마로부터 발효된 식물성 뮤신을 제조하는 방법 및 이를 포함하여 콜라겐 합성능, 보습, 피부 보호 및 상처 재생이 우수한 화장료 조성물 {METHOD FOR PREPARING FERMENTED VEGITABLE MUCIN FROM YAM AND COSMETIC COMPOSITIONS WITH IT HAVING SUPERIOR COLLAGEN SYNTHETIC ABILITIES, MOISTURIZING EFFECT, SKIN PROTECTION AND WOUND HEALING}

본 발명은 마로부터 식물성 뮤신을 제조하는 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마의 추출물을 발효시켜 식물성 뮤신을 제조하는 방법과, 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

뮤신(mucin)이란 점막에서 분비되는 점액물질로 점액소(粘液素) 또는 점소라고도 한다. 물과 중성염 용액에는 녹기 어렵고, 산성에서는 녹지 않고 침전되나, 알칼리성에서는 점성질의 액이 된다. 그 화학적 본체는 당단백질의 일종이나, 점액의 기원에 따라 여러 당단백질을 함유하고 있으며, 또한 점액의 종류에 따라 두 종류 이상의 당단백질이 함유되는 경우가 많다. 대표적인 것으로 턱밑샘(顎下腺) 뮤신이 있으나, 이것도 양·돼지·소에서는 그 구조가 크게 다르다. 이 밖에도 위점막뮤신·소장뮤신·기관뮤신·자궁경관뮤신 등이 있다. 이 중 소화 기관의 뮤신은 기관의 보호 및 소화운동의 윤활제 역할을 하고, 위점막 뮤신은 위산과다와 위궤양 치료에 사용된다.

이 밖에도 뮤신은 콜라겐, 엘라스틴, 단백질 등 천연 복합물질인 콘드로이친을 함유하였기 때문에 외부의 거친 환경으로부터 수분손실을 막아 피부의 건조를 막아주고, 상처가 난 피부를 빠르게 재생시켜 주는 효과가 있다. 따라서, 뮤신 성분은 여드름 상처, 민감성 피부를 재생시켜 주고 탄력을 부여하는 새로운 물질로 각광받고 있다.

현재 뮤신 성분을 포함한 화장품으로 선출원된 국내 공개특허 제1995-002741호의 '달팽이로부터 추출한 뮤신 성분을 이용한 화장품의 제조방법'과 같이, 달팽이점액 여과물을 포함한 화장품이 사용되고 있다. 그러나 이는 동물 유래의 보습제들이기 때문에 적정량 이상 사용되었을 경우에는 피부자극이나 오염에 의한 감염을 배제할 수 없고 또한 비용이 비싸기 때문에 정작 화장품 자체에는 극히 소량의 뮤신만이 유효성분으로 함유되어 실질적인 효과는 미미한 실정이었다.

하지만, 식물 추출물에서 유래한 식물성 뮤신의 경우에는 피부자극이 강한 동물성 뮤신에 비하여 세포 독성 및 피부 자극이 현저히 적다는 장점이 있다. 무엇보다도 식물성 뮤신을 함유하는 식물의 경우 동물성 뮤신을 함유한 달팽이 등과 달리 재배 및 채취가 용이하여 대용량으로 생산이 가능할 뿐만 아니라 비용이 훨씬 적게 들고 친환경적이다. 따라서, 화장품 내 다량 함유가 가능하여 실제로 화장품을 사용할 경우보다 우수한 효능을 얻을 수 있다.

이러한 이유로 인하여 피부에 대한 부작용, 비용 및 환경문제 등의 단점이 있는 동물성 뮤신의 단점을 극복할 수 있으면서도 항산화 효과가 우수하고 피부 탄력 증가, 피부 보습 효과 및 주름을 개선시키며, 항염, 항균 효과가 있는 식물성 뮤신을 함유하는 화장료 조성물의 개발이 요구되었다.

이러한 요구에 따라 국내 공개특허 제2013-0047806호의 '식물성 뮤신 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물'에서는 애플마, 백련초, 더덕, 산약, 연근 등에서 추출한 뮤신 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 대해 게시하였으나, 애플마, 백련초, 더덕, 산약, 연근을 단순히 정제수를 용매로 하여 자석 교반기로 저어주는 것만으로 뮤신을 추출함으로써, 고농도의 식물 유래 뮤신을 제조할 수 없었으며, 애플마, 백련초, 더덕, 산약, 연근에 포함된 중금속 및 잔류 농약들을 그대로 포함하고 있어 세포 독성을 갖게 되는 등의 문제점이 있었다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 마를 분쇄 및 여과하여 추출물을 획득하고, 상기 추출물을 락토바실러스균으로 발효시켜 식물성 뮤신을 제조함으로써, 세포 독성이 전혀 없으면서 수분유지기능 및 콜라겐 합성능력이 우수한 고농도의 뮤신을 제조하는데 목적이 있다.

또한 세포 독성이 전혀 없어 피부에 안전하며, 피부 보호와 세포 재생에 효과적인 화장료 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 마로부터 식물성 뮤신을 제조하는 방법은, (a) 마를 분쇄하는 단계와, (b) 상기 (a) 단계의 분쇄된 마를 여과하는 단계와, (c) 상기 (b) 단계의 여과물을 침전시켜 상등액을 수득하는 단계와, (d) 상기 (c) 단계의 수득물을 여과하는 단계와, (e) 상기 (d) 단계의 여과물을 발효시키는 단계를 포함한다.

상기 (e) 단계는, 상기 (d) 단계의 여과물에 락토바실러스속의 유산균을 접종하여 발효한다.

상기 (d) 단계는 25∼50℃에서 20~100시간 동안 진행한다.

상기 (e) 단계의 발효물을 여과하는 단계를 추가로 포함한다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 마 추출물을 발효하여서 되는 식물성 뮤신을 유효성분으로 함유한다.

상기 식물성 뮤신은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~10중량%로 함유된다.

상기 식물성 뮤신은 락토바실러스속의 유산균을 통해 발효된다.

본 발명의 마로부터 식물성 뮤신을 제조하는 방법에 의하면, 종래 동물 유래의 뮤신에 비하여 수분유지기능 및 콜라겐 합성능력이 우수하고, 면역강화작용을 갖는 고농도의 식물 유래 뮤신을 제조할 수 있는 이점이 있다.

또한 세포 독성이 전혀 없어 피부에 안전하며, 피부 보호와 세포 재생에 효과적인 화장료 조성물을 대량으로 생산할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 식물성 뮤신을 제조하는 방법의 공정도이다.
도 2는 본 발명에 따른 피부세포 안전성 시험에서 실시예의 물질처리 24시간 후의 세포사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 피부세포 안전성 시험에서 실시예의 세포 생존능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 피부세포 안전성 시험에서 비교예의 물질처리 24시간 후의 세포사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 피부세포 안전성 시험에서 비교예의 세포 생존능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 콜라겐 합성능 시험의 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명에 따른 마로부터 발효된 식물성 뮤신을 제조하는 방법을 나타낸 공정도이다.

본 발명의 식물성 뮤신 제조방법은, 마를 분쇄, 여과하고, 이를 다시 침전 및 여과한 후, 발효함으로써, 세포독성이 없고, 콜라겐 합성능이 우수한 식물성 뮤신을 제조할 수 있다는 점에 특징이 있다.

즉, 본 발명의 식물성 뮤신 제조방법은, 도 1에 도시된 바와 같이, (a) 마를 분쇄하는 단계와,(b) 상기 (a) 단계의 분쇄된 마를 여과하는 단계와, (c) 상기 (b) 단계의 여과물을 침전시키는 단계와, (d) 상기 (b) 단계의 침전물을 여과하는 단계와, (e) 상기 (d) 단계의 여과물을 발효시키는 단계를 포함한다. 또한 (e) 단계 후, 상기 (e) 단계의 발효물을 여과하는 단계를 추가로 포함한다.

종래와 같이, 마로부터 식물성 뮤신을 얻기 위해, 마를 분쇄하고 증류수를 투입하여 원심분리하는 경우, 인체에 해로운 중금속이나 잔류 농약이 식물성 뮤신에 그대로 포함되게 되어 화장료의 원료로서 사용될 수 없는 단점이 있다.

그러나 본 발명에 의한 식물성 뮤신의 제조방법은, 마의 추출물을 발효시켜 식물성 뮤신을 얻음으로써, 중금속이나 잔류 농약이 분해될 뿐 아니라, 발효를 통해 유효물질인 식물성 뮤신의 피부흡수율을 높일 수 있는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 단계별로 자세히 설명한다.

(a) 마를 분쇄하는 단계

마를 깨끗이 세척하고, 껍질을 제거한다. 그리고 껍질이 제거된 마를 분쇄한다. 상기 분쇄방법은 제한하지 않으며, 분쇄기를 이용하여 실시할 수 있다. 또한 분쇄를 위하여 물을 첨가하고 교반기로 교반하면서 분쇄할 수 있는데, 이때 첨가되는 물의 양은 마의 중량을 기준으로 2~10배가 되도록 한 후, 50~1,000rpm에서 30~180분간 교반하여 분쇄할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 마는 참마(Dioscorea japonica Thunb.)의 뿌리를 사용하는데, 그 이유는 식물로서는 참마의 뿌리에 양질의 식물성 뮤신이 가장 많이 포함되어 있기 때문이다.

(b) 상기 (a) 단계의 분쇄된 마를 여과하는 단계

상기 (a) 단계를 통해 분쇄된 마를 여과지 또는 필터를 이용하여 여과하여 불순물을 제거한다. 상기 여과방법은 여과지나 필터를 이용할 수 있는데, 후공정으로 다시 한번 여과공정이 있으므로, 이 단계에서는 찌꺼기와 약간의 불순물만을 제거하기 위해 거칠게 여과한다. 예를 들면 20~400mesh 정도의 여과지 또는 표준체를 이용하여 여과한다. 또한, 분쇄된 형태의 마는 끈적한 점액질의 형태로 되어 여과가 쉽지 않기 때문에 1차로 거친 여과를 하는 것이다.

(c) 상기 (b) 단계의 여과물을 침전시켜 상등액을 수득하는 단계

1차 여과, 즉 (b) 단계 후, 수득된 여과물을 침전시켜, 불필요한 슬러지 및 전분성분을 가라앉힌 후 상등액인 점액 성분만을 수득한다. 상기 침전방법은 원심분리를 이용할 수 있는데, 1,000~8,000rpm 정도로 10~15분 정도 20~30℃에서 진행한다.

즉, 침전 단계를 통해 상등액인 뮤신 성분이 포함된 점액 성분만을 수득하는 것이다.

그리고, 침전에 앞서, 상기 (b) 단계의 여과물에 보존제 처리를 할 수 있는데, 사용되는 보존재로는 일반적인 식품을 제조하는데 있어서 사용되는 종류의 것은 모두 이용가능 하다.

(d) 상기 (c) 단계의 수득물을 여과하는 단계

(c) 단계의 상등액을 수득한 후, 이를 다시 여과한다. 이 단계에서의 여과 역시 여과지 또는 필터를 이용할 수 있다. 2차 여과는, 앞선 1차 여과보다는 여과지 또는 표준체의 구멍 크기가 작은 것을 이용함이 바람직하나, 그 크기를 제한하지는 않는다. 예를 들면 400~600mesh의 것을 이용할 수 있다.

(e) 상기 (d) 단계의 여과물을 발효시키는 단계

다음으로, 상기 (d) 단계의 여과물을 발효시킨다. (e) 단계인 발효단계는, 미생물을 이용하여 (d) 단계의 여과물을 분해시키는 것이다. 즉, 상기 미생물 및 미생물이 분비하는 효소에 의해 물질이 자연 분해됨으로써, 물질의 분자 크기가 작아져 피부흡수가 용이해지며, 발효에 따른 기존 성분이 강화된다. 또한, 미생물에 의해 인체에 유해한 중금속, 잔류농약 등과 같은 독성물질이 완전히 분해되어 세포 독성이 없어지며, 발효 산물은 열과 이산화탄소에 강하고 잘 변질되지 않아 유효성분의 보존성이 증가한다.

본 발명의 발효에 이용되는 미생물은 특히 제한되지 않으나, 바람직하게는 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 유산균을 접종하여 발효시킨다. 상기 락토바실러스 속은 당류를 발효하여 에너지를 획득함으로서 다량의 유산을 생성하는 세균으로, 형태적으로는 그램(Gram) 양성 무포자 간균으로 다형성을 나타내고, 크기는 0.5~0.9×1~11μm로 단간균에서 장간균의 여러 형태를 나타낸다. 본 속은 산소가 적은 환경에서 즐겨 발육하며 각종의 당에서 유산을 생성한다. 이들은 산도(pH 3~4 정도)에서 내성을 보이는 것이 많고 영양 요구성은 매우 복잡하고, 당류 외 많은 아미노산이나 비타민류를 요구하여 균종 또는 균주에 따라 미량 영양소를 가하지 않으면 발육할 수 없는 것도 알려져 있다.

그리고 상기 발효는 25∼50℃에서 20~100시간 동안 진행하는 것이 효과적이다. 이는 상기 발효온도가 25℃보다 낮거나, 50℃보다 높게 되면 유산균의 활성이 제대로 이루어지지 않아 발효가 원활히 이루어지지 않는 문제가 있고, 발효시간이 20시간 보다 짧을 경우 완전한 발효가 이루어지지 않은 상태가 되고, 100시간을 초과하게 되는 경우에는 이미 충분한 발효가 이루어진 상태이므로 더 이상의 발효기간을 유지하는 것은 무의미하기 때문이다. 그리고 발효 시의 습도조건은 73~75%인 것이 바람직하다.

또한, 상기 미생물의 접종량은 여과물 99.90~99.99중량%에 대해 락토바실러스 속의 유산균 0.01~0.10중량%가 됨이 바람직하다. 이는 유산균의 접종량이 너무 적게 되면 발효가 충분히 진행되지 않아, 보습 화장료의 기능성을 떨어뜨릴 수 있고, 유산균 사용량이 0.10중량%를 넘어서면 과량이 되어 불필요한 비용이 추가되는 것이기 때문이다.

그리고 상기와 같이 발효가 완료되면, 상기 (e) 단계의 발효물을 다시 여과한다. 이는 최종적인 여과로서, 1회 내지 다수 회에 걸쳐 여과를 진행할 수 있다. 이때의 여과는 0.1~10㎛의 구멍 크기를 갖는 필터를 이용할 수 있는데, 다수 회에 걸쳐 여과한다.

발효액이 여과되면, 필요에 따라 멸균된 보존제 및 부형제를 첨가하는데, 사용되는 보존제 및 부형제는 제한하지 않으며, 보존제로는 일반 화장품 보존제로서 가장 많이 사용되는 파라벤이나, 부형제로서 덱스트린(dextrin) 등을 사용할 수 있다.

상기와 같은 방법을 통해 마로부터 식물성 뮤신을 수득하면, 이를 화장료 조성물에 유효성분으로 사용할 수 있게 된다. 즉, 상기와 같은 식물성 뮤신을 화장료 조성물에 사용할 경우 종래의 식물성 뮤신과 달리 발효로 중금속 및 농약성분이 없게 되며, 피부흡수율이 높아지게 된다. 또한, 종래의 달팽이 점액 추출물보다 콜라겐 합성능이 뛰어나 주름개선에 효과적이며, 피부의 보호와 상처 재생에 효과적이다.

그리고 본 발명의 화장료 조성물은 상기 식물성 뮤신을 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~10중량%로 함유하는 것이 바람직한데, 그 함유량이 0.0001중량% 미만이면 식물성 뮤신의 효과가 미미하게 되고, 10중량%를 초과할 경우 과량이 되어 투입 대비 그 효과가 낮아 비효율적이기 때문이다.

본 발명의 화장료 조성물은, 상기 식물성 뮤신 이외에, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있으며, 그 종류를 제한하지 않는다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 제조되는 데에 제한이 있는 것은 아니며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으며, 그 종류가 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 구체적인 실시예 및 시험예를 통해 본 발명을 좀더 상세히 설명한다.

(실시예)

참마를 준비하여 깨끗이 세척하고, 껍질을 제거하였다. 껍질이 제거된 참마 500g에 물 2.5ℓ를 가하고 교반기로 800rpm에서 30분간 교반하여 분쇄하였다. 그 후, 300mesh의 여과지를 이용하여 1차 여과하고, 이를 원심분리(5,000rpm, 15분, 25℃)하여 상등액을 수득하고, 500mesh의 여과지로 2차 여과하였다. 다음으로, 2차 여과물에 락토바실러스속 유산균을 접종(2차 여과물 총 중량 대비 0.01중량%)한 후, 발효(온도 35℃, 습도 74%, 50시간)하였다. 그리고 최종 발효물을 5㎛의 필터를 이용하여 3회에 걸쳐 여과하였다. 그리고 최종 여과물을 -50℃ 조건에서 20시간 동결건조를 실시하여 최종 뮤신을 수득하였다.

그리고 상기 수득한 식물성 뮤신을 이용하여 하기 표 1과 같이, 0.1%, 0.5%, 1%, 5%로 농도로 화장료 조성물을 제조하였다.

(비교예)

크기 5~8cm의 달팽이를 흐르는 깨끗한 물에 세척하고 비슷한 크기만 선별하여 70% 에탄올로 깨끗이 소독하였다. 소독한 달팽이를 검정색 망에 넣어 6시간 분비된 점액을 수집하고 다시 먹이를 준 후 12시간 회복기를 주고 위와 동일한 방법으로 다시 점액을 수집하였으며 수집한 점액은 냉장보관하였다.

그리고 상기 실시예와 같이 화장료 조성물을 제조하되, 식물성 뮤신을 대신하여 수집한 점액을 사용하였다.

피부세포 안전성 in vitro 시험( MTT )

① 세포배양

인간 피부세포주(각질형성세포주 HaCaT)는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% fetal bovine serum(FBS), antibiotic-antimycotic (GIBCO, Cat No. 15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm² culture dish에서 37℃, 5% CO ₂ 의 조건으로 배양하였다. 이 세포가 80%가 될 때 계대배양을 하여 실험에 사용하였다.

② 시험방법

다양한 기능성 화장품 원료 물질의 기능성 탐색에서 첫 단계는 피부를 구성하는 세포종들(keratinocyte, melanocyte 그리고 fibroblast 등)에서 세포독성을 나타내지 않는 농도범위를 선택하는 것이다. 이를 위해 시험물질을 녹이거나 희석시킬 때는 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배지를 사용하였다. 이러한 농도의 탐색에는 실제 상기 세포들을 배양하면서 다양한 농도의 시험물질을 세포 배양에 처리한 후 세포의 성장 및 증식, 혹은 독성에 미치는 영향을 조사하는 방법에 MTT 시험법이 사용된다.

이는 세포의 미토콘드리아 탈수화 효소에 특이적으로 반응하는 MTT(3-(4,5-dimethyl thiazol-2yl)-2,5 diphenyl-2H-tetrazolium bromide)를 이용한 분석법으로, 더욱 신뢰할 만한 세포 안정성에 관한 영향을 시험할 수 있다. 구체적인 시험 방법으로는 세포를 24well에 1×104 혹은 1×105 cell/well로 분주한 후 세포배양 조건에서 세포수가 50~60%에 도달할 때까지 배양한다. 배지를 버리고 10% PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 다음 10% FBS가 포함하지 않는 새로운 배지를 넣고 일정농도의 시험물질(AP1~20)을 처리하여 48시간 추가 배양한다. MTT 용액(6.6mg/ml, 3-(4,5-dimethyl thiazol-2yl)-2,5 diphenyl-2H-tetrazolium bromide액)을 각 well에 50㎕ 씩 넣고 3시간 추가 배양한다. 배양액을 제거한 다음 dimethylsulfoxide(DMSO, Amresco, 0231-500ML)를 200㎕씩 넣고 10분간 흔들어 준 다음 100㎕씩 96well에 취하여 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader로 540nm에서 흡광도를 측정한다. 세포 독성 정도(세포 생존능)는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

세포 생존능(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100

③ 시험결과

인간 각질형성 세포주인 HaCaT에서의 실시예와 비교예의 세포 안전성을 평가하였다. 실시예와 비교예에 대해 0.1%, 0.5%, 1%, 5% 농도 범위에서 시험하였다.

도 2 및 도 3은 물질처리 24시간 후의 세포사진이며, 도 4 및 도 5에서는 세포 생존능이 80% 이상인 것을 세포 독성이 없는 것으로 간주하였다.

그 결과 도 2 내지 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예와 비교예 모두 농도가 증가함에도 세포 독성이 없는 것을 확인하였다.

콜라겐( Collagen ) 합성능 시험

① 시험방법

피부의 주요한 구성성분은 콜라겐이다. 콜라겐은 진피 건조 중량의 70-80%를 차지 한다. 사람의 진피 중 type I, III 콜라겐이 주요한 성분이며, type I은 총 콜라겐의 80%를 type III는 총 콜라겐의 15%를 차지한다. 피부의 주름은 콜라겐의 합성과 분해의 불균형에 기안하는데 보통 피부에서 type I 콜라겐의 합성과 그 분해 효소인 MMP-1이 균형을 이루고 있다. 그러나 광노화 된 피부에서는 type I, III 콜라겐의 합성이 저하되고, MMP-1의 활성이 증가되어 있다고 보고되고 있다. 또한 콜라겐은 세포 내에서 프로콜라겐(procollagen)으로 합성된 후 세포 외로 분비되어 콜라겐 섬유로 중합한다.

본 시험방법은 인간섬유아세포(CCD986-sk) 배양 시 시료의 세포 내 프로콜라겐의 발현 증가 정도를 mRNA 수준에서 무처리군과 비교 시험하는 것으로, 콜라겐의 양을 측정하기 위하여, Real-time PCR로 측정하였다. 인간섬유아세포(CCD986-sk)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic(GIBCO, Cat No. 15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm² culture dish에서 37℃, 5% CO ₂ 의 조건으로 배양하였다. 이 인간섬유아세포가 100%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1×10⁴ cells/well 분주한 후 세포배양 조건에서 confluence가 80%이상 도달될 때까지 배양하였다. 이 후 배지를 제거한 DMEM free 배지(FBS가 빠진 배지)로 교환 후 일정농도의 시험물질(실시예 및 비교예: 0.1%, 0.5%, 1%, 5%)을 처리하였다. 그 후 24시간 세포배양 조건에서 추가 배양하여 각 물질이 주름 관련 유전자인 프로콜라겐의 발현에 어떠한 영향이 있는지 보았다. 시험방법은 real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 아래와 같다.

ⓐ RNA Isolation과 cDNA 합성

RNA isolation과 cDNA 합성은 FastLane Cell one-step buffer set (QIAGEN 216213)이용하였다. 배지를 제거한 세포는 FCW(cell wash buffer)로 세척하고, 50㎕ cell processing mixture(Buffer FCPL이 첨가된 Buffer FCPW에 gDAN Wipeout buffer 첨가한 mixture)을 첨가하여 실온에서 5분간 인큐베이션(incubation)하였다. 이후 새로운 E-tube에 옮긴 후 75℃에서 5분간 반응시켰다.

ⓑ Real-time PCR 분석

프로콜라겐 유전자를 분석하기 위하여 상기에서 합성된 cDNA를 template로 하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine(Qiagen社)으로 수행하였다. 실험에 사용한 프라이머(primer)들은 Qiagen사의 QuantiTect® primer assays (18S rRNA ; QT00199367, procollagen C-endopeptidase enhancer protein(PCOLCE) ; QT01005725)를 사용하였다. 발현율은 18S rRNA로 노멀라이제이션(Normalization)하였다. Real-time PCR 조건은 하기 표 2와 같다.

② 시험결과

섬유아세포(CCD986sk)에서 실시예 및 비교예 0.1%, 0.5%, 1%, 5% 농도에서 프로콜라겐의 발현에 어떤 영향을 미치는지 real-time PCR 방법으로 시험하였다. 그 결과를 도 6의 그래프로 나타내었다.

프로콜라겐의 발현은, 음성대조군(무처리군)을 기준으로 양성대조군의 수치인 100보다 높은 수치가 나오면 프로콜라겐의 발현을 증가시키는 물질이라고 말할 수 있으며, 특히 음성대조군(TGFβ-1)의 수치보다 높거나 비슷하면 콜라겐 합성능 효과가 뛰어나다고 말할 수 있는데, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 무처리군과 비교하였을 때 비교예는 0.1%에서 약 1.3배, 1%에서 약 1.18배 정도 증가하였고, 실시예는 0.1%를 제외한 0.5% 1%, 3% 농도 모두에서 각각 약 1.3배, 1.9배, 1.19배 정도 증가하였다. 따라서 실시예와 비교예 모두 콜라겐 합성능이 우수하나, 본 발명의 실시예가 비교예에 비해 콜라겐 합성에 더욱 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

이상, 본 발명을 바람직한 실시 예를 사용하여 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위는 특정 실시 예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 이해하여야 할 것이다.