【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物の塩ストレス緩和剤およびそれを用いる植物の塩ストレス緩和方法に関し、詳しくはアルファルファ緑葉脱蛋白質上澄液または該上澄液に含まれる特定の成分を有効成分として含有する植物の塩ストレス緩和剤並びに該塩ストレス緩和剤を用いて植物の一価カチオンによる生育ストレスを緩和する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】アルファルファ［学名： Medicago s ativ
a L.、米名：alfalfa （アルファルファ）、英名：luce
rne （ルーサン）、medicks.和名：ムラサキウマゴヤシと呼ばれている］はマメ科植物で、そのモヤシはそのまま食することができる。 また、茎葉から緑葉蛋白質を抽出し、食料や濃厚飼料として利用することも行われている。 この緑葉蛋白質を抽出する際に排出される脱蛋白質上澄液（以下、ブラウンジュースと称することがある。）の利用については、微生物培養培地やサイレージ化あるいは肥料化などが試みられているが、まだ確立されるには至っていない。

【０００３】また、ブラウンジュース中には植物の生育促進効果（特開平５−２７号公報、特開平３−５８９０
５号公報）や植物の発芽発根促進効果（特開平４−５４
１０５号公報、特開平４−５３４１６号公報）、不溶性ミネラル可溶化や有効微生物増殖などの土壌改良作用（特願平５−２９２３９６号明細書）などがあることが知られている。 他に、過剰鉄の存在する寒天培地においてブラウンジュース（５００〜2,０００倍希釈液）を施用した場合に、塩によって引き起こされた植物のストレスが緩和され、生育を寛容するような効果が見出されていたが、それ以外の塩類については全く知られていなかった。 ましてや、その効果を高める方法については全く検討がなされていなかった。

【０００４】また、従来から塩による植物のストレスについては、細胞外に存在する塩によって細胞内のアミノ酸や糖の種類や含量の変化が起こり、細胞内の浸透圧を調節して、塩ストレスに対して耐性を有するようになるといった、塩ストレスを受けた植物の生理的解明についてはよく知られている。 しかしながら、外部からの施用によって植物の塩ストレスを緩和するような物質については、ほとんど知られていなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】近年、化学肥料の大量使用や長期にわたる連作により、土壌中での塩類の高濃度集積が見られるようになり、特にハウス土壌では塩類集積の弊害が頻発している。 また、海岸付近地域での海水や海風による塩害や、乾燥地帯や半乾燥地帯での過度の蒸散による土壌表層の塩類集積などが生じており、農地の利用を制限している。 このような問題の解決方法としては、土壌を交換することや潅水により除去することが一般的に行われているが、多大の費用や労力を要する。 また、潅水による塩類除去は、周辺地域に大量の塩水を流入させることから、環境汚染を引き起こすとして使用規制が行われようとしている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ブラウンジュースを有効成分とする組成物に塩、特に一価カチオンであるナトリウムやカリウムによって引き起こされる生育ストレスを緩和し、植物を順調に生育させる成分を含有することを見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち本発明は、アルファルファ緑葉脱蛋白質上澄液（ブラウンジュース）を有効成分として含有することを特徴とする植物の塩ストレス緩和剤並びにこの塩ストレス緩和剤を、植物を栽培する土壌または人工培地に施用することを特徴とする植物の一価カチオンによる生育ストレスを緩和する方法を提供するものである。

【０００８】本発明で用いるアルファルファ緑葉脱蛋白質上澄液、すなわちブラウンジュースは、通常、アルファルファから緑葉蛋白質を抽出する際に排出されるものである。 すなわち、刈り取ったアルファルファを絞り、
グリーンジュースとプレスケーキとに分け、得られたグリーンジュースを加熱後、濾過して緑葉蛋白質を取り除いた際の脱蛋白質上澄液のことである。 また、乾燥したアルファルファ（ヘイ、キューブ、ペレット）に水を加えて絞ったものも利用することができる。 アルファルファの搾汁、グリーンジュースからの蛋白質抽出等の工程は、常法によればよく、圧力、温度、濾過法等の条件に制限はない。 このように、本発明に用いられるブラウンジュースは、飼料や食品であるアルファルファから蛋白質を加熱除去したものであり、原料は容易に入手可能で、かつ安全性に優れたものである。 また、使用方法が簡単であり、植害も少なく、塩ストレス緩和剤として極めて有用なものである。

【０００９】なお、本発明ではブラウンジュース自体を植物の塩ストレス緩和剤として用いる他、該ブラウンジュースから適当な手段により分離して得た画分を有効成分として植物の塩ストレス緩和剤とすることもできる。
以下に、その態様を示す。 （１）ブラウンジュースを酢酸エチルを用いて溶媒分画して得られる高極性・両性物質の画分を有効成分として含有することを特徴とする植物の塩ストレス緩和剤。 （２）透析処理および／またはゲル濾過によって分画されるブラウンジュース中の分子量５００〜１５００の物質を含む画分を有効成分として含有することを特徴とする植物の塩ストレス緩和剤。 （３）ブラウンジュースの活性炭非吸着画分を有効成分として含有することを特徴とする植物の塩ストレス緩和剤。

【００１０】ブラウンジュースの調製方法としては、特開平４−５３４１６号公報に記載されている方法などにより、塩ストレス緩和物質を含有するようにすればよい。 以下にブラウンジュースの調製例を示す。 刈り取ったアルファルファを搾汁機にて搾汁してグリーンジュースを得、これに１３０℃の蒸気を送入して蛋白質を凝固せしめた後、遠心分離を行って目的とするブラウンジュースを得る。 なお、含有蛋白質を凝固させて除去するために、グリーンジュースに酸を加えたり、乳酸発酵を行う等の酸性処理を施したり、５０〜９５℃の加熱処理を施すことが行われているが、本発明にはこのような方法で処理して得たブラウンジュースを使用することもできる。

【００１１】本発明の塩ストレス緩和剤の使用量については、対象とする土壌や人工培地、植物の種類、使用方法、使用時期等により異なるが、通常は０．１〜０．３
ｍｌ／ｋｇ土壌あるいは０．２〜１０ｍｌ／ｋｇ人工培地、好ましくは１〜２ｍｌ／ｋｇ人工培地の割合となるように添加混合すると良い。 塩ストレス緩和剤の施用回数は播種前に土壌や人工培地に潅水で添加したり、混合すればよい。 また、植物の生育初期に１〜２回、土壌や人工培地に潅水で添加したり、混合してもよい。

【００１２】本発明の塩ストレス緩和剤の適用される土壌は塩害が予測されるもの、例えばナトリウム，カリウム等の１価カチオン含量が２ｇ／ｋｇ以上の土壌などがある。 具体的には、化学肥料の大量使用や長期にわたる連作により、土壌中に塩類の高濃度集積が見られるハウス土壌、海岸付近地域での海水や海風による塩害土壌、
乾燥地帯や半乾燥地帯での過度の蒸散により塩類集積が生じた表層土壌などが挙げられる。 また、本発明の塩ストレス緩和剤の適用される人工培地としては、ナトリウム，カリウム等の１価カチオン含量が０．５Ｍ以上、すなわち０．０３（ｗ／ｗ）％以上のものがある。

【００１３】本発明の塩ストレス緩和剤が適用される植物は特に制限されないが、通常は耐塩性の低い野菜類、
例えば葉菜類のサラダナ，コマツナ等が挙げられる。

【００１４】

【実施例】以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。 製造例１（本発明の塩ストレス緩和剤の調製） 本発明の塩ストレス緩和剤は特願平５−２９２３９６号明細書の製造例１に記載の土壌改良材の製造方法にしたがって製造することができるが、以下にその具体例を示す。 乾燥アルファルファペレット２ｋｇに水７．５ｋ
ｇを添加後、十分に撹拌し、搾汁機にて搾汁してグリーンジュースを得、さらに１２１℃で１５分間蒸煮して蛋白質を凝固せしめた後、濾過することにより、ブラウンジュースを６ｋｇ得、これを本発明の塩ストレス緩和剤とした。

【００１５】実施例１（本発明の塩ストレス緩和剤による効果） 植物培養用ガラス製平底棒ビン（内径２．２ｃｍ、高さ１１．５ｃｍ、柴田科学器械工業（株）製）に所定量の塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ）および本発明の塩ストレス緩和剤を加えた園試処方培地（第１表）を１０ｍｌ添加した。 この培地を入れた平底棒ビン１本にサラダナ（品種名：「岡山サラダナ」、タキイ種苗（株）製）を１粒播種し、サランラップで蓋をし、２５℃で連続明所（６，
０００ｌｕｘ）下で２週間培養した。 １試験区は３０本ずつ培養し、１個体当たりの地上部重（生体重ｇ）の平均値を算出し、生育状況を調査した。

【００１６】ＮａＣｌを添加したときの結果を第２表に、ＫＣｌを添加したときの結果を第３表に示す。 表から明らかなように、両者とも０．５Ｍの塩添加培地で培養すると、地上部重が対照区（塩無添加培地）の８０％
程度に減少するが、本発明の塩ストレス緩和剤を５００
〜１０００倍希釈で添加すると、対照区（塩無添加区）
とほぼ同じ地上部重を示すようになる。 したがって、本発明の塩ストレス緩和剤の添加により、塩過剰による植物の塩ストレスが緩和された。

【００１７】

【表１】

【００１８】

【表２】

【００１９】

【表３】

【００２０】実施例２（本発明の塩ストレス緩和剤による効果） 培養容器（商品名「バイオポット」、渡辺化成（株）
製）に実施例１で用いた塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ）および本発明の塩ストレス緩和剤の所定量を加えた園試処方培地を１００ｍｌ添加した。 次いで、実施例１と同じサラダナを各容器に２０粒ずつ播種し、サランラップで蓋をし、２５℃で連続明所（６，０００ｌｕｘ）下で２週間培養した。 １試験区４ポットずつ培養し、１ポットあたりの地上部重（生体重ｇ）の平均値を算出し、生育状況を調査した。

【００２１】ＮａＣｌを加えたときの結果を第４表に、
ＫＣｌを加えたときの結果を第５表に示す。 表から明らかなように、実施例１の場合と同様に塩を０．５Ｍ添加した培地で塩ストレスによる生育阻害が生じるが、本発明の塩ストレス緩和剤を添加すると、対照区（塩無添加区）とほぼ同じ地上部重を示す。 したがって、この例においても、本発明の塩ストレス緩和剤の添加により、植物の塩ストレスが緩和された。 このように実施例１と２
の結果より、ＮａＣｌやＫＣｌを０．５Ｍ以上含む培地では、塩ストレスによる生育阻害を生じることが分かった。 本発明の塩ストレス緩和剤の有効濃度は２５０〜５
０００倍希釈（０．２〜４ｍｌ／ｋｇ人工培地）であり、５００〜１０００倍希釈（１〜２ｍｌ／ｋｇ人工培地）で大きな効果を示している。

【００２２】

【表４】

【００２３】

【表５】

【００２４】実施例３（本発明の塩ストレス緩和剤による効果） 育苗用培土（商品名「トップソイル１号」、三河ミクロン（株）製）３００ｇをノイバウエルポットに入れた。
このポットに、一晩水に浸積して発芽させたコマツナ（品種名「丸葉小松菜」：長文種苗店製）を１ポットあたり９本播種し、２５℃で培養した。 子葉展開後（播種から５日後）、塩水（ＮａＣｌまたはＫＣｌ：１．５ｇ
／５０ｍｌ）および本発明の塩ストレス緩和剤１０００
倍希釈液（５０μｌ／５０ｍｌ）をポットに潅注した。
この方法で１試験区につき２ポット培養した。 播種から１５日後に地上部重（生体重ｇ）を測定し、１ポットあたりの地上部重の平均値を算出した結果を第６表に示す。

【００２５】表から明らかなように、ＮａＣｌとＫＣｌ
はいずれも塩水処理を行うと、地上部重が対照区（塩無添加区）の８０％程度に減少するが、本発明の塩ストレス緩和剤を添加した区では、対照区と同等以上の生育が認められた。 このように、本発明の塩ストレス緩和剤は寒天培地での培養時のみでなく、土壌栽培においても同様に植物の塩ストレス緩和作用を示した。 すなわち、土壌での本発明の塩ストレス緩和剤の有効濃度は０．１〜
０．３ｍｌ／ｋｇであることが分かる。

【００２６】

【表６】

【００２７】実施例４（本発明の塩ストレス緩和剤による効果） 無菌化し、ＨＵＴＮＥＲ培地（第７表）で継代培養したアオウキクサ（ Lemn a paucicostat a 、以下レムナと記す。）を用いて本発明の塩ストレス緩和剤の効果を検討した。 レムナの培養は、５０ｍｌ容の三角フラスコに２
０ｍｌの上記培地を添加し、１２１℃で１５分間滅菌後、三角フラスコ１個につき１個のレムナを入れて２７
℃にて５，５００ｌｕｘ（明暗周期１２時間）で行った。 この方法で１試験区２本づつ培養した。 なお、三角フラスコにはＨＵＴＮＥＲ培地に０．０１Ｍの塩（Ｎａ
Ｃｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ ₂ 、ＭｎＣｌ ₂またはＦｅＳＯ
₄ ）を添加し、またはこの塩と共に本発明の塩ストレス緩和剤（２５０倍希釈：８０μｌ／２０ｍｌ）を添加して培養した。

【００２８】レムナは通常、１個に４枚の葉（フロンド）を有している。 処理開始から１週間培養後の三角フラスコ１本あたりのフロンド数の平均値を算出し、生育調査を行った。 その結果を第８表に示す。 表から明らかなように、どの塩を添加した場合も、レムナには塩ストレスによる生育阻害が生じ、フロンド数は培養開始時と同じ４個のままであった。 しかし、ＮａＣｌとＫＣｌを添加した培地では、本発明の塩ストレス緩和剤を添加することにより、レムナの増殖が認められた。 なお、Ｍｇ
Ｃｌ ₂ 、ＭｎＣｌ ₂およびＦｅＳＯ ₄を添加したものに該緩和剤を添加した場合は、レムナが増殖しないことから、本発明の塩ストレス緩和剤の効果は、ＮａＣｌとＫ
Ｃｌに起因する塩ストレスのみに有効であると考えられる。

【００２９】

【表７】

【００３０】

【表８】

【００３１】実施例５（本発明の塩ストレス緩和剤による効果） この例では、０．０１ＭのＮａＣｌを含むＨＵＴＮＥＲ
培地に所定量の本発明の塩ストレス緩和剤を添加したものに、実施例４と同様にしてレムナを１週間培養した結果（フロンド数）を第９表に示し、また０．０１ＭのＫ
Ｃｌを含む同培地に所定量の本発明の塩ストレス緩和剤を添加し、同様にして培養したときの結果を第１０表に示した。 なお、レムナの培養方法と生育調査方法は実施例４と同じである。 表から明らかなように、本発明の塩ストレス緩和剤無添加の場合は、ＮａＣｌまたはＫＣｌ
を含む培地でレムナは増殖しないが、本発明の緩和剤を１００〜５００倍希釈の濃度で加えると、レムナの増殖が可能となる。 したがって、本発明のレムナでの塩ストレス緩和効果は、１００〜５００倍希釈（２〜１０ｍｌ
／ｋｇ人工培地）が有効濃度と言える。 また、該緩和剤が高濃度である程、フロンド数が増加することから、本発明の塩ストレス緩和剤による効果は濃度依存性であると考えられる。

【００３２】

【表９】

【００３３】

【表１０】

【００３４】実施例６（本発明の塩ストレス緩和剤による効果） 本発明の塩ストレス緩和剤（製造例１）を、溶媒抽出の定法に従って酢酸エチルを用いて分画し、５つの物性の異なる画分（両性・高極性物質、塩基性物質、中性物質、弱酸性物質、強酸性物質）を得た。 これらの画分を０．０１Ｍ ＮａＣｌを含むＨＵＴＮＥＲ培地に８０μ
ｌ／２０ｍｌ（２５０倍希釈）添加し、レムナを１週間培養したときのフロンド数を第１１表に示した。 なお、
レムナの培養方法と生育調査方法は実施例４と同じである。 表から明らかなように、溶媒抽出によって分画された画分のうち、両性・高極性物質を含む画分の添加区のみにおいてレムナの増殖が認められた。 このことから、
本発明の塩ストレス緩和剤の有効成分は、両性・高極性の物質であると考えられる。

【００３５】

【表１１】

【００３６】実施例７（本発明の塩ストレス緩和剤による効果） この例では、本発明の塩ストレス緩和剤を分子量分画して得た６つの画分（分子量５００以上、１０００以上、
１５００以上、３５００以上、６〜８０００以上、１２
５００以上）を用い、これらを０．０１Ｍ ＮａＣｌを含むＨＵＴＮＥＲ培地に８０μｌ／２０ｍｌ（２５０倍希釈）添加し、これにレムナを入れて２週間培養したときのフロンド数を示した。 なお、レムナの培養方法と生育調査方法は実施例４と同じである。 分子量１５００以上の画分は、ゲル濾過材セファデックスＧ−１５（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社製）を用いて分子量１５００未満の物質を除いて得た画分を使用した。 その他の画分は透析処理を行って得た画分を使用した。 分子量５００以上と１
０００以上の画分の透析処理は、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社製のセルロースエステル製透析用チューブを、その他の画分は、同社製の再生セルロース製透析用チューブを使用して行った。 結果を第１２表に示す。

【００３７】

【表１２】

【００３８】第１２表から明らかなように、分子量分画によって分画された画分のうち、分子量５００以上の画分を用いた場合にレムナの増殖が旺盛に見られた。 なお、分子量１０００以上と１５００以上の画分でもレムナの増殖が見られたが、分子量３５００以上画分ではレムナは全く増殖しなかった。 以上の分子量分画の結果から、製造例１により得た本発明の塩ストレス緩和剤に含まれる有効成分の分子量は５００〜１５００であると考えられる。

【００３９】実施例８（本発明の塩ストレス緩和効果） 本発明の塩ストレス緩和剤を活性炭処理して得た活性炭非吸着画分を０．０１Ｍ ＮａＣｌを含むＨＵＴＮＥＲ
培地に８０μｌ／２０ｍｌ（２５０倍希釈）の割合で添加し、これにレムナを入れて２週間培養したときのフロンド数を第１３表に示す。 なお、レムナの培養方法と生育調査方法は実施例４と同じである。 活性炭処理は、本発明の塩ストレス緩和剤５０ｍｌに５ｇ活性炭素（粉末）を加えて２時間撹拌して行った。 処理後、Ｎｏ． ５
Ｃ濾紙（東洋濾紙（株）製）で採取した濾液を活性炭非吸着画分とした。 表から明らかなように、活性炭非吸着画分を添加すると、塩ストレス条件下でもレムナの生育が可能となり、製造例１の塩ストレス緩和剤を添加した場合以上にフロンド数が増加した。 このことから、塩ストレス緩和効果の有効物質は活性炭非吸着の物質と考えられる。

【００４０】

【表１３】

【００４１】

【発明の効果】本発明の塩ストレス緩和剤は、一価カチオン、すなわちナトリウムとカリウムイオンによる植物の生育ストレスを緩和する効果を有している。 本発明の塩ストレス緩和剤の使用は、大量の化学肥料投与により引き起こされ、施設栽培を中心に近年問題視されている塩類集積土壌や、海岸付近や乾燥地など塩害が生じやすい地帯での作物生産量の向上に極めて有用である。

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