などに伴う強いストレスにより一時的に摂餌しなくなったりすることに対する改善効果，活魚輸送時における活力低下防止効果，環境汚染に対する抵抗力強化効果，病気に対する予防効果などを有する甲殻類用飼料，特にクルマエビ稚エビ用飼料に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年，魚介類の人工種苗生産技術が発達し，クルマエビ，マダイ，イシダイ，イシガキダイ，マコガレイ，ヒラメ，トラフグ，シマアジ，ブリ，アユ等各種水産物の人工種苗生産が可能となり，クルマエビ，
マダイなどは大量の人工種苗生産が実施されている。 これらは種苗である稚エビ，仔稚魚の量産化いかんにかかっており，稚エビ，仔稚魚の成長，生残率，奇形などのない健全な種苗の育成に影響される。

【０００３】これら人工種苗生産を含めた甲殻類養殖一般において，水温変化，酸素不足などのストレスに対する抵抗性は甲殻類を健全に効率よく飼育するために求められる性質である。 しかし直接に飼育環境を整えること以外に効果のある手段は見つかっていない。 特に幼生期および稚エビの場合，生残率が極端に落ちてしまうためその対策が強く求められている。 幼生エビは，通常，孵化後１日で餌を消化する能力を有するようになり，養殖を行う場合には，その最初の餌料として，珪藻、シオミズツボワムシ，アルテミアなどを与えている。 次いで，
稚エビの成長に合わせて飼育環境も変えるが，稚エビは移動により強いストレスを受け，一時的に摂餌しなくなり成育が止まったり，生残率が落ちたりする。 養殖種苗の生産には，ストレスに対して強い稚エビに育てること，あるいは稚エビのストレスを減少するのに効果のある物質の発見などが，強く求められている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は，ストレスを減少するのに効果のある養殖種苗の生産に適した甲殻類用飼料を提供することを目的としている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】飼育環境の変化や移動によりうける強いストレスにより一時的に摂餌しなくなり成育が止まったり，生残率が落ちたりするため，養殖種苗の生産にはストレスを与えないように飼育することのほかに，ストレスに対して強くすることが必要である。
本発明者は飼料性ドコサヘキサエン酸エステルおよび／
またはリン脂質によるクルマエビ稚エビのストレスに対する効果を発見し，その後，オニテナガエビ稚エビ，ウシエビ稚エビ，コウライエビ稚エビなどでも同様の効果が得られることを確認し，この改善効果について鋭意研究して本発明を完成した。

【０００６】本発明は，ドコサヘキサエン酸またはそのエステル類および／またはリン脂質により栄養強化したことを特徴とするストレスに対する改善効果を有する甲殻類用飼料である。

【０００７】本発明の対象甲殻類は特に制限されない。
人工的に種苗を生産するクルマエビ（ Ｐｅｎａｅｕｓ
ｊａｐｏｎｉｃｕｓ ），オニテナガエビ（ Ｍａｃｒｏｂ
ｒａｃｈｉｕｍ ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉ ），ウシエビ（ Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ ），コウライエビ（ Ｐｅｎａｅｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ），イセエビ（ Ｐａｎｕｌｉｒｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ ）などが好ましいものとして例示される。 もっとも好ましい対象甲殻類としてはクルマエビ稚エビ，オニテナガエビ稚エビ，ウシエビ稚エビ，コウライエビ稚エビか挙げられる。

【０００８】本発明の甲殻類用飼料は，従来の甲殻類用飼料の原材料とほぼ同じものを用いることができ，一般の甲殻類用飼料に用いられるイカミール，オキアミミール，ホワイトミール，大豆油かす，コーングルテンミールなどの動植物性タンパク質源を主原料とし，グルテン，アルブミン，デンプンなどのバインダー類にその他ビタミン混合物，ミネラル混合物，微量金属を含有する。

【０００９】これに，さらに油分を加えて栄養的に改良することができる。 油分を高含量で含有させると魚の成長促進においてすぐれた効果が得られる。 油分は，魚粉などの原材料由来の脂肪分に加えて，動物性油脂や植物性油脂か含まれる。 油脂としては高度不飽和脂肪酸のω
３系脂肪酸を含むものが好ましく，融点が−２０〜５０
℃のものを用いるのが好ましい。 さらに摂餌誘因物質としてタウリン，ベタイン，アラニン），イノシン−５'
−モノリン酸（ＩＭＰ）を用いることができる。

【００１０】ストレスに対する改善効果を高める物質として，ドコサヘキサエン酸またはそのエステルおよび／
またはリン脂質を用いる。

【００１１】ドコサヘキサエン酸は，４，７，１０，１
３，１６，１９位にシス２重結合をもつ炭素数２２の直鎖ヘキサエンである。 天然物由来のドコサヘキサエン酸は，天然油脂，特にサバ，イワシ，タラ等の水産油脂中にそれ自体として，あるいはそのグリセライド等の誘導体として含まれている。 ドコサヘキサエン酸，およびそのエステル，アミド等は，血栓性疾患，炎症性疾患，癌等の治療や予防に有用なことが知られており，これらの用途のために天然油脂由来のドコサヘキサエン酸を取り出すための方法か開発されている。 本発明においてはドコサヘキサエン酸をドコサヘキサエン酸エステルとして使用し，その純度は９０％以上の高純度のものか好ましい。

【００１２】上記高純度のドコサヘキサエン酸エステルは，例えばドコサヘキサエン酸含有の脂肪酸混合物を精留し，次いで尿素付加体を形成して精製する方法（特開昭５７−１４９４００号公報，特開昭５８−８０３７号公報）で得られる。 この方法で得られている高純度品は，ドコサヘキサエン酸に他のＣ２２高度不飽和脂肪酸エステルおよび夾雑するＣ２０の高度不飽和脂肪酸エステルが含まれており，その純度は約９０％である。 また，炭素数２０で二重結合５個をもつエイコサペンタエン酸又はそのエステルと炭素数２２で二重結合６個をもつドコサヘキサエン酸又はそのエステルとの分離精製に逆相分配型のカラム超臨界流体抽出処理を利用する方法（たとえば，特開昭５８−８８３３９号公報）で得られる。 この方法の場合にはドコサヘキサエン酸は濃度３０
％という高い原料を用いなければならないが，エイコサペンタエン酸も同量含まれているため，ドコサヘキサエン酸とエイコサペンタエン酸との分離が困難であり，その結果純度９５％のドコサヘキサエン酸は４０％の収率で得られている。

【００１３】さらにまた，高純度ドコサヘキサエン酸エステルは，ドコサヘキサエン酸および／またはその誘導体を含む天然油脂から得られる脂肪酸エステルの混合物を高真空下で複数の蒸留塔によって精密蒸留して炭素数２２の脂肪酸エステルを主成分とする留分を取得し，次いで，この留分を銀塩を含む水性媒体で接触処理し，得られた水溶液を超臨界流体で抽出処理して高純度ドコサヘキサエン酸エステルを分離取得する方法で得られる。

【００１４】本発明で用いるリン脂質としては鶏卵レシチン，大豆レシチンが例示されるが，大豆レシチンで優れた効果が見られる。 レシチンとは，ホスファチジルコリンのことで，不純物としてホスファチジルエタノールアミン，ホスファチジルイノシトール，その他を含む場合が多い。 植物由来のレシチンは卵黄よりも極めて安価に入手できることから，大豆レシチンが大量に生産され，古くから主に食品用に使われている。 その脂肪酸鎖の種類と割合は，その原産地や肥料などにより異なっている。

【００１５】ドコサヘキサエン酸またはそのエステル類および／またはリン脂質の添加量は，純度，内容，飼料の組成などで異なるが，配合飼料に対して前者１〜２重量％，後者３〜５重量％で使用される。 普通，高度不飽和脂肪酸（エイコサペンタエン酸やドコサヘキサエン酸）の総量は４〜５重量％以上になると仔稚魚に対して成長，生残阻害がでることがある。 したがって，２重量％以下で使用する。 ただし，他の飽和脂肪酸，オレイン酸，リノレン酸およびリン脂質は１０〜２０重量％でも使用可能である。

【００１６】本発明の甲殻類用飼料は，任意の形状，大きさとすることかできるか，押し出し成形による場合，
ダイ等の形状を変更することにより，直径約０．５〜５
ｍｍ，長さ約１〜１０ｍｍの円筒状とすることができる。 エビ幼生の場合は，微粒子飼料の形を採用する。

【００１７】押し出し成形により一定の形状をもった飼料を作るには，ドコサヘキサエン酸またはそのエステル類および／またはリン脂質で栄養強化した飼料原料に油脂を添加後，水を加えて加圧加熱用押出機で加熱混練して製造する。 ドコサヘキサエン酸およびそのエステル類および／またはリン脂質で栄養強化するが，従来の甲殻類用飼料の原料とほぼ同じものを用いることができ，イカミール，オキアミミール，ホワイトミール，大豆油かす，コーングルテンミールなどの動植物性タンパク質源を主原料とし，グルテン，アルブミン、デンプンなどのバインダー類にビタミン，ミネラル類を含有するが，動物性油脂もしくは植物性油脂を加えて加水加圧加熱下において，加熱加圧押し出しによりペレット状に成形した後乾燥する方法により製造する。

【００１８】幼生エビ用の場合は，徴粒子飼料を使用する。 その製造方法は次の通りである。 トウモロコシのタンパク質であるゼインを６０％エタノールに溶解し，飼料粉末素材（タンパク質源，炭水化物源，ミネラルビタミン，添加物など）混合物と充分攪拌混合した後，凍結乾燥，微粉化したものかゼイン微粒子飼料である。

【００１９】

【実施例】以下，この発明の実施例を示し，さらに詳しくこの発明の構成および作用効果について説明する。 この発明はこれら実施例によって何ら限定されることはない。 実施例においては，ドコサヘキサエン酸エステルとして高純度ドコサヘキサエン酸エチルエステル（以下，
「ＤＨＡ」と略称することもある。 ）を使用した。

【００２０】実施例１ 試験区設定 表１に示すようにＤＨＡ試験区としては、試験飼料におけるＤＨＡ含量か１％になるように添加した区と対照区としてＤＨＡ無添加区の２区を設定した。 大豆レシチン試験区としては，大豆レシチン含量か５％になるように添加した区と対照区として大豆レシチン無添加区の２区を設定し計４区とした。

【００２１】

【表１】

【００２２】試験飼料組成 試験飼料は表２に示すように，タンパク質源としてビタミンフリーのカゼインを使用し，炭水化物源としてグルコース，スクロース，α−スターチを用いた。 脂肪源として表３に示すようにＤＨＡ試験区は９２．５％の純度のＤＨＡを試験飼料におけるＤＨＡ含量が０％，１％になるように添加し，大豆レシチン含量が３％，コレステロール含量が０．５％になるように添加し，総脂質量をオレイン酸で調整した。 また大豆レシチン試験区は大豆レシチン含量が０％，５％になるように添加し，イカ肝油を４％，コレステロールを０．５％添加し，総脂質量をオレイン酸で調整した。 ビタミン混合物は表４に示したもの，ミネラル混合物は表５に示したものを使用した。 また，摂餌誘因物質は表６に示すようにクルマエビに効果があると思われるタウリン，ベタイン，グリシン，グルタチオン，ＩＭＰを用いた。 さらにクルマエビの必須アミノ酸と飼料中のアミノ酸を比較して不足するアルギニン塩酸塩およびトリプトファンを補い，酸化防止剤としてエトキシキンを加えた。 バインダーにアルブミンを用い，ドライペレットタイプの飼料を作製した。
なお、本実施例で用いた大豆レシチンの組成は表７のとおりであった。 表８に供試エビと飼育方法を示す。 表９
に飼育実験結果を示す。 図１にＤＨＡのクルマエビの体重に及ぼす影響，図２に大豆レシチンのクルマエビの体重に及ぼす影響を示す。

【００２３】

【表２】

【００２４】

【表３】

【００２５】

【表４】

【００２６】

【表５】

【００２７】

【表６】

【００２８】

【表７】

【００２９】

【表８】

【００３０】

【表９】

【００３１】実施例２ 塩分濃度ストレス試験 試験方法 ７２リットル角形水槽中に４区分したネットカゴをセットし，そのネットカゴの中にエアレーションのもとで塩素を除去した水道水で作った塩水（塩濃度７パーミル）
を入れた１リットルビーカーをセットした。 １リットルビーカー内の水温が２４℃となった時点で，２日間絶食させた試験エビを各試験区につき５尾ずつ無作為に取り上げ，このビーカー内に収容した。 このとき各ビーカー内で酸素補給のため，エアレーションを行い，７２リットル角形水槽内においては５００Ｗヒーターを１個セットし，１リットルビーカー内の水温が２４℃となるように恒温水槽とした上で，温度を均一に保つため攪拌の目的で６カ所から充分なエアレーションを行った。 各試験区の海水は３４パーミルであり，急激な塩分濃度低下によるクルマエビ稚エビの耐性について調べた。 ストレスを比較する指標として，塩分濃度７バーミルの環境において試験エビが横転するまでの時間を測定した。 試験エビの横転決定は，エビが横転してからガラス棒で正常な状態に戻してやり，それでも横転したまま１分間静止した点と定義した。 生残率と時間の関係より指数関数を導き，生残率が５０％となる時間を試験エビの半数が横転するまでに要する時間，即ち半数横転時間（ＬＤ
Ｔ _５０ ）と定義し，その値においてストレス耐性を比較した。 またストレス実験は３回ずつ行い，平均値を用いた。

【００３２】試験結果を以下に示す。 半数死亡時間（Ｌ
ＤＴ _５０ ）で比較すると，ＤＨＡ試験区ではＤＨＡ無添加区の４８．１分に対してＤＨＡ添加区は６８．２分と約２０．１分，塩分濃度７パーミルの環境下における耐性が改善された（図３）。 また，大豆レシチン試験区でも，大豆レシチン無添加区の３０．６分に対して大豆レシチン添加区は１００．４分と実に６９．８分も耐性が改善された（図４）。 このことから，ＤＨＡおよび大豆レシチンともに，餌中に添加することで低塩分濃度での環境下におけるクルマエビ稚エビのストレス耐性を改善することが示唆された。

【００３２】実施例３ 水温ストレス試験 試験方法 ７２リットル角形水槽中に４区分したネットカゴをセットし，２日間絶食させた試験エビを各試験区につき５尾ずつ無作為に取り上げ，そのネットカゴ内に収容した。
このとき７２リットル角形水槽内には５００Ｗヒーター２個，２００Ｗヒーター４個を用いて２４℃から４０℃
まで段階的に水温を上昇させた。 また水槽内は流水とし，水温を均一に保つため攪拌の目的で６カ所から充分なエアレーションを行った。 ストレス耐性を比較する指標として４つの水温上昇期間を設け，さらにこれらを４
つのグループに分け各グループ期間において横転を確認した後に取り除き，それを生残率として用いた。 なお試験エビの横転決定は，エビが横転してからガラス棒で正常な状態に戻してやり，それでも横転したまま１分間静止した点と定義した。 また，ストレス実験は３回ずつ行い，それらの測定値の平均値で表し，水温の上昇は下記のように設定した。

【００３３】水温設定 Ａ期間：２４．０〜３０．０℃（３０．０℃で３０分保持） Ｂ期間：３０．０〜３４．０℃（３４．０℃で３０分保持） Ｃ期間：３４．０〜３８．０℃（３８．０℃で３０分保持） Ｄ期間：３８．０〜４０．０℃（４０．０℃で３０分保持） 各期間の水温上昇は平均０．５℃／時間

【００３４】グループ設定 グループ１：Ａ期間の水温変化を受けたもの グループ２：Ａ期間＋Ｂ期間の水温変化を受けたもの グループ３：Ａ期間＋Ｂ期間＋Ｃ期間の水温変化を受けたもの グループ４：Ａ期間＋Ｂ期間＋Ｃ期間＋Ｄ期間の水温変化を受けたもの

【００３５】試験結果を以下に示す。 表１０に示すように、生残率（％）で比較すると，ＤＨＡ試験区ではグループ２において，ＤＨＡ無添加区の８０％に対しＤＨＡ
添加区では１００％，グループ３では，ＤＨＡ無添加区の６０％に対し，ＤＨＡ添加区では８０％と耐性が改善されていた。 また，大豆レシチン試験区においてもＤＨ
Ａ試験区と全く同じ結果を示した。 このことから，ＤＨ
Ａおよび大豆レシチンともに，餌中に添加することで水温上昇の環境下におけるクルマエビ稚エビのストレス耐性を改善することが示唆された。

【００３６】

【表１０】

【００３７】

【発明の効果】ストレスに対して強い養殖甲殻類を育てることができる。 塩分濃度変化ストレス，温度変化ストレスなどのストレスを減少するのに効果のある養殖種苗の生産に適した甲殻類用飼料を提供することができる。
飼育環境の変更などに伴う強いストレスにより一時的に摂餌しなくなったりすることに対する改善効果，活エビ輸送時における活力低下防止効果，環境汚染に対する抵抗力強化効果，病気に対する予防効果などを有する甲殻類用飼料を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＤＨＡのクルマエビの体重に及ぼす影響を説明する図面である。

【図２】大豆レシチンのクルマエビの体重に及ぼす影響を説明する図面である。

【図３】ＤＨＡのクルマエビのストレス耐性に及ぼす影響を説明する図面である。

【図４】大豆レシチンののクルマエビのストレス耐性に及ぼす影響を説明する図面である。