用于检测食品中的分析物的指示剂释放系统、其测试条和分析方法
阅读：446发布：2020-05-12
专利汇可以提供用于检测食品中的分析物的指示剂释放系统、其测试条和分析方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且指示剂储库，包括多孔载体材料和由可释放闭孔材料封装在所述多孔载体材料中的指示剂物质，所述闭孔材料被固定到所述多孔载体材料的化合物结合至所述多孔载体材料，当所述闭孔材料结合润湿所述指示剂储库的液体中存在的分析物时，所述指示剂物质从所述孔中释放出。，下面是用于检测食品中的分析物的指示剂释放系统、其测试条和分析方法专利的具体信息内容。
1.指示剂储库，包括具有孔的多孔载体材料和包含在所述多孔载体材料的孔中的指示剂物质，其中所述多孔载体材料的孔被与所述多孔载体材料形成非共价键的闭孔材料封闭，其中所述闭孔材料被选择特异性结合选自下述液体中的分析物：液体食品、液体农业样品和用于从非液体食品或农产品中提取分析物的液体；并且其中当所述分析物特异性结合所述闭孔材料且非共价键脱离时，所述指示剂物质从打开的孔中释放。
2.根据权利要求1的指示剂储库，其中所述闭孔材料通过固定到所述多孔载体材料的化合物非共价地结合所述多孔载体材料，其中所述固定到所述多孔载体材料的化合物包括半抗原、有机分子、金属与有机配体的络合物、核酸、核酸的链片段、或任何表位或肽分子，和/或其中所述闭孔材料包括抗体、抗体片段、受体蛋白或适体。
3.根据前述权利要求中任一项的指示剂储库，其中所述闭孔材料适于特异性结合选自下述的分析物物质或分析物物质的特定组：毒素、抗生素、激素或激素性有效物质、变应原、引起消化不足的物质、传染性海绵状物、遗传改性生物或其组分、掺杂物、营养添加剂、或酶，和/或其中所述闭孔材料适于特异性结合选自下述的分析物微生物或分析物微生物的特定组：细菌、细菌芽胞、致病菌、霉菌、酵母菌、原生动物、引起动物传染病的试剂、或病毒，和/或其中所述闭孔材料适于特异性结合其为核苷酸的特定序列或特定序列组的分析物。
4.根据前述权利要求中任一项的指示剂储库，其中所述闭孔材料对于所述分析物的亲和力比对于将其结合到所述载体材料的化合物的亲和力高。
5.根据前述权利要求中任一项的指示剂储库，其中所述多孔载体材料包括中孔材料，其中所述中孔材料包括二氧化硅和氧化铝颗粒中的至少一种。
6.所根据权利要求5的指示剂储库，其中所述颗粒包括磁性颗粒或顺磁性颗粒。
7.根据前述权利要求中任一项的指示剂储库，其中所述指示剂物质选自荧光材料、化学发光材料、电化学活性物质和/或具有特定拉曼光谱或特定IR光谱的材料。
8.根据前述权利要求中任一项的指示剂储库，其中所述固定到所述载体材料的化合物共价或非共价键合或吸附于所述载体材料。
9.根据前述权利要求中任一项的指示剂储库，其中所述载体材料包括有机分子，所述有机分子提高所述闭孔材料对于分析物的特异性，或减少对于所述分析物的非特异性结合，和/或其中所述载体材料
-是具有在2-500nm之间，例如在2-20nm之间，更特别地在2-5nm之间的中孔的周期性介孔二氧化硅；和
-具有的比表面积在选自400至2000m2g-1、500至1500m2g-1的范围之内，特别地在600至
1200m2g-1的范围之内。
10.根据前述权利要求中至少一项的指示剂储库，其中所述液体为选自下述的液体食品：水、牛奶、葡萄酒、无酒精饮料、啤酒、苹果酒、蜂蜜、蛋或其组分、食用油、或来自食品工业的废水；
和/或
其中所述液体为选自下述的液体农业样品：用于农业灌溉或加工收获的农作物的水，或包括来自牧场和/或耕作土壤的排水系统的水的废水，从家畜动物收集用于监测它们的健康和状态的生理液体，所述生理液体选自血液、血液组分、尿液或细胞外液样品；
和/或
其中所述液体为用于从选自下述的非液体物质提取分析物的液体：谷物、大米、玉米、咖啡豆和/或所有类型的种子、肉、鱼、海鲜食品、用作食品和/或动物饲料的植物或蔬菜、奶粉、非液体乳制品、面粉和/或粉碎过程的产物。
11.根据前述权利要求中至少一项的指示剂储库，其中所述分析物来源于肥料；杀虫剂，比如杀真菌剂、杀螨剂、杀昆虫剂、除草剂、灭鼠剂或生长调节剂；种子处理或拌种材料。
12.根据前述权利要求中任一项的指示剂储库，其中所述指示剂储库排列在测试条上，因此一旦所述液体中包含的分析物被所述闭孔材料由于其亲和力而结合时，则液体润湿该测试条，从所述指示剂储库的各孔中释放指示剂物质，并且，对于所述化合物的可脱离键脱离，因此所述指示剂物质从所述多孔载体材料的各孔释放。
13.一种用于监测液体食品、液体农业样品或来自食品或农业相关物质的液体提取物中的分析物的系统，包括：
根据前述权利要求中任一项的指示剂储库，
润湿工具，用于润湿或混合所述储库与所述液体，以便能够根据所述液体中分析物的浓度释放所述指示剂物质，
分离工具，用于分离所述指示剂储库与含有释放的指示剂的液体，和
检测工具，用于检测和/或定量释放的指示剂浓度。
14.权利要求13的系统，包括多个不同的指示剂储库，所述多个指示剂储库中的每个能够检测不同的分析物。
15.根据权利要求13或14的系统，其中不同的指示剂储库之间的区别在于指示剂物质的光谱、电化学和/或等离子共振特征。
16.权利要求13至15中任一项的系统，其中
-对于光学检测，所述检测工具包括照明源和偶联至滤光器阵列和分光光度计的光检测器，任选地引入波导或光学纤维；
-对于电化学检测，所述检测工具包括连接电极的电流计和/或恒电势器；和
-对于光电化学检测，所述检测工具包括连接电极和也偶联至光检测器的电流计和/或恒电势器；
和/或
其中用于分离指示剂储库与含有释放的指示剂的液体的分离工具选自：磁铁；离心机；
膜滤器；横流条；液相提取模块；微流体分离模块；和/或磁铁和磁性颗粒，所述磁性颗粒用结合到权利要求1至12中定义的闭孔材料的试剂功能化。
17.根据权利要求16的系统，其中用其功能化磁性颗粒的试剂包括针对所述闭孔材料的抗体或抗体片段，其中任选地所述抗体或抗体片段对于所述闭孔材料具有的亲和力，低于所述闭孔材料对于将其结合到所述多孔载体材料上的化合物和所述闭孔材料对于所述分析物的亲和力。
18.适用于“横流”测定的测试条，包括至少一个包含根据权利要求1至12中任一项的指示剂储库的部分。
19.根据权利要求18的测试条，进一步包括至少一个由金属胶体和/或金属纳米颗粒改性的部分。
20.根据权利要求18或19的测试条，其中所述测试条包括硝基纤维素、纸、或玻璃纤维网眼织物。
21.一种用于检测液体食品、液体农业样品、或用于从其它类型的食品或农业相关物质中提取分析物的液体中分析物的分析方法，包括∶
-提供如权利要求1至12的任一项中所述的指示剂储库；
-用含有分析物的液体润湿所述指示剂储库；和
-测定所述指示剂物质的释放，所述测定是以定性和/或至少半定量方式实现的。
22.根据权利要求21的分析方法，其中所述润湿是如下获得的：在测试条上形成含有分析物的液体的定向流动和至少部分形成所述液体或其组成部分的前部，以便利用所释放的指示剂物质在所述测试条上的位置，有可能明确地测定分析物的存在和/或借助于读数装置进行定量，其中所述读数装置选自∶单手可操作读数装置或扫描仪，电信终端设备，移动电话或“智能手机”，数字照相机。
用于检测食品中的分析物的指示剂释放系统、其测试条和分
析方法
[0002] 由于工业农业和全球人为对于环境的影响，液体食品比如例如牛奶可能含有有害物质比如抗生素、霉菌毒素或激素活性物质(例如，激素和类似物)。立法机构将牛奶中例如抗生素和黄曲霉素残余物的最高最大量设定为在ng/kg至μg/kg范围内的极低浓度。特别地，在食品比如从个体生产者现场收集的牛奶的情况下，因此优选地在收集之前鉴定污染批次且从而避免例如已经由生产者或农场主的相对大罐负载带来的污染(即现场的)。对于这种情况，需要灵敏度分析，在此情况下，样品采集、向实验室转运样品和检查只能在所述实验室中进行，这对于全面监测最大量的符合性是不切实际的，且太昂贵而根本不可能。
[0003] 因此，需要非常简单、相对快速稳定的新分析化学检测方法，其可以由非专业的使用者现场使用，并且同时仍然具有足够的灵敏度、可信度和精确度。然而，甚至不同大小的实验室都可以受益于具有这些前述性质的方法，因为其可使得它们更有效和节约成本。
[0004] 在这个背景下，根据一个实施方案，提出了一种指示剂储库(indicator reservoir)，其包括具有孔的多孔载体材料和通过可释放闭孔材料包括在所述多孔载体材料的多个孔中的指示剂物质。所述有机闭孔材料可脱离地(即，非共价)结合所述载体材料。特别地，所述闭孔材料被固定到所述多孔载体材料的化合物非共价结合所述多孔载体材料。选择闭孔材料特异性结合分析物。当所述闭孔材料结合分析物时，指示剂物质从所述孔释放出。所述分析物通常包含(或不包含)在润湿指示剂储库的液体中。换句话说，所述多孔载体材料表面上的所有孔都被盖上，从而被闭孔材料封闭。因此，只要分析物没有被闭孔材料特异性结合和闭孔材料从多孔载体材料释放，所述孔内部储存的指示剂物质不能释放到周围液体中。如果含有分析物的液体接触指示剂储库，则能够使非共价键分离和能够形成在闭孔材料和分析物质间的特异性键，从而防止在闭孔材料和粘附的化合物之间再形成非共价键。如果润湿液不含有分析物，则可脱离(即非共价)键将足够强至将闭孔材料保持在所述孔附近。因此，孔被阻塞且因此基本上阻止了指示剂物质从各孔逃逸，因而没有产生信号。
[0005] 需要针对分析物的含量表征的液体通常是水溶液或悬浮液。所述液体可选自：液体食品，液体农业样品，或用于从其他类型的食品或农业相关物质提取分析物的液体。
[0006] 注意到，如本文和附加权利要求书中使用的，在本申请意义上的液体食品包括液体食品杂货，比如瓶装饮用水、果汁、牛奶和液体乳制品、汤、酱料、调味料、液体方便食品、酒精饮料和非酒精饮料如葡萄酒、啤酒、苹果酒、液体调味品比如酱油、醋、蜂蜜、蛋或其组分、食用油或任何其他易腐坏(perishable)液体食品。
[0007] 注意到，如本文和附加权利要求书中使用的，液体农业样品应理解为涵盖选自下述的任何液体：生产用水或直接农业来源的废水，即可耕土地或适于作牧场的土地的排出水，灌溉用水或用于或来自加工收获的农作物的水，来自从牧场和/或耕作土壤引流的水，从家畜动物采集用于监测它们的健康和良好状态的生理液体(选自血液、血液组分、尿液或细胞外液样品)。
[0008] 然而，从宠物如例如猫、狗、金丝雀、常见宠物鹦鹉或其它家养宠物采集的这种生理液体如血液、血清、尿液、唾液或其馏分是从液体农业样品的理解中排除的。从人类，例如农业工作者采集的任何样品也不能认为是农业样品。从自来水中采集的样品也不认为是农业样品或食品。自来水被认为包括用于例如在家庭中直接使用递送的非瓶装饮用水。从不属于农业应用的水体或土壤采集的一般环境样品也不能认为包括农业样品。
[0009] 而且，非农业地表水、海水和湖水和河水以及地下水、工业废水和家庭废水都被认为包括在液体食品或包括在液体农业样品或农业相关样品中。这样的水和废水明确从如本说明书和权利要求书中使用的液体农业样品的理解中排除。
[0011] 例如无机多孔载体材料的各孔被与闭孔材料相关的实体(包括有机分子(半抗原样物质))封闭。所述闭孔材料非共价结合紧密固定于载体材料表面的有机分子(此处指如化合物)。当闭孔材料结合食品中的特定分析物(即，分配给存在于液体食品中特定指示剂物质的一种)时，通过所述闭孔材料从孔口分离，所述指示剂物质-最初排列在各孔之内-从各孔释放出。在结合分析物质后，所述闭孔材料再结合固定在载体的有机分子(其为例如半抗原样物质)受阻且因此所述闭孔材料分离。
[0012] 闭孔材料选自抗体、受体蛋白和适体。适体可选自寡适体和肽适体。抗体、受体蛋白和适体能够特异性结合分析物。
[0013] 可以给出所提出的指示剂储库和相应指示剂释放系统的基本机制的下述说明，例如，如果闭孔材料包括抗体：
[0014] 抗体和半抗原之间的键或抗体和类似于半抗原衍生物有机分子之间的键是非共价的。
[0015] 因此，闭孔盖(例如，抗体)一直结合和分离。所得到的系统是动态的。因为在这样的动态系统中，结合非常快地出现，而解离相当慢，仅出现指示剂物质从指示剂储库的各孔微不足道的浸出。
[0016] 而且，分析物对于抗体的亲和力远高于半抗原对于所述抗体的亲和力。因此，在分析物的存在下，抗体(盖)的结合位点被有效地阻断了。因此，阻止了抗体与半抗原的任何快速再结合。
[0017] 因此，抗体可以足够进一步远离孔口，同时阻断其结合位点。
[0018] 因此，即使在分析物和抗体(还包括动态系统)之间的复合物解离的情况下，也不会发生孔的再密封。
[0019] 至于上述提及的亲和力，抗体对于分析物的亲和力也远高于所述抗体对于半抗原的亲和力。
[0020] 在这方面地，被认为是典型分析物的食品污染物应理解为指为了不超过官方规定的最大浓度必须监测其存在的化学物质。因此，食品污染物是在常规粗制品中既不存在，在常规食品制备过程期间也没有加入的物质。更特别地，它们是来自环境的污染物或在农业耕作、畜牧或得到粗制品或食品本身的制备过程中的污染物。典型的实例为杀虫剂，兽医药物和覆盖到植物或动物产品上的动物饲料物质(例如，霉菌毒素、具有激素活性的物质)，或来自感染的粗制品上的霉菌的毒素(霉菌毒素)。
[0021] 根据一个实施方案，闭孔材料包括抗体、抗体片段、受体蛋白、或适体。有利地，这样的分子能够特异性结合不同类型的分析物。
[0022] 根据一个实施方案，在指示剂储库中，固定于载体材料的化合物包括有机分子。特别地，其包括半抗原、半抗原样有机分子、金属离子与有机配体的络合物、核酸或其链片段、或任何表位或肽分子。已知这样的分子被特异性抗体、其片段、特异性适体和酶特异性结合。
[0023] 抗体或半抗原的结合受到例如液体食品(例如牛奶)润湿指示剂储库(即，由于储库与润湿液体食品接触导致)的影响。在分析物存在下释放的指示剂物质的类型和/或数量以定性方式和/或至少半定量方式(即使不是完全定量方式)指示液体食品中分析物的存在在与食品监测实践相关的预定浓度范围之内。
[0024] 所述实施方案的优点在于自由使用指示剂储库，在测试条上或在游离溶液中，例如在比色杯或微流体系统中。这样可用于现场监测液体食品中的食品化学物。为了这样的目的，指示剂储库可以应用于合适的基材(例如纸条或多孔测试棒)，或者可以引入到含有液体样品的比色杯或微流体系统中。然后，以光谱、电化学、比色或其它指示剂特定的方式测定比色杯或微流体系统。使用受体蛋白的基本优点是建立通用测定的可能性，因为例如使用羧肽酶将能够检测β-内酰胺抗生素群组，因为这些蛋白质识别β-内酰胺环结构的活性形式(参见，例如Biacore Journal-Number 2 2003,22-23)。
[0025] 根据一个实施方案，针对其特异性和/或亲和力调整和/或选择闭孔材料，使得其特异性结合食品中的分析物，例如霉菌毒素、抗生素或起激素或激素类似物作用的物质。
[0026] 所述实施方案的优点在于检测事件-抗体、受体蛋白或适体结合分析物和因此相关的储库的各孔开放-与信号生成(即，从释放的指示剂的测量)分离(decoupled)。例如，独立结合事件可以释放大量指示剂，相当于信号扩增和因此更高灵敏度。而且，这样的系统在设计中具有高度的模块化。
[0027] 根据一个实施方案，闭孔材料适于特异性结合选自下述的分析物物质或分析物物质的特定组：毒素、抗生素、激素或激素性有效物质、变应原、引起消化不足的物质、传染性海绵状物(transmissible spongiforms)即朊病毒、遗传改性生物或其组分、掺杂物、营养添加剂、或酶。
[0028] 其中，在引起消化不足的物质的情况下，目标物质是需要被生物破坏、吸收和清除营养物的生物化学物。这些包括：
[0030] -调节消化的激素，比如胃泌素(胃)、胰泌素(小肠)、胆曩收缩素(小肠)、胃抑肽(小肠)、和胃动素(小肠)；
[0031] -胃酸和胆汁酸。
[0032] 抗生素和霉菌毒素是各种各样液体食品例如牛奶(其具有最大实用重要性)的那些污染物。从实用观点来说，可靠地检测取代物如掺杂物也具有极大的显著性。出于明显的原因，致病菌如朊病毒、毒素和变应原需要从食物中除去。而且，为了精确地指示，其它物质含量必须是已知的。
[0033] 根据一个实施方案，闭孔材料适于特异性结合选自下述的分析物微生物或分析物微生物的特定组：细菌、细菌芽胞、致病菌、霉菌、酵母菌、原生动物、引起动物传染病的试剂，或病毒。有利地，可以避免中毒，并且可以提供安全的食品。
[0034] 根据一个实施方案，通过亲和色谱纯化或呈单克隆抗体特异性结合分析物来调整或选择闭孔材料，所述分析物包括特定核苷酸序列或特定核苷酸序列组。
[0035] 根据一个实施方案，抗体为抗体片段，例如Fab或F(ab’)2。而且，受体蛋白为具有用于结合受体结构的小分子或用于更大分子部分的特定结合的蛋白质，例如作为特异性受体蛋白质的青霉素结合蛋白(PBP)。PBP是参与细胞壁合成的细菌酶类，代表β-内酰胺抗生素的攻击点。它们能够特异性结合β-内酰胺抗生素。
[0036] 所述实施方案的优点在于抗体或受体蛋白和小分子例如霉菌毒素、抗生素、掺杂物或激素活性物质之间的特异性比较高。
[0037] 根据一个实施方案，多孔载体材料涵盖中孔材料。所述中孔材料可以包括例如具有中孔的SiO2颗粒，其中中孔具有在2nm至50nm之间的平均孔径。
[0038] 所述实施方案的优点在于中孔多孔载体颗粒对于指示剂分子的高负载能力。中孔SiO2颗粒具有有序三维结构，其容易允许指示剂分子从储库转运到周围溶液中。
[0039] 根据一个实施方案，前述中孔材料包括SiO2和Al2O3之一。其可以选自纳米颗粒或微颗粒。纳米颗粒具有范围在40至500nm之间，通常范围在80nm至130nm之间之内的基本上球形的算术平均外径。微颗粒具有范围在0.5μm至200μm之内，通常范围在0.8μm至5μm之间之内的算术平均外径。
[0040] 所述实施方案的优点在于控制粒径和因此控制颗粒可以负载的指示剂的量。
[0041] 根据一个实施方案，载体多孔材料包括纳米多孔结构，其包括磁性或顺磁性材料，例如磁性或顺磁性颗粒。有利地，这样的材料促进指示剂储库与液相的有效分离，因而适于不同测定形式。在其它实施方案中，中孔材料可以由无机材料，例如一种或多种多孔碳、硅、碳化硅、碳氧化硅、碳氮化Si、氧氮化Si或氮化Si或氧化铝(Al2O3)组成。
[0042] 根据一个实施方案，上述所指的指示剂物质选自荧光材料、化学发光材料、电化学活性物质和/或具有特定拉曼光谱或特定IR光谱的材料，波长范围在10-8至10-4m之内，并且激发和检测使用的测量频率为1016至1012Hz。这意味着，为了能够提供关于在讨论的所述液体样品中在讨论的所述分析物的类型和/或浓度的定性和/或至少半定量信息，所提出的测量可以包括捕获发光(荧光、磷光、生物发光、化学发光和电化学发光)和拉曼散射的吸收。
[0043] 所述实施方案的特定优点在于通过选择下述的应用范围：合适检测方法，例如用于透明、有色或混浊的样品，和载体系统的期望的实施方案，捕获的浓度范围和多路检测的可能性。
[0044] 根据一个实施方案，半抗原，其与抗体、受体蛋白或适体一起形成闭孔复合物，共价结合载体材料。共价键的化学性质可以例如涵盖Si-O-Si键。而且，所述复合物可以非共价结合载体材料或可以被吸附。
[0045] 所述实施方案的特定优点在于中孔SiO2材料的简单功能化，所述中孔SiO2材料在表面上具有硅烷醇基，可以容易与有机改性的硅烷(其大量种类市售可获得)反应。因此，载体颗粒可以以理想方式化学适用于分析物、检测反应、样品基质或应用类型中。吸附和非共价结合也是表面改性多孔载体颗粒的有效方式。
[0046] 根据一个实施方案，载体材料载有起抗体或受体蛋白的半抗原作用或作为适体的结合位点(即，对于闭孔材料)的有机分子。所述有机分子在结构上非常类似于起在产生抗体的生物体(鸡、小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、驴、马)或产生抗体的细胞(例如，永久性小鼠细胞系或不同杂交瘤细胞系)中产生免疫应答作用的有机化合物。
[0047] 此处，抗体、寡适体、肽适体或受体蛋白的特异性，即闭孔材料对于分析物的特异性高于所述闭孔材料对于所述有机分子的结合。经由选择官能团，特异性和因此结合常数可以以受控和靶向方式且根据如此处描述的需要设定：相对于分析物的受体蛋白强结合、所述化合物和闭孔材料(盖、抗体、抗体片段、适体、受体蛋白)之间的弱结合。
[0048] 所述实施方案的特定优点在于避免了抗体、受体蛋白或适体和载体结合半抗原之间的非特异性相互作用和结合，另外，在一方面，抗体、受体蛋白或适体和分析物之间的可能结合容易，在另一方面，然后导致从开孔替换抗体、受体蛋白或适体，如上所述。
[0049] 根据一个进一步的实施方案，载体材料包括：
[0050] -周期性介孔二氧化硅，具有在2-50nm之间，例如在2-20nm之间，更特别地在2-5nm之间的中孔；和
[0052] 所述实施方案的特定优点为孔径特别地适合闭合所述孔径的生物分子的尺寸、将期望量的指示剂分子储存在储库中和使扩散时间最佳地适合指示剂分子尺寸的可能性。而且，载体材料的较大比表面提供了结合半抗原或其它有机分子的充足区域。
[0053] 根据一个实施方案，液体食品选自：水、牛奶、葡萄酒、非酒精饮料、啤酒、苹果酒、蜂蜜、蛋或其组分、食用油、或来自食品工业的废水。
[0054] 有利地，这样的液体食品和加工液体需要监测。所提出的材料和方法允许监测。
[0055] 根据一个实施方案，液体农业样品选自用于农业目的的生产用水或来自牧场和/或直接由耕作土壤的排水的废水。而且，液体农业样品选自血液或血液组分，来自饲养动物(家畜)的尿液，或从饲养动物(家畜)采集用于监测其健康和良好状态的血清。
[0056] 根据一个实施方案，液体为用于从选自下述的非液体物质提取分析物的液体：比如谷物、大米、玉米、咖啡豆和/或所有类型的种子、肉、鱼、海鲜食品、用作食品和/或动物饲料的植物或蔬菜、奶粉、非液体乳制品、面粉和/或各种类型的粗粉(粉碎过程的产物)。
[0057] 有利地，可以有效地监测这样的材料的污染物。
[0058] 根据一个实施方案，提供用于监测液体食品、液体农业样品或含有来自食品或农业相关物质的提取物的液体中分析物的系统，其包括：上述指示剂储库；用于润湿或混合所述储库与所述液体以便能够根据所述液体中分析物的浓度释放所述指示剂物质的工具；用于分离所述指示剂储库与含有所述释放指示剂的液体的工具；和用于检测和/或定量所述液体中的释放指示剂浓度的工具。
[0059] 有利地，所提出的系统适于监测农业、牧场、园艺和食品技术中的液体食品和相关基质中的分析物。
[0060] 根据一个方案，所述系统包括多个不同的指示剂储库，所述多个指示剂储库中的每个能够特异性检测不同分析物。
[0061] 有利地，可以甚至在一次测定之内同时检测不同分析物。
[0062] 根据一个实施方案，不同指示剂储库之间的差异存在于释放物质(即指示剂)的光谱、电化学和/或等离子共振特性。
[0063] 有利地，可以以不同测定形式同时检测不同分析物。甚至更有利地，可以通过不同测定形式同时检测某些分析物。
[0064] 根据一个实施方案，检测工具包括照明源和偶联至滤光器阵列、光谱仪、电流计和/或恒电势器的光检测器。
[0065] 根据一个实施方案，检测工具：
[0066] -对于光学检测食品中的分析物，包括照明源和偶联至滤光器阵列和分光光度计的光检测器，任选地引入波导或光学纤维。
[0067] 其中，所述分光光度计应当认为涵盖适合检测和/或测量发光、荧光、光学吸收和/或光传输的任何装置。
[0071] 根据一个实施方案，分开指示剂储库与含有释放的指示剂的液体的工具包括离心机；膜滤器；横流条；液相提取模块；微流体分离模块；和/或磁铁和磁性颗粒，其中所述磁性颗粒用结合如上所述闭孔材料的试剂功能化。
[0072] 根据一个实施方案，用其功能化磁性颗粒的试剂包括抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段对于闭孔材料具有特异性。
[0073] 根据一个实施方案，所述抗体或抗体片段对于结合至多孔载体材料的化合物的亲和力低于所述抗体或片段对于分析物的亲和力。
[0074] 有利地，这能够有效地识别分析物和由释放的指示剂指示分析物的存在。
[0075] 根据一个进一步的实施方案，指示剂储库排列在测试条上。然后，当液体食品中包含的分析物因其亲和力被抗体或适体结合时，液体食品润湿测试条从测试条上的指示剂储库的孔释放指示剂物质。从而，闭孔材料和半抗原(化合物)之间的可分离键/非共价键脱离。结果，所述闭孔材料可以从多孔载体材料扩散开。如此，从孔开口移除了所述闭孔盖，即闭孔材料。结果，指示剂物质不再限于载体材料的各孔中。所述指示剂物质脱逸，可以对于其存在定性测定和/或测量，即对于其在测试条表面上或在液体容积中的量定量。基于使用的检测工具的合适校准，可以检测样品中分析物的浓度。
[0076] 所述实施方案的特定优点是简单实现了传感(sensory)纳米颗粒或微颗粒成为易于处理的形式，并且使用了图像读出方法(用于横流试验的读数装置、数字照相机、手提式通讯装置照相机等)。
[0077] 根据本发明的另一个实施方案，提供了适于横流测定(LFA)的测试条或测试棒。所述条或棒包括至少一个提供有根据在本文说明书中上面描述和仍然下面描述的任一项实施方案的指示剂储库的部分或一个区段。
[0078] 所述实施方案的特定优点是可用指示剂的种类、避免了成本密集的抗体/金纳米颗粒共轭物(如在妊娠试验的情况下)和关于倍增的可能性。有利地，所提出的分析方法和使用所提出的指示剂储库不需要抗体/金共轭物，使有可能以成本节约的方式提供测试条。
[0079] 根据一个实施方案，测试条包括由金属胶体改性的部分或区段和/或由至少一种金属纳米颗粒改性的部分或区段。
[0080] 已知金属胶体例如银纳米颗粒和/或纳米厚金属层与RAMAN探针相互影响，产生称为SERS的作用：即，它们提高了灵敏度。由于分析物吸附到金属微粒或结构的表面，这些纳米结构的基质的局部表面等离子体与分子中的Raman迁移偶联，并且导致拉曼散射增加，其通常包括几个数量级。这得到了检测甚至仅最小量的寻求分析物低至亚ppm、ppb范围和ppt范围的灵敏度增加的特别优势。从食品毒理学观点，尤其是对于某些霉菌毒素，这样的高灵敏度是实际相关的。
[0081] 根据一个实施方案，所提出的测试条包括纸或至少一种硝基纤维素或玻璃纤维纸。
[0082] 所述实施方案的特定优点是硝基纤维素具有测定时间快的非常好流动性、具有将纳米颗粒和微颗粒有效地保留在沉积位置的网络和本身不会具有发光或电化学活性的性质。
[0083] 根据另一个实施方案，提供一种用于检测霉菌毒素、激素活性物质或抗生素的残留量的分析方法。所述监测方法包括步骤：
[0084] -提供载有指示剂储库的测试条，所述指示剂储库包括多孔载体材料和指示剂物质；其中所述指示剂物质封装在多孔载体材料的孔中；其中通过包括闭孔材料(盖)和化合物的闭孔实体所述指示剂物质从所述各孔可释放；其中当所述闭孔材料结合分析物时，所述指示剂物质从所述孔可释放。因此，借助于从指示剂储库释放的指示剂可检测分析物，其中所述分析物存在于润湿所述指示剂储库的液体食品中；
[0085] -用含有分析物的液体润湿所述指示剂储库；和
[0086] -测定测试条上指示剂物质的释放，所述测定是以定性和/或至少半定量方式实现的。
[0087] 所述实施方案的优点涉及例如全面现场监测由牛奶场的小型和中型牛奶生产者递送的批次中上述已经指出的物质和还在下述指出的物质(分析物、食品污染物或污染食品的物质)含量的可能性。
[0088] 根据一个实施方案，“润湿”步骤选自形成含有分析物的液体或至少一种其液体组分的定向流体，并且实现了在测试条(21、24、25、26、27)上至少部分形成前述定向流体的前部(29)。如此，利用所释放的指示剂物质在所述测试条上的位置，有可能明确地测定分析物的存在和/或借助于定制读数装置进行定量。
[0090] 根据一个实施方案，选择用于进行所述分析方法的测量设备选自：单手可操作的读数装置或扫描仪，电信终端设备例如移动电话或“智能电话”或数字照相机。
[0091] 所述实施方案的优点已经被提及。这些装置也是不太熟悉食品分析的货车驾驶员或一些其它辅助人员以容易无误差方式可操作的。
[0092] 上述实施方案可以根据需要彼此组合。利用下述说明和附加权利要求揭示进一步的实施方案、修饰和改进。
[0093] 因此，根据优选的实施方案，提供测试条测定与手提式和快速测量“横流”荧光读数装置的组合。在这方面地，“横流”荧光读数装置应理解为指通常适于用所谓的"横流条"(LFS)评价荧光基免疫色谱快速测试且通常在实验室外使用的读数装置。可能使用所述“横流”荧光读数装置的基本优点特别地在于下述事实：所述装置具有坚固结构，运行可靠，在没有任何问题下可使用，甚至在实验室外部例如在田野中使用。这便于现场分析样品材料。由于目前获得的免疫化学LFS测试的普遍性，所述荧光读数装置是以成本节约方式可获得的。
[0094] 目前提出的生物分子-门控指示剂释放系统能够以巨大信号放大响应特定分析物的存在，因为光学或电化学信号与直接化学相互作用无关。因为这些系统是中孔的，纳米尺寸混合材料和产生的信号可以利用微型化检测系统或移动通信装置非常容易地捕获。因此，可能非常容易地实现在测试条上或在微流体芯片中的整合。
[0095] 因此，有害物质的捕获、或定性和定量分析变得快速、灵敏、特异性、便宜和简单，这对于不熟练的人员直接现场或在田野中日常使用尤其必要。
[0096] 迄今为止，用于简单检测牛奶中的抗生素或黄曲霉素的方式，其检测也可以在田野或“现场”进行，涵盖大量微生物的(例如 DSM Food Specialties,Delft,the Netherlands)、色谱(例如，J.Chromatogr.A 1998,812,99；J.Chromatogr.A
2003,987,227)或免疫化学的(Food Control 2011,22,993；World Mycotox.J.2015,8,
181-191)的方法。例如，特别地也使用用免疫化学检测的测试条(例如，市售Aflasensor或来自Unisensor,Belgium的Twinsensor检测试剂盒)。
2003,987,227)或免疫化学的(Food Control 2011,22,993；World Mycotox.J.2015,8,
181-191)的方法。例如，特别地也使用用免疫化学检测的测试条(例如，市售Aflasensor或来自Unisensor,Belgium的Twinsensor检测试剂盒)。
[0097] 在测试条的情况下，基本原理包括例如经由检测功能化的金纳米颗粒聚集的比色检测。基于可微型化技术的其它方法为例如被整合到各种微流体系统中的电化学生物传感器(Sensors 2010,10,9439)、适体生物传感器(Mater.Sci.Eng.C 2013,33,2229)或动态光散射(J.Agric.Food Chem.2013,61,4520)。
[0098] 然而，已经已知的方案仅仅部分地令人满意地，且需要高度的技术操作(technical effort)。例如，免疫化学、微生物或色谱的实验室方法通常耗时，需要昂贵的仪器和可消耗的材料，并且通常不能用于现场检测。
[0099] 采用免疫化学检测的常规测试条的准确性、精确性和可重现性不足，并且仅能定性是/否答案。而且，测试条本身由于使用金纳米颗粒而相对昂贵。
[0100] 因此，本发明的一个目的是能够快速、简单、灵敏和微型化检测，以便检测液体食品比如牛奶中特定有机有害的物质污染物。
[0101] 下述目的构成本发明的基础:
[0102] 在孔中含有化学指示剂物质的混合中孔纳米颗粒或微颗粒的合成，中孔颗粒通常具有规则排列的具有在2至50nm之间直径的孔。
[0103] 所述中孔颗粒是在用类似于目标物质(例如抗生素或黄曲霉素)的特定有机分子(半抗原或其它有机分子)在外表面上共价功能化的。所述半抗原或有机分子对于生物学受体分子(例如，抗体、受体蛋白或适体)具有亲和力。另外，其它类型的分子比如寡-或聚-(乙二醇)可以连接到表面上以提高结合特异性。
[0104] 在所述中孔颗粒的孔负载和外表面功能化之后，用生化大分子(例如，抗体、受体蛋白、或适体)封闭所述孔开口。
[0105] 在要检测的液体食品(例如牛奶)中目标物质(例如抗生素或黄曲霉素)的存在下，阻断中孔材料的孔开口的生物分子结合所述特定目标物质(例如，抗生素或黄曲霉素)。从而所述各孔打开，接着指示剂物质扩散出，并且可以例如在与载体颗粒空间分离之后，利用特定信号(例如，光学或电化学)测量(参见，图1)。
[0106] 在该过程期间，一个目标分子平均释放大量(通常几百个)指示剂分子，从而所述系统具有信号扩增特性。另外，所述物质定量相关物，使有可能定量分析。换句话说，释放的指示剂物质的量与分析物的浓度相关。因此，指示信号可以校准，并且基于指示剂储库的测定用于定量分析。
[0107] 阻断中孔材料的孔开口的生物分子与含有目标物质的液体食品的直接接触足以触发释放反应。这可能例如受到使用测试条浸渍或滴加(例如，图2)或逐滴加入到微流体系统或芯片中的影响。
[0108] 混合材料的合成非常灵活，因为可以选择各种多孔材料、半抗原、指示剂分子。另外，各种生物分子，尤其是蛋白质，可用于封闭所述孔。该模块化不仅对于现场(on-the-spot)分析，而且对于高通量筛选或多路检测都含有巨大潜力。
[0109] 将混合的、中孔传感材料整合到例如测试条或微流体芯片能够同时开发简单、成本节约和可再生产可制造的快速测试。然后，所述测试可以用于例如分析测定牛奶中的有机污染物。
[0110] 例如通过根据权利要求1的指示剂储库实现了所述目的。
[0111] 基于纳米颗粒或微颗粒的指示剂释放系统可以以非常多方式用于微型化检测方法中。由于载体颗粒和释放的指示剂(例如释放的染料)的空间分离，定量检测是可能的。
[0112] 因为所述系统可用于测试条上用于微流体芯片中，可以对于食品化学相关目标物质进行现场直接检验液体食品。关于所有组分和最后检测，所述系统非常灵活；其也允许通过使用不同负载的和门控的颗粒并行检测各种参数(多路化)。
[0113] 因此，可能令人惊奇地容易进行快速、简单、灵敏和微型化检测，以便以定量和至少半定量方式检测液体食品比如牛奶中的特定有机有害物质污染物。
[0114] 因此，提供了一种快速、简单、灵敏和微型化检测，以便检测液体食品比如牛奶中特定有机有害的物质污染物和测定其含量。
[0116] 图1显示分析事件过程的原理图，用显微镜观察。
[0117] 图2显示基于3个实施例和1个对照的本发明提出的液体食品分析事件过程的原理图，用肉眼观察。图解显示平行使用在不同特异性的储库混合物中的不同指示剂物质，即在每种情况下对于其它分析物的选择性不同。在每种情况下，填充指示剂物质的中孔SiO2颗粒呈混合物用在测试条的单个点中。对于液体食品中要讨论的分析物而言不同指示剂物质出现的分开的结果图解描述在图2中。
[0118] 图3显示根据一个将在下面进一步描述的实际实施例分析物-触发的染料从中孔指示剂储库释放的示意图。在门控载体15中，具有内部捕获染料分子的各孔被改性的半抗原盖上，所述半抗原固定在中孔颗粒的表面，并载有加帽抗体(capping antibody)2。所述抗体是通过给新西兰白兔免疫接种牛血清白蛋白(BSA)与分析物磺胺噻唑(sulfothiazole)(STZ)的共轭物获得。示意性地，分析物5由绿色三角形描绘。只要溶液中不存在任何分析物5，则固定的表位衍生物3被抗体结合。
[0119] 图4至10图解了如下进一步列出的实际实施例的荧光特性。
[0120] 测试条可以例如用镊子紧夹上缘，浸入食品(例如牛奶)的液体样品中进行检查。在纤维性或多孔测试条材料中，液体食品-由于毛细管力吸附-将逐渐上升至其上缘。在此过程中，前部通过储库(没有浸入到样品中)。然后，横流打开那些孔，其闭孔分子(例如抗体或适体)与可能存在于流过的样品中的分析物特异性反应。换句话说，如果分析物与闭孔分子接触，则后者从开孔后留下的孔边释放。预期用于在讨论的食品分析物的指示剂物质立即从打开的孔释放到横流液相中，并根据色谱原理迁移到前部的后面。在色谱分离完成，即当前部迁移直至低于上缘之后，从样品中取出测试条，可以测量。如有必要，在测试条干燥之后，也可以进行测量。测试条也可以归档并重复测量。本发明描述的具体实施，至少半定量测试对于熟悉薄层色谱的食品化学家是显而易见的。例如，测试条材料的极性可以适于特定的任务。例如，如此使用纯硝基纤维素或蜡状或以其它方式改性的硝基纤维素(例如，用一些蛋白质例如BSA嵌段的)。后者可能对于获得指示剂染料的更好流动相当有效。
[0121] 在下文中，将解释参考符号，并且将更特别地与所述参考符号一起解释附图。
[0122] 参考标记的清单
[0123] 1中孔SiO2
[0124] 2适体、受体蛋白、抗体或抗体片段，例如Fab(抗原-结合片段)；
[0125] 3有机分子，半抗原类似物；
[0126] 4指示剂物质：检测剂、染料、SERS受体、氧化还原活性物质；
[0127] 5食品污染物，分析物；
[0128] 10分析事件过程的原理图，用显微镜观察；
[0129] 15即用颗粒基础的混合传感材料＝中孔材料1，其填充指示剂的孔被例如被保持半抗原类似物的抗体封闭；
[0130] 15a-c即用颗粒基础的混合传感材料，全部都由中孔材料1组成，然而，其各孔填充不同指示剂且被保持不同半抗原类似物的抗体封闭；
[0131] 16在抗体2与分析物5相互作用之后的颗粒基础的混合传感材料。只要抗体2与封闭各孔的分析物特异性地结合，通过分析物与抗体的相互作用，封装在SiO2的各孔中的指示剂物质就释放。
[0132] 20显示基于3个实施例和1个对照的液体食品分析事件过程的原理图，用肉眼观察；
[0133] 21浸入液体食品23中的测试条。测试特定分析物的含量。
[0134] 22在测试条上即用颗粒基础的传感材料15(斑点)的储库；
[0135] 22a在不含分析物的液体食品比如牛奶例如已经浸泡测试条(例如纸、硝基纤维素、玻璃纤维、非纺织物)且在测试条中上升形成前部29之后，所述测试条上即用颗粒基础的传感材料15的储库(斑点)。所述上升是根据纸或薄层色谱的原理获得的。在此过程中，横流过储库的液体食品润湿了仅与中孔SiO2的各孔松弛结合(可脱离)的抗体或抗体片段。因为所述液体食品不含抗体能够结合的任何分析物，所有中孔材料的孔都仍然关闭。因此，各孔中存在的指示剂物质不能逃逸和到达由毛细管方式上升的液体食品流动液。因此，无论如何都没有出现任一个测试条显色。因而，在沿着其纵向进行测试条的所有类型扫描期间，将不可能捕获信号；至多，将可能捕获特定液体食品样品与测试条相互作用出现的“噪音”。
[0136] 23样品容器(左)中的液体食品，已被测试条利用毛细管力部分吸收并且在测试条中上升形成不断发展的前部29(右)；
[0137] 24测试条，液体食品样品不含任何分析物(对照样品)；
[0138] 24a相同测试条，液体食品样品(对照样品)不含任何分析物；因此，储库中的所有中孔SiO2颗粒保持其起始状态未改变，其中颗粒被已经结合潜在分析物的抗体或抗体片段封闭-如果所述分析物在所检验液体食品中至少以最小量存在。
[0139] 25测试条，液体食品样品含有抗生素A，其是由特异性设计用于分析物“抗生素A”的指示剂释放可检测的。可以以分析方式(定性和/或至少半定量)检测指示剂。此处，测量信号可以是电化学可捕获的和/或荧光可捕获的和/或金属胶体(例如银纳米颗粒)的拉曼信号可以以放大方式呈SERS信号可检测和/或信号可以以另外的方式以放大方式可检测。此处，SERS代表表面增强的拉曼散射。然而，该清单不是结论性的。对于为化学发光物质的指示剂是同样可能的。而且，同样可能的是适于采用另外的光谱法进行高灵敏度检测(例如，采用金属纳米颗粒的SERS检测)的分子探针。不言而喻，有可能的是，对于在每种情况下具有特定激发和/或发射光谱的指示剂物质，在每种情况下在填充指示剂物质的不同中孔SiO2颗粒的混合物中，以在测试条上储库中的混合物形式彼此平行使用。这些可能性图解描绘在图2中。
[0140] 25a测试条，液体食品样品含有抗生素A；因此，储库的特定孔选择性打开，特异性指定用于检测抗生素A的指示剂物质释放出。被其它抗体封闭的其它孔保持封闭。因此，除了指示剂物质指示抗生素A从储库完全逃逸出、流出或扩散出和/或从其中释放的事实之外，所述储库相对于其起始状态在其它方面未改变。
[0141] 26测试条，液体食品样品含有抗生素B。
[0142] 26a测试条，液体食品样品含有抗生素B；因此，储库的特定孔选择性打开，特异性指定用于检测抗生素B的指示剂物质释放出。被其它抗体封闭的其它孔保持封闭。因此，除了指示剂物质指示抗生素B从储库完全逃逸出、流出或扩散出和/或从其中释放的事实之外，所述储库相对于其起始状态在其它方面未改变。
[0143] 27测试条，液体食品样品含有霉菌毒素A。
[0144] 27a测试条，液体食品样品含有霉菌毒素A；因此，储库的特定孔选择性打开，特异性分配用于检测霉菌毒素A的指示剂物质释放出。被其它抗体封闭的其它孔保持封闭。因此，除了指示剂物质指示霉菌毒素A从储库完全逃逸出、流出或扩散出和/或从其中释放的事实之外，所述储库相对于其起始状态在其它方面未改变。
[0145] 28液体食品利用毛细力上升的进展，形成前部29；
[0146] 29在测试条24、25、26、27中利用毛细管力上升的液体食品23的前部；
[0147] 33指示液体食品中存在抗生素A的指示剂的特异性释放
[0148] 33a色谱分析形成的斑点，包括预期用于抗生素A的指示剂物质。在测试完成之后，其位置位于紧靠整体上经历了流过液体食品(或其组分之一)的测试条上缘前部之后。在利用薄层色谱分离的术语中，所述指示剂物质具有最大的Rf值。在这方面，Rf值通常被专家认为指理解为在讨论的指示剂物质从起点(储库)行进覆盖的路径与“流动相”-此处其相当于液体食品或其液体组分之一的全部路径之比的关系。随前部迁移或紧随其后的组分具有的Rf值接近1；仅从应用位置(释放位置，即储库)稍微向前移动的组分(指示剂)具有的Rf值<<1。
[0149] 34指示液体食品中存在抗生素B的指示剂的特异性释放；
[0150] 34a色谱分析形成的斑点，包括预期用于抗生素B的指示剂物质。在测试完成之后，其位置位于整体上经历了流过液体食品(或其组分之一)的测试条上缘前部与测试条上的起点(储库斑点)之间的约一半。在利用薄层色谱分离的术语中，所述指示剂物质具有的Rf值接近于0.5。
[0151] 35指示液体食品中存在霉菌毒素A的指示剂的特异性释放；
[0152] 35a色谱分析形成的斑点，包括预期用于霉菌毒素A的指示剂物质。在测试完成之后，其位置位于紧靠液体食品(或其组分之一)流过的测试条上储库之后。在利用薄层色谱分离的术语中，所述指示剂物质具有最小Rf值(约Rf～0.1)，因此可以与系统的其余指示剂物质清楚地区分。
[0153] 下述给出的表列出了：
[0154] 表1:抗生素和黄曲霉素，应当监测牛奶中其含量，及其合适的抗体基测试。
[0155] 表2:对于所提出的指示剂储库可使用的荧光和化学发光指示剂物质。
[0156] 表3:关于引起消化不足的物质的实例。
[0157] 考虑到所提出的指示剂储库，所提出的方法和所提出使用的通过表1和表3中举例说明的市售可获得的抗体和适体，可用于定制所提出的指示剂储库用于检测如所述的例如抗生素、霉菌毒素和引起消化不足的物质。
[0158]
[0159]
[0160]
[0161]
[0162]
[0163]
[0164] 表3引起消化不足的物质的清单
[0165]
[0166]
[0167] 引起消化不足的物质为例如麸质、蛋、玉米、花生和乳制品，其由于缺乏相应酶引起。
[0168] 而且，致病生物可影响消化，例如：幽门螺旋杆菌；真菌菌态不平衡/念珠菌病(白色念珠菌通常在消化道中发现)；或小肠细菌过度生长(SBBO)。
[0169] 很明显地，在暴露于抗原之后的样品中测量的荧光可能受到指示剂储库与分析物溶液接触时间的影响。为了优化灵敏度和信号强度，已经实验测试了用于制备指示剂储库的不同染料和试验设计。
[0170] 图4显示用实验室制备的混合中孔纳米颗粒的指示剂储库的上清液的荧光增强。中孔MCM-41纳米颗粒是根据已知方法合成的(Q.Cai,Z.-S.Luo,W.-Q.Pang,Y.-W.Fan,X.-H.Chen,F.-Z.Cui,Chem.Mater.2001,13,258；S.Huh,J.W.Wiench,J.-C.Yoo M.Pruski,V.S.-Y.Lin,Chem.Mater.2003,15,4247)。类似的材料是市售可获得的，如MCM-41，例如来自Sigma-Aldrich，可以使用而无需进一步处理。
[0171] 所述颗粒的各孔填充染料磺酰罗单明B(SRB)。为了将最大量的染料负载到MCM-41支架中，制备染料SRB钠盐(2mmol L-1)在乙腈中的溶液。然后，将2份12.0mL加入到300mg的每种MCM-41纳米颗粒或微颗粒材料中，得到0.8mmol染料(g固体)-1浓度的悬浮液。在室温下，搅拌该悬浮液24小时。将每种类型材料的两个级分(2×40mL)离心(以6000rpm，5分钟)，并浓缩成最终体积1.5mL。此后，加入0.14mL和0.7mL体积的半抗原的DMF溶液(0.02和0.01mmol)，得到0.2和0.1mmol(g固体)-1的最终悬浮液。在室温下，搅拌得到的悬浮液5.5小时。最后，将该悬浮液离心(以6000rpm，5分钟)，用乙腈(0.75mL)洗涤得到的固体，通过离心分离，并在真空中在35℃下干燥12小时。按照与SRB相同的方法，可以将另外的染料例如BODIPY-PEG装载到无水(neat)MCM-41颗粒中。
[0172] 颗粒表面和因此孔开口用磺胺噻唑半抗原改性，而使用BSA-磺胺噻唑共轭物作为抗原用于获得针对半抗原磺胺噻唑(STZ)-一种磺酰胺抗生素的兔抗血清。
[0173] 在用3-氨基丙基)三乙氧基硅烷酰胺化反应之后，半抗原被固定。在第一步中，制备0.1mL的N-琥珀酰亚胺(NHS，10mg；88μmol)和N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC，36mg；175μmol)的无水DMF溶液。然后，将每种溶液加入到半抗原(20mg，70μmol)在无水DMF(0.3mL)中的溶液中。在室温下，搅拌该混合物2小时，并离心。在室温下，再搅拌该混合物4小时，并通过离心除去固体。在第二步中，将(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(14.7μL，65μmol)加入到所述溶液中，并在室温下搅拌反应混合物20小时。离心该溶液，并在产物形成之后，将其置于0.5mL的DMF中。通过UPLC-MS证实活性酯中间体和半抗原衍生物的形成。所述半抗原衍生物被固定到中孔二氧化硅微粒MCM-41的表面。最后，用多克隆血清培养所述颗粒，得到相应抗体-门控的中孔材料15(参见图1,3)。为了避免不需要的浸析，随后进行两步加帽(capping)过程：首先，进行仅用血清培养30分钟。在第二步中，加入BSA，并再培养该混合物1.5小时。
为此目的，将1mg的中孔材料级分(实验室样品“M4”)悬浮在含有200ppm SRB和2μL血清的
450μL生理缓冲盐水(PBS)中，并搅拌30分钟。接着，向该悬浮液中加入50μL的BSA溶液(5％)，并再保持搅拌1.5小时。将该材料离心，用1mL的PBS洗涤7次，在室温下在真空中干燥
1小时，并贮存在冰箱中，得到材料，命名为M4-A1＠B。
为此目的，将1mg的中孔材料级分(实验室样品“M4”)悬浮在含有200ppm SRB和2μL血清的
450μL生理缓冲盐水(PBS)中，并搅拌30分钟。接着，向该悬浮液中加入50μL的BSA溶液(5％)，并再保持搅拌1.5小时。将该材料离心，用1mL的PBS洗涤7次，在室温下在真空中干燥
1小时，并贮存在冰箱中，得到材料，命名为M4-A1＠B。
[0174] 特别地，图4显示在分析物STZ(894ppb)的存在(红色；“2”)和不存在(黑色；“1”)下，在585nm(λexc＝560nm)下记录的作为该材料M4-A1＠B(N＝1)在PBS中的悬浮液的时间函数的荧光。
[0175] 还评价牛奶中由于不同浓度的STZ引起的荧光增强。对于这些实验，制备100μM STZ在牛奶中的储备溶液。将600μg的M4-A1＠B悬浮在3300μL的PBS中，并将该悬浮液分成330μL的等分试样。在加入STZ之前，从每个等分试样抽取165μL，如前所述测量F0。然后，将6μL的不同浓度STZ溶液加入到其它级分中，用手振摇小瓶20s，离心,然后在荧光计中测量上清液的荧光(λem＝585nm,λexc＝560nm)。获得的荧光信号显示在图5中。结果表明动态范围大致类似于在PBS缓冲液中的。通过拟合逻辑函数曲线，有可能导出IC20，即定量限(LOQ)87±
8ppb和IC50 172±12ppb。
8ppb和IC50 172±12ppb。
[0176] 受到这些结果鼓励，用测试条在快速简单横流类型试验的意义上以荧光读数进一步测试门控指示系统的可能应用。如上解释的，在展开之后，所述条带显示两个不同区域，传感材料(指示剂储库)已经沉积的第一个区域(区域A)和其中可以随溶剂前部移动的收集释放染料的第二个区域(区域B)(参见图2、7)。
[0177] 在没有磺酰胺的情况下，第二个区域(图7中的区域B)将显示最小信号。在存在磺酰胺的情况下，该区域中的荧光将与分析物浓度相关。可以用荧光读数器采用合适的激发波长和发射波长，或者通过在合适光激发条件下拍照，定量释放的染料量。使用来自的Hi-Flow硝基纤维素纸制备各条带。切下0.5×5cm的条带，并在第一个区域(区域A)处点样2μL的M4-A1＠B(5mg mL-1)在PBS中的悬浮液(在60μL的PBS中300μg)。将各条带放置在室温下干燥。
[0178] 然后，将各条带浸入150μL的掺入各种量的STZ的原料奶中，展开，并置于室温下干燥。该实验进行2次，一次用贮存在冰箱中6天的牛奶，另一次用贮存1天的来自小农场的鲜奶。然后，用横流读数器和自制机罩(housing)记录荧光直方图，所述自制机罩装有作为激发光源的LED(λexc 505nm)和可以拟合常规数字照相机的过滤器(532nm截止值和550nm长通(long-pass))。结果显示在图6中。图6a)描绘了用读数器记录的典型直方图，显示在STZ的存在下，第二区域中的荧光增强。如图6b)中呈现的运行测定分析显示第二区域中释放的染料积分值和总染料信号(第一和第二区域)之间的比值。使用该方法，有可能获得低于1ppb的IC50，然而因为实验设备简单，数据有相当大的噪音。图6c)(第二区域和图6d中释放的染料亮度)(亮度比)能够比较读数器结果与通过提取用照相机拍照图像的亮度获得的结果。该参数相当于每个斑点的XYZ CIE 1931色空间的“Y”坐标直方图的平均坐标数。报到的数据表明对于使用的读数器不确定性较高，推测是由于所述条带储器中的复位作用引起的。
[0179] 然而，因为来自所述基质本身的干扰作用不能被排除，我们在进行测定之前采用离心的牛奶并对于所有条带使流动达到固定距离3cm重复实验。提高了可重现性。
[0180] 特别地，图6显示：a)在不存在(黑色)和存在(红色)2ppm的STZ下，在150μL的原料奶中展开之后，对于包括位于约15mm的斑点M4-A1＠B的条带，用横流读数器记录荧光直方图(λexc 560nm；λem 625nm)。插入图：横流读数器的照片。b)用读数器得到的条带信号的染料释放的相应荧光增强(FB/(FA+FB))，作为STZ浓度的函数(λexc 565nm,λem 625nm)。将红色点归类为逸出值，在拟合中不考虑。c)所述条带的B区域中的亮度变化(CIE 1931 XYZ色空间的L或“Y”值)，作为STZ浓度的函数。插入图：自制机罩灯的照片。D)相应亮度增强(LB/(LA+LB)，作为STZ浓度的函数(N＝2)。
[0181] 由于目的在于减少测量误差，通过如下制备感测条：使用市售可获得的打印机在硝基纤维素纸中图上蜡的疏水性壁面，并置于110℃的烘箱中1分钟熔融蜡，产生横跨该纸厚度的疏水性屏障。疏水性屏障的设计描绘在图7A中。
[0182] 切下0.6×4cm的条带，并按照如前所述相同的方法将2μL的M4-A1＠B(5mg mL-1)在PBS中的悬浮液点样在区域A。此后，将40μL含有一定量的STZ(磺胺噻唑)或SPY(磺胺嘧啶)的牛奶加入到所述“样品”区域，并且牛奶在约3.5分钟期间流动直到流动停止。从样品区域除去过量的牛奶，并将所述条带置于室温下干燥。接着，用自制的灯仅进行亮度测量(图7)。
[0183] 特别地，图7显示：A)(a)在流动之前，(b)在流动期间，和(c)干燥，在用自制灯的激发下，所设计条带的图像。B)用照相机记录的亮度数据的比值，作为STZ(黑色)和SPY(蓝色)，N＝1的函数。C)测量的所述条带的区域B中亮度变化的相应数据。将红色点归类为逸出值，在拟合中不考虑。当然，可以使用已知适用于横流装置和/或测定的任何其它技术或方法，代替此处表示的作为阐述本发明要点的仅一个实例的条带。
[0184] 进一步，为了证实牛奶浸出性能的影响，用含有如前设计的疏水性屏障的0.6×4cm条带，在PBS中进行实验。按照如前所述相同的方法，将2μL的M4-A1＠B(5mg mL-1)在PBS中的悬浮液点样在区域(参见图7)。然后，将40μL的含有一些量的STZ的PBS加入到所述“样品”区域中，并使溶剂流动3.5分钟。如图8中可以看到的，观察到亮度增强呈浓度的函数，显示与悬浮液中M4-A1＠B的灵敏度类似。
[0185] 特别地，图8显示(左侧)用照相机记录的亮度数据，作为PBS缓冲液流动的STZ-浓度的函数，和(右侧)亮度的相应比值，作为STZ浓度的函数(N＝1)。
[0186] 双相提取测量可以显著地改善指示剂释放系统的性能。因为磺酰罗丹明B(SRB)的染料分配系数太低，不能进行从水/牛奶到CHCl3的有效相转移，我们依靠水溶性的PEG基化的硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)染料。按照对于制备M4-A1＠B的相同条件进行所述材料的加帽，但是在该情况下，将1mg的中孔二氧化硅悬浮在含有360ppm的BODIPY-PEG和2μL血清的450μL PBS中30分钟。此后，将50μL的BSA溶液(5％)加入到所述悬浮液中，并再搅拌1.5小时。将物质离心，并用1mL PBS仅洗涤3次，因为该染料显示远小于SRB的浸出趋势。在最后一个洗涤周期中离心所述悬浮液之前，将其分成10个级分，分别在室温下在真空中干燥1小时，并贮存在冰箱中，得到10个约100μg的M7-A1＠B的级分。
[0187] 试图避免提取工艺，并且目的在于分别比较不同染料对于M4-A1＠B的影响，首先按照如前解释的类似方法，在不存在和存在一些量的STZ下测试材料M7-A1＠B。为此目的，进行两个独立试验，使用贮存在冰箱(6天)中由FOSS提供的一盒牛奶和来自波兰(在冰箱中1天)的鲜奶。将200μg的材料用2mL的牛奶悬浮，并将悬浮液分成150μL的等分试样。在加入STZ之前，如前所述，从每个等分试样取70μL，测量F0。然后，将20μL的不同浓度的STZ溶液加入到其余级分(80μL)中，在热混合器中以800rpm振摇10分钟，离心，并在535nm下测量上清液的荧光，λexc＝515nm(图9)。
[0188] 尽管观察到显著的散射，但是有可能追踪在减去纯牛奶的信号之后不断增强的染料荧光信号。图9显示由于在不存在STZ下染料浸出的抑制引起对于M4-A1＠B的灵敏度增强。通过将曲线拟合为逻辑函数，有可能推导定量限(LOQ)65±18ppt和IC50 1.5±1.4ppb，其比M4-A1＠B更灵敏约2个数量级。
[0189] 特别地，图9显示在不存在(1；黑色)和在存在(2；红色)2ppm的STZ下，含有M7-A1＠B的牛奶悬浮液中释放的BODIPY-PEG的荧光光谱(λexc＝515nm)。b)在10分钟的相互作用时间之后，在535nm(λexc＝515nm)下记录的M7-A1＠B悬浮液的上清液的荧光增强，作为加入的STZ浓度的函数；(N＝2)。
[0190] 接着，研究STZ和SPY的浓度的影响。为此目的，我们重复所述过程，但是向每个级分中加入不同浓度的相应磺酰胺，并在反应10分钟之后，从氯仿相取等分试样(图10)。在该情况下，使用贮存在冰箱中5和7天的牛奶。显然在两种情况下都可以发现高灵敏度的响应，对于STZ的LOQ为0.5±0.1ppb和IC50为0.8±0.1。对于SPY，荧光增强和灵敏度都较低(LOQ：4.6±2.2ppb,IC50:16.2±6.9ppb)。
[0191] 特别地，图10显示在10分钟反应时间之后，在从M7-A1＠B在原料奶中的悬浮液提取染料之后，在538nm(λexc＝515nm)下CHCl3相的荧光增强，作为STZ(上部)和SPY(下部)浓度的函数。将红色点归类为逸出值，在拟合中不考虑(N＝2，仅显示一次重复)。
[0192] 通过在使用之前增加材料洗涤周期的次数可以进一步提高灵敏度，尽管由于在持续洗涤期间除去了部分染料，荧光增强较低。特别地，LOQ和IC50值都提高了(对于STZ，LOQ为0.02±0.01ppb，对于SPY，LOQ为0.78±0.38ppb，并且对于STZ，IC50为0.28±0.15ppb，对于SPY，IC50为4.4±1.7ppb)，其可能应归于空白释放的抑制较好。而且，在较低STZ浓度(100ppt)下，在测定工作范围中释放的染料量高于转移抗体的至少100倍，优选地200倍，在高于50ppb的浓度下，其降低到80倍，这是信号放大的显著标志，尤其是在期望的低浓度范围下。
[0193] 因此，简短地且简明地描述本发明所述材料和方法的示例性的实施方案：
[0194] 1.一种混合中孔纳米颗粒或微颗粒材料，其含有在各孔之内的化学指示剂物质，并且其中特定的有机分子(半抗原)共价结合在外表面上，其中分子对于生物分子(例如，抗体、受体蛋白或适体)具有亲和力，并且结构上类似于目标物质(例如，抗生素、霉菌毒素例如黄曲霉素、或激素活性物质)
[0195] 2.根据第1点的混合中孔纳米颗粒或微颗粒材料，其中使用具有在2-50nm之间的中孔和从500直至1500m2g-1的比表面的周期性中孔二氧化硅(例如，MCM-41、HMS、MSU-n、MSU-V、FSM-16、KSW-2、SBA-n(n＝1、2、3、8、11-16)、UVM-7、UVM-8、M-UVM-7或M-UVM-8)(例如，Sigma-Aldrich)。所提及的中孔二氧化硅材料也可以含有经由同种物合成的整合的磁性颗粒(例如，Fe2O3)。
[0196] 3.根据第1点的混合中孔纳米颗粒或微颗粒材料，其中有色、荧光或化学发光染料(参见表2)包含在所述各孔中，作为光学或电化学指示剂物质。
[0197] 4.根据第1点的混合中孔纳米颗粒或微颗粒材料，其中类似于目标物质((例如，抗生素或霉菌毒素，参见表1)的有机分子共价结合到所述二氧化硅载体颗粒。所述分子可以含有与所述中孔材料的硅烷醇基反应的烷氧硅烷基，或者经由固定在所述中孔材料上的官能团(例如氨基或羧酸基)直接固定到所述表面上。所述材料还可以在表面上载有其它有机分子，其例如可以进一步提高特异性或降低非特异结合(例如聚(环氧乙烷))。
[0198] 5.根据第1点的混合中孔纳米颗粒或微颗粒材料，其中使用市售可获得的或自制的生物分子(例如抗体或适体)闭合各孔，其中生物分子对于目标物质具有高亲和力且对于半抗原具有稍低亲和力。
[0199] 6.根据第1-5点中任一点的方法，其中例如，可以通过任何合适的方法，将1μl的材料以5mg mL-1浓度斑点化或条带化(striped)、沉积在硝基纤维素条、具有部分蜡涂层的硝基纤维素、或其它载体材料例如玻璃纤维网眼织物(mesh fabric)或玻璃纤维纸上。
[0200] 7.根据第6点或第1-6点中任一点的方法，其中可以经由荧光读数装置、发光读数装置或照相机(例如移动通信设备、数字照相机)以定性和至少半定量方式(即使不是定量方式)检测释放的指示剂物质。
[0201] 尽管本文已经描绘和描述了具体实施方案，但是在没有背离本发明保护范围下适当地修饰所显示的实施方案在本发明的范围之内。下述权利要求书代表通常定义本发明的第一次非限定性尝试。
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