技术领域
[0001] 本
发明涉及
微生物的技术领域，特别是涉及一种复合芽孢杆菌菌剂的制备方法和应用。
背景技术
[0002] 21世纪以来，人口数量的增长，使得农产品需求量的剧增。为实现农产品产量增长，化学
肥料和化学
农药的滥用日渐加剧。化学制剂的滥用使
植物病菌对
杀菌剂敏感度降低并产生抗药性，导致农业生产成本增加，降低农产品效益价值；另外，化学制剂的残留使农田环境污染问题日渐突出，某些化学物质甚至随着食物链进而威胁到人类健康。为改变这种不良现象，响应国家鼓励和倡导绿色环保农业的政策，探寻新的微生物菌剂以替代或部分替代
化学农药和化学肥料的研究备受关注。
[0003] 芽孢杆菌凭借其抗逆性强，耐热、酸、
碱等，在工业生产中较高的生物量和芽孢产率有利于产品的加工、贮藏，可以保证产品的
质量，成为理想的微生物菌剂筛选对象。芽孢杆菌可以通过产生
激素可促进植物根系生长、增强根系吸收矿物营养和
水分,从而实现促进植物生长；另外，芽孢杆菌可以在植物根围定殖，进而能够诱导植物产生系统抗性以提高植物抵抗病原菌的能
力。
[0004] 在促进植物生长和防治植物病害方面，目前多采用的是单一微生物菌株的使用。但是，由于不同菌株的促生/抗病机制不同，不同菌株的复配使用能够实现菌株间的优势互补，增强各菌株在环境中的适应性，将各个菌株的促生功能和防治植物病害功能充分发挥。
目前国内大多数复合菌产品都是单菌培养，再经混合获得“复合菌”产品，这种方法获得的“复合菌”产品可能本身存在拮抗，造成功效减弱或者施用后造成根系有益菌减少，功效降低。由于本发明的复合菌剂采用三种功能细菌同罐
发酵培养的方法获得，从而节约了大量的成本，使产品利润最大化。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对化学肥料和化学农药长期过量施用对环境的破坏，提供一种复合芽孢杆菌菌剂的制备方法及田间应用，该复合芽孢菌剂包括甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus KNK-1、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus BCJB01和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BMJBN02。
[0006] 本发明目的通过以下技术方案实现：
[0007] 一种复合芽孢杆菌菌剂，包括甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus KNK-1、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus BCJB01和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BMJBN02，皆由山东省科学院生态研究所分离获得并保存。
[0008] 甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus KNK-1已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.16842，保藏日期2018年11月30日,该菌株已在
申请号为201910183156.0的申请文件中记载；所述蜡状芽孢杆菌Bacillus cereusBCJB01已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.10477，保藏日期2015年1月30日,该菌株已在申请号为201510081973.7的申请文件中记载；所述菌株巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BMJBN02已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.10478，保藏日期2015年1月30日，该菌株已在申请号为201510082296.0的申请文件中记载。
[0009] 一种复合芽孢杆菌菌剂的制备方法，由以下步骤进行：
[0010] (1)将保存的甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus KNK-1、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus BCJB01和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BMJBN02分别接种到液体LB培养基中，30℃±1℃条件下培养至对数生长期，
种子液浓度不低于1.0×108cfu/mL，获得供接种用使用的种子液；
[0011] (2)将步骤(1)获得的甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus KNK-1、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus BCJB01和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BMJBN02的混合，获得混合种子液，混和种子液中甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus KNK-1、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus BCJB01和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BMJBN02的活菌数量比为2:2:6～1.5:1.5:7；
[0012] (3)将步骤(2)获得的混合种子液以10％(体积百分比)的接种量接种到发酵培养基，使发酵培养体系中菌体初始浓度不低于1.0×107cfu/mL，培养条件为：在30℃±1℃条件下，通气保压0.05MPa，溶
氧量20％～25％，转速200～220r/min，发酵过程中保持发酵液PH7.0～7.2，培养36h后测量活菌总量，活菌总量达到1.0×109cfu/mL，混合发酵结束，得到发酵液；
[0013] (4)将步骤(3)得到发酵液，按照20％(质量体积比)添加
硅藻土，充分混匀，进行
喷雾干燥，得到甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus KNK-1、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus BCJB01和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BMJBN02的发酵液预制剂；添加合适的助剂，制备获得复合芽孢杆菌菌剂，菌剂中活菌数量不低于1.0×1011cfu/g。
[0014] 进一步优选，本发明的复合芽孢杆菌菌剂包括
可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、
悬乳剂或水乳剂。
[0015] 进一步优选，可湿性粉剂的制备方法为，取91～94份骤(4)获得的混合物，1～2份有机硅BD-3077，1～1.5份羧甲基
纤维素钠，1～2份壳聚糖，2～3.5份木质素磺酸钠和1份辅酶A充分混合，通过气流
粉碎机，混合物粉碎至Φ＝45μm以下，即获取复合芽孢杆菌的可湿性粉剂，可湿性粉剂中活菌数量不低于1.0×1011cfu/g。
[0016] 本发明获得的复合芽孢菌的可湿性粉剂在室温条件下，半年后复合芽孢杆菌菌剂中活菌数目不低于1.0×1011cfu/g，其
稳定性好。而剂型为悬浮剂或悬乳剂的稳定性次之，室温条件下半年后该剂型中活菌数目下降20％；水分散粒剂或水乳剂剂型的稳定性最低，室温条件下半年后该剂型中活菌数目下降50％。
[0017] 进一步优选，步骤(2)中发酵培养基配方：玉米粉2％，
豆粕粉1％，
酵母粉0.3％，CaCl20.1％，MgSO4˙7H2O 0.05％，K2HPO˙3H2O0.3％，KH2PO40.2％，FeSO4˙7H2O 0.0008％(皆为质量比)，余量为水，pH7.0～7.5，0.1MPa，连同
发酵罐一起115℃灭菌60min，待冷却到常温条件下使用。
[0018] 本发明的另一目的，提供复合芽孢杆菌菌剂在促进植物生长和/或防治植物病原菌侵染引起的相关植物病害中的应用，对植物促生和田间植物病害防治有显著效果；作为优选，本发明的复合芽孢杆菌菌剂在促进茄果类、瓜果类植物生长和/或防治土传病原菌镰刀菌和霜霉菌引发的茄果类、瓜果类病害中的应用；进一步的，本发明的复合芽孢杆菌菌剂在防治霜霉菌引发的茄果类、瓜果类霜霉病、枯萎病和疫病中的应用。
[0019] 进一步的，本发明的复合芽孢杆菌菌剂应用于工厂化育苗、田间直播或叶面喷施防治病害。
[0020] 在具体应用中，育苗使用时可以以10g/L添加到营养基质中获得栽培基质；田间直播时以3kg/亩进行应用；防治病害时可采用叶面喷施，用量为500倍稀释液即可获得理想防效。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 本发明提供了一种包含甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus KNK-1、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus BCJB01和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BMJBN02的复合芽孢杆菌菌剂及制备方法，该复合芽孢杆菌菌剂制备方法简单，易操作。
[0023] 该复合芽孢杆菌菌剂在促进植物生长和/或防治植物病原菌侵染引起的相关植物病害中的应用，为微生物源肥料、农药的研发开拓新的途径。
[0024] 本发明的复合芽孢杆菌菌剂能明显促进植物生长，尤其对茄果类、瓜果类植物的促生效果显著。尤其对茄果类和/或瓜果类植物的促生效果显著。”
[0025] 本发明的复合芽孢杆菌菌剂采用三种功能细菌同罐发酵培养的方法获得，与目前国内大多数单菌培养、再经混合获得的“复合菌”产品相比，本身不存在拮抗，功能菌的功效能够相互
叠加，功效稳定，另外该菌剂的制备过程节约了大量的成本，使产品利润最大化。
[0026] 本发明的复合芽孢杆菌菌剂与市场化学肥料和/或化学农药相比，对促进植物生长和/或防治植物病害效果良好，植物生物量增量接近30％，壮苗指数上升约92％，植物病害防治效果在70％以上，最高可达80％。
具体实施方式
[0027] 为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
[0029] 一种复合芽孢杆菌菌剂的制备方法，由以下步骤进行：
[0030] (1)将保存的甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus KNK-1、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus BCJB01和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BMJBN02分别接种到液体LB培养基中，30℃±1℃条件下培养至对数生长期，种子液浓度不低于1.0×108cfu/mL，获得供接种用使用的种子液；
[0031] (2)将步骤(1)获得的甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus KNK-1、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus BCJB01和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BMJBN02的混合，获得混合种子液，混和种子液中甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus KNK-1、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus BCJB01和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BMJBN02的活菌数量比为2:2:6；
[0032] (3)将步骤(2)获得的混合种子液以10％(体积百分比)的接种量接种到发酵培养基，使发酵培养体系中菌体初始浓度不低于107cfu/mL，培养条件为：在30℃±1℃条件下，通气保压0.05MPa，溶氧量20％，转速220r/min，培养36h，发酵液PH 7.0～7.2；
[0033] (4)将步骤(3)得到发酵液，按照20％(质量体积比)添加
硅藻土，充分混匀，进行喷雾干燥，分别得到甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus KNK-1、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus BCJB01和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BMJBN02的发酵液预制剂；
[0034] (5)取91份步骤(4)获得的混合物，1份有机硅BD-3077，1.5份羧甲基
纤维素钠，2份壳聚糖，3.5份木质素磺酸钠和1份辅酶A充分混合，通过气流粉碎机，混合物粉碎至Φ＝45μm以下，即获取粉状复合芽孢杆菌菌剂，制剂中活菌数量不低于1.0×1011cfu/g。
[0035] 复合芽孢杆菌菌剂包括可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂或水乳剂，对这五种剂型的储存稳定性比较，筛选出能够长时间稳定保存的剂型。在室温条件下分别于1m和6m(菌剂制备后1个月和6个月)采用活菌计数法进行检验，检验结果如表1所示。
[0036] 表1复合芽孢杆菌菌剂不同剂型的稳定性
[0037]
[0038] 结果显示，在室温条件下，复合芽孢杆菌菌剂的5种剂型(可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂或水乳剂)中，可湿性粉剂中的活菌数目在一个月和六个月时仍保持活菌数目的稳定性(活菌数高于95％)，而剂型为悬浮剂或悬乳剂的稳定性次之，室温条件下半年后该剂型中活菌数目下降20％；水分散粒剂或水乳剂剂型的稳定性最低，室温条件下半年后该剂型中活菌数目下降50％。这表明复合芽孢杆菌菌剂的剂型为可湿性粉剂的稳定性最佳。
[0039] 以下实施例2、3、4中所述复合芽孢杆菌菌剂均为实施例1所制得；所述产品的百分含量均为质量/体积百分比。
[0040] 实施例2复合芽孢杆菌菌剂在促进辣椒工厂化育苗及生产中的应用
[0041] 由以下步骤进行：
[0042] (1)将复合芽孢杆菌菌剂按10g/L添加到育苗基质中，充分混匀后获得栽培基质，按照常规方法
播种并常规管理“中椒6号”，直接使用育苗基质(该育苗基质的配方：皮德曼公司生产的育苗基质的配方：有机质含量≥45％，
腐殖酸含量≥15％，PH值：5.5～6.8，游离水含量≤20％)充当栽培基质的“中椒6号”栽培组为阴性对照，使用栽培基质中添加氮磷
钾复合肥(氮∶磷∶钾＝15∶15∶15)的“中椒6号”栽培组为阳性对照(使用量为60g/m2)，每组处理30株，重复3遍，21d后观察统计株高、茎粗、整株鲜重、根系体积、整株干重和壮苗指数。试验结果见表1。
[0043] 壮苗指数＝茎粗(cm)/株高(cm)×整株干重(g)
[0044] 表2复合芽孢杆菌菌剂在辣椒工厂化育苗中的促生试验
[0045] 阴性对照 阳性对照 复合芽孢杆菌菌剂
株高(cm) 18.41±0.60 21.30±1.91 24.23±3.22
茎粗(mm) 2.32±0.09 2.88±0.07 3.79±0.10
根系体积(cm3) 8.51±0.77 12.19±0.54 13.18±1.37
整株鲜重(g) 6.45±0.85 8.81±1.05 9.82±0.44
整株干重(g) 0.92±0.12 1.37±0.13 1.77±0.21
壮苗指数 0.012±0.0015 0.018±0.0018 0.023±0.0017
[0046] 结果显示，相较阴性对照，使用复合芽孢杆菌菌剂工厂化育苗的“中椒6号”的株高、茎粗、整株鲜重、根系体积、整株干重和壮苗指数均有显著增长，生物量积累接近30％(29.20％)，尤其是壮苗指数增长91.67％；另外，复合芽孢杆菌菌剂对“中椒6号”的促生效果明显优于氮磷钾复合肥(氮∶磷∶钾＝15∶15∶15)。这表明复合芽孢杆菌菌剂在工厂化育苗有很好的促进植物生长的效果。
[0047] (2)播种21d后，将复合芽孢杆菌菌剂处理组和阴性对照组的栽培基质进行有效氮、有效磷和有效钾含量的检测。有效氮检测采用碱解扩散法，有效磷检测采用0.5M
碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法和有效钾检测采用NH4OAc浸提-火焰光度计法。上述有效氮、有效磷和有效钾含量的检测方法参考《
土壤农化分析与环境监测》(杨剑虹，王成林，代亨林编著，中国大地出版社，2008版)。试验结果见表2。
[0048] 表3复合芽孢杆菌菌剂对栽培基质中有效氮、有效磷和有效钾含量的影响[0049] 有效氮(mg/g) 有效磷(mg/g) 有效钾(mg/g)
复合芽孢杆菌菌剂 1127.33±1.88 203.14±3.64 747.11±3.67
阴性对照 148.92±5.57 102.57±7.78 90.41±5.32
[0050] 结果显示，相较阴性对照，使用复合芽孢杆菌菌剂的栽培基质的有效氮、有效磷和有效钾含量均有显著提升，分别提升757.00％，198.05％和826.36％，这表明复合芽孢杆菌菌剂通过提升栽培基质中有效氮、有效磷和有效钾的含量，实现促进植物生长的效果。
[0051] 实施例3复合芽孢杆菌菌剂在防治辣椒病害中的应用(本发明产品与田间常见农药对比)
[0052] 一种复合芽孢杆菌菌剂在防治辣椒病害中的应用，经由以下步骤进行：
[0053] (1)试验对象为实施例2(1)长势一致的中等敏感品种“中椒6号”种苗，试验在山东省科学院生态所
温室试验田进行，该试验田于2017年和2018年爆发过辣椒霜霉病、辣椒疫病和辣椒枯萎病。
[0054] (2)试验共5个处理：实施例2(1)中复合芽孢杆菌菌剂处理的“中椒6号”种苗分别由45％百菌清200倍液，64％杀毒矾可湿粉500倍液，复合芽孢杆菌菌剂为100倍液，复合芽孢杆菌菌剂为500倍液，清水对照。采用叶面喷施处理，每处理30株，3次重复。缓苗后，苗期施药，每隔7天用药1次，连续用药5次。在最后一次施药后10天进行病害调查。试验期间平均
温度28℃。取样调查每组处理的辣椒霜霉病、辣椒疫病和辣椒枯萎病发病率。试验结果见表3。
[0055] (3)病害判断指标：参考《辣椒病虫害诊断与防治图谱》(王久兴、王艳侠、张兆辉编写，金盾出版社，2004版)中对辣椒霜霉病、辣椒疫病和辣椒枯萎病的病征描述为判断参考。
[0056] (4)杀菌剂45％百菌清和64％杀毒矾可湿粉田间应用方法参考中华人民共和国行业标准(NY/T1464-2007)中规定的杀菌剂防治辣椒霜霉病、辣椒疫病和辣椒枯萎病田间药效试验的方法和要求。
[0057] 表4复合芽孢杆菌菌剂与常见农药对比
[0058]
[0059] 由表4可知，复合芽孢杆菌菌剂在防治辣椒病害方面，当使用复合芽孢杆菌菌剂为100倍稀释液时，辣椒霜霉病、辣椒疫霉病和辣椒枯萎病的发病率降为12.21％、11.17％和
21.27％，病株发病率仅为28.98％，控病效果明显优于使用化学保护剂处理组(杀菌剂45％百菌清和64％杀毒矾可湿粉)；使用复合芽孢杆菌菌剂为500倍稀释液时，辣椒霜霉病、辣椒疫霉病和辣椒枯萎病的发病率降为18.99％、15.37％和29.91％，病株发病率仅为32.23％，控病效果接近使用化学保护剂处理组(杀菌剂45％百菌清和64％杀毒矾可湿粉)，并且安全性高。
[0060] 实施例4复合芽孢杆菌菌剂在设施地黄瓜中的应用
[0061] 一种复合芽孢杆菌菌剂在设施地黄瓜中的应用
[0062] 试验于2019在泰安市岱岳区
马庄镇进行。试验地土壤，为黄褐土，
土壤肥力中等，地势平坦，具有
灌溉条件。该地区于2018年爆发过黄瓜霜霉病和黄瓜枯萎病，供试品种为“园丰元6号”。试验肥料用量与施用方法、田间栽培管理按当地最佳措施进行。
[0063] 试验按农业部药检所田间试验准则设计，共5个处理：复合芽孢杆菌菌剂，氮磷钾复合肥(氮：磷：钾＝15:15:15)，45％百菌清粉剂和64％杀毒矾粉剂，清水对照。其中，复合芽孢杆菌菌剂和氮磷钾复合肥(氮：磷：钾＝15:15:15)采用基肥法施用(复合芽孢菌剂3kg/亩，氮磷钾复合肥50kg/亩)，45％百菌清粉剂200倍液和64％杀毒矾粉剂500倍液采用灌根施用，在播种期进行，每处理100株，3次重复，共15个小区面积0.5亩，各小区留2行保护行。上述5个处理于21d后追加灌根处理，随机区组设计。选取追加药剂处理前10d(初次处理后
12d)的真叶期植株和处理后10d(初次处理后30d)的扬花期植株进行田间调查。每小区采用双对
角线固定5点取样，每点调查6株，记录调查对象的生长情况，发病情况及病级。试验期间温度25～28℃。
[0064] 病情严重度分级指标：参考中华人民共和国行业标准(NY/T1464-2007)病害分级标准中的黄瓜霜霉病和黄瓜枯萎病分级标准，以整株为单位进行分级。0级：无病斑；1级：病斑0.1％～5.0％；3级：病斑5.1％～10.0％；5级：病斑10.1％～30.0％；7级：病斑30.1％～40.0％；9级：病斑40.1％～100％，植株严重畸形，甚至死亡。
[0065] 发病率(％)＝(发病植株数/调查植株数)×100％
[0066] 病情指数＝∑(病级叶数×该级代表值)/调查总叶数×发病最高级数相对防效(％)＝[(对照区药前病指-处理区药后病指)/对照区药后病指]×100％
[0067] 数据统计分析：统计分析用EXCEL2007和SPSS19.0
软件进行，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法。
[0068] 表5不同处理的定植时黄瓜农艺性状比较
[0069]
[0070] 由表5可知，与清水对照相比，复合芽孢杆菌菌剂对黄瓜定植后，处于真叶期的植株促生壮苗效果显著，株高增加为19.34％，茎粗增加18.45％，促生增效接近对照药剂氮磷钾复合肥的促生效果，但复合芽孢杆菌菌剂用量(3kg/亩)远远低于氮磷钾复合肥的使用量(50kg/亩)。
[0071] 表6不同处理对黄瓜霜霉病和黄瓜枯萎病的影响
[0072]
[0073] 由表6可知，复合芽孢杆菌菌剂对黄瓜霜霉病和黄瓜枯萎病的防效显著。其中第一次施用复合芽孢杆菌菌剂12d后，其对黄瓜霜霉病和黄瓜枯萎病的相对防效等于/或略优于参照化学保护剂(45％百菌清粉剂和64％杀毒矾粉剂)的相对防效；第一次施用复合芽孢杆菌菌剂30d时(即各处理追加灌根处理10d后)，其对黄瓜霜霉病和黄瓜枯萎病的相对防效接近/或优于参照化学保护剂。
