壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3及其应用
阅读：507发布：2021-04-13
专利汇可以提供壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株新菌株‑‑壮观丝衣霉ZRV2011F2‑P3及作为可溶性环 氧 化酶 (sEH)活性 抑制剂 的应用，壮观丝衣霉ZRV2011F2‑P3保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10637，保藏日期为2015年3月19日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；此菌株来自传统米醋 发酵 醋醪，能够生产心 血管 疾病 靶标sEH酶的抑制剂，强烈抑制sEH的N端 磷酸 酶的活性，从而达到 预防 和 治疗 高胆固醇血症的作用，并且有助于揭示心 血管疾病 靶标sEH的新的生理功能。，下面是壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3及其应用专利的具体信息内容。
1.壮观丝衣霉(Talaromyces spectabilis)ZRV2011F2-P3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10637，保藏日期为2015年3月19日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
2.一种权利要求1所述壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3在制备可溶性环氧化酶活性抑制剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抑制剂是将壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3培养液经甲醇浸提后的浸提液离心，取上清液浓缩去除甲醇，取浓缩物用等体积缓冲液悬浮，取悬浮液即为抑制剂；所述悬浮液相对于可溶性环氧化酶反应体系的体积终浓度为1～
5％，所述可溶性环氧化酶反应体系包括可溶性环氧化酶、底物和反应介质。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液为含终浓度1mM MgCl2和终浓度
0.1mg/ml BSA的25mM bis-tris HCl，pH 7.0。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3接种至M6培养基，25～30℃培养11～13天，将培养液用甲醇浸提，将甲醇浸提液离心，取上清液减压浓缩去除溶剂，取浓缩物用等体积缓冲液悬浮，获得的悬浮液即为可溶性环氧化酶活性抑制剂；所述M6培养基的终浓度组成为:甘油70-110g/L，葡萄糖10-30g/L，豆粕30-50g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0.5-1g/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH自然。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3接种至M6培养基前，先接种至斜面培养基进行活化，所述活化方法为：将壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3接种至PDA斜面，25～30℃培养5天，获得菌体斜面；所述PDA培养基的组成：马铃薯浸出粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂13g/L，氯霉素0.1g/L，溶剂为去离子水，pH自然。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述甲醇浸提方法为：将培养液冷冻干燥后，加入培养液1倍体积的体积浓度90％甲醇水溶液，混匀，超声10sec后，在4℃浸提12h，获得甲醇浸提液。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述M6培养基的终浓度组成为：甘油70g/L，葡萄糖30g/L，豆粕30g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁1g/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
9.一种权利要求1所述壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3制备的可溶性环氧化酶活性抑制剂，其特征在于所述的抑制剂是以所述的壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3培养液经甲醇浸提后的浸提液离心，取上清液浓缩去除甲醇，取浓缩物用等体积缓冲液悬浮，取悬浮液即为所述的抑制剂。
壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3及其应用
(一)技术领域
[0001] 本发明涉及一种可溶性环氧化酶抑制剂，特别涉及一株新菌株--壮观丝衣霉(Talaromyces(Byssochlamys)spectabilis)ZRV2011F2-P3(宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的有性型)及其作为可溶性环氧化酶抑制剂的应用。(二)背景技术
[0002] 可溶性环氧化酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)是近几年出现的具有交叉功能的心血管疾病新靶标，该酶的抑制剂被认为是最具前景的心血管疾病靶标药物，不仅有抗高血压、抗炎症功能，还有保护心肌、肾脏、大脑等与高血压和粥样动脉硬化相关的终末器官的作用(Marino,J.P.,Jr.(2009)Soluble epoxide hydrolase,a target with multiple opportunities for cardiovascular drug discovery.Curr Top Med Chem,9,452-63.)。
[0003] sEH是由两个60Kda的单体以反平行方式组成的同型二聚体，具有双重酶活性。每个单体有两个结构域，C末端有环氧化物水解酶活性，而N末端含有磷酸酶活性位点。sEH的主要生理功能是将环氧化二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acides,EETs)等环氧化合物水解成相应的二醇化合物，EETs被证明是内皮源性超极化因子，具有抗高血压、维持血管稳态平衡和抗炎症等作用，而这些环氧化合物的二醇化合物几乎不具备这类生理功能。因此抑制sEH的活性就能够增进EETs的心血管保护功能。
[0004] sEH的N末端磷酸酶活性，尽管功能尚未完全明确，已被认为是一个潜在高胆固醇血症的治疗靶标，而且sEH单核苷酸多态性的研究表明，拥有N末端Lys55Arg的人群，即使C末端的环氧化物水解酶活性不高，其较高的磷酸酶活性依然会增加冠心病的风险。
[0005] 寻找sEH抑制剂已经成为世界各大制药公司新药研发的热点，已经有一个sEH的人工合成抑制剂1,3-二取代脲类化合物AR9281进入临床二期a研究(Imig,J.D.&B.D.Hammock(2009)Soluble epoxide hydrolase as a therapeutic target for cardiovascular diseases.Nature Reviews Drug Discovery,8,794-805.)。而具有sEH抑制作用的天然化合物尚未见报道。(三)发明内容
[0006] 本发明目的是从米醋发酵醋醪中分离到1株真菌--壮观丝衣霉(Talaromyces spectabilis)ZRV2011F2-P3，其代谢产物能够抑制sEH的活性，壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3体积终浓度5％添加量对sEH磷酸酶的抑制率为93.7％。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明提供一株新菌株--壮观丝衣霉(Talaromyces spectabilis)ZRV2011F2-P3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10637，保藏日期为2015年3月19日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
[0009] 本发明还涉及所述壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3作为可溶性环氧化酶(sEH)活性抑制剂的应用，所述抑制剂是将壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3培养液经甲醇浸提后的浸提液离心，取上清液浓缩去除甲醇，取浓缩物用等体积缓冲液悬浮，取悬浮液即为抑制剂；所述悬浮液相对于可溶性环氧化酶反应体系的体积终浓度为1～5％，所述可溶性环氧化酶反应体系包括可溶性环氧化酶、底物和反应介质。所述底物为AttoPhos(Promega)或PHOME(Cayman)，以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH 7.0)为反应介质。
[0010] 优选，所述悬浮浓缩物所用缓冲液为含终浓度1mM MgCl2和终浓度0.1mg/ml BSA的25mM bis-tris HCl，pH 7.0。
[0011] 本发明壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3作为可溶性环氧化酶(sEH)活性抑制剂的应用，具体方法为：将壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3接种至M6培养基，25～30℃培养11～13天，将培养液用甲醇浸提，将甲醇浸提液离心，取上清液减压浓缩去除溶剂，取浓缩物用等体积缓冲液悬浮，获得的悬浮液即为可溶性环氧化酶活性抑制剂；所述M6培养基的终浓度组成为:甘油70-110g/L，葡萄糖10-30g/L，豆粕30-50g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0.5-1g/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH自然。
[0012] 优选，所述培养液经24h冷冻干燥(Freeze Dry System，LABCONCO，USA)。
[0013] 优选，所述M6培养基的终浓度组成为：甘油70g/L，葡萄糖30g/L，豆粕30g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁1g/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
[0014] 所述壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3接种至M6培养基前，先接种至斜面培养基进行活化，所述活化方法为：将壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3接种至PDA斜面，25～30℃培养5天，获得菌体斜面；所述PDA培养基的组成：马铃薯浸出粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂13g/L，氯霉素0.1g/L，溶剂为去离子水，pH自然。
[0015] 本发明所述甲醇浸提方法为：将培养液冷冻干燥后，加入培养液1倍体积的体积浓度90％甲醇水溶液，经涡旋混匀，置于超声波清洗仪(KUDOS，上海科导)中超声10sec后，在4℃浸提12h，获得甲醇浸提液。
[0016] 本发明还提供一种所述壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3制备的可溶性环氧化酶活性抑制剂，所述的抑制剂是以所述的壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3培养液经甲醇浸提后的浸提液离心，取上清液浓缩去除甲醇，取浓缩物用等体积缓冲液悬浮，取悬浮液即为所述的抑制剂。
[0017] 本发明利用多孔板酶标仪SPECTRAMAX M5(MD，美国)检测可溶性环氧化酶活性抑制剂对sEH的两种酶活性抑制情况：C-端水解酶与N-端磷酸酶的抑制作用。本发明所述壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3的代谢产物能够较强地抑制sEH的N端磷酸酶活性，而对C端水解酶的阻碍作用较弱。壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3的这种对sEH的N端磷酸酶的高特异性抑制作用，不仅具备了潜在的阻碍高胆固醇血症的发生与发展作用，而且有望在生理作用机制尚未完全明晰的N端磷酸酶的活性机理研究中发挥作用。
[0018] sEH是一个具有双酶活性的心血管疾病的新靶标，尽管C端水解酶的生理功能比较清楚，N端磷酸酶的生理功能因底物尚未十分明确而不明朗。酶抑制剂的发现对该酶功能解析是十分重要的。以上个世纪70年代莫纳克林K的发现为例，莫纳克林K是人体胆固醇合成限速酶-HMG-CoA还原酶的抑制剂，不仅发展成为降胆固醇的药物，给成千上万的心血管疾病患者带来福音，其发现还直接帮助了美国得克萨斯大学的布朗(Michael S.Brown)和戈尔茨坦(Joseph L.Goldstein)揭示出胆固醇代谢调节机理并荣获1985年诺贝尔生理学奖。可见，特意性高的抑制剂将有助于更多的sEH生理功能的探索与分析，加深对心血管疾病形成机理的认识，从而达到控制与治疗这一致死率最高的疾病的终极目标。
[0019] 因此，在尚未见到微生物代谢产物中有能够抑制sEH活性的文献报道的今天，本发明所述壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3的代谢产物，除了具有潜在的高胆固醇血症的治疗作用，还有可能以其对sEH的N端磷酸酶的高特异性抑制作用，在揭示N端磷酸酶的生理作用方面发挥作用。
[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株新菌株--壮观丝衣霉(Talaromyces spectabilis)ZRV2011F2-P3，此菌株来自传统米醋发酵醋醪，能够生产心血管疾病靶标sEH酶的抑制剂，强烈抑制sEH的N端磷酸酶的活性，从而达到预防和治疗高胆固醇血症的作用，并且有助于揭示心血管疾病靶标sEH的新的生理功能。(四)附图说明
[0021] 图1为实施例3中壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3的M6培养液对sEH的磷酸酶和水解酶活性的抑制作用柱形图，纵坐标为抑制率，横坐标为抑制剂体积终浓度。
[0022] 图2为实施例4中壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3的M6培养液对sEH的磷酸酶和水解酶活性的抑制作用柱形图，纵坐标为抑制率，横坐标为抑制剂体积终浓度。(五)具体实施方式
[0023] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0024] 实施例1.菌株壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3的分离鉴定及其代谢产物中sEH活性抑制剂的检测
[0025] 1.菌株的分离纯化
[0026] 利用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基从米醋固态发酵醋醪(大米糖化阶段的料饼)中分离丝状真菌。采用无菌水将醋醪配制成质量浓度20％的悬浊液，进一步用无菌水稀释10倍，100倍和1000倍，分别涂布在虎红PDA平板，25℃-30℃培养5天，从能够挑出单个菌落的平板上，挑选不同形态的菌落于PDA平板进行划线培养，25℃-30℃培养3-5天，从划线培养的平板上挑选单个菌落，保存于PDA斜面。从PDA斜面挑取菌落接种到PDA平板进行划线培养，25-30℃培养3天，重复划线培养2次，进一步分离纯化，从划线培养的平板上挑选单菌株，命名为菌株ZRV2011F2-P3。
[0027] 2.培养基的配制
[0028] PDA培养基的具体成分如下：马铃薯浸出粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂13g/L，氯霉素0.1g/L，溶剂为去离子水，pH自然。虎红PDA培养基在PDA培养基的基础上添加终浓度0.05g/L的虎红。
[0029] 3.菌株代谢产物的获得
[0030] 将菌株ZRV2011F2-P3接种于M6培养基中，25℃-30℃培养13天，将培养液冷冻干燥，然后加入培养液等量体积的90％甲醇水溶液(体积浓度)，涡旋混匀，置于超声波清洗仪(KUDOS，上海科导)中超声10sec，4℃浸提12h，将浸提液离心取上清液，减压浓缩去除溶剂，获得甲醇提取物。以等体积的缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH 7.0)将甲醇提取物重悬，作为抑制剂用于sEH抑制活性的检测，添加量为5％体积终浓度。
[0031] M6培养基组成为：甘油110g/L，葡萄糖10g/L，豆粕50g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠1g/L，硫酸锌0.5g/L，橄榄油5g/L，溶剂为水，pH值自然。
[0032] 4.代谢产物中sEH活性抑制剂的检测
[0033] 以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH 7.0)为反应介质，利用人工底物经人源sEH酶切后，其产物能够形成荧光的特点，采用多孔板检测仪SPECTRAMAX M5(MD，美国)动态监测酶反应过程中反应液的荧光强度，以反应的初速度来表示sEH活性的大小。在相同的100μL反应体系中，以添加缓冲液替代样品为空白对照，其活性计为100％。以添加样品(步骤3制备的培养液提取物，即抑制剂)为实验对象，分别检测sEH酶活性，从而获得样品对sEH酶活性的抑制率。
[0034] (1)磷酸酶活性检测
[0035] 以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH 7.0)为反应介质，以终浓度为300ng/ml的人源sEH酶为催化剂，加入终浓度为5μM的底物AttoPhos(Promega)，在30℃反应30分钟，在激发波长435nm，发射波长555nm动态检测荧光强度。
[0036] (2)水解酶活性检测
[0037] 以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH 7.0)为反应介质，以终浓度为12.5μM的PHOME(Cayman)为底物，以终浓度为160ng/ml人源sEH酶为催化剂，30℃反应20分钟，以激发波长330nm，发射波长465nm进行荧光动态检测。
[0038] (3)检测结果
[0039] 菌株ZRV2011F2-P3的M6培养液甲醇浸提物添加量为5％(V/V)时，对sEH磷酸酶的抑制率为81.5％，对水解酶的抑制率为13％。
[0040] 可见，此菌株ZRV2011F2-P3的代谢产物只对sEH双酶活性中的N端磷酸酶活性具有较高的专一性抑制作用。
[0041] 5.菌株ZRV2011F2-P3的真菌ITS rRNA基因序列的分析
[0042] 利用真菌ITS rRNA基因序列进行菌株ZRV2011F2-P3的分子鉴定。采用真菌DNA提取试剂盒(Omega)提取DNA，利用真菌ITS引物ITS1(5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3')和ITS4(5'TCCTCCGCTTATTGATATGC 3')进行ITS rRNA基因序列的PCR扩增。扩增体系：反应体系25μL，DNA模板100ng，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP mix(10Mm)0.5μL，10μM上下游引物各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，加去离子水补足至25μL。扩增条件：预变性94℃5min，循环94℃1min，50℃1min，72℃2min，共30个循环，72℃延伸10min。
[0043] 菌株ZRV2011F2-P3的PCR产物纯化后送至上海桑尼生物工程有限公司(中国)进行DNA测序，将测序结果(SEQ ID NO：1所示)提交NCBI数据库中进行Blast比对，比对结果显示菌株ZRV2011F2-P3与Talaromyces(Byssochlamys)spectabilis strain LTBF 008 1同源性为99％，将菌株ZRV2011F2-P3鉴定为壮观丝衣霉，命名为壮观丝衣霉(Talaromyces spectabilis)ZRV2011F2-P3。
[0044] SEQ ID NO：1
[0045] GAGGGTACTCGGGGCCCGCCTCCCATCCGAGTTGTCCTGACACCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTGGTTCACGCCCCG
[0046] GCCGCCGGGGGGTTCACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACCCCTGGAACGCTGCCTGGAAGGTTGCCGTCTGAGTA
[0047] TACAATCAATCAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGT
[0048] AATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTG
[0049] TCCGAGCGTCATTGCTAACCCTCCAGCCCGGCTGGTGTGTTGGGCCGCCGTCCCCCCCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAA
[0050] AGGCAGCGGCGGCGTCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACACGCTTCAGTAGAACCGGCCGGCTTGCTGG
[0051] CCACACGACCTTCACGGTCACCTATATTTCTCTTAGGTGACCTCGGATCAGGTAGCACCCCC。
[0052] 实施例2壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3抑制剂
[0053] (1)将壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3接种至PDA斜面培养基，25～30℃培养5天，获得菌体斜面；所述PDA培养基的组成：马铃薯浸出粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂13g/L，氯霉素0.1g/L，溶剂为去离子水，pH自然。
[0054] (2)将步骤(1)斜面菌体接种至M6培养基，25～30℃培养11～13天，取培养液冷冻干燥(Freeze Dry System，LABCONCO，USA)24h后，加入培养液1倍体积的90％甲醇水溶液(体积浓度)，经涡旋混匀，置于超声波清洗仪(KUDOS，上海科导)中超声10sec后，在4℃浸提12h，将浸提液离心取上清液，即获得甲醇浸提液，将甲醇浸提液减压浓缩去除溶剂，获得浓缩物，以等体积的缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH 7.0)将浓缩物重悬，获得sEH抑制剂。
[0055] 实施例3.壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3对sEH抑制作用随着添加浓度的增加而增强[0056] 1、sEH酶活性检测条件
[0057] (1)磷酸酶活性检测
[0058] 对照：以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH7.0)为反应介质，以终浓度为300ng/ml的人源sEH酶为催化剂，加入终浓度为5μM的底物Attophos(promega)，在30℃反应30分钟，以激发波长435nm、发射波长555nm进行荧光动态检测。
[0059] 实验：
[0060] 以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH 7.0)为反应介质，以终浓度为300ng/ml的人源sEH酶为催化剂，加入终浓度为5μM的底物Attophos(promega)，再分别加入体积终浓度1％，3％和5％的实施例2获得的sEH抑制剂，在30℃反应20分钟，在激发波长435nm，发射波长555nm进行动态荧光检测。
[0061] (2)水解酶活性检测
[0062] 对照：以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH7.0)为反应介质，以终浓度为12.5μM的PHOME(Cayman)为底物，以终浓度为160ng/ml人源sEH酶为催化剂，30℃反应20分钟，在激发波长330nm，发射波长465nm进行荧光动态检测。
[0063] 实验：
[0064] 以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH 7.0)为反应介质，以终浓度为160ng/ml的人源sEH酶为催化剂，加入终浓度为12.5μM的PHOME为底物，再分别加入体积终浓度1％，3％和5％实施例2获得的sEH抑制剂，在30℃反应30分钟，在激发波长330nm，发射波长465nm进行荧光动态检测。
[0065] 2、检测结果：
[0066] 利用96孔板进行荧光检测，每个样品重复2次，分别计算每个孔板中的酶活性，与空白对照比较计算抑制率，取平均值。如图1所示，当sEH抑制剂添加量为1％，3％和5％(V/V)时，其对sEH磷酸酶与水解酶的抑制率分别呈现随着添加量增加而增加的趋势(图1)。
[0067] 实施例4
[0068] 将实施例2中M6培养基的组成改为：甘油70g/L，葡萄糖30g/L，豆粕30g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁1g/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH自然。
[0069] 其它操作同实施例2，获得sEH抑制剂，结果见图2所示。
[0070] 1、sEH酶活性检测条件
[0071] (1)磷酸酶活性检测
[0072] 对照：以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH7.0)为反应介质，以终浓度为300ng/ml的人源sEH酶为催化剂，加入终浓度为5μM的底物Attophos(promega)，在30℃反应20分钟，在激发波长435nm，发射波长555nm进行荧光动态检测。
[0073] 实验：
[0074] 以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH 7.0)为反应介质，以终浓度为300ng/ml的人源sEH酶为催化剂，加入终浓度为5μM的底物Attophos(promega)，再分别加入体积终浓度1％，3％和5％的sEH抑制剂，在30℃反应30分钟，在激发波长435nm，发射波长555nm进行动态荧光检测。
[0075] (2)水解酶活性检测
[0076] 对照：以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH7.0)为反应介质，以终浓度为12.5μM的PHOME(Cayman)为底物，以终浓度为160ng/ml人源sEH酶为催化剂，30℃反应20分钟，在激发波长330nm，发射波长465nm进行荧光动态检测。
[0077] 实验：
[0078] 以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH 7.0)为反应介质，以终浓度为160ng/ml的人源sEH酶为催化剂，加入终浓度为12.5μM的PHOME为底物，再分别加入体积终浓度1％，3％和5％sEH抑制剂，在30℃反应20分钟，在激发波长330nm，发射波长465nm进行荧光动态检测。
[0079] 2、检测结果：
[0080] 利用96孔板进行荧光检测，每个样品重复2次，分别计算每个孔板中的酶活性，与空白对照比较计算抑制率，取平均值。如图2所示，当sEH抑制剂添加量为5％(V/V)时，其对sEH磷酸酶的抑制率为93.7％，对水解酶的抑制率为8.7％(图2)。结果表明，在M6培养基中检测到较高的抑制N端磷酸酶的活性。结合实施例3，表明壮观丝衣霉ZRV2011F2-P3能够在较广泛的培养基中生产sEH抑制剂，有潜在的获得最优化生产条件的可能性。
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