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在乙醇生产中使用肌醇六磷酸酶的方法

阅读：838发布：2020-06-10

专利汇可以提供在乙醇生产中使用肌醇六磷酸酶的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本申请涉及在谷物加工、乙醇和生物燃料生产中使用一种或多种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的方法。，下面是在乙醇生产中使用肌醇六磷酸酶的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.提高酵母生产乙醇的效率的方法，所述方法包括：
(a)提供包含至少85％与SEQ ID NO:2的氨基酸残基23-434中所示的氨基酸序列相同或者至少85％与SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的变体多肽；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性；和
(b)将变体多肽添加到乙醇生产设施中的乙醇加工液中，
其中变体多肽的添加改善了乙醇生产效率，包括以下的一种或多种：
增加的酵母细胞计数、酵母出芽或酵母生存力；
增加的乙醇产率、降低的甘油水平或降低的总糖水平；
降低的结垢率；
增加的磷水平；和
增加的乙醇生产设施的运行时间。
2.如权利要求1的方法，其中乙醇生产设施包括原料、锤磨机、浆料罐、喷射式蒸煮器、液化、醪液蒸煮器、酵母混合罐、酵母繁殖罐、发酵罐、啤酒、蒸馏系统、全釜馏物、离心机、酒槽水、蒸发器、冷凝物、糖浆、湿谷物、滚筒干燥器、具有可溶物的干酒糟、浓缩的蒸馏可溶物、干酒糟、具有可溶物的湿酒糟、或其任何组合。
3.如权利要求1所述的方法，其中与不添加肌醇六磷酸酶的生产方法相比，添加所述变体多肽提高了乙醇生产效率。
4.如权利要求1所述的方法，其中与添加野生型肌醇六磷酸酶的生产方法相比，添加所述变体多肽提高了乙醇生产效率。
5.如权利要求1所述的方法，其中与添加市售的肌醇六磷酸酶的生产方法相比，添加所述变体多肽提高了乙醇生产效率。
6.如权利要求1所述的方法，其中在发酵之前将所述变体多肽添加到乙醇加工液中。
7.如权利要求1所述的方法，其中将所述变体多肽添加到醪液蒸煮器中的乙醇加工液中。
8.如权利要求1所述的方法，其中将变体多肽添加到酵母混合罐中的乙醇加工液中。
9.如权利要求8所述的方法，其中将乙醇加工液从酵母混合罐继续前进至酵母繁殖罐。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述变体多肽以每酵母繁殖罐0.5加仑的剂量加入。
11.如权利要求1所述的方法，其中降低的结垢率包括啤酒/醪液热交换器入口压力、啤酒进料温度和啤酒进料阀位置中的一个或多个的结垢率。
12.如权利要求1所述的方法，其中运行时间包括啤酒/醪液热交换器在线时间和啤酒进料预热交换器在线时间中的一个或两个。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述市售的肌醇六磷酸酶选自Novozyme 50161和U.S.Water PhytOUT。
14.如权利要求1所述的方法，其中乙醇生产设施在乙醇生产厂、白酒或饮用酒精生产厂或燃料乙醇厂中。
15.如权利要求2所述的方法，其中所述原料选自：玉米、小麦、大麦、马铃薯、柳枝稷(switchgrass)、芒草(Miscanthus)、杨木、稻草、玉米秸秆、麦秸、甘蔗渣、稻壳、玉米纤维、甜菜渣、柑橘果肉、柑橘皮、硬木、软木间伐材(thinning)、来自木材加工的硬木和软木残留物、木材锯末、锯屑、市政固体废物的纸部分、市政木材废料、市政绿色废料、锯木厂废料、纸浆厂废料、建筑废料、拆除废料、木屑、锯屑、废纸，含有糖、淀粉和纤维素的材料。
16.如权利要求2所述的方法，其中发酵罐用酵母细胞将糖、淀粉或纤维素转化为醇，并且通过蒸馏分离醇。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述变体多肽将肌醇六磷酸盐水解成肌醇和游离磷酸，并从肌醇六磷酸中释放矿物质。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述肌醇六磷酸是以钙盐、镁盐、金属离子、蛋白质、未水解的肌醇六磷酸盐污泥或肌醇六磷酸酯形式的肌醇六磷酸盐。
19.如权利要求1所述的方法，其中变体多肽与一种或多种其他酶组合使用。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述一种或多种其他酶包括淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、黄原胶酶、糖苷酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、支链淀粉酶、葡糖异构酶、α-葡糖苷酶、或它们的组合。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述变体多肽在pH 2.5至pH 12.0的条件下保持肌醇六磷酸酶活性。

说明书全文

在乙醇生产中使用肌醇六磷酸酶的方法

[0001] 序列表

[0002] 本申请包括根据“专利合作条约(PCT)下国际专利申请中提供核苷酸和氨基酸序列表的标准(Standard for the Presentation of Nucleotide and Amino Acid Sequence Listings in International Patent Applications Under the Patent Cooperation Treaty(PCT))”ST.25以ASC II文本(.txt)文件提交的计算机可读形式(CRF)的核苷酸和氨基酸序列表。所述序列表于2017年2月28日生成，命名为
“160169SequenceListing”，大小为9.46千字节，其整体引入本申请的说明书作为参考并用于所有目的。

技术领域

[0003] 本申请涉及在谷物加工、乙醇和生物燃料生产中使用一种或多种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的方法。

背景技术

[0004] 将生物质资源如谷物、玉米、小麦或甘蔗转变为乙醇、生物燃料或生物基的产品是快速成长的行业。过去十年中乙醇需求增长的原因有多种，包括对清洁燃烧燃料的监管要求，例如从E10(含约10％乙醇的混合物)到E85(含85％乙醇的混合物)范围的汽油/乙醇混合物。然而，增加的车辆燃料效率和经济不确定性为乙醇生产行业带来了未来的风险，除非进一步提高乙醇生产的效率和成本效益。

[0005] 在乙醇生产中，用于将生物质转化为乙醇的多步发酵方法产生大量副产物，例如油、干酒糟(dried distillers grains,DDG)或具有可溶物的干酒糟(DDGS)。这些副产物中的一些，例如“酒槽水(thin stillage)”(富含碳源例如甘油、葡萄糖和麦芽糖的副产物)可以进一步加工以提取商业上有价值的组分，例如额外的乙醇。冈萨雷斯等人“通过代谢工程化的大肠杆菌从酒槽水中生产乙醇(Production of ethanol from thin stillage by metabolically engineered Escherichia coli.)”Biotechnology Letters 2010,32(3)：405-411。其他副产物如“酒石(beerstone)”或其他有机金属盐在乙醇加工设备中沉淀并抑制这些设备正常发挥功能。去除这些有问题的副产物可能是一个耗时或昂贵的过程，并导致频繁的设备清洁或维护停工期。

[0006] 简述

[0007] 本文公开的一些实施方案提供了用于提高酵母生产乙醇的效率的方法，所述方法包括：(a)提供包含至少85％与SEQ ID NO:2的氨基酸残基23-434中所示的氨基酸序列相同或者至少85％与SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的变体多肽；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性；以及(b)将变体多肽添加到乙醇生产设施中的乙醇加工液中，其中变体多肽的添加改善了乙醇生产效率。改善的乙醇生产效率包括以下的一种或多种：增加的酵母细胞计数、酵母出芽或酵母生存力；增加的乙醇产量、降低的甘油水平或降低的总糖水平；降低的结垢率；增加的磷水平；和增加乙醇生产设施的运行时间。

[0008] 在一些实施方案中，乙醇生产设施包括原料、锤磨机、浆料罐、喷射式蒸煮器、液化、醪液蒸煮器(mash cooker)、酵母混合罐、酵母繁殖罐、发酵罐、啤酒、蒸馏系统、全釜馏物、离心机、酒槽水、蒸发器、冷凝物、糖浆、湿谷物、滚筒干燥器、具有可溶物的干酒糟、浓缩的蒸馏可溶物、干酒糟、具有可溶物的湿酒糟或其任何组合。

[0009] 在一些实施方案中，与不添加肌醇六磷酸酶的生产方法相比，添加所述变体多肽改善了乙醇生产效率。在一些实施方案中，与添加野生型肌醇六磷酸酶的生产方法相比，添加所述变体多肽提高了乙醇生产效率。在一些实施方案中，与其中添加市售的肌醇六磷酸酶的生产方法相比，添加所述变体多肽改善了乙醇生产效率。

[0010] 可以在乙醇生产的任何步骤中将具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽添加到乙醇加工液中。在一些实施方案中，在发酵之前将变体多肽添加到乙醇加工液中。在一些实施方案中，将变体多肽添加到醪液蒸煮器中的乙醇加工液中。在一些实施方案中，将变体多肽添加到酵母混合罐中的乙醇加工液中。在一些实施方案中，将乙醇加工液从酵母混合罐继续前进至酵母繁殖罐。在一些实施方案中，变体多肽以每酵母繁殖罐0.5加仑的剂量加入。

[0011] 在一些实施方案中，降低的结垢率包括啤酒/醪液热交换器入口压力、啤酒进料温度和啤酒进料阀位置中的一个或多个的结垢率。在一些实施方案中，运行时间包括啤酒/醪液热交换器在线时间和啤酒进料预热交换器在线时间中的一个或两个。

[0012] 在一些实施方案中，市售的肌醇六磷酸酶选自Novozyme 50161和U.S.Water PhytOUT。在一些实施方案中，乙醇生产设备在乙醇生产厂、白酒或饮用酒精生产厂、或燃料乙醇厂中。在一些实施方案中，发酵罐用酵母细胞将糖、淀粉或纤维素转化为醇，并且通过蒸馏分离醇。

[0013] 在一些实施方案中，所述原料选自：玉米、小麦、大麦、马铃薯、柳枝稷(switchgrass)、芒草(Miscanthus)、杨木、稻草、玉米秸秆、麦秸、甘蔗渣、稻壳、玉米纤维、甜菜渣、柑橘果肉、柑橘皮、硬木、软木间伐材(thinning)、来自木材加工的硬木和软木残留物、木材锯末、锯屑、市政固体废物的纸部分、市政木材废料、市政绿色废料、锯木厂废料、纸浆厂废料、建筑废料、拆除废料、木材锯末、锯屑、废纸，含有糖、淀粉和纤维素的材料。

[0014] 在一些实施方案中，变体多肽将肌醇六磷酸盐(phytate)水解成肌醇和游离磷酸，并从肌醇六磷酸中释放矿物质。在一些实施方案中，肌醇六磷酸是以钙盐、镁盐、金属离子、蛋白质、未水解的肌醇六磷酸盐污泥或肌醇六磷酸酯(myo-inositol-hexaphosphate)形式的肌醇六磷酸盐。

[0015] 在一些实施方案中，变体多肽与一种或多种其他酶组合使用。在一些实施方案中，所述一种或多种其他酶包含淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、黄原胶酶、糖苷酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、支链淀粉酶(pullanase)、葡糖异构酶、α-葡糖苷酶、或它们的组合。在一些实施方案中，变体多肽在pH 2.5至pH 12.0的条件下保留肌醇六磷酸酶活性。

[0016] 附图简述

[0017] 图1说明了可以整合使用本文公开的肌醇六磷酸酶的示例性醇方法。

[0018] 图2a、2b和2c以图示总结了酵母健康状态数据，包括酵母细胞计数和酵母生存力。

[0019] 图3a、3b和3c以图示总结了乙醇产率、甘油水平和总糖水平的数据。

[0020] 详述

[0021] 定义

[0022] 本文提及的所有专利、申请、公开申请和其他出版物均通过引用并以其整体并入本文作为参考材料。如果本文使用的术语或短语的方式与以引用方式并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中所述的定义相反或不一致，则本文的使用优先于通过引用并入本文的定义。

[0023] 如本文所用，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指代物，除非另有明确说明或通过上下文指出。例如，一种二聚体包括一种或多种二聚体，除非另有明确说明或通过上下文说明。

[0024] 如本文所用，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用，指任何长度的聚合形式的核苷酸，并且可包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物，或其混合物。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。它还包括例如通过烷基化和/或通过加帽进行修饰，和未修饰形式的多核苷酸。更具体地，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA和mRNA，无论是剪接还是未剪接，任何其他类型的嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的多核苷酸，以及含有核苷酸主链的其他聚合物，例如聚酰胺(例如肽核酸(“PNA”))和聚吗啉代(polymorpholino)(可从Anti-Virals公司,Corvallis,OR.以商购)聚合物和其它合成的序列特异性核酸聚合物，条件是该聚合物含有核碱基，其构型允许碱基配对和碱基堆积，例如在DNA和RNA中所发现的。因此，这些术语包括例如3'-脱氧-2',5'-DNA、寡脱氧核糖核苷酸N3'至P5'氨基磷酸酯、2'-O-烷基取代的RNA、DNA与RNA之间或PNA与DNA或RNA之间的杂交体，还包括已知类型的修饰，例如标记、烷基化、“帽”、用类似物取代一个或多个核苷酸，核苷酸间的修饰，例如具有不带电荷的连接(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的那些，具有带负电荷的连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，以及具有带正电荷的连接(例如氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸酯)的那些，含有侧链部分的那些，所述侧链部分例如蛋白质(包括酶(例如核酸酶)、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)，具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂等)的那些，含有螯合物(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等的螯合物)的那些，含有烷化剂的那些，具有修饰连接的那些(例如α-异头核酸等)，以及未修饰形式的多核苷酸或寡核苷酸。

[0025] 如本文所用，多肽是指通过肽键结合在一起的氨基酸单体的长的线性链。“纯化的”或“分离的”多肽或“基本上纯的”多肽制剂在本文中可互换使用，并且如本文所用，是指已与其他蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸和与之天然相关的其他生物学物质分离的多肽。优选地，所述多肽也与用于纯化多肽的物质例如抗体或凝胶基质、例如聚丙烯酰胺分离。多肽的纯度可用标准方法测定，包括例如聚丙烯酰胺凝胶电泳(例如SDS-PAGE)、柱色谱(例如高效液相色谱(HPLC))和氨基末端氨基酸序列分析。

[0026] 本发明的变体多肽的片段可以保留至少一种肌醇六磷酸酶特异性活性或表位。肌醇六磷酸酶活性可通过检测催化肌醇六磷酸到肌醇和游离磷酸的作用来测定。例如，含有例如至少8-10个氨基酸的肌醇六磷酸酶多肽片段可用作生产肌醇六磷酸酶特异性抗体的免疫原。该片段可含有例如，在肌醇六磷酸酶中保守的氨基酸序列，该氨基酸序列可含有在肌醇六磷酸酶中保守的氨基酸。通过比较肌醇六磷酸酶的序列，可以容易地鉴定这些片段。确定氨基酸序列同源性的比较长度可以是例如至少15个氨基酸，例如至少20、25或35个氨基酸。可以使用标准序列分析软件测定同源性。

[0027] 如本文所用，在两个蛋白质或多肽序列(或核苷酸序列)的上下文中的“序列同一性”或“同一性”或“同源性”包括涉及两个序列中的残基，当在指定的比较窗口上比对以获得最大对应时它们是相同的。与用于两个序列的最佳比对的参考序列相比，比较窗口中氨基酸序列或核苷酸序列的部分可以包括添加或缺失(即，间隙)。当对蛋白质使用序列同一性百分比时，可认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸的取代而不同，其中用氨基酸取代具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基并且因此不改变分子的功能特性。当序列在保守取代方面不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。通过这种保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这些调整的手段对于本领域技术人员来说是公知的。百分比的计算是通过确定在两个序列中出现相同氨基酸或核酸碱基残基的位置数以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。通常，这涉及将保守取代评分为部分而非完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如当给予相同的氨基酸得分为1且非保守取代得分为0时，保守取代给出0和1之间的得分。计算保守取代的评分，例如可根据迈耶斯和米勒的算法(Computer Applic.Biol.Sci.,1998,4,11-17)。

[0028] 如本文所用，“基本上互补的”或“基本上匹配的”是指两个核酸序列具有至少约70％的序列同一性。优选地，两种核酸序列具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％的序列同一性。或者，“基本上互补”或“基本上匹配”是指两个核酸序列可以在高严格条件下杂交。

[0029] 如本文所用，“碳水化合物”、“糖类”或“糖”是指由碳(C)、氢(H)和氧(O)原子组成的大分子，通常具有2：1的氢：氧原子比(如在水中)；换句话说，具有经验公式Cm(H2O)n(其中m可以与n不同)。多糖可具有一种以上的糖并用于储存能量。单糖并且仅含有一个糖单元，而二糖可含有两个糖单元或两个连接的单糖。如本文所用，术语“总糖”通常是指非乙醇的糖的组合和变种。然而，该术语也可用于指糖的任何组合。

[0030] 如本文所用，“酶”是指大分子催化剂。酶负责数千种维持生命的代谢过程。酶是高选择性催化剂，大大加速了代谢反应的速率和特异性。反应可包括但不限于食物的消化、分子的裂解或分解，以及DNA的合成。尽管已经鉴定了一些催化性RNA分子，但大多数酶是蛋白质。酶采用特定的三维结构，并且可以使用有机(例如生物素)和无机(例如镁离子)辅因子来辅助催化。酶通常对于它们催化的反应和参与这些反应的底物具有很高的特异性。酶和底物的互补形状、电荷和亲水/疏水特征是这种特异性的原因。酶还可以显示高水平的特异性，例如立体特异性、区域选择性和化学选择性。作为非限制性的实例，一些酶可用于分解大分子，例如淀粉、聚糖苷、糖、蛋白质、支链糖、脂糖、APG。在一些实施方案中，酶可用于分解胶束并释放油。

[0031] 如本文所用，“肌醇六磷酸酶”是指催化植酸盐、植酸、肌醇六磷酸(或肌醇六磷酸盐)、肌醇多磷酸、肌醇六磷酸酯(IP6)或其盐或组合物水解，转化为无机磷、无机磷酸盐和肌醇的任何多肽、酶或磷酸酶。

[0032] 如本文所用，“纤维素酶”是指可以水解纤维素和多糖以产生单糖的酶。在一些实施方案中，提供了包含纤维素酶活性的酶。

[0033] 如本文所用，“糖苷水解酶”、“糖苷酶”或“糖基水解酶”是可以帮助复合糖中糖苷键水解的酶。这些术语可以互换使用。这些酶可以降解生物质，例如纤维素、半纤维素、APG和糖苷。糖苷酶形成糖苷键断裂的主要催化机制。在一些实施方案中，提供了包含糖苷水解酶活性的酶。在一些实施方案中，酶可使胶束不稳定。

[0034] 如本文所用，“酵母细胞计数”是指分别或以任何组合测量活的或非活的酵母细胞。酵母细胞计数可以使用任何方法测量，包括但不限于使用血细胞计数器、计数室、基于显微镜的计数方法、电子计数方法、自动计数技术，或任何手动或自动细胞计数装置或机器(例如Coulter计数器)。术语“活的酵母细胞”也可与“活酵母细胞”互换使用，“死酵母细胞”可与“非活酵母细胞”或“不活的酵母细胞”互换使用。可以使用任何普遍接受的方法进行酵母生存力的计算，包括通过：1)染色(例如亚甲蓝)以区分活酵母细胞和非活酵母细胞，2)活细胞和非活细胞的细胞计数，和3)使用下式计算：酵母存活％＝[(总计数细胞-总计数非活细胞)/总计数细胞]×100。

[0035] 酵母出芽百分比通常用于计算酵母繁殖率。较高的酵母繁殖率可能与乙醇或生物燃料生产的增加速率直接相关。因此，酵母出芽的优化可用于在发酵过程中最大化乙醇产量的产生。如本文所用，出芽酵母细胞计数可使用任何普遍接受的方法测量，包括但不限于使用血细胞计数器、计数室、基于显微镜的计数方法、电子计数方法、自动计数技术或任何手动或自动化细胞计数装置或机器(例如Coulter计数器)。如果单个芽至少是母细胞大小的一半，则从母细胞中出现的酵母细胞芽被计为单独的细胞。然后可以将这些出芽酵母细胞计数与活酵母细胞计数结合使用，以使用下式确定酵母出芽百分比：酵母出芽％＝(总出芽细胞/总的活细胞)×100。

[0036] 如本文所用，“结垢”是指不希望的物质在装置、设备或机器的固体表面上的积聚，抑制其性能或功能。其他常用术语可包括沉积、沉积形成、污垢形成、结垢或水垢沉积。“结垢率”是指这种不希望的物质积聚的速率。较高的结垢率直接导致乙醇生产设施的操作或在线时间减少，从而增加了乙醇生产的成本。

[0037] 如本文所用，“在线时间”或“运行时间”是指在清洁、维护或关闭设备或机器变得合乎需要或必要之前，设备或机器可能连续运行的时间长度。由于多种原因，设备或机器可能会关闭，但乙醇生产中一个特别相关的原因是结垢。例如，一旦形成或沉积了足够量的不期望的物质，一些处理设备的性能将降低，直到已经执行了清洁处理。清洁过程可能需要酸性或腐蚀性溶液、纯净水、洗涤剂等。较低的在线时间增加了乙醇或生物燃料生产的时间和财务成本。

[0038] 应当理解，本文所述的内容的各方面和实施方案包括“由......组成”和/或“基本上由......组成”的方面和实施方案。

[0039] 根据以下说明书，其他目的、优点和特征将变得很清楚。

[0040] 具有肌醇六磷酸酶活性的多肽

[0041] 本公开物的一些实施方案提供分离的、合成的或重组的核酸，其包含(a)(i)核酸序列，具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO:1的序列同一性，并且包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或十四个对SEQ ID NO：1的核苷酸碱基配对序列修饰；(ii)核酸序列，具有至少70％、80％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：1的序列同一性，并且包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或十四个对SEQ ID NO：1的核苷酸碱基配对序列修饰；(iii)编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或十四个对SEQ ID NO：2的氨基酸残基修饰的序列；或(iv)编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有包含至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：2的序列同一性，其中所述核酸编码至少一种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，并且任选地通过序列比较算法分析或通过目视检查确定序列同一性；或(b)与其完全互补的序列。

[0042] 本公开物的一些实施方案提供(i)编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或十四个对SEQ ID NO：3的氨基酸残基修饰的序列；或(ii)编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有包含至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：3的序列同一性的序列，其中所述核酸编码至少一种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，并且任选地通过序列比较算法分析或通过目视检查确定序列同一性；或(b)与其完全互补的序列。

[0043] 本公开物的一些实施方案提供了具有以下序列的多肽，所述序列包含对SEQ ID NO：2的氨基酸残基23-434的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或十四个氨基酸残基修饰；或(v)具有包含至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：2的氨基酸残基23-434的序列同一性的序列的多肽。

[0044] 本公开物的一些实施方案提供了具有以下序列的多肽，所述序列包含对SEQ ID NO：2的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或十四个氨基酸残基修饰；或(v)具有包含至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：2的序列同一性的序列的多肽。

[0045] 本公开物的一些实施方案提供了具有以下序列的多肽，所述序列包含对SEQ ID NO：3的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或十四个氨基酸残基修饰；或(v)具有包含至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：3的序列同一性的序列的多肽。

[0046] 一些实施方案可提供编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有包含至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与本文所公开的变体多肽的序列同一性的序列，其中所述核酸编码至少一种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，并且任选地通过使用序列比较算法分析或目视检查确定序列同一性，或(b)与其完全互补的序列。

[0047] 本公开物的一些实施方案提供了与SEQ ID NO：2具有序列同源性并具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽。这些变体多肽标记为“PV-[编号]”，包括：

[0048] PV001:变体多肽，其包含至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的全长的同一性的氨基酸序列；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0049] PV002:变体多肽，其包含至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：2的氨基酸残基23-434中所示氨基酸序列的同一性的氨基酸序列；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0050] PV003:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和一个选自以下的单个氨基酸取代：A47F、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、L50W、M51A、M51G、M51L、G67A、W68E、Y79H、Y79N、Y79S、Y79W、Q84W、Q86H、A95P、K97C、K97E、K97V、P100A、P102A、P102Y、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、A109V、E113P、L126R、T136H、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、D139Y、P145L、L146R、L146T、F147Y、N148K、N148M、N148R、P149L、P149N、l150Tl、l150Y、K151H、K151P、C155Y、L157C、L157P、N159V、N159Q、N161K、V162L、V162T、T163R、T163P、D164R、L167S、S168E、G171M、G171S、S173G、S173H、S173V、I174F、G179R、R181Y、V191A、L192F、F194L、S197G、S208P、S211H、L216T、P217D、P217G、P217L、P217S、S218I、S218Y、N226C、A232P、V233W,Q275V、A236H、A236T、L244S、Q246W、Q247H、A248L、A248T、P254S、G257A、G257R、H263P、W265L、N266P、L269I、L269T、L269P、H272W、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、Q275V、Y277D、T282H、R289A、T291V、T291W、L296T、M298K、A299T Q309P、N339E、T341D、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、N348K、N348W、T349Y、G353C、L363P、Q377R、L379S、L379V、Q381S、S389H、S389V、G395E、G395I、G395L、G395Q、G395T、V422M、I427G、I427S、I427T、A429P，及其组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0051] PV004:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0052] PV005:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和两个M298K、A299T的氨基酸取代，并进一步包含选自以下的单个氨基酸取代：A47F、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、L50W、M51A、M51G、M51L、G67A、W68E、Y79H、Y79N、Y79S、Y79W、Q84W、Q86H、A95P、K97C、K97E、K97V、P100A、P102A、P102Y、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、A109V、E113P、L126R、T136H、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、D139Y、P145L、L146R、L146T、F147Y、N148K、N148M、N148R、P149L、P149N、l150Tl、l150Y、K151H、K151P、C155Y、L157C、L157P、N159V、N159Q、N161K、V162L、V162T、T163R、T163P、D164R、L167S、S168E、G171M、G171S、S173G、S173H、S173V、I174F、G179R、R181Y、V191A、L192F、F194L、S197G、S208P、S211H、L216T、P217D、P217G、P217L、P217S、S218I、S218Y、N226C、A232P、V233W,Q275V、A236H、A236T、L244S、Q246W、Q247H、A248L、A248T、P254S、G257A、G257R、H263P、W265L、N266P、L269I、L269T、L269P、H272W、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、Q275V、Y277D、T282H、R289A、T291V、T291W、L296T、M298K、A299T Q309P、N339E、T341D、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、N348K、N348W、T349Y、G353C、L363P、Q377R、L379S、L379V、Q381S、S389H、S389V、G395E、G395I、G395L、G395Q、G395T、V422M、I427G、I427S、I427T、A429P，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0053] PV006:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0054] PV007:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和Q84W、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0055] PV008:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和A95P、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0056] PV009:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和K97C、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0057] PV010:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和S168E、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0058] PV011:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和R181Y、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0059] PV012:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和N226、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0060] PV013:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0061] PV014:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和Q84W、A95P、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0062] PV015:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和Q84W、A95P、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0063] PV016:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0064] PV017:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、K97C、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0065] PV018:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、K97C、R181Y、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0066] PV019:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、R181Y、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0067] PV020:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、R181Y、N226C、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0068] PV021:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0069] PV022:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和A47F、W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0070] PV023:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97E、S168E、R181Y、N226C、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0071] PV024:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97V、S168E、R181Y、N226C、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0072] PV025:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、T136H、S168E、R181Y、N226C、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0073] PV026:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、N159V、S168E、R181Y、N226C、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0074] PV027:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、N159E、S168E、R181Y、N226C、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0075] PV028:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、T163R、S168E、R181Y、N226C、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0076] PV029:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、D164R、S168E、R181Y、N226C、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0077] PV030:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168R、R181Y、N226C、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0078] PV031:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、G197R、R181Y、N226C、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0079] PV032:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0080] PV033:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、V233W、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0081] PV034:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、Q275V、Y277D、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0082] PV035:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、Y277D、R289A、M298K和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0083] PV036:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、Y277D、M298K、A299T和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0084] PV037:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和A47F、W68E、Q84W、A95P、K97E、T136H、N159V、S168E、G179R、R181Y、N226D、V233W、Q275V、Y277D、R289A、M298K、A299T和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0085] PV038:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和A47F、W68E、Q84W、A95P、K97E、N159V、T163R、D164R、S168E、G179R、R181Y、N226D、V233W、Q275、Y277D、M298K、T349Y和A299T的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0086] PV039:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、T163R、D164R、G179R、V233W、Q275V和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0087] PV040:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168R、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、T163R、D164R、G179R、V233W、Q275V、R289A和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0088] PV041:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97V、S168R、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、T163R、G179R、V233W、Q275V、R289A和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0089] PV042:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97V、S168R、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、T163R、D164R、G179R、V233W、Q275V和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0090] PV043:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168R、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、T163R、D164R、G179R、V233W、Q275V和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0091] PV044:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97E、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、T163R、D164R、G179R、V233W、Q275V和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0092] PV045:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97E、S168R、R181Y、N226C、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、T163R、D164R、G179R、V233W、Q275V、R289A和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0093] PV046:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97E、S168E、R181Y、N226C、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159E、T163R、D164R、G179R、V233W、Q275V、R289A、T349Y和L363P的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0094] PV047:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97V、S168E、R181Y、N226C、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、T163R、D164R、G179R、V233W、Q275V、R289A和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0095] PV048:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97E、S168R、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、T163R、D164R、G179R、V233W、Q275V、R289A和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0096] PV049:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97E、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、N159V、D164R、G179R、V233W、Q275V、R289A和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0097] PV050:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97E、S168R、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、N159V、T163R、D164R、G179R、V233W、Q275V、R289A和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0098] PV051:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97V、S168R、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159E、T163R、D164R、G179R、V233W、Q275V、R289A和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0099] PV052:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97E、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、T163R、G179R、V233W、Q275V和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0100] PV053:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97E、S168R、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、C97E、T136H、N159V、T163R、D164R、G179R、V233W、Q275V和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0101] PV054:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159E、T163R、D164R、G179R、V233W、Q275V、R289A和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0102] PV055:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、D164R、G179R、V233W、Q275V和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0103] PV056:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97V、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、D164R、G179R、V233W、Q275V和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0104] PV057:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97V、S168E、R181Y、N226C、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、D164R、G179R、V233W、Q275V和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0105] PV058:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、V233W和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0106] PV059:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97E、T136H、N159V、T163R、D164R、S168R、G179R、R181Y、N226D、Q275V、Y277D、M298K、A299T和T349Y的氨基酸取代的组合，其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0107] PV060:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、C226D、V233W、T291V和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0108] PV061:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、V233W、A236T和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0109] PV062:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、L157P、N159V、V233W和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0110] PV063:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、L157P、N159V、D164R、G179R、V233W、Q275V和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0111] PV064:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、D164R、G179R、V233W、S236T Q275V和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0112] PV065:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、D164R、G179R、V233W、Q275V、T291V和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0113] PV066:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、L192F、V233W和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0114] PV067:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、L192F、V233W、T291V和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0115] PV068:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、D164R、G179R、L192F、V233W、Q275V和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0116] PV069:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、D164R、G179R、V233W、Q275V、T291V和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0117] PV070:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、D164R、G179R、L192F、V233W、Q275V、T291V和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0118] PV071:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、L192F、V233W、A236T和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0119] PV072:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、V233W、A236T、T291V和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0120] PV073:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、L192F、V233W、A236T、T291V和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0121] PV074:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、D164R、G179R、L192F、V233W、A236T、Q275V和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0122] PV075:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、D164R、G179R、V233W、A236T、Q275V、T291V和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0123] PV076:变体多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列和W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226D、Y277D、M298K、A299T、A47F、T136H、N159V、D164R、G179R、L192F、V233W、A236T、Q275V、T291V和T349Y的氨基酸取代的组合；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0124] PV077:如上所述的任何变体多肽，其中氨基酸序列如SEQ ID NO：2的氨基酸残基23-440中所示，并且所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0125] PV078:如上所述的任何变体多肽，其中氨基酸序列如SEQ ID NO：2的氨基酸残基1-434中所示，并且所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0126] PV079:如上所述的任何变体多肽，其中氨基酸序列如SEQ ID NO：2的氨基酸残基23-434中所示，并且所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性。

[0127] 本公开物的一些实施方案提供具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽，其与SEQ ID NO：3具有序列同源性。具有肌醇六磷酸酶活性和与SEQ ID NO：3的序列同源性的变体多肽标记为“PhV-[编号]”并且包括至少所描述的修饰。这些变体多肽包含SEQ ID NO：3所示的全长氨基酸序列和以下的氨基酸取代的组合：

[0128] PhV-001 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T A123V T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N D398E

[0129] PhV-002 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92A Q121T A123V T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N D398E

[0130] PhV-003 D2E A4E A6S F8Y N33M R67L K76N N78T D92A Q121T A123V T152G S164E A200N D258N M260I S261H N270Q H374N D398E

[0131] PhV-004 D2E A4E A6S F8Y N33M R67L K76N N78T D92N Q109N Q121T A123V A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q
H374N D398E

[0132] PhV-020 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0133] PhV-031 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0134] PhV-048 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76I N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0135] PhV-053 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q121T A123V T152G S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N[0136] PhV-055 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N
D258N S261H N270Q Q276N H374N

[0137] PhV-058 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0138] PhV-059 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N D398E

[0139] PhV-060 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q109N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q I300L N346G
H374N

[0140] PhV-064 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92A Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0141] PhV-065 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92T Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0142] PhV-066 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92V Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0143] PhV-067 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92A Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0144] PhV-068 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92E Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0145] PhV-069 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92T Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0146] PhV-070 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92V Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0147] PhV-072 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92E Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0148] PhV-073 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76I N78T D92N Q109N Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N

[0149] PhV-074 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76I N78T D92N Q109N Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q 1300L H374N D398E

[0150] PhV-075 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92N Q109N Q121 T A144E S164E A200N S217G D258N S261H N270Q I300L H374N[0151] PhV-076 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92A Q121T
A123V S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N

[0152] PhV-077 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92E Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N

[0153] PhV-078 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92T Q121T A1 23V S1 64E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N

[0154] PhV-079 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92V Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N

[0155] PhV-081 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T A123V T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N D398E

[0156] PhV-083 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T1 52G S164E A200N D258N S261H N270Q Q276N I300L H374N D398E

[0157] PhV-084 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92A Q121T S136K S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0158] PhV-085 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76I N78T D92A Q109N Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N

[0159] PhV-088 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G T156G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N D398E

[0160] PhV-089 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N D398E

[0161] PhV-094 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q109N Q121T A123V T152G T156G S164E A200N D258N S261H N270Q
Q276N I300L N346G H374N

[0162] PhV-095 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76I N78T D92N Q121T A144E T152G S164E A200N S217G D258N S261H N270Q H374N
D398E

[0163] PhV-096 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76I N78T D92A Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0164] PhV-097 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92A Q109N Q121T A123V Q159N S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0165] PhV-098 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92A Q121T S136K S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0166] PhV-099 D2E A4E A6S F8Y N33D K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0167] PhV-101 N33D K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N H374N

[0168] PhV-103 N33D D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N[0169] PhV-104 N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0170] PhV-105 N33D D92N S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0171] PhV-106 N33D K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H H374N

[0172] PhV-107 N33D K76N N78T D92N Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0173] PhV-108 N33D D92N Q121T A123V A144E T152G S164E A200N S217G D258N S261H N270Q H374N

[0174] PhV-109 N33D D92N Q121T A123V A144E T152G Q159N S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0175] PhV-110 N33D D92N Q121T T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N

[0176] PhV-111 N33D D92A Q121T T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270QH374N

[0177] PhV-112 S1-D2-T3Q A4G P5A N33D D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0178] PhV-113 S1-D2-T3Q A4G P5A N33D D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0179] PhV-114 A6D G7K F8M Q9K N33D D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0180] PhV-115 N33D D92A Q121T A123V A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N

[0181] PhV-116 N33D D92N Q121T A123V A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N

[0182] PhV-117 S1A D2S T3R A4N N33D D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0183] PhV-118 N33D D92N Q121T A123V A144E T152G S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N

[0184] PhV-119 N33D D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N[0185] PhV-120 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0186] PhV-121 S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0187] PhV-122 N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0188] PhV-123 D2E A4E A6S F8Y N33D D92N S164E A200N H374N

[0189] PhV-124 D2E A4E A6S F8Y N33D K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H H374N

[0190] PhV-125 N33D D92A Q121T A123V T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0191] PhV-126 N33D D92A Q121T A123V T152G S164E A200N D258N M260I S261H N270Q H374N

[0192] PhV-127 N33D D92N Q121T A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N

[0193] PhV-128 A4E A6S N33D D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N

[0194] PhV-129 N33D R67L D92N Q121T A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N

[0195] PhV-130 L16V N33D D92N Q121T A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N

[0196] PhV-131 K12R N33D D92N Q121T A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N

[0197] PhV-132 K12R L16V N33D D92N Q121T T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N

[0198] PhV-133 N33D R67L D92N Q121T A123V T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N

[0199] PhV-134 N33D D92N Q121T A144E T152G Q159N S164E A166E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N

[0200] PhV-135 N33D R67L D92N Q121T A123V A144E T152G Q159N S164E A166E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N

[0201] PhV-136 N33D D92A Q121T A123V A144E T152G Q159N S164E A166E A200N S21 7G D258N M260I S261H N270Q H374N

[0202] PhV-137 N33D D92A Q121T T152G Q159N S164E A166E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N D398E

[0203] PhV-138 N33D D92N Q121T A123V A144E T152G Q159N S164E A166E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N D398E

[0204] PhV-139 N33D D92N Q121T A144E T152G Q1 59N S164E A200N S217G D258N S261H N270Q H374N

[0205] PhV-140 K12R N33D R67L D92N Q121T A123V A144E T1 52G S164E A200N S217G D258N S261H N270Q H374N

[0206] PhV-141 L16V N33D R67L D92N Q121T A123V A144E T152G S164E A200N S217G D258N S261H N270Q H374N

[0207] PhV-142 N33D R67L D92N Q121T A123V A144E T152G S164E A166E A200N S217G D258N S261 H N270Q H374N

[0208] PhV-143 N33D D92N Q121T A123V A144E T152G S164E A166E A200N S217G D258N S261H N270Q I300L H374N

[0209] PhV-144 N33D D92N I120L Q121T A123V A144E T152G S164E A200N S217G D258N S261H N270Q I300L H374N

[0210] PhV-145 N33D D92N I120L Q121T A123V A144E T152G S164E A200N S217G D258N S261H N270Q L371A H374N

[0211] PhV-146 N33D R67L D92N I120L Q121T A123V A144E T152G S164E A166E A200N S217G D258N S261H N270Q L371A H374N，or

[0212] PhV-147 N33D D92N I120L Q121T A123V A144E T152G S164E A200N S217G D258N S261H N270Q I300L L371A H374N.

[0213] 本公开物的一些实施方案提供了加工肌醇六磷酸盐、肌醇六磷酸或其盐的方法，包括以下步骤：(a)提供具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其中所述多肽包含本文公开的多肽；(b)提供包含肌醇六磷酸盐、肌醇六磷酸或其盐的组合物；(c)使步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物在所述多肽可裂解肌醇-无机磷酸酯键的条件下接触。

[0214] 本公开物的一些实施方案提供了将肌醇六磷酸酯组合物水解成肌醇和无机磷酸盐的方法，包括以下步骤：(a)提供具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其中所述多肽包含本文公开的氨基酸序列，或由本文公开的核酸序列编码的多肽；(b)提供包含肌醇六磷酸酯的组合物；以及(c)使步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物在所述多肽水解肌醇六磷酸酯以产生肌醇和无机磷酸盐的条件下接触，并且任选地所述组合物包含肌醇六磷酸。在一些实施方案中，肌醇六磷酸酯组合物包括以钙盐、镁盐、金属离子、蛋白质、未水解的肌醇六磷酸盐污泥或肌醇六磷酸酯组合物形式的肌醇六磷酸盐。

[0215] 在一些实施方案中，所述肌醇六磷酸酶活性是耐热的，并且任选地，该多肽在暴露于以下温度范围后保持肌醇六磷酸酶活性：约40℃至约70℃之间，或约37℃至约100℃之间，或高于37℃至约50℃，55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃或更高温度下。在一些实施方案中，所述肌醇六磷酸酶活性是耐热的，并且任选地，该多肽在以下温度范围保持肌醇六磷酸酶活性：约40℃至约70℃之间，或约37℃至约100℃之间，或高于37℃至约50℃，55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃或更高温度下。

[0216] 本公开物的一些实施方案中提供的具有肌醇六磷酸酶活性的多肽是耐热的，并且任选地，该多肽在暴露于以下温度范围后保持肌醇六磷酸酶活性：约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、
101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高温度。在一些实施方案中，该耐热多肽可以在暴露于以下温度范围后保持活性，例如肌醇六磷酸酶活性：约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃至约55℃、约55℃至约70℃，约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约
110℃、约110℃至约120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃，113℃、114℃、115℃或更高温度。在一些实施方案中，该耐热多肽可以在暴露于上述温度范围后在以下pH下保持活性，例如肌醇六磷酸酶活性：约pH 2.0、约pH 2.5、约pH 3.0、约pH 3.5、约pH 4.0、约pH 4.5、约pH
5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH 6.5、约pH 7.0、约pH 7.5、约pH 8.0、约pH 8.5、约pH 9.0、约pH 9.5、约pH 10.0、约pH 10.5、约pH 11.0、约pH 11.5、约pH 12.0或更高。

[0217] 本公开物的一些实施方案提供具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其活性是热稳定的。例如，如本文所述的多肽可以是热稳定的。任选地，该热稳定多肽可以在包含以下温度范围的条件下保持结合和/或酶促活性，例如肌醇六磷酸酶活性：约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约37℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约120℃、或95℃、96℃、97℃、
98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、
111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高温度。在一些实施方案中，该热稳定多肽可以在以下温度范围的条件下保持活性，例如肌醇六磷酸酶活性：约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约
25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约
105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、
114℃、115℃或更高温度。在一些实施方案中，该耐热多肽可以在上述温度范围下在以下pH下保持活性，例如肌醇六磷酸酶活性：约pH 2.0、约pH 2.5、约pH 3.0、约pH 3.5、约pH 4.0、约pH 4.5、约pH 5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH 6.5、约pH 7.0、约pH 7.5、约pH 8.0、约pH
8.5、约pH 9.0、约pH 9.5、约pH 10.0、约pH 10.5、约pH 11.0、约pH 11.5、约pH 12.0或更高。

[0218] 在一些实施方案中，任何多肽的肌醇六磷酸酶活性包含以下比活性：在约37℃下，每毫克蛋白质约100至约1000单位；或者，每毫克蛋白质约500至约750单位；或者，在37℃下，每毫克蛋白质约500至约1200单位；或者，在37℃下，每毫克蛋白质约750至约1000单位。在一些实施方案中，耐热的肌醇六磷酸酶活性在暴露于约37℃的温度后包含约100至约
1000单位/毫克蛋白质的比活性；或者，热稳定的肌醇六磷酸酶活性包括每毫克蛋白质约
500至约750单位的比活性；或者，热稳定的肌醇六磷酸酶活性包括在37℃下每毫克蛋白质约500至约1200单位的比活性；或者，热稳定的肌醇六磷酸酶活性在37℃下包含约750至约
1000单位/毫克蛋白质的比活性。在一些实施方案中，热稳定的肌醇六磷酸酶活性在包括约
37℃的温度条件下包含约100至约1000单位/毫克蛋白质的比活性；或者，热稳定的肌醇六磷酸酶活性包含每毫克蛋白质约500至约750单位的比活性；或者，热稳定的肌醇六磷酸酶活性在37℃下包含每毫克蛋白质约500至约1200单位的比活性；或者，热稳定的肌醇六磷酸酶活性在37℃下包含约750至约1000单位/毫克蛋白质的比活性。

[0219] 在一些实施方案中，所述多肽在包括约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0或更低(更酸性)的pH的条件下保持肌醇六磷酸酶活性。在一些实施方案中，该多肽可在包括约pH 7.5、pH 8、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10.0、pH 10.5、pH 11.0、pH 11.5、pH 12、pH12.5或更高的条件下保持肌醇六磷酸酶活性。

[0220] 在一些实施方案中，本文公开的多肽可以是异二聚体，并且在一些实施方案中，该异二聚体包含第二结构域，其中任选地第二结构域是多肽并且所述异二聚体是融合蛋白，并且任选地第二结构域是表位或标签。

[0221] 在一些实施方案中，提供了固定化多肽，其中所述固定化多肽包含同二聚体或异二聚体，其中任选地将所述多肽固定在细胞、囊泡、脂质体、膜、薄膜、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、珠子、凝胶、平板、阵列、毛细管、晶体、片剂、丸剂、胶囊、粉末、附聚物、表面或多孔结构之上或内部。在一些实施方案中，本文提供包含固定化多肽的阵列(例如，微阵列)，其中所述多肽可以是异二聚体，或所述阵列包含固定化核酸，或其组合。

[0222] 在一些实施方案中，本文提供了包含载体和多肽或其同二聚体或异二聚体的小丸；其中任选地将该多肽包衣用于控制释放，并且任选地，肌醇六磷酸酶活性是耐热的或热稳定的，并且任选地，所述小丸以丸粒形式制备，或者作为丸剂、片剂、胶囊、凝胶、凝胶片(geltab)、喷雾剂、粉末、冻干制剂、液体形式、薄膜、作为悬浮液或浆液，或使用聚合物包衣的添加剂制备，或以颗粒形式制备，或通过喷雾干燥制备。

[0223] 广义上，变体多肽是从具有任何来源的基因产物中分离、衍生或重组的，所述来源包括细菌、真菌、动物和植物来源。来源的实例可包括例如芽孢杆菌、曲霉菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、嗜糖假单胞菌(Pseudomonas sarccharophilla)等。

[0224] 提高乙醇生产效率的方法

[0225] 本文公开的一些实施方案提供了用于提高酵母生产乙醇的效率的方法，该方法包括：(a)提供包含与SEQ ID NO：2的氨基酸残基23-434中所示的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的变体多肽；其中所述变体多肽具有肌醇六磷酸酶活性；以及(b)将该变体多肽加到乙醇生产设施中的乙醇加工液中，其中与野生型肌醇六磷酸酶、市售的肌醇六磷酸酶或无肌醇六磷酸酶相比，添加变体多肽提高了乙醇生产效率。在一些实施方案中，与不添加肌醇六磷酸酶、添加野生型肌醇六磷酸酶或添加市售的肌醇六磷酸酶的生产过程相比，在乙醇生产过程中的任何步骤添加所述变体多肽提高了乙醇生产效率。乙醇生产过程中提高的效率包括增加的酵母细胞计数、酵母出芽或酵母生存力、增加的乙醇产量、降低的甘油水平或糖水平(例如总糖水平)中的一种或多种。乙醇生产过程中提高的效率包括以下的一种或多种：增加的酵母细胞计数、酵母出芽或酵母生存力、增加的乙醇产率、甘油水平或糖水平；结垢率下降；磷水平增加；和增加乙醇生产设施的运行时间。

[0226] 在一些实施方案中，与野生型肌醇六磷酸酶、市售的肌醇六磷酸酶或无肌醇六磷酸酶相比，改善的效率包括酵母细胞计数的增加，其增加约或大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或上述任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，与野生型肌醇六磷酸酶、市售的肌醇六磷酸酶或无肌醇六磷酸酶相比，改善的效率包括酵母出芽增加，其增加约或大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、
7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或上述任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，与野生型肌醇六磷酸酶、市售的肌醇六磷酸酶或无肌醇六磷酸酶相比，改善的效率包括酵母生存力增加，其增加约或大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、
7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或上述任何两个值之间的范围。

[0227] 在一些实施方案中，与野生型肌醇六磷酸酶、市售的肌醇六磷酸酶或无肌醇六磷酸酶相比，改善的效率包括乙醇产率增加，其增加约或大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或上述任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，与野生型肌醇六磷酸酶、市售的肌醇六磷酸酶或无肌醇六磷酸酶相比，改善的效率包括甘油水平降低，其降低约或大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、
8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或上述任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，与野生型肌醇六磷酸酶、市售的肌醇六磷酸酶或无肌醇六磷酸酶相比，改善的效率包括总糖水平降低，其降低约或大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、
9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或上述任何两个值之间的范围。

[0228] 在一些实施方案中，与野生型肌醇六磷酸酶、市售的肌醇六磷酸酶或无肌醇六磷酸酶相比，改善的效率包括结垢率降低，其降低约或大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或上述任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，与野生型肌醇六磷酸酶、市售的肌醇六磷酸酶或无肌醇六磷酸酶相比，改善的效率包括磷水平增加，其增加约或大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、
9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或上述任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，与野生型肌醇六磷酸酶、市售的肌醇六磷酸酶或无肌醇六磷酸酶相比，改善的效率包括运行时间增加，其增加约或大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、
10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或上述任何两个值之间的范围。

[0229] 本文公开的具有肌醇六磷酸酶活性的多肽可以在特定类型的设备或乙醇加工阶段所需的时间点和条件下添加到乙醇加工设备和/或加工液中。例如，如本文所公开的肌醇六磷酸酶可用于如图1所示的醇产物加工的任何步骤中。

[0230] 在一些实施方案中，将具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽添加至以下任何一种：原料、锤磨机、浆料罐、喷射式蒸煮器、液化、醪液蒸煮器、酵母混合罐、酵母繁殖罐、发酵罐、啤酒、蒸馏系统、全釜馏物、离心机、酒糟水、蒸发器、冷凝物、糖浆、湿谷物、滚筒干燥器、具有可溶物的干酒糟、浓缩的蒸馏可溶物、干酒糟、具有可溶物的湿酒糟或其任何组合。

[0231] 在一些实施方案中，将肌醇六磷酸酶在约20℃至约80℃，例如约20℃至约77℃，约40℃至约65℃，或约30℃至约55℃(例如，52℃)的温度下加入乙醇加工液中。在一个方面，在足以使肌醇六磷酸盐和肌醇六磷酸酶之间的反应进行至完全而不降解酶的温度下，将肌醇六磷酸酶加入到乙醇加工液中。在另一方面，将肌醇六磷酸酶在pH为约3至约9，例如约
4.0至约5.0，约4.0至约5.5，或约4.0至约5.3下加入到乙醇加工液中。在另一方面，在4.0的pH下加入肌醇六磷酸酶，并且反应在约40℃至约65℃，约20℃至约77℃或约30℃至约55℃(例如，52℃)的温度下进行。

[0232] 在一些实施方案中，将变体多肽以每繁殖罐约0.01加仑至每繁殖罐约10加仑，或每繁殖罐0.1加仑至5加仑，或每繁殖罐0.5加仑至2.5加仑的浓度添加至乙醇加工液中。在一些实施方案中，变体多肽以每繁殖罐0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10加仑加入。

[0233] 在一个实施方案中，将变体多肽以较低浓度添加至乙醇加工液中，并使反应进行较长时间。延长反应时间或停留时间允许使用较少量的酶，使乙醇加工更经济。在一个方面，将变体多肽添加至乙醇加工液中，持续足以使变体多肽与不溶性肌醇六磷酸盐完全反应的停留时间。另一方面，加入变体多肽持续约2分钟至约1200分钟，例如约3分钟至约200分钟，或约3分钟至约40分钟的停留时间。

[0234] 本文公开的具有肌醇六磷酸酶活性的多肽可用于乙醇生产的干酒糟加工中，乙醇如“酒(spirits)”中，例如啤酒或威士忌生产(除了用于加工生物质以生产生物燃料)中的。本公开物的肌醇六磷酸酶可用于乙醇生产工厂，例如用于加工例如玉米等谷物。干酒糟可以通过下述方法制备：首先将谷物(例如玉米)研磨成粗稠度并加入热水中。冷却后，加入酵母，混合物发酵数天至一周。发酵后剩余的固体是酒糟。如本文所公开的肌醇六磷酸酶可用于该方法的任何步骤。

[0235] 本文公开的多肽可用于将生物质或任何木质纤维素材料(例如包含纤维素、半纤维素和木质素的任何组合物)加工成除饲料、食品和化学品外的燃料(例如生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇、生物丙醇、生物甲醇、生物柴油)。例如，在一个方面，本文公开的酶分解生物质(例如木质纤维素物质、谷物或油籽)中的不可消化的肌醇六磷酸(肌醇六磷酸盐)以释放可消化的磷；因此，在一个实施方案中，如本文所公开的肌醇六磷酸酶用于处理或预处理生物质。

[0236] 因此，本发明的组合物和方法可用于生物燃料的生产和/或加工，例如，为基于石油的产品的使用提供有效和可持续的替代品和/或辅助剂；例如，本文公开的组合物和方法可以与酶的混合物一起使用以产生生物燃料-例如生物甲醇、生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇、生物柴油等；它们可以添加到柴油燃料、汽油、煤油等中。本文公开的一些实施方案提供了表达本发明酶的生物体，所述酶参与涉及天然生物质转化的化学循环。在一个方面，用于转化的酶和方法用于酶集合中，用于有效加工生物质，同时将多糖、纤维素和/或半纤维素聚合物解聚成可代谢的(例如可发酵的)碳部分。一些实施方案公开了用于发现和实施最有效的酶以实现这些重要的新“生物质转化”和替代能源工业过程的方法。

[0237] 本发明的多肽和方法可用于提供有效和可持续的替代物或辅助剂，以使用基于石油的产品，例如作为生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇、生物丙醇、生物甲醇和/或生物柴油和汽油的混合物。在一些实施方案中，提供了表达用于参与涉及天然生物质转化的化学循环的酶的生物体。一些实施方案提供了用于发现和实施最有效的酶的方法，以实现这些重要的新“生物质转化”和替代能源工业过程。

[0238] 一些实施方案公开了用于加工材料的本发明的方法、酶和酶的混合物或“混合剂(鸡尾酒)”，所述材料例如生物质材料，例如包含纤维寡糖、阿拉伯木聚糖低聚物、木质素、木质纤维素、木聚糖、葡聚糖、纤维素和/或可发酵糖的组合物；例如方法，其包括使所述组合物与本发明的多肽或由本文公开的核酸编码的多肽接触，其中任选地所述材料来自农作物(例如小麦、大麦、马铃薯、柳枝稷、杨木)、是食品或饲料生产的副产品、是木质纤维素废物、或是植物残余物或废纸或废纸产品，并且任选地，植物残余物包括茎、叶、外皮、外壳、玉米或玉米穗轴、玉米秸秆、玉米纤维、干草、稻草(例如稻草或小麦秸秆)、甘蔗渣、甜菜浆、柑橘果肉和柑橘皮、木材、木材间伐材(thinnings)、木屑、木浆、纸浆废料、木材废料、刨花和锯末、建筑和/或拆除的废物和碎屑(例如木材、木屑和锯末)，并且任选地，废纸包括废弃或使用过的复印纸、计算机打印纸、笔记本纸、记事本纸、打字纸、报纸、杂志、纸板和纸基包装材料以及再生纸材料。此外，可以使用城市废物，例如市政固体废物的纸部分、市政木材废物和市政绿色废物，以及含有糖、淀粉和/或纤维素的其他材料。在可选的实施方案中，材料例如生物质材料的处理产生生物醇，例如生物柴油、生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇。

[0239] 本文公开的方法还可包括通过发酵和/或化学合成转化木质纤维素材料(由本发明的酶处理)并将其制成燃料(例如生物醇，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)。在一个方面，产生的糖被发酵和/或不可发酵的产物被气化。

[0240] 本文公开的方法还包括使用本发明的酶转化藻类、初榨植物油、废植物油、动物脂肪和油脂(例如牛油、猪油和黄油脂)或污水，并通过发酵和/或通过化学合成或转化将其制成燃料(例如生物醇，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)。

[0241] 本文公开的酶(包括例如生物体，例如微生物，例如真菌、酵母或细菌，产生并且在一些方面分泌如本文公开的重组酶)可以在任何生物质转化过程的任何阶段中使用或包含/整合例如在任何一个步骤、几个步骤，或包含在所有步骤、或所有以下生物质转化过程的方法、或所有这些生物燃料替代品中：

[0242] 直接燃烧：通过直接加热燃烧材料，是最简单的生物质技术；如果生物质源在附近，可能非常经济。

[0243] 热解：是在没有氧气的情况下通过加热使生物质热降解。在一个方面，将生物质加热至约800至1400华氏度之间的温度，但不引入氧气以支持燃烧，从而产生气体、燃料油和木炭。

[0244] 气化：生物质可用于通过加热或厌氧消化产生甲烷。合成气是一氧化碳和氢气的混合物，可以来自生物质。

[0245] 垃圾填埋气：由垃圾填埋场中埋藏垃圾的腐烂(厌氧消化)产生。当有机废物分解时，它会产生包含大约50％甲烷(天然气的主要成分)的气体。

[0246] 厌氧消化：将有机物质转化为甲烷(天然气的主要成分)和二氧化碳的混合物。在一个方面，将生物质如废水(污水)、粪肥或食品加工废物与水混合并在没有空气的情况下进料到消化罐中。

[0247] 发酵酒精发酵：通过将纤维素物质和/或淀粉转化为糖，将糖发酵成醇，然后通过蒸馏分离醇水混合物来生产燃料醇。原料例如专用作物(如玉米、小麦、大麦、马铃薯、柳枝稷、芒草、杨木)、农业残留物和废弃物(如稻草、玉米秸秆、麦秸、甘蔗渣、稻壳、玉米纤维、甜菜渣、柑橘果肉和柑橘皮)、林业废弃物(例如硬木和软木间伐材、木材加工的硬木和软木残余物、刨花和锯末)、城市废物(例如市政固体废物的纸质部分、市政木材废物、市政绿色废物)、木材废物(例如锯木厂废物、纸浆厂废物、建筑废物、拆除废物、刨花和锯末)以及废纸或其他含有糖、淀粉和/或纤维素的物质可以转化为糖，然后通过酵母发酵转化为醇。或者，含糖的材料可通过发酵直接转化为醇。

[0248] 酯交换：将油转化为生物柴油的示例性反应称为酯交换。酯交换反应过程使醇(如甲醇)与植物油、动物脂肪或再生油脂中含有的甘油三酯油反应，生成脂肪酸烷基酯(生物柴油)和甘油。该反应需要加热和强碱催化剂，如氢氧化钠或氢氧化钾。

[0249] 生物柴油：生物柴油是由植物油、动物脂肪或再生油脂制成的脂肪酸烷基酯的混合物。生物柴油可以以其纯净形式用作车辆燃料，但它通常用作石油柴油添加剂，以减少柴油动力车辆产生的颗粒物、一氧化碳、烃类和空气中的有毒物质。

[0250] 水解：包括使用本文公开的酶催化的化合物(例如生物质，例如木质纤维素材料)的水解。

[0251] 热电联产：使用单一燃料和设施同时生产多种形式的能源。在一个方面，生物质热电联产比单独的生物质生成具有更大的潜在增长，因为热电联产产生热量和电力二者。

[0252] 在一个方面，本文公开的多肽可以与其他酶联合使用，例如水解酶或具有α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、支链淀粉酶(pullanase)、纤维素分解酶活性的酶，例如葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶和/或其它酶，用于从任何有机物质，例如生物质，例如来自植物和动物的组合物，包括任何农作物或其它可再生原料、农业残余物或动物废物、市政和工业废物的有机成分、建筑或拆除的废物或碎片，或诸如藻类或酵母等微生物，产生燃料例如生物醇，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油。

[0253] 在一个方面，本文公开的多肽用于将木质纤维素生物质转化为燃料(例如生物醇，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)的方法中，或者用于水解或消化生物物质的方法中，以便它们可以用作燃料(例如生物醇，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)，或者用于使生物质更容易加工成燃料。

[0254] 在一个方面，本文公开的多肽，包括酶的混合物或“混合剂”，用于使醇(如乙醇、丙醇、丁醇、丙醇、甲醇)与植物油、动物脂肪或再生油脂中含有的甘油三酯油进行反应，形成脂肪酸烷基酯(生物柴油)和甘油的酯交换过程中。在一个方面，生物柴油由大豆油或再利用的烹饪油制成，动物脂肪、其他植物油和其他再利用的油也可用于生产生物柴油，这取决于它们的成本和可用性。在另一方面，所有种类的脂肪和油的混合物用于生产生物柴油燃料。

[0255] 在一些实施方案中，酶，包括酶的混合物或“混合剂”，和本文公开的方法，可以与从生物质制备乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙醇和/或柴油的更“传统的”方法结合使用，例如，作为包括通过使干燥的木质纤维素材料在反应器中经受由强酸和金属盐的稀溶液组成的催化剂来水解木质纤维素材料的方法；这可以降低纤维素水解的活化能或温度，以获得更高的糖产率，如美国专利号6,660,506和6,423,145所述，其内容通过引用整体并入本文。

[0256] 混合物或“混合剂”可包括本文公开的多肽与其他酶类型，包括葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如，可以在生物质转化为燃料和乙醇生产中使用纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，例如，如PCT申请WO0043496和WO8100857中所述，其内容通过引用整体并入本文。可与本文公开的酶一起使用的酶包括淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、黄原胶酶、糖苷酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、支链淀粉酶、葡糖异构酶、α-葡糖苷酶或其组合等，它们可以与肌醇六磷酸酶(例如酶类)组合使用以将淀粉转化为可发酵的糖或乙醇，如PCT申请号WO2005/096804中所述，其内容通过引用整体并入本文。

[0257] 结合使用本文公开的酶(包括酶的混合物或“混合剂”)的另一示例性方法包括水解生物质，包括任何木质纤维素材料，例如含有半纤维素、纤维素和木质素，或任何其他可水解的多糖，通过使所述材料在水性介质中在某一温度和压力下经受第一阶段水解步骤，所述温度和压力选择为主要使半纤维素解聚而不是主要使纤维素解聚成葡萄糖。该步骤产生浆液，其中液体水相含有由半纤维素解聚产生的溶解的单糖和含有纤维素和木质素的固相。第二阶段水解步骤可以包括使至少大部分纤维素解聚的条件，这样的步骤产生含有纤维素的溶解/可溶的解聚产物的液体水相，如美国专利号5,536,325中所述，其内容通过引用整体并入本文。本文公开的酶(包括公开的混合物或酶的“混合剂”)可以在该示例性方法的任何阶段加入。

[0258] 另一方面，公开了用于从纤维素基质生产生物燃料(包括生物醇，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)的方法，包括提供包含纤维素底物、本文公开的酶和发酵剂(例如，在反应容器内，例如半连续固体进料的生物反应器中)的浆液形式的反应混合物，并且反应混合物在足以引发和维持发酵反应的条件下反应(例如，如美国专利申请号20060014260中所述，其内容通过引用整体并入本文)。在一个方面，实验或理论计算可以确定最佳进料频率。在一个方面，根据优化的进料频率，以一定间隔将额外量的纤维素底物和酶提供到反应容器中。

[0259] 制备生物燃料(包括生物醇，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)的一种示例性方法描述于美国专利申请出版号20050069998；20020164730中，其内容通过引用整体并入本文；并且在一个方面包括以下阶段：研磨木质纤维素生物质(例如研磨到尺寸为15-30mm)，使获得的产物在反应器中经受蒸汽爆炸预处理1到10分钟(例如在190-230℃的温度下)；在旋风分离器或相关制造产品中收集预处理材料；通过在压滤机中过滤分离液体和固体部分，将固体部分引入发酵沉积物中并添加一种或多种酶，例如纤维素酶和/或β-葡糖苷酶(例如，溶于柠檬酸盐缓冲液pH 4.8)。

[0260] 使用本文公开的酶制备包含生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇的生物燃料(包括生物醇，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)的另一示例性方法包括预处理包含至少包含半纤维素和纤维素的木质纤维素原料的起始材料。在一个方面，起始材料包括马铃薯、大豆(油菜籽)、大麦、黑麦、玉米、燕麦、小麦、甜菜或甘蔗或一种组分或废物或食物或饲料生产的副产物。在一些实施方案中，所述起始材料选自：玉米、小麦、大麦、马铃薯、柳枝稷、芒草、杨木、稻草、玉米秸秆、麦秸、甘蔗渣、稻壳、玉米纤维、甜菜渣、柑橘果肉、柑橘皮、硬木、软木间伐材、木材加工的硬木和软木残渣、木屑、锯末、市政固体废物的纸部分、市政木材废料、市政绿色废料、锯木厂废料、纸浆厂废料、建筑垃圾、拆除垃圾、木屑、锯末、废纸、含糖、淀粉和纤维素的物质。

[0261] 起始材料(“原料”)在破坏植物纤维结构的条件下反应，以实现半纤维素和纤维素的至少部分水解。破坏性条件可包括例如使起始材料在pH 0.5至2.5下经受180℃至270℃的平均温度，持续约5秒至60分钟的时间；或者，温度为220℃至270℃，pH为0.5至2.5，持续5秒至120秒的时间，或等同的条件。

[0262] 在木质纤维素材料的水解中使用本文所公开的酶的示例性条件包括在约30℃至48℃之间的温度和/或约4.0至6.0之间的pH下的反应。其他示例性条件包括约30℃至60℃的温度和约4.0至8.0的pH。
实施例

[0263] 以下实施例说明了本发明的各方面。除非另有说明，实施例中的百分比均以重量计。

[0264] 为了便于理解，提供具体实施例以帮助解释技术建议，即，这些实施例仅用于说明目的，而不是以任何方式限制本发明的范围。除非另有说明，否则实施方案不指明具体条件时其符合常规条件或制造商推荐的条件。

[0265] 实施例1:添加具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽到发酵过程中可能导致酵母细胞计数增加、酵母出芽或酵母活力增加

[0266] 如下测试具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽对发酵过程中酵母细胞计数、酵母出芽和酵母生存力的影响。首先，通过使用锤磨机或等同物将由完整玉米或玉米粒组成的原料研磨成粉。然后将水与粗粉一起浆化以在浆料罐中形成“醪液”。为了在后期发酵阶段期间使细菌生长最小化，随后使用诸如喷射式蒸煮器的高温炊具来处理醪液并降低醪液中的细菌水平。然后将该浆料泵入液化罐中。醪液中的玉米淀粉通过添加酶(包括α-淀粉酶)发生凝胶化并降解成较短的糖链(例如糊精)。仔细监测醪液的pH，并通过添加精心计算量的氨来调节。该氨在后续步骤中用作酵母的氮源。为了在后期发酵阶段期间使细菌生长最小化，随后使用诸如喷射式蒸煮器的高温炊具来处理醪液并降低醪液中的细菌水平。

[0267] 在将醪液转移到发酵罐后，将发酵罐分成四种不同的发酵类别。第一发酵类别包括发酵罐，每个发酵罐添加特定类型的变体肌醇六磷酸酶多肽。这些变体肌醇六磷酸酶多肽包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3具有基本相似性的多肽或本文公开的变体肌醇六磷酸酶多肽。第二类发酵类别包括发酵罐，其中添加市售的肌醇六磷酸酶Novozyme 50161。第三类发酵类别包括发酵罐，其中添加市售的肌醇六磷酸酶PhytOUT。第四类发酵类别是发酵罐的对照组，其中不添加肌醇六磷酸酶。将三种类型的肌醇六磷酸酶(变体多肽、Novozyme 50161和US Water PhytOUT)分别与在精细分离的酵母繁殖罐中的酵母和葡糖淀粉酶混合，并在转移醪液后在将酵母添加到发酵罐中时共同添加。或者，在将酵母加入发酵罐后加入肌醇六磷酸酶。一旦将醪液转移到发酵罐中并添加酵母，就开始发酵过程。作为发酵过程的一部分，醪液中的糖转化为乙醇和二氧化碳(CO2)。该方法的副产物包括甘油和其他产物。

[0268] 尽管工业发酵过程通常运行约40至50小时，但对于这些比较测试，发酵过程可根据需要进行更短或更长的时间。在此期间，乙醇加工液和酵母混合物的样品以定期和/或一致的时间点取样。这些样品用于测量酵母细胞计数、酵母出芽和酵母活力随时间的变化。

[0269] 使用任何普遍接受的方法测量酵母细胞计数，包括但不限于使用血细胞计数器、计数室、基于显微镜的计数方法、电子计数方法、自动计数技术，或任何手动或自动细胞计数装置或机器(例如库尔特计数器)。使用任何普遍接受的方法计算酵母活力，例如通过1)染色(例如亚甲蓝)以区分活酵母细胞和非活酵母细胞，2)活细胞和非活细胞的细胞计数和3)按照下式计算：酵母存活％＝[(总计数细胞-总计数的非存活细胞)/总计数细胞]×100。
通过计数出芽的酵母细胞计算酵母出芽百分比，同时如果芽至少是母细胞的一半，则仔细区分从母细胞中出现的酵母细胞芽作为单独的细胞。将出芽酵母细胞计数与活细胞计数组合以使用以下公式确定酵母出芽％：酵母出芽％＝(总出芽细胞/总活细胞)×100。

[0270] 然后将来自三类肌醇六磷酸酶处理的发酵罐和对照的非肌醇六磷酸酶处理的发酵罐的定时样品相互比较用于酵母细胞计数、酵母出芽百分比和酵母生存力。根据这些比较，将具有肌醇六磷酸酶活性的变体肌醇六磷酸酶多肽添加到发酵过程中可以证明，与非肌醇六磷酸酶处理的发酵罐以及Novozyme 50161处理的罐和PhytOUT处理的罐相比增加的酵母细胞计数、酵母出芽百分比或酵母生存力。

[0271] 实施例2:添加具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽到发酵过程中可以增加乙醇产率、降低甘油水平或降低总糖水平

[0272] 如下测试具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽对发酵过程中乙醇产率、甘油水平和总糖水平的影响。首先，通过使用锤磨机或等同物将由完整玉米或玉米粒组成的原料研磨成粉。然后将水与粗粉一起浆化以在浆料罐中形成“醪液”。为了在后期发酵阶段期间使细菌生长最小化，随后使用诸如喷射式蒸煮器的高温炊具来处理醪液并降低醪液中的细菌水平。然后将该浆体泵入液化罐中。醪液中的玉米淀粉发生凝胶化并且通过添加酶(包括α-淀粉酶)降解成较短的糖链(例如糊精)。仔细监测醪液的pH，并通过添加精心计算量的氨来调节。该氨还在后续步骤中用作酵母的氮源。

[0273] 在将醪液转移到发酵罐后，将发酵罐分成四种不同的发酵类别。第一发酵类别包括发酵罐，每个发酵罐添加特定类型的变体肌醇六磷酸酶多肽。这些变体肌醇六磷酸酶多肽包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3具有基本相似性的多肽或本文公开的变体肌醇六磷酸酶多肽。第二类发酵类别包括发酵罐，其中添加市售的肌醇六磷酸酶Novozyme 50161。第三类发酵类别包括发酵罐，其中添加市售的肌醇六磷酸酶PhytOUT。第四类发酵类别是发酵罐的对照组，其中不添加肌醇六磷酸酶。将三种类型的肌醇六磷酸酶(变体肌醇六磷酸酶多肽、Novozyme 50161和US Water PhytOUT)分别与在精细分离的酵母繁殖罐中的酵母和葡糖淀粉酶混合，并在转移醪液后在将酵母添加到发酵罐中时共同添加。或者，在将酵母加入发酵罐后加入肌醇六磷酸酶。一旦将醪液转移到发酵罐中并添加酵母，就开始发酵过程。作为发酵过程的一部分，醪液中的糖转化为乙醇和二氧化碳(CO2)。该方法的副产物包括甘油和其他产物。

[0274] 尽管工业发酵过程通常运行约40至50小时，但对于这些比较测试，发酵过程可根据需要进行更短或更长的时间。在此期间，乙醇加工液和酵母混合物的样品以定期和/或一致的时间点取样。这些样品用于测量乙醇产率、甘油水平和总糖水平随时间的变化。

[0275] 使用光密度测定法、沸点测定法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法、红外光谱法(IR)、傅里叶变换红外光谱法(FTIR)或任何其他普遍接受的方法测量乙醇产率。优选使用HPLC、气相色谱、IR或FTIR，因为这些技术还有助于测量甘油和总糖水平。然后将来自三类肌醇六磷酸酶处理的发酵罐和对照的非肌醇六磷酸酶处理的发酵罐的定时样品相互比较乙醇产率、甘油水平和总糖水平。根据这些比较，将具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽添加到发酵过程中可以证明，与非肌醇六磷酸酶处理的发酵罐以及Novozyme 50161处理的罐和PhytOUT处理的罐相比增加的乙醇产率、降低的甘油水平或降低的糖水平。

[0276] 实施例3:添加具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽导致污垢率下降

[0277] 如下测试具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽对发酵过程中结垢率的影响。首先，通过使用锤磨机或等同物将由完整玉米或玉米粒组成的原料研磨成粉。然后将水与粗粉一起浆化以在浆料罐中形成“醪液”。为了在后期发酵阶段期间使细菌生长最小化，随后使用诸如喷射式蒸煮器的高温炊具来处理醪液并降低醪液中的细菌水平。然后将该浆体泵入液化罐中。醪液中的玉米淀粉发生凝胶化并且通过添加酶(包括α-淀粉酶)降解成较短的糖链(例如糊精)。仔细监测醪液的pH，并通过添加精心计算量的氨来调节。该氨还在后续步骤中用作酵母的氮源。为了在后期发酵阶段期间使细菌生长最小化，随后使用诸如喷射式蒸煮器的高温炊具来处理醪液并降低醪液中的细菌水平。

[0278] 在将醪液转移到发酵罐后，将发酵罐分成四种不同的发酵类别。第一发酵类别包括发酵罐，每个发酵罐添加特定类型的变体肌醇六磷酸酶多肽。这些变体肌醇六磷酸酶多肽包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3具有基本相似性的多肽或本文公开的变体肌醇六磷酸酶多肽。第二类发酵类别包括发酵罐，其中添加市售的肌醇六磷酸酶Novozyme 50161。第三类发酵类别包括发酵罐，其中添加市售的肌醇六磷酸酶PhytOUT。第四类发酵类别是发酵罐的对照组，其中不添加肌醇六磷酸酶。将三种类型的肌醇六磷酸酶(变体多肽、Novozyme 50161和US Water PhytOUT)分别与在精细分离的酵母繁殖罐中的酵母和葡糖淀粉酶混合，并在转移醪液后在将酵母添加到发酵罐中时共同添加。或者，在将酵母加入发酵罐后加入肌醇六磷酸酶。一旦将醪液转移到发酵罐中并添加酵母，就开始发酵过程。作为发酵过程的一部分，醪液中的糖转化为乙醇和二氧化碳(CO2)。该方法的副产物包括甘油和其他产物。

[0279] 尽管工业发酵过程通常运行约40至50小时，但对于这些比较测试，发酵过程可根据需要进行更短或更长的时间。然而，作为与实施例1和2的一个显著差异，通过两种不同方法测量结垢率。在第一种方法中，在定期和/或一致的时间点测量发酵罐入口压力。增加的入口压力的测量结果通常用作增加结垢的代表。在满足所需时间后，打开发酵罐，然后直接检查并比较固体污垢沉积物。然后收集这些沉积物并风干。在干燥过程后，可以通过X射线荧光光谱(XRF)或类似技术检查样品。将特别检查沉积物的肌醇六磷酸和肌醇六磷酸盐浓度，因为这些沉积物与肌醇六磷酸酶活性最相关。

[0280] 来自三类肌醇六磷酸酶的定时的入口压力样品和来自三类肌醇六磷酸酶处理的发酵罐和对照的非肌醇六磷酸酶处理的发酵罐的固体沉积物的物理检查进行互相比较。根据这些比较，结果可证明，将具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽添加到发酵过程中显示了与非肌醇六磷酸酶处理的发酵罐以及Novozyme 50161和PhytOUT处理的发酵过程相比降低的污垢率。

[0281] 实施例4:添加具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽增加磷水平

[0282] 如下测试具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽对发酵过程中磷水平的影响。首先，通过使用锤磨机或等同物将由完整玉米或玉米粒组成的原料研磨成粉。然后将水与粗粉一起浆化以在浆料罐中形成“醪液”。为了在后期发酵阶段期间使细菌生长最小化，随后使用诸如喷射式蒸煮器的高温炊具来处理醪液并降低醪液中的细菌水平。然后将该浆体泵入液化罐中。醪液中的玉米淀粉发生凝胶化并且通过添加酶(包括α-淀粉酶)降解成较短的糖链(例如糊精)。仔细监测醪液的pH，并通过添加精心计算量的氨来调节。该氨还在后续步骤中用作酵母的氮源。

[0283] 在将醪液转移到发酵罐后，将发酵罐分成四种不同的发酵类别。第一发酵类别包括发酵罐，每个发酵罐添加特定类型的变体肌醇六磷酸酶多肽。这些变体肌醇六磷酸酶多肽包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3具有基本相似性的多肽或本文公开的变体肌醇六磷酸酶多肽。第二类发酵类别包括发酵罐，其中添加市售的肌醇六磷酸酶Novozyme 50161。第三类发酵类别包括发酵罐，其中添加市售的肌醇六磷酸酶PhytOUT。第四类发酵类别是发酵罐的对照组，其中不添加肌醇六磷酸酶。将三种类型的肌醇六磷酸酶(变体肌醇六磷酸酶多肽、Novozyme 50161和US Water PhytOUT)分别与在精细分离的酵母繁殖罐中的酵母和葡糖淀粉酶混合，并在转移醪液后在将酵母添加到发酵罐中时共同添加。或者，在将酵母加入发酵罐后加入肌醇六磷酸酶。一旦将醪液转移到发酵罐中并添加酵母，就开始发酵过程。作为发酵过程的一部分，醪液中的糖转化为乙醇和二氧化碳(CO2)。该方法的副产物包括甘油和其他产物。

[0284] 尽管工业发酵过程通常运行约40至50小时，但对于这些比较测试，发酵过程可根据需要进行更短或更长的时间。在此期间，乙醇加工液和酵母混合物的样品以定期和/或一致的时间点取样。这些样品用于测量磷水平随时间的变化。

[0285] 磷水平可以通过原子吸收光谱法、氨的钼酸盐-钒酸盐分光光度法或任何其他普遍接受的方法通过无机元素含量来测量。将来自三类肌醇六磷酸酶处理的发酵罐和对照的非肌醇六磷酸酶处理的发酵罐的定时样品相互比较磷水平。根据这些比较，可以证明添加具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽显示了与非肌醇六磷酸酶处理的发酵过程以及Novozyme 50161和PhytOUT处理的发酵过程相比提高的磷发酵水平。

[0286] 实施例5:添加具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽导致乙醇生产设备运行时间的增加

[0287] 如下测试具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽对发酵过程中污垢率的影响。首先，通过使用锤磨机或等同物将由完整玉米或玉米粒组成的原料研磨成粉。然后将水与粗粉一起浆化以在浆料罐中形成“醪液”。为了在后期发酵阶段期间使细菌生长最小化，随后使用诸如喷射式蒸煮器的高温炊具来处理醪液并降低醪液中的细菌水平。然后将该浆体泵入液化罐中。醪液中的玉米淀粉发生凝胶化并且通过添加酶(包括α-淀粉酶)降解成较短的糖链(例如糊精)。该氨还在后续步骤中用作酵母的氮源。

[0288] 在将醪液转移到发酵罐后，将发酵罐分成四种不同的发酵类别。第一发酵类别包括发酵罐，每个发酵罐添加特定类型的变体肌醇六磷酸酶多肽。这些变体肌醇六磷酸酶多肽包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3具有基本相似性的多肽或本文公开的变体肌醇六磷酸酶多肽。第二类发酵类别包括发酵罐，其中添加市售的肌醇六磷酸酶Novozyme 50161。第三类发酵类别包括发酵罐，其中添加市售的肌醇六磷酸酶PhytOUT。第四类发酵类别是发酵罐的对照组，其中不添加肌醇六磷酸酶。将三种类型的肌醇六磷酸酶(变体肌醇六磷酸酶多肽、Novozyme 50161和US Water PhytOUT)分别与在精细分离的酵母繁殖罐中的酵母和葡糖淀粉酶混合，并在转移醪液后在将酵母添加到发酵罐中时共同添加。或者，在将酵母加入发酵罐后加入肌醇六磷酸酶。一旦将醪液转移到发酵罐中并添加酵母，就开始发酵过程。作为发酵过程的一部分，醪液中的糖转化为乙醇和二氧化碳(CO2)。该方法的副产物包括甘油和其他产物。

[0289] 对于运行时间测试，允许发酵过程运行直到需要或必需清洁、维护或关闭。执行多次运行以确认运行时间的差异是一致的。将来自三类肌醇六磷酸酶处理的发酵罐和对照的非肌醇六磷酸酶处理的发酵罐的连续运行时间相互比较。根据这些比较，结果可证明，添加具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽到发酵过程中显示了与非肌醇六磷酸酶处理以及Novozyme50161和PhytOUT处理的发酵过程相比增加的运行时间。

[0290] 实施例6:向发酵过程中添加具有肌醇六磷酸酶活性的变体多肽可提高酵母健康并提高乙醇转化效率

[0291] 乙醇生产-醪液制备过程

[0292] 如下测试具有肌醇六磷酸酶活性的SEQ ID NO:2变体多肽对在发酵过程中提高酵母健康并提高乙醇转化效率的影响。首先，通过使用锤磨机或等同物将由完整玉米或玉米粒组成的原料研磨成粉。然后将水与粗粉一起浆化以在浆料罐中形成“醪液”。为了在后期发酵阶段期间使细菌生长最小化，随后使用诸如喷射式蒸煮器的高温炊具来处理醪液并降低醪液中的细菌水平。然后将该浆体泵入液化罐中。醪液中的玉米淀粉发生凝胶化并且通过添加酶(包括α-淀粉酶)降解成较短的糖链(例如糊精)。仔细监测醪液的pH，并通过添加精心计算量的氨来调节。该氨还在后续步骤中用作酵母的氮源。

[0293] 离开液化容器的醪液被转移到两个地方；一个是繁殖罐，另一个是发酵罐。繁殖和发酵都是分批过程，并在每批后进行清洁。从液化开始的总醪液中的一小部分进入繁殖罐并用另外的水稀释。然后在繁殖罐中将该混合物用酵母(干燥或乳状)接种。在繁殖步骤中加入辅助酶如蛋白酶和三类肌醇六磷酸酶(SEQ ID NO:2变体多肽、Novozyme 50161和US Water PhytOUT)。此外，葡糖淀粉酶和抗生素也可以添加到繁殖步骤中。

[0294] 繁殖的开始发生约4-10小时后，在清洁的发酵罐中开始填充醪液。基于酵母细胞计数、发酵填充时间和发酵罐的体积确定将已繁殖的材料转移到发酵罐。在填充发酵罐的10-20％工作体积后，将繁殖物转移或送至发酵罐进行发酵。当发酵罐填充时，葡糖淀粉酶以下列方式之一添加：第一种，在发酵填充开始时一次性(整块剂量(slug dose))全部加入；第二种，在发酵过程中多次(多个块剂量)；或者第三以及在大多数情况下，在整个发酵填充过程中连续加入葡糖淀粉酶。辅助酶如额外的肌醇六磷酸酶、真菌α-淀粉酶、纤维素酶和/或蛋白酶通常作为整块剂量直接添加到发酵罐中。通常将发酵罐填充至发酵罐容量的
95％-98％。发酵时间为45-65小时。然后将发酵的醪液(啤酒)转移到啤酒井中。

[0295] 乙醇生产-发酵

[0296] 在将醪液转移至发酵罐后，将发酵罐分成四种不同的发酵类别。第一发酵类别包括具有与SEQ ID NO：2基本相似的变体多肽的发酵罐。第二类发酵类别包括其中添加市售的肌醇六磷酸酶Novozyme 50161的发酵罐。第三类发酵类别是其中加入市售的肌醇六磷酸酶U.S.Waters PhytOUT的发酵罐。第四类发酵类别是发酵罐的对照组，其中未添加肌醇六磷酸酶。一旦将醪液转移到发酵罐中并添加酵母，就开始发酵过程。作为发酵过程的一部分，醪液中的糖转化为乙醇和二氧化碳(CO2)。该方法的副产物包括甘油和其他产物。

[0297] 在发酵过程中，在以下时间从四个类别中的每一个中取样以测量乙醇产率、甘油水平和总糖水平：第一个样品在大约8小时，第二个样品在大约11-14个小时，第三个样品在约20小时，第四个样品在约30小时，第五个样品在约40小时，第六个样品在约50小时，第七个样品在约60小时。对于三种肌醇六磷酸酶处理的发酵类别，在约70小时时取另外的样品。对于用与SEQ ID NO：2基本相似的变体多肽处理的发酵罐，在约85小时时取另外的样品。对于检测酵母健康，例如酵母细胞计数、酵母出芽和酵母生存力，在相同的时间段取出样品，但第五个样本是所有四个发酵类别的最后一个。

[0298] 酵母细胞计数和酵母生存力

[0299] 尽管所有四个类别的酵母细胞计数随时间下降，但SEQ ID NO：2变体多肽处理的发酵显示酵母细胞计数的下降小得多。从约10小时开始并持续到最后一次取样，与其他类别相比，SEQ ID NO：2变体多肽处理的发酵显示出始终较高的酵母细胞保持(图2)。

[0300] 在40小时标记处，SEQ ID NO：2变体多肽处理的发酵显示出最高的酵母生存力(图2)。另外两种肌醇六磷酸酶处理的发酵表现不如非肌醇六磷酸酶处理的发酵，尽管差异很小。此外，通过最后一次样品检测，Novozyme 50161处理的发酵显示出酵母生存力的非常高的标准偏差，表明酵母生存力存在显著量的挥发度。这种高挥发度是有问题的，因为它表明Novozyme处理的发酵的酵母生存力在批次之间是高度不可预测的。

[0301] 乙醇产率、甘油水平和总糖水平

[0302] SEQ ID NO：2变体多肽处理的发酵与Novozyme 50161处理的发酵在最高的乙醇产量方面持平，但与Novozyme 50161发酵相比具有较低的总糖水平和略低的甘油水平(图3)。与其他两个类别相比，它具有相似的总糖水平和甘油水平，但在最重要的项目，即乙醇产率方面优于那些发酵方法。

[0303] 磷水平

[0304] 通过从所有四种类型的发酵中测量多次磷酸盐样品来测量磷水平。对于三种肌醇六磷酸酶处理的发酵，采集28个磷酸盐样品。对于非肌醇六磷酸酶处理的发酵，仅取3个样品。在所有28个样品中，变体多肽处理的发酵的平均磷水平为2039ppm磷酸盐，平均发酵时间样品点为28.3小时。Novozyme 50161处理的发酵平均磷水平为1814ppm磷酸盐，平均采样时间为21.5小时。PhytOUT处理的发酵平均具有1603ppm磷酸盐，平均取样时间为26.6小时。非肌醇六磷酸酶处理的发酵在65小时的更高平均取样时间内取得的样品较少，并且平均含有944ppm磷酸盐。因此，所述变体多肽处理的发酵的磷水平显著地高于所有其他测试的发酵类别。

[0305] 前述实施方案的详细描述参考了附图，附图显示出了本公开物的特定实施方案。具有不同结构和操作的其他实施方案不脱离本公开物的范围。术语“本发明”等是参考本说明书中提出的申请人的发明的许多可选方面或实施方案的某些具体实例而使用的，并且其使用和其不存在都不旨在限制申请人发明的范围或权利要求的范围。为了方便读者，本说明书分为几个部分。标题不应被解释为限制本发明的范围。定义旨在作为本发明说明书的一部分。应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以改变本发明的各种细节。此外，前面的描述仅用于说明的目的，而不是为了限制的目的。

[0306] 本申请中提及的所有出版物，包括专利文献和科学文章，以及参考文献和附件，通过引用整体并入所引用的材料，并且用于所有目的，其程度如同每个单独的出版物通过引用单独并入一样。

[0307] 上述出版物或文献的引用并不意味着承认任何前述内容是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。

[0308] 尽管已经参考附图结合其实施方案充分描述了本发明，但是应该注意，对于本领域技术人员来说，各种改变和修改将是显而易见的。这些变化和修改应被理解为包括在本发明的范围内。应该理解，本发明的各种实施方案仅以示例的方式呈现，而不是作为限制。同样地，各种图可以描绘用于本发明的示例架构或其他配置，其被完成以帮助理解可包括在本发明中的特征和功能。本发明不限于所示出的示例架构或配置，而是可以使用各种替代架构和配置来实现。另外，尽管以上根据各种示例性实施方案和实施手段描述了本发明，但是应该理解，在一个或多个其所述特定实施方案中描述的各种特征和功能不限于它们对于其所属的特定实施方案的适用性。相反，它们可以单独或以某种组合应用于本发明的一个或多个其他实施方案，无论是否描述了这些实施方案以及这些特征是否被呈现为所述实施方案的一部分都是如此。因此，本发明的广度和范围不应受任何上述示例性实施方案的限制。

[0309] 除非另有明确说明，否则本文件中使用的术语和短语及其实施方案应被解释为开放式的而非限制性的。作为前述的例子：术语“包括”应理解为“包括但不限于”等含义；术语“示例”用于提供讨论项目中的示例性实例，而不是其穷尽或限制性列表；诸如“常规”、“传统”、“正常”、“标准”、“已知”以及类似含义的术语等形容词不应被解释为将所描述的项目限制在给定时间段或在给定时间内可用的项目。但相反，这些术语应该被理解为包含现有的、现在已知的或将来的任何时候可用的常规、传统、正常或标准技术。同样，与连词“和”相关联的一组项目不应被理解为要求这些项目中的每一项都存在于分组中，而应该被理解为“和/或”，除非从上下文或另有明确说明。类似地，与连词“或”相关联的一组项目不应被理解为要求该组之间的相互排他性，而是应该被理解为“和/或”，除非从上下文中显而易见或另有明确说明。此外，尽管可以单数形式描述或要求保护本发明的项目、元件或组分，但是除非明确说明限于单数形式，否则预期复数形式在其范围内。例如，“至少一个”可以指单个或多个，并且不限于任一个。在某些情况下，存在扩大的单词和短语，例如“一个或多个”、“至少”、“但不限于”，或其他类似短语，这不应理解为在可能没有这种扩大的短语的实例中意图或要求更窄的情况。

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