红树植物根际促生固氮菌(DZY－HS14)及其应用
专利汇可以提供红树植物根际促生固氮菌(DZY－HS14)及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种红树 植物 根际 促生固氮菌(DZY－HS14)及其应用，该菌是从热带红树植物根际 沉积物 中筛选出来的芽胞杆菌属Bacillus sp.DZY－HS14，含有16SrDNA序列和固氮基因nifH，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M207043。该菌种具有较高的 生物 固氮活性，用含有该菌的菌剂接种红海榄和木榄等红树植物可以明显促进植株生长，因此可以作为制备促进红树林植物生长的生物固氮菌肥的应用。，下面是红树植物根际促生固氮菌(DZY－HS14)及其应用专利的具体信息内容。
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种对红树林植物具有良好促生效果红树林根际固氮菌及 其制备生物固氮菌肥的应用。
背景技术：
红树林为自然分布于热带、亚热带海岸潮间带的木本植物群落，覆盖大约60-75％热带和亚热带 海岸，对维护海湾河口的生态平衡起重要作用，是海洋生产力的重要组成部分(Holguin et al.，2001)， 被认为是具有较高生产力的生态系统。该生态系统具有较高的有机质水平(全球每年凋落物为100Tg C)，为毗连的沿岸水域和相关的生物群落生境提供有机物(Holguin et al.，2001；Lugomela and Bergman， 2002)。然而红树林生态系统的无机营养较贫乏，尤其是无机氮水平较低(Holguin et al.，1992；Vazquez et al.，2000)，固氮生物的生物固氮被证明是红树林生态系统无机氮的主要来源(Hicks and Sylvester， 1985；Kyaruzi et al 2003)。生物固氮作为红树林生态系统和生源元素生物地球化学循环的重要环节， 对红树林生态系统及生态环境产生极大的影响。
由于人类的过度开发、围海造地和都市化等行为，使全球的红树林正以惊人的速度减少，据联合 国粮农组织保守的数据估算，红树林正以每年平均减少1-2％的速度消失，其速度甚至超过了珊瑚礁 和热带森林的消失速度。在发展中国家中，消失的速度更快，而红树林的90％以上位于发展中国家。 美国红树林行动项目组负责人Aheredo(1999)认为，热带亚热带国家曾在3/4的海岸线上分布有红 树林，现在仅剩下不到一半，而且大部分红树林为严重退化的生态系统。科学家预言，如果任其发展， 在未来的近100年内，人类将彻底失去红树林(Duke，2007)。
近年来，红树林生态系统的维护和红树林植株的保育等研究成为热门研究领域，也有多个国际组 织和团体发起的旨在保护红树林的国际会议。《中国21世纪议程》(1994)优先项目计划中把红树 林恢复与重建技术纳入了议事日程。ITTO组织，2002-2006年的计划目标亦把红树林生态系统恢复列 为首要资助目标之一(廖宝文，2005)。可见红树林湿地生态系统的恢复工作亟需我们大力开展，但 无论理论的研究还是实际恢复工作的开展都面临较大困难。
红树林的恢复建设工作一直比较缓慢，这主要是由于红树林造林成活率极低(廖宝文，1999)。 墨西哥和印度等国家的科学家利用植物生长促生菌(PGPB，plant growth-promoting bacteria)对 红树林进行促生，取得了一定阶段性进展，但发现的适合红树林促生的菌种仍为少数，此类菌种依旧 缺少且多数被保密收藏。
目前中国林业科学研究院热带林业研究所正与墨西哥西北生物研究中心合作，引进相关菌种对我 国主要红树植物进行接种测试和相关菌剂研究，以期解决我国滩涂地段红树林造林成活率极低的棘手 问题。然而，引进菌种在我们国家红树林中的成活率小，并且也存在外种入侵所会产生的各种隐患。
发明内容：
本发明的目的是提出一株从中国热带红树植物根系中筛选出的，具有较高的生物固氮活性的红树 植物根际促生固氮菌新种。
本发明的另一目的是提出所述的红树植物根际促生固氮菌在制备生物固氮菌肥的应用。
本发明所提出的红树植物根际促生固氮菌，是从海南省三亚市的热带红树林区红树植物根际沉积 物样品中筛选出来的固氮菌新种。其分类命名为：芽胞杆菌属Bacillus sp.DZY-HS14。该菌于2007 年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：中国武汉市武汉大学)，保藏编号： CCTCC NO：M207043。
本发明所述菌种的菌学特性描述如下：
革兰氏阳性，杆状，产生椭圆形芽孢(图1--图4)，有周生鞭毛。0.1×4-9μm，个体差异很大(如 图6)。氧化酶阳性，接触酶阳性，好氧或者兼性厌氧。在Ashby、LB以及BUG培养基上生长良好。 在Ashby培养基上经过5d左右培养可以长为直径4-5cm左右，白色、圆形、边缘整齐的扁平菌落(如 图1)。对抗生素多数敏感，抗药性较小。芽孢杆菌是常见固氮菌种。该属细菌在红树林中也有发现过， 并报道过有固氮作用。乙炔还原法(ARA)表明该菌可以利用N2作为氮源，且具有较高的生物固氮 活性，纯培养条件下，其固氮活性25-80umolC2H2h-1mg-1鲜重。
从菌株Bacillus sp.DZY-HS14的纯培养物提取基因组DNA，运用固氮基因特定的引物PolF/PolR (参考Poly et al.，2001)和细菌16S rDNA全序列通用引物16SF/16SR(参考Weisenburg et al.，1998) 进行PCR扩增，均扩增到理想的目的条带，证明该菌株具有固氮基因(图5)。通过测序分析得到固 氮基因nifH序列和16S rDNA序列，通过GenBank中的BLAST软件将nifH序列和16S rDNA序列与 GenBank数据库中的序列进行比对，在数据库中没有找到完全相似的序列，表明这2条基因序列为首 次发现的新基因序列。向基因库成功递交新基因序列得到登录号为：EU707337和EU707338。
在GenBank数据库中选取了部分与测定的16S rDNA序列相似性较高的代表性基因序列，通过 ClustalW软件和Mega软件以Neibor-joining方法构建系统进化树(见图7)，进行系统发育分析。从 系统发育树(图4)可以看出与菌株Bacillus sp.DZY-HS14的16S rDNA序列具有较近亲缘关系的序 列均来自芽孢杆菌属(Bacillus)，并且与已知菌株B.licheniformis的16S rDNA序列具有98％的相似 性，与该属中的已知菌株B.niabensis具有97％的同源性。生理生化结果表明，该菌和与它亲缘关系 最相近的两株已知菌株明显不同(表1)，这表明菌株Bacillus sp.DZY-HS14为一株新种。
表1B.licheniformis、和Bacillus sp.DZY-HS14指标比较(+：表示阳性反应；-：表示阴性反应)
注：B.licheniformis数据参考东爱珠《常见细菌鉴定手册》。B.niabensis数据来自Bacillus niabensis sp. nov.，isolated from cotton-waste composts for mushroom cultivation Int.J.Syst.Evol.Microbiol.57(8)， 1909-1913(2007)
用含Bacillus sp.DZY-HS14的菌液处理两种红树木榄(Bruguiera gymnorhiza)和红海榄 (Rhizophora stylosa)，结果如表2所示。
表2Bacillus sp.DZY-HS14对木榄和红海榄肧处理45天后的影响
注：表中值均为10组平行样平均值。生物量中重量指湿重；剩下重量均指干重。
从表2中我们可以看出该菌对于木榄和红海榄有着良好的促生作用。和对照组相比，光合色素含 量平均值明均明显高于对照组。总叶绿素含量平均值高于木榄对照组139.7％，高于红海榄对照组 34.01％。胡萝卜素含量也分别比木榄和红海榄对照组高183.4％和20.6％。对于叶面积的生长促进作用 也比较明显，分别促进木榄和红海榄叶面积180.7％和72.6％。而对于不同树种的地上和地下的促进则 不相同，对于木榄促进地下部分效果好些，对于红海榄促进地上部分效果好些。这些结果表明，用含 有该菌的菌剂接种海榄、红海榄和木榄等红树植物可以明显促进植株生长，因此，该菌可以作为制备 促进红树林植物生长的生物固氮菌肥的应用。
本发明将在以下方面产生有益效果：该菌种是从中国热带红树植物根系中筛选分离出来的，适合 本地各种环境条件，对于红树林植物的促生效果较好，可用于自然红树林生态系统菌肥的生产工程菌， 提高红树林生态系统的生产力，有望用于红树林恢复、造林的艰巨任务中。
附图说明：
图1、图2、图3和图4分别是Bacillus sp.DZY-HS1菌落不同放大倍数的透射电镜照片；
图5是菌株Bacillus sp.DZY-HS1的电泳图，图中，1：基因组DNA，2：16S rDNA，3：扩增到 的固氮基因nifH，M1：λDNA/EcoR I+Hind III，M2：DL2000；)的基因组DNA、16S、以及扩增 到的固氮基因nifH；
图6显示菌株Bacillus sp.DZY-HS14透射电镜测定大小；
图7是菌株Bacillus sp.DZY-HS1在16S rDNA系统发育树中位置。
具体实施方式
1、材料
1.1土样采集
样品采自海南省三亚市红沙河沿岸红树林区红树植物根际沉积物，样品采集后装入灭菌的封口聚乙烯 袋中，带回实验室低温保存。
1.2培养基
Ashby液体培养基：甘露醇10.0g，KH2PO4·H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4 0.1g，CaCO3 5.0g，去离子水1000mL，pH 7.0。
Ashby固体培养基：Ashby液体培养基+2.2％琼脂。
改良无氮液体培养基：蔗糖10g，苹果酸5.0g，K2HPO4·H2O 0.1g，KH2PO4·H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，Na2MOO4·H2O 0.002g，FeCl3 0.01g，去离子水1000ml，pH 7.0。
LB培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂1-2％，去离子水1000ml，pH 7.0。
2、方法
2.1菌种分离
将样品混匀后取约1g于200ml Ashby、或者Ashby+无氮液体培养基(Ashby 培养基与培养基以1∶1比例混合)中，30℃恒温48h进行加富培养。然后将菌液分别稀释至 10-4、10-5、10-6三个稀释度，各稀释度的菌悬液以涂布法接种于Ashby固体培养基上，30℃ 48h培养后选 择典型的单一菌落进一步纯化。
2.2菌种纯化
将分离出的菌落，用接种针挑取典型的单一菌落，经涂片染色，在光学显微镜下观察菌体形态，如所 分离的菌落不纯，应做系列稀释后再次用平板涂布法分离，直至获得纯种。将纯化后的菌株接种于无氮 Ashby固体培养基和LB全培养基甘油保存。
2.3液体培养中固氮酶活力测定
采用乙炔还原法测定固氮活性(参考Capone 1993)，将斜面保存的纯菌株接种于10ml液体改良 培养基内，于30℃摇床振荡培养72h，分别取1ml于灭菌的5ml小瓶中，盖上橡皮塞。用注 射器从容器中抽走5％空气，然后加入相同体积的乙炔气体。每个样品设3个重复，1个空白对照，对照容 器中不加入乙炔气体。所有样品于30℃孵育12h，用SQ-204气相色谱检测乙烯的生成量。乙炔还原法 (ARA)表明该菌可以利用N2作为氮源，且具有较高的生物固氮活性，纯培养条件下平均固氮活性为25-80 μmol C2H2h-1mg-1鲜重。
2.4DNA的提取与纯化
方法参考东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》P409。
2.5nifH基因的扩增
采用固氮细菌的nifH基因通用引物PolF/PolR(参考Poly et al.，2001)进行PCR扩增：PolF： 5’-TGCGA(C/T)CC(G/C)AA(A/G)GC(C/G/T)GACTC-3’，PolR：5’-AT(G/C)GCCATCAT (C/T)TC(A/G)CCGGA-3’。
经过多次实验后建立了适宜的反应体系和反应条件。
取2μl PCR反应产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的PCR产物直接交与Invitrogen生物技术有 限公司用ABI Prism 3730 XL DNA分析系统测序。得到的nifH序列直接递交Genbank数据库，序列号为： EU707338。
2.616S rDNA全序列的扩增
采用细菌16S rDNA全序列通用引物16SF/16SR(Weisenburg et al.，1998)，16SF： 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16SR：5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，进行PCR扩增。 经过多次实验后建立了适宜的反应体系和反应条件如下：
取2μl PCR反应产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的PCR产物直接交与Invitrogen生物技术有 限公司用ABI Prism 3730 XL DNA分析系统测序。得到的16S rDNA序列直接递交Genbank数据库，序列 号为：EU707337。利用DNAMAN软件对测序结果进行同源性比较，利用BLAST软件将测定得到的基因 序列与GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行序列比对分析，获取相近典型菌株的16S rDNA基因 序列，然后利用BIOEDIT中的ClustalW对序列进行排列，利用Mega中的邻接法(Neighbor-Joining)建 立16S rDNA基因的系统发育树，进行系统发育分析，其中的遗传距离用Tamura-Nei公式计算，枝长代表 了分歧程度，各枝上的数字是1000次bootstrap重抽样分析的支持百分比。
2.7菌株制剂在土壤中的有效性试验
将该菌Bacillus sp.DZY-HS1接种到无氮Ashby液体培养基中，直至浓度为108cell/ml，待用。
采用2种红树植物-木榄和红海榄进行盆栽实验。每种红树10个平行样。外加对照。塑料盆放在 露天条件下，用已准备好的菌液浸泡红树根部3-4h后栽种入塑料盆。45天后测量各个指标。对比实 验指标为植物根、叶面积、植株重量、光合色素等。
结果如表2所示。
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