毒肽产生、植物中的肽表达和富含半胱氨酸的肽的组合
阅读：739发布：2020-09-22
专利汇可以提供毒肽产生、植物中的肽表达和富含半胱氨酸的肽的组合专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且新的杀虫蛋白、核苷酸、肽、其在 植物 中的表达、生产所述肽的方法、新的处置方法、生产技术、新的肽、新的制剂和新的 生物 、提高来自 酵母 表达系统的杀虫肽生产产量的方法。本 发明 还涉及并公开了 选定 的我们称为富含半胱 氨 酸的杀虫肽(CRIPS)的内毒素，其是来源于苏 云 金芽孢杆菌(Bt)的肽及其基因，以及内毒素与称为抑制物胱氨酸结(ICK)基因和肽的毒肽的组合、以及内毒素与其它类型的杀虫肽例如胰蛋白酶调节抑卵因子(TMOF)肽序列的组合，它们用于基因和肽两者的各种制剂和组合，用于控制昆虫。，下面是毒肽产生、植物中的肽表达和富含半胱氨酸的肽的组合专利的具体信息内容。
1.一种包含与富含半胱氨酸的杀虫蛋白(CRIP)例如抑制物半胱氨酸结(ICK)基序蛋白有效连接的内质网信号肽(ERSP)的蛋白质，其中所述ERSP是所述蛋白质(ERSP-ICK)的N端。
2.权利要求1的肽，其中所述ERSP是将表达的CRIP导向植物细胞的内质网的任何信号肽。
3.权利要求2的肽，其中所述CRIP是抑制物半胱氨酸结(ICK)蛋白。
4.权利要求2的肽，其中所述CRIP是非ICK蛋白。
5.权利要求2的肽，其中所述ERSP是来源于植物的长度为5-50个氨基酸的肽。
6.一种与翻译稳定性蛋白(STA)有效连接的权利要求1的肽，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，翻译稳定性蛋白(STA)可在任选为ICK基序蛋白(ERSP-STA-ICK)或非ICK基序蛋白(ERSP-STA-非ICK)的CRIP的N端一侧；或者在ICK或非ICK基序蛋白(ERSP-ICK-STA)或(ERSP-非ICK-STA)的C端一侧。
7.一种具有添加至已知肽并与所述已知肽有效连接的N端二肽的肽，其中所述N端二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成，其中所述肽选自CRIP (富含半胱氨酸的杀虫肽)，例如选自ICK肽或非ICK肽。
8.一种具有添加至已知肽并与所述已知肽有效连接的N端二肽的权利要求7的肽，其中所述N端二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成。
9.权利要求8的肽，其中所述来自N端二肽的N端氨基酸的非极性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。
10.权利要求8的肽，所述N端肽的C端氨基酸的极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸。
11.权利要求8的肽，其中所述来自N端二肽的N端氨基酸的非极性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，所述N端肽的C端氨基酸的极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸。
12.权利要求11的肽，其中所述二肽由甘氨酸-丝氨酸组成。
13.一种包含至少两种类型的杀虫蛋白或肽的组合物，其中一种类型是成孔杀虫蛋白(PFIP)，另一种类型是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)。
14.权利要求13的组合物，其中所述CRIP是ICK，任选所述ICK源自于或来源于Hadronyche versuta或布鲁山脉漏斗网蜘蛛、Atrax robustus、Atrax formidabilis、Atrax infensus，包括称为U-ACTX多肽、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b的毒素或突变体或变体。
15.权利要求14的组合物，其中所述CRIP是非ICK CRIP，任选所述非ICK CRIP源自于或来源于具有非ICK CRIPS的动物，例如海葵、海胆和海蛤蝓，任选包括名为Anemonia viridi 的海葵，任选包括名为Av2和Av3的肽，尤其类似于Av2和Av3的肽，包括序列表所列出的这类肽或突变体或变体。
16.一种使用权利要求13的组合物控制Bt抗性昆虫的方法，所述方法包括产生至少两种类型的肽的组合物，其中一种类型的肽是成孔杀虫蛋白(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自权利要求1和本文描述的任何组合物和序列表提供的任何蛋白质；然后将所述组合物施用于昆虫所在地。
17.一种包括保护植物免遭Bt抗性昆虫在内的控制Bt抗性昆虫的权利要求16的方法，所述方法包括产生表达至少两种正确折叠的肽的组合的植物，其中一种类型的肽是成孔杀虫蛋白(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自本文所述的任何组合物和选自序列表提供的任何蛋白质。
18.权利要求16的方法，其中在PFIP影响昆虫肠内衬期间的任何时间给予CRIP。
19.权利要求18的方法，其中在测试昆虫的Bt抗性后给予CRIP，且其中所述昆虫的Bt抗性测试为阳性。
20.将呈固体或液体形式的本文所述任何化合物施用于昆虫、昆虫所在地，或作为植物结合杀虫剂施用。
毒肽产生、植物中的肽表达和富含半胱氨酸的肽的组合
[0001] 相关申请的引用本申请是PCT申请，其要求早期在2012年3月9日提交的美国临时申请顺序号
61/608,921、2012年5月8日提交的美国临时申请顺序号61/644,212、2012年9月7日
提交的美国临时申请顺序号61/698,261和2012年11月26日的美国临时申请顺序号
61/729,905的权益，所述申请的完整内容通过引用结合到本文中。
发明领域
61/608,921、2012年5月8日提交的美国临时申请顺序号61/644,212、2012年9月7日
提交的美国临时申请顺序号61/698,261和2012年11月26日的美国临时申请顺序号
61/729,905的权益，所述申请的完整内容通过引用结合到本文中。
发明领域
[0002] 描述并要求保护新的杀虫蛋白、核苷酸、肽、其在植物中的表达、生产所述肽的方法、新的处置方法、生产技术、新的肽、新的制剂和产生比用于昆虫控制的相关肽所预期的更高产量的新的和已知生物体的组合。
[0003] 发明背景通过现代农业和园艺生产的食物的全球安全性受到虫害的挑战。农民依靠杀虫剂来抑
制虫害，然而由于从市场中清除危险化学物质以及对所有主要类别的化学和生物杀虫剂有抗性的昆虫品系的进化，农民可获得的对安全实用的杀虫剂的商业选择正在缩小。新的杀虫剂对农民维持作物保护是必需的。
制虫害，然而由于从市场中清除危险化学物质以及对所有主要类别的化学和生物杀虫剂有抗性的昆虫品系的进化，农民可获得的对安全实用的杀虫剂的商业选择正在缩小。新的杀虫剂对农民维持作物保护是必需的。
[0004] 杀虫肽是对其目标(通常为某种类型的昆虫或蜘蛛类动物)有毒的肽，所述肽常常可具有节肢动物起源，例如来源于蝎或蜘蛛。所述肽可递送到内部，例如通过注射将毒素直接递送到昆虫的肠或内部器官，或通过诱使昆虫从其食物中食入毒素，例如昆虫摄食转基因植物，和/或当通过将毒素散布在昆虫居住的场所将毒素递送给昆虫，或通过喷洒或其它方法将毒素递送至昆虫的环境，然后昆虫与所述肽有某种形式的接触时，所述肽可具有抑制生长、损害运动或甚至杀死昆虫的能力。
[0005] 然而，杀虫肽进入市场时有很大的问题，迄今很少(如有的话)杀虫肽获准并在市场上销售，只有一个著名的例外，即来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillis thuringiensis)或Bt的肽。目前在昆虫对Bt蛋白产生抗性方面存在顾虑。
[0006] Bt蛋白，或Bt肽，是以植物结合杀虫剂(plant incorporated protectant)和叶面喷撒两种形式用于作物保护的有效杀虫剂。Bt蛋白的商业制剂广泛用于控制幼虫期的昆虫。ICK肽包括具有杀虫活性的许多分子。所述ICK肽对天然存在的生物目标物种(通常为某种类型的昆虫或蜘蛛类动物)常常是有毒的。通常ICK肽可具有节肢动物起源，例如蝎或蜘蛛的毒液。Bt是一种并且是唯一的商用杀虫肽的来源生物。已鉴定出潜在的其它类别和类型的肽，例如胰蛋白酶调节抑卵因子(Trypsin modulating oostatic factor，TMOF)肽。TMOF肽以各种方式被递送到它们的生理作用部位，并且TMOF肽被鉴定为具有极大潜力的潜在杀幼虫剂，参见D. Borovsky，Journal of Experimental Biology 206，3869-3875，但像几乎所有的其它杀虫肽一样，TMOF未被商业化或未被农民广泛使用，并且有理由如此。
[0007] 具有可再现的肽形成和折叠，以合理和经济的价格，在商业规模上成功生产杀虫肽的能力可能受到挑战。杀虫肽种类繁多、性能独特且性质特殊，结合极其多种的生产技术，可提供肽应用和生产的众多方法，但很少(如有的话)是商业上成功的。
[0008] 为什么已鉴定的众多杀虫肽中如此少量已被推向市场有几个原因。第一，大多数杀虫肽足够脆弱或毒性不足而难以商用。第二，杀虫肽难以商业化生产且昂贵。第三，许多杀虫肽快速降解并且半寿期短。第四，当通过植物表达时，极少杀虫肽正确折叠，因此在遗传修饰生物体(GMO)中失去其毒性。第五，大多数已鉴定的杀虫肽当被昆虫采食时，在昆虫中的全身分布被阻断和/或丧失其毒性性质。Bt蛋白是最后这个问题的例外，并且因为它们扰乱昆虫摄食，因此被广泛使用。
[0009] 在此，我们提出对于阻碍杀虫肽的商业化和广泛使用的这些主要问题的几个解决方法。在第一部分中，我们描述了如何产生允许植物产生和表达保持对昆虫的毒性的正确折叠的杀虫肽的特殊表达盒和系统。
[0010] 在第二部分中，我们描述了如何对肽的组成产生相对小的改变，并如此进行以显著提高可通过发酵生产的速率和量。该处置方法还同时降低商业化工业肽生产的成本。该部分教导了如何可将蛋白质“转化”成不同的更有成本效益的肽，所述肽可以更高产量生产，并且出人意料地仍具有与转化前恰好一样的毒性。在第三和最后的部分中，我们描述了如何将不同类别的杀虫肽组合在一起，使得它们可以协同方式一起运作以显著改变并提高与其各个组分相比时组分肽的毒性和活性。该部分还提供支持我们的系统、方法和肽组合和制剂的详细资料和数据以应付正在逼近的Bt抗性昆虫的发生和散布的威胁。Bt抗性昆虫代表了下一个对全球食物供应的巨大威胁，我们教导本领域技术人员如何迎接和战胜这种威胁。
[0011] 发明概述本发明描述了如何在植物中产生毒性杀虫肽，因此当它们通过植物表达时正确折叠。
本发明描述了如何使用各种载体在实验室和商业生产环境中生产高产量的肽。本发明描
述了一个类别的毒性杀虫肽，我们称为CRIPS，其表示富含半胱氨酸的杀虫肽(Cysteine Rich Insecticidal Peptides，CRIPS)。本发明描述了另一个类别的毒性杀虫肽，我们称为PFIPS，其表示成孔杀虫蛋白(Pore Forming Insecticidal Proteins，PFIPS)。本发明描述了如何可将CRIPS和PFIPS的新的协同组合制备在一起并用于各种目的，包括保护作物
免遭Bt或苏云金芽孢杆菌肽抗性昆虫。我们公开了如何制备和使用CRIPS和PFIPS的组
合以非常低的剂量杀死和控制昆虫，甚至Bt抗性昆虫。虽然不受理论约束，但是我们对Bt或苏云金芽孢杆菌肽和蛋白质的理解，可供我们教导本领域的普通技术人员建立保护植物和控制昆虫的新的方法、组合物、化合物(蛋白质和肽)和程序。
本发明描述了如何使用各种载体在实验室和商业生产环境中生产高产量的肽。本发明描
述了一个类别的毒性杀虫肽，我们称为CRIPS，其表示富含半胱氨酸的杀虫肽(Cysteine Rich Insecticidal Peptides，CRIPS)。本发明描述了另一个类别的毒性杀虫肽，我们称为PFIPS，其表示成孔杀虫蛋白(Pore Forming Insecticidal Proteins，PFIPS)。本发明描述了如何可将CRIPS和PFIPS的新的协同组合制备在一起并用于各种目的，包括保护作物
免遭Bt或苏云金芽孢杆菌肽抗性昆虫。我们公开了如何制备和使用CRIPS和PFIPS的组
合以非常低的剂量杀死和控制昆虫，甚至Bt抗性昆虫。虽然不受理论约束，但是我们对Bt或苏云金芽孢杆菌肽和蛋白质的理解，可供我们教导本领域的普通技术人员建立保护植物和控制昆虫的新的方法、组合物、化合物(蛋白质和肽)和程序。
[0012] 我们描述并要求保护包含与富含半胱氨酸的杀虫蛋白(CRIP) (例如抑制物半胱氨酸结(Inhibitor Cysteine Knot，ICK)基序蛋白)有效连接的内质网信号肽(ERSP)的
蛋白质，其中所述ERSP是所述蛋白质(ERSP-ICK)的N端。一种肽，其中所述ERSP是将表
达的CRIP导向植物细胞的内质网的任何信号肽。一种肽，其中所述CRIP是抑制物半胱氨
酸结(ICK)蛋白。一种肽，其中所述CRIP是非ICK蛋白。一种肽，其中所述ERSP是来源于
植物的长度为5-50个氨基酸的肽。一种与翻译稳定性蛋白(Translational Stabilizing Protein，STA)有效连接的肽，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，翻译稳定性蛋白(STA)可在CRIP的N端一侧，所述CRIP任选为ICK基序蛋白(ERSP-STA-ICK)或非ICK基序蛋白
(ERSP-STA-非ICK)；或在ICK或非ICK基序蛋白的C端一侧(ERSP-ICK-STA)或(ERSP-非
ICK-STA)。
蛋白质，其中所述ERSP是所述蛋白质(ERSP-ICK)的N端。一种肽，其中所述ERSP是将表
达的CRIP导向植物细胞的内质网的任何信号肽。一种肽，其中所述CRIP是抑制物半胱氨
酸结(ICK)蛋白。一种肽，其中所述CRIP是非ICK蛋白。一种肽，其中所述ERSP是来源于
植物的长度为5-50个氨基酸的肽。一种与翻译稳定性蛋白(Translational Stabilizing Protein，STA)有效连接的肽，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，翻译稳定性蛋白(STA)可在CRIP的N端一侧，所述CRIP任选为ICK基序蛋白(ERSP-STA-ICK)或非ICK基序蛋白
(ERSP-STA-非ICK)；或在ICK或非ICK基序蛋白的C端一侧(ERSP-ICK-STA)或(ERSP-非
ICK-STA)。
[0013] 我们描述并要求保护具有添加至已知肽并与所述已知肽有效连接的N端二肽的肽，其中所述N端二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成，其中所述肽选自CRIP (富含半胱氨酸的杀虫肽)，例如选自ICK肽或非ICK肽。一种具有
添加至已知肽并与所述已知肽有效连接的N端二肽的肽，其中N端二肽由二肽N端的一个
非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成。一种肽，其中来自N端二肽的N端氨基
酸的非极性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。一种肽，其中N端肽的C端氨基酸的极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸。权利要求8的肽，其中N端二肽的N端氨基酸的非极性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸且N端肽的C端氨基酸的所述极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸。一种肽，其中所述二肽由甘氨酸-丝氨酸组成。
添加至已知肽并与所述已知肽有效连接的N端二肽的肽，其中N端二肽由二肽N端的一个
非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成。一种肽，其中来自N端二肽的N端氨基
酸的非极性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。一种肽，其中N端肽的C端氨基酸的极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸。权利要求8的肽，其中N端二肽的N端氨基酸的非极性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸且N端肽的C端氨基酸的所述极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸。一种肽，其中所述二肽由甘氨酸-丝氨酸组成。
[0014] 我们描述了包含至少两种类型的杀虫蛋白或肽的组合物，其中一种类型是成孔杀虫蛋白(PFIP)，另一种类型是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)。一种组合物，其中CRIP
是ICK，任选所述ICK源自于或来源于Hadronyche versuta或布鲁山脉漏斗网蜘蛛(Blue
Mountain funnel web spider)、Atrax robustus、Atrax formidabilis、Atrax infensus，包括称为U-ACTX多肽的毒素U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b或突变体或变体。
一种组合物，其中CRIP是非ICK CRIP，任选所述非ICK CRIP源自于或来源于具有非ICK
CRIPS的动物例如海葵、海胆和海蛤蝓，任选包括名为Anemonia viridi 的海葵，任选包括名为Av2和Av3的肽，尤其类似于Av2和Av3的肽，包括序列表所列出的这类肽或突变体或
变体。
是ICK，任选所述ICK源自于或来源于Hadronyche versuta或布鲁山脉漏斗网蜘蛛(Blue
Mountain funnel web spider)、Atrax robustus、Atrax formidabilis、Atrax infensus，包括称为U-ACTX多肽的毒素U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b或突变体或变体。
一种组合物，其中CRIP是非ICK CRIP，任选所述非ICK CRIP源自于或来源于具有非ICK
CRIPS的动物例如海葵、海胆和海蛤蝓，任选包括名为Anemonia viridi 的海葵，任选包括名为Av2和Av3的肽，尤其类似于Av2和Av3的肽，包括序列表所列出的这类肽或突变体或
变体。
[0015] 我们描述了使用权利要求13的组合物控制Bt抗性昆虫的方法，所述方法包括产生至少两种类型的肽的组合物，其中一种类型的肽是成孔杀虫蛋白(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自权利要求1和本文描述的任
何组合物和序列表提供的任何蛋白质；然后将所述组合物施用于昆虫所在地。一种控制Bt抗性昆虫包括保护植物免遭Bt抗性昆虫的方法，所述方法包括产生表达至少两种正确折
叠的肽的组合的植物，其中一种类型的肽是成孔杀虫蛋白(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自本文所述任何组合物和选自序列表提
供的任何蛋白质。一种方法，其中在PFIP影响昆虫肠内衬期间的任何时间给予CRIP。一种方法，其中在测试昆虫的Bt抗性后给予CRIP，且其中所述昆虫Bt抗性测试为阳性。我们描述了将呈固体或液体形式的本文所述任何化合物施用于昆虫、昆虫所在地，或作为植物结合杀虫剂施用。
何组合物和序列表提供的任何蛋白质；然后将所述组合物施用于昆虫所在地。一种控制Bt抗性昆虫包括保护植物免遭Bt抗性昆虫的方法，所述方法包括产生表达至少两种正确折
叠的肽的组合的植物，其中一种类型的肽是成孔杀虫蛋白(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自本文所述任何组合物和选自序列表提
供的任何蛋白质。一种方法，其中在PFIP影响昆虫肠内衬期间的任何时间给予CRIP。一种方法，其中在测试昆虫的Bt抗性后给予CRIP，且其中所述昆虫Bt抗性测试为阳性。我们描述了将呈固体或液体形式的本文所述任何化合物施用于昆虫、昆虫所在地，或作为植物结合杀虫剂施用。
[0018] 图3是发明的ERSP (对角条纹)与CRIP基序(垂直条纹)融合的N端融合物的示图，所述CRIP基序与用水平条纹表示的翻译稳定性蛋白(STA)融合。通过称为间插接头肽(LINKER) (以方格图案表示)的间插序列将STA与CRIP基序分隔。图3中显示两种可
能的方向。
能的方向。
[0019] 图4是类似于图3的示图，具有下标字母“N”的(LINKER-CRIP)基序表明LINKER-CRIP基序可使用一次或重复数次，优选1-10个重复序列，有可能甚至更多达15、20或25次。
[0020] 图5是显示CRIP-LINKER或ICK-LINKER组还可起STA-LINKER组的作用的示图。换句话说，CRIP-LINKER或ICK-LINKER的组合可起STA-LINKER的作用。换句话说，可以使用两个ICK基序与一个LINKER，并省去翻译稳定性蛋白或STA的需要。
[0021] 图6是抑制物半胱氨酸结(ICK)基序蛋白中半胱氨酸共价交联的示图。图中的箭头表示β片层；数字表示形成ICK基序的胱氨酸氨基酸，按其在一级结构中从N到C端
出现的顺序编号。粗曲线表示蛋白质的一级结构；细直线表示特定半胱氨酸共价交联产生ICK基序。有时包含半胱氨酸2号的β片层不存在。
出现的顺序编号。粗曲线表示蛋白质的一级结构；细直线表示特定半胱氨酸共价交联产生ICK基序。有时包含半胱氨酸2号的β片层不存在。
[0022] 图7是ACTX的ELISA检测水平(作为总可溶性蛋白的百分比(%TSP))的示图，所述ACTX作为与不同的其它结构元件的翻译融合物自编码ACTX的植物转基因的表达产生。
[0024] 图9是使用编码具有以下3种不同ERSP序列的翻译融合物的FECT表达载体，烟草叶瞬时表达GFP融合的U-ACTX-Hv1a的iELISA检测的%TSP图：BAAS信号肽(BGIH)、伸
展蛋白信号肽(EGIH)和修饰的伸展蛋白信号肽(E*GIH)。
展蛋白信号肽(EGIH)和修饰的伸展蛋白信号肽(E*GIH)。
[0025] 图10是从瞬时转化的烟草叶提取的胰蛋白酶处理和非胰蛋白酶处理的Jun a 3融合的ω-ACTX-Hv1a蛋白的浓缩过程的示图。
[0026] 图11是含ω-ACTX-Hv1a样品的HPLC色谱图。如下将样品加载到HPLC系统中以产生色谱图：A. 25 µg合成的ω-ACTX-Hv1a；B. 500 µL的样品B 1 kD过滤截留物；C.
500 µL的样品A 1 kD过滤截留物。
500 µL的样品A 1 kD过滤截留物。
[0027] 图12是在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis, K. lactis)菌株中产生的U+2-ACTX-Hv1a (本文有时亦称“U+2”)和天然U-ACTX-Hv1a (本文有时亦称“天然U”)
两者的归一化肽产量的分布图。U+2数据用黑色表示，天然U数据用灰色表示。x轴表示归一化产量，单位为在600 nm波长处的毫克/升/光吸收单位(mg/L.A.)。左边y刻度表示
U+2菌株的分数。右边y刻度天然U菌株的分数。
两者的归一化肽产量的分布图。U+2数据用黑色表示，天然U数据用灰色表示。x轴表示归一化产量，单位为在600 nm波长处的毫克/升/光吸收单位(mg/L.A.)。左边y刻度表示
U+2菌株的分数。右边y刻度天然U菌株的分数。
[0028] 图13是来自U+2和天然U-ACTX-Hv1a乳酸克鲁维酵母菌株的归一化肽产量的分布图。此处y轴表示各菌株的归一化产量(针对下述相应培养物中的细胞密度归一化)，单位为以600 nm波长处的毫克/升/光吸收单位(mg/L.A.)，x轴相当于所观察到的各菌株
产量相对于针对经工程改造产生相同肽同种型的所有其它乳酸克鲁维酵母菌株所观察到
的产量的百分等级。
产量相对于针对经工程改造产生相同肽同种型的所有其它乳酸克鲁维酵母菌株所观察到
的产量的百分等级。
[0029] 图14是用U+2和天然U-ACTX-Hv1a的家蝇注射生物测定的剂量反应图。U+2数据用黑色圆点标示，天然U数据用灰色三角标示。x刻度表示以微微摩尔/克家蝇为单位的剂量。y刻度表示死亡百分比。
[0030] 图15是自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris，P. pastoris)菌株生产的U+2和天然U-ACTX-Hv1a的肽产量的分布图。U+2数据用黑色表示，天然U数据用灰色表示。x轴
表示单位为毫克/升的产量，y刻度表示自巴斯德毕赤酵母菌株生产的总U+2或天然U的
分数。
表示单位为毫克/升的产量，y刻度表示自巴斯德毕赤酵母菌株生产的总U+2或天然U的
分数。
[0031] 图16是另一个自巴斯德毕赤酵母菌株生产的U+2和天然U-ACTX-Hv1a的肽产量的分布图。此处y轴表示各菌株的单位为毫克/升的产量，x轴相当于所观察到的各菌株
产量的百分等级(相对于针对经工程改造以生产相同肽同种型的所有其它巴斯德毕赤酵
母菌株所观察到的产量)。
产量的百分等级(相对于针对经工程改造以生产相同肽同种型的所有其它巴斯德毕赤酵
母菌株所观察到的产量)。
[0032] 图17是自乳酸克鲁维酵母表达菌株产生的海葵毒素Av3和Av3+2的肽产量的分布图。来自名为Anemonia viridi的海葵的天然毒素称为Av3。修饰毒素在此处标示为Av3 + 2。像上述实例一样，我们在乳酸克鲁维酵母菌株中产生毒肽。x轴表示单位为mAu.sec/A的各菌株的肽产量，y轴表示菌株的分数。图17中，天然Av3菌株用浅灰色表示，修饰的高产量菌株Av3 +2用黑色表示。
[0033] 图18表示通过以生产相同肽的转化体的百分等级为函数对肽产量作图，自相应乳酸克鲁维酵母菌株生产的Av3+2和天然Av3的肽产量的差异。此处y轴表示各菌株的归
一化产量，单位为mAu.sec/A，x轴相当于所观察到的各菌株产量相对于针对经工程改造产生相同肽同种型的所有其它乳酸克鲁维酵母菌株所观察到的产量的百分等级。
一化产量，单位为mAu.sec/A，x轴相当于所观察到的各菌株产量相对于针对经工程改造产生相同肽同种型的所有其它乳酸克鲁维酵母菌株所观察到的产量的百分等级。
[0034] 图19在施用和暴露于ICK肽或Bt蛋白后叶生物测定24小时百分比死亡率相对于虫龄的示图。
[0035] 图20在对72小时幼虫使用Bt蛋白或ICK肽或Bt + ICK肽的组合施用后18、24和48小时，测量百分比死亡率的叶生物测定的示图。
[0036] 图21在暴露于Bt蛋白或非ICK CRIP或其组合后24小时和48小时，测量由Bt抗性昆虫引起的叶片损伤的食叶生物测定的示图。
[0037] 图22在对Bt蛋白抗性小菜蛾(P. xylostella)幼虫使用Bt蛋白或ICK肽或其组合施用后24和48小时，测量百分比死亡率的食叶生物测定的示图。
[0038] 序列表简述本发明包括1593个序列的序列表。
[0039] 在第1部分提到或提及SEQ ID NO: 1-28、1553-1570和1593。
[0040] 在第2部分提到或提及SEQ ID NO: 29-32和1571-1592。
[0041] 在第3部分提到或提及SEQ ID NO: 33-1042。
[0042] SEQ ID NO: 1043-1221是来源于或具有蜘蛛源的序列。
[0043] SEQ ID NO: 1222-1262是来源于或具有海葵源的序列。
[0044] SEQ ID NO: 1263-1336是来源于或具有蝎源的序列。
[0045] SEQ ID NO: 1337-1365是来源于或具有蝎源的序列。
[0046] SEQ ID NO: 1366-1446是来源于或具有Cry或Cyt源的序列。
[0047] SEQ ID NO: 1447-1552是来源于或具有VIP源的序列。
[0048] 发明详述定义
“ACTX”或“ACTX肽”意指自属于Atracinae亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛分离的杀虫
ICK肽家族。一种这样的蜘蛛称为澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛，其学名为Hydronyche
versuta。来自该种的ACTX肽的两个实例是ω肽和U肽。
“ACTX”或“ACTX肽”意指自属于Atracinae亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛分离的杀虫
ICK肽家族。一种这样的蜘蛛称为澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛，其学名为Hydronyche
versuta。来自该种的ACTX肽的两个实例是ω肽和U肽。
[0049] “农杆菌感染法(agroinfection)”意指其中通过使用农杆菌属(Agrobacteria)根癌农杆菌(A.tumefaciens)或发根农杆菌(A.rhizogenes)，将DNA导入植物细胞中的植物转化方法。
[0051] “二元载体”或“二元表达载体”意指可在大肠杆菌(E.coli)菌株和农杆菌属(Agrobacterium)菌株两者中自我复制的表达载体。此外，载体含有被左和右边界序列置于中间的DNA区(常常称为t-DNA)，所述边界序列被待拷贝并被农杆菌递送至植物细胞中的
毒力基因识别。
毒力基因识别。
[0052] “Bt”亦称苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis 或B.thuringiensis)，意指在全世界范围内已使用60多年以控制农业、林业和公共健康虫害的革兰氏阳性土壤细菌。
[0053] “Bt蛋白”和“Bt肽”在此是指同一物，这些是由Bt产生的肽。所述肽常被写为“cry”、“cyt”或“VIP”蛋白，由cry、cyt和vip 基因编码。Bt蛋白更常被认为是由cry 基因编码的杀虫晶体蛋白。Bt蛋白是PFIPS (成孔杀虫蛋白)的实例，参见下文定义。序列表提供了实例PFIPS和其它Bt蛋白。
[0054] “嵌合基因”意指编码来源于一个或多个编码序列的部分的基因以产生新基因的DNA序列。
[0055] “可切割接头”意指是蛋白酶(可将蛋白质裂解并分成两部分)的靶位点的蛋白质中的短肽序列或被置于ORF的读框中并编码是蛋白酶(可将蛋白质裂解并分成两部分)的靶位点的蛋白质中的短肽序列的短DNA序列。
[0056] “条件培养基”意指已被细胞利用并且富含来源于细胞的物质但不含细胞的细胞培养基。
[0057] “转化”或“转化的”是指制备HP肽的过程。
[0058] “CRIP”和“CRIPS”是一种或多种富含半胱氨酸的杀虫蛋白的缩略语。富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIPS)富含形成二硫键的半胱氨酸的肽。在具有至少10个氨基酸的蛋白质或肽中，CRIPS含有至少四(4)个、有时六(6)个和有时八(8)个半胱氨酸氨基酸，其中
半胱氨酸形成两(2)、三(3)或四(4)个二硫键。二硫键有助于杀虫肽的折叠、三维结构和活性。它们形成的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键和三维结构在这些杀虫肽的毒性中起重要作用。CRIP的实例为抑制性半胱氨酸结或ICK肽(通常具有6-8个半胱氨酸)和具有二硫
键但不被视为ICK肽的毒肽(非ICK CRIPS)两者。ICK的实例可为来自蜘蛛和上文定义
的ACTX肽。非ICK CRIP的实例可为像Av2和Av3 (其是最早从海葵中鉴定的肽)的肽。
这些肽是调节昆虫外周神经系统(PNS)中的钠通道的一类化合物的实例。非ICK CRIPS可
具有形成2-4个二硫键的4-8个半胱氨酸。这些半胱氨酸-半胱氨酸二硫键稳定的毒肽
(CRIPS)当暴露于环境时可具有显著的稳定性。许多CRIPS自分泌毒液的动物(例如蜘蛛、蝎、蛇和海螺和海葵)中分离，并且它们对昆虫是有毒的。下面提供其它描述。
半胱氨酸形成两(2)、三(3)或四(4)个二硫键。二硫键有助于杀虫肽的折叠、三维结构和活性。它们形成的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键和三维结构在这些杀虫肽的毒性中起重要作用。CRIP的实例为抑制性半胱氨酸结或ICK肽(通常具有6-8个半胱氨酸)和具有二硫
键但不被视为ICK肽的毒肽(非ICK CRIPS)两者。ICK的实例可为来自蜘蛛和上文定义
的ACTX肽。非ICK CRIP的实例可为像Av2和Av3 (其是最早从海葵中鉴定的肽)的肽。
这些肽是调节昆虫外周神经系统(PNS)中的钠通道的一类化合物的实例。非ICK CRIPS可
具有形成2-4个二硫键的4-8个半胱氨酸。这些半胱氨酸-半胱氨酸二硫键稳定的毒肽
(CRIPS)当暴露于环境时可具有显著的稳定性。许多CRIPS自分泌毒液的动物(例如蜘蛛、蝎、蛇和海螺和海葵)中分离，并且它们对昆虫是有毒的。下面提供其它描述。
[0059] “确定成分培养基”意指由已知化学组分组成但不含未加工的蛋白质性提取物或副产物(例如酵母提取物或蛋白胨)的培养基。
[0060] “二硫键”意指通过两个半胱氨酸氨基酸侧链的两个巯基的偶联得到的两个半胱氨酸间的共价键。
[0061] “双重转基因肽表达载体”或“双重转基因表达载体”意指含有2拷贝的杀虫肽表达盒的酵母表达载体。
[0062] “ELISA”或“iELISA”意指其中将样品固定在板的表面，然后如下检测的分子生物学方案：施加第一抗体，接着施加与酶缀合的第二抗体，所述酶将无色底物转化成可在样品中检出或定量的有色底物。在该方案过程中，洗去抗体，使得仅保留与其表位结合的抗体用于检测。我们手中的样品是自植物分离的蛋白质，ELISA允许定量测定回收的已表达的转基因蛋白的量。
[0063] “表达ORF”意指编码蛋白质复合物的核苷酸，并限定为ORF中的核苷酸。
[0064] “ER”或“内质网”是所有真核生物共有的亚细胞器，其中发生某些翻译后修饰过程。
[0065] “ERSP”或“内质网信号肽”是在转基因mRNA分子的蛋白质翻译期间被宿主细胞信号识别颗粒识别并结合的氨基酸N端序列，其使蛋白质翻译核糖体/mRNA复合物移动至胞质的ER中。结果是蛋白质翻译暂停，直到它与ER相接，在其中翻译继续，所得蛋白质被注入ER中。
[0066] “ersp”意指编码肽ERSP的核苷酸。
[0067] “ER运输”意指细胞表达的蛋白质运送到ER中用于翻译后修饰、分选和转运。
[0068] “FECT”意指使用剔除外被蛋白基因和三基因框(triple gene block)的狐尾草花叶病毒的瞬时植物表达系统。
[0069] “GFP”意指来自水母维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白。它是翻译稳定性蛋白的实例。
[0070] “高产肽”或“HP肽”意指按照本文所述程序能够生产或“转化”且一旦转化，可在生物系统中以高的产量或较高生产率或大于常量生产的肽。较高的生产率可为采用转化前用来生产肽的相同或类似生产方法，用转化前的肽可达到生产率的20-400%或更大。
[0071] “杂合肽”，亦称“杂合毒素”，亦称“杂合-ACTX-Hv1a”，亦称“天然杂合 ACTX-Hv1a”以及“U肽”，亦称“U毒素”，亦称“天然U”，亦称“U-ACTX-Hv1a”，亦称“天然U-ACTX-Hv1a”全是指ACTX肽，其是在称为澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛Hydronyche versuta的蜘蛛中2+ +
发现的，是昆虫电压门控Ca 通道和电压门控K 通道的双重拮抗剂。
发现的，是昆虫电压门控Ca 通道和电压门控K 通道的双重拮抗剂。
[0072] “IGER”意指一种短肽的名称，基于其一字母代码的实际序列。它是间插接头的实例。
[0073] “ICK基序”、“ICK基序蛋白”、“抑制物胱氨酸结基序”、“毒性昆虫ICK肽”、“ICK肽”、“CK”肽”、“胱氨酸结基序”或“胱氨酸结肽”意指16-60个含至少6个半-胱氨酸核心氨基酸、具有3个二硫桥的氨基酸肽，其中3个二硫桥是共价键，6个半-胱氨酸残基中的共价二硫键介于自N端氨基酸开始的6个核心半-胱氨酸氨基酸的第一和第四、第二和第五及第三和第六个半-胱氨酸之间。这种类型的肽一般包含β-发夹二级结构，通常由位于
基序的第四和第六个核心半-胱氨酸之间的残基组成，发夹通过由基序的3个二硫键提供
的结构交联而被稳定。注意其它的半胱氨酸/胱氨酸或半-胱氨酸氨基酸可存在于抑制物
胱氨酸结基序内。序列表中提供了实例。
基序的第四和第六个核心半-胱氨酸之间的残基组成，发夹通过由基序的3个二硫键提供
的结构交联而被稳定。注意其它的半胱氨酸/胱氨酸或半-胱氨酸氨基酸可存在于抑制物
胱氨酸结基序内。序列表中提供了实例。
[0074] “ick”意指编码ICK基序蛋白的核苷酸。
[0075] “ICK基序蛋白表达ORF”或“表达ORF”意指编码ICK基序蛋白复合物的核苷酸，并限定为ORF中的核苷酸。
[0076] “ICK基序蛋白表达载体”或“ICK表达载体”或“ICK基序表达载体”意指含有表达ORF的二元载体。二元载体还含有表达ORF周围必要的转录启动子和终止子序列以促进其编码的ORF和蛋白质表达。
[0077] “昆虫”意指任何节肢动物和线虫，包括螨、已知侵染所有作物、蔬菜和乔木的昆虫，包括在林业、园艺和农业领域被视为有害生物的昆虫。可用本文公开的方法保护的具体作物的实例为大豆、玉米、棉、苜蓿和蔬菜作物。具体作物和昆虫列表出现本文件结束时。
[0079] “昆虫血淋巴环境”意指存在于昆虫或昆虫幼虫内的特定pH和蛋白水解酶条件。
[0080] “杀虫活性”意指在昆虫暴露于化合物或肽的时候或之后，昆虫死亡，停止或减慢其运动或其摄食，停止或减慢其生长，不能化蛹，无法生殖或无法生产能育后代。
[0081] “杀虫肽”或“杀虫蛋白”或“毒肽”或“毒蛋白”意指当被昆虫食入、与昆虫接触或注入昆虫时具有杀虫活性的蛋白质。
[0082] “杀虫肽生产菌株筛选”意指从较低产的菌株鉴定出较高产的杀虫肽生产酵母菌株的筛选过程。在本文所述方法中，它是指利用反向HPLC或家蝇注射生物测定的筛选。
[0083] “整合表达载体或整合载体”意指本身可插入酵母细胞基因组的特定基因座并稳定地变成酵母基因组的一部分的酵母表达载体。
[0084] “间插接头”意指蛋白质中将所述蛋白质分隔成不同部分的短肽序列，或被置于ORF的读框中以将上游和下游DNA序列分隔的短DNA序列，使得在蛋白质翻译期间DNA中编码的蛋白质可实现其独立的二级和三级结构形成。在植物细胞环境中、在昆虫和/或鳞翅类肠环境中和在昆虫血淋巴和鳞翅类血淋巴环境中，间插接头可以是抗切割的或是易被切割的。
[0085] “已知肽”意指已知具有生物活性的肽，且其可以是成熟肽或其任何形式或片段，包括前肽和肽原(pro peptide)及活性肽的缀合物。优选的已知肽是具有杀虫活性的肽。
[0086] “L”在适当的上下文中意指连接翻译稳定性蛋白与ICK基序蛋白或多个ICK基序蛋白结构域的间插接头肽，和连接相同或不同的多个ICK基序蛋白的间插接头肽。当提及氨基酸时，“L”也可指亮氨酸。
[0087] “接头、LINKER”或在某些情况下“L”意指连接翻译稳定性蛋白与ICK基序蛋白或多个ICK基序蛋白结构域的间插接头肽，和连接相同或不同的多个ICK基序蛋白的间插接头肽。接头可具有以下(至少) 3个作用之一：在昆虫肠环境中裂解、在植物细胞中裂解或设计成不刻意裂解。
[0088] “l”或接头”意指编码间插接头肽的核苷酸。
[0089] “鳞翅类肠环境”意指存在于鳞翅类昆虫或幼虫的前肠、中肠或后肠内的特定pH和蛋白水解酶条件。
[0090] “鳞翅类血淋巴环境”意指存在于鳞翅类昆虫或幼虫内的特定pH和蛋白水解酶条件。
[0091] “多个ICK基序蛋白结构域”意指由被多个间插接头肽连接的多个ICK基序蛋白组成的蛋白质。多个ICK基序蛋白结构域中的ICK基序蛋白可以是相同的或不同的，且该结构域中的间插接头肽也可以是相同的或不同的。
[0092] “非ICK CRIPS”可具有4-8个形成2-4个二硫键的半胱氨酸。非ICK肽包括不是ICK肽的胱氨酸结肽。非ICK肽可具有与ICK不同的胱氨酸键的连接顺序。非ICK CRIP的
实例是像Av2和Av3 (其是最早从海葵中鉴定的肽)一样的肽。这些海葵肽是调节昆虫外
周神经系统(PNS)的钠通道的一类化合物的实例。
实例是像Av2和Av3 (其是最早从海葵中鉴定的肽)一样的肽。这些海葵肽是调节昆虫外
周神经系统(PNS)的钠通道的一类化合物的实例。
[0093] “非极性氨基酸”是弱疏水性的氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。甘氨酸或gly是用于本发明二肽的最优选的非极性氨基酸。
[0094] “归一化肽产量”意指条件培养基中的肽产量除以在测量肽产量的时间点上的相应的细胞密度。肽产量可用体积单位中所产生的肽的质量表示，例如mg/升或mg/L，或用HPLC色谱仪中所产生的肽的UV吸光度峰面积表示，例如mAu.sec。细胞密度可用在600 nm波长处培养物的可见光吸光度(OD600)表示。
[0095] “一字母代码”意指以其一字母代码列出以辨别蛋白质一级结构中不同氨基酸的肽序列。丙氨酸=A，精氨酸=R，天冬酰胺=N，天冬氨酸=D，天冬酰胺或天冬氨酸=B，半胱氨酸=C，谷氨酸=E，谷氨酰胺=Q，谷氨酰胺或谷氨酸=Z，甘氨酸=G，组氨酸=H，异亮氨酸=I，亮氨酸=L，赖氨酸=K，甲硫氨酸=M，苯丙氨酸=F，脯氨酸=P，丝氨酸=S，苏氨酸=T，色氨酸=W，酪氨酸=Y，缬氨酸=V。
[0096] “ω肽”，亦称“ω毒素”，亦称“ω-ACTX-Hv1a”，亦称“天然ω -ACTX-Hv1a”全是指最早从称为澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛Hydronyche versuta的蜘蛛中分离的，且是昆虫2+
电压门控Ca 通道的拮抗剂的ACTX肽。
电压门控Ca 通道的拮抗剂的ACTX肽。
[0097] “ORF”或“开放阅读框”或“肽表达ORF”意指编码始于ATG起始密码子并终于TGA、TAA或TAG终止密码子的蛋白质的DNA序列。ORF也可指DNA编码的翻译的蛋白质。
[0098] “有效连接”意指两个邻接DNA序列放置在一起使得一个的转录活性可作用于另一个。
[0099] “PEP”意指植物表达的肽。
[0100] “肽表达盒”或“表达盒”意指由在生物表达系统中完成杀虫肽转录所必需的全部DNA元件组成的DNA序列。在本文所述方法中，它包括转录启动子、编码α-交配因子信号序列和Kex 2切割位点的DNA序列、杀虫肽转基因、终止密码子和转录终止子。
[0101] “肽表达载体”意指含有异源杀虫肽转基因的宿主生物表达载体。
[0102] “肽表达酵母菌株”、“肽表达菌株”或“肽生产菌株”意指可产生异源杀虫肽的酵母菌株。
[0103] “特殊制备的肽”意指之前自生物表达系统具有低肽产量并因使用本文所述用于提高肽产量的方法而变成HP肽的肽。
[0104] “肽转基因”或“杀虫肽转基因”意指编码杀虫肽并且可在生物表达系统翻译的DNA序列。
[0105] “肽产量”意指从肽表达酵母菌株的细胞中产生的条件培养基中的杀虫肽浓度。它可用体积单位中所产生的肽的质量表示，例如mg/升或mg/L，或用HPLC色谱仪中所产生的肽的UV吸光度峰面积表示，例如mAu.sec。
[0106] “围食膜”意指截留大的食物颗粒的昆虫肠内的内衬可有助于所述食物颗粒运动通过肠，同时允许消化，并且还保护肠壁。
[0107] “PFIP”意指可在内衬昆虫肠的细胞(例如肠上皮细胞)中形成孔或通道的蛋白质。PFIPS的实例为Bt蛋白例如cry、crt和VIP，其它PFIP实例可见于序列表。
[0108] “PIP”或“植物结合杀虫剂”意指由转基因植物产生的杀虫蛋白和植物产生所述蛋白质所必需的遗传物质。
[0109] “植物可切割接头”意指可切割的接头肽，或编码可切割的接头肽的核苷酸，其含有植物蛋白酶识别位点，并且可在植物细胞中在蛋白质表达过程期间被切割。
[0110] “植物再生培养基”意指这样的任何培养基，其含有植物生长的必需元素和维生素及促进细胞再生为可发芽并生成源于组织培养的小植株的胚所必需的植物激素。所述培养基常常含有选择剂，转基因细胞表达针对所述选择剂赋予所述选择剂抗性的选择基因。
[0111] “植物转基因蛋白”意指在编码所述蛋白质的DNA或RNA被递送至一个或多个植物细胞后在植物中表达的来自异源物种的蛋白质。
[0112] “极性氨基酸”是极性的氨基酸，包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸和酪氨酸；优选的极性氨基酸为丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；其中丝氨酸为最优选的。
[0113] “转录后基因沉默”或“PTGS”意指活细胞内抑制基因表达的细胞过程。
[0114] 在本文件中，“蛋白质”具有与“肽”相同的含义。
[0115] “重组载体”意指外源DNA插入其中的DNA质粒载体。
[0116] “选择基因”意指赋予基因组修饰的生物在选择压力下生长的优势的基因。
[0117] “STA”，或“翻译稳定性蛋白”，或“稳定性蛋白”，或“融合蛋白”意指具有可在细胞中蓄积而又不作为蛋白质降解的细胞过程的目标的充足三级结构的蛋白质。蛋白质可介于5和50aa (例如另一种ICK基序蛋白)、50-250aa (GNA)、250-750aa (例如几丁质酶)和
750-1500aa (例如增强蛋白)之间。翻译稳定性蛋白由ORF中与编码杀虫蛋白的序列融合
在框中的蛋白质的DNA序列编码。融合蛋白可在杀虫蛋白的上游或下游，并且在两个序列间可具有任何间插序列，只要间插序列不导致任一DNA序列的移码。翻译稳定性蛋白还可具有增加ICK基序蛋白跨肠壁递送并进入昆虫血淋巴中的活性。这种递送可如下实现：通过跨肠壁主动运输整个ORF，或通过在肠环境内切割以分开ICK基序蛋白同时翻译稳定性
蛋白损坏围食膜和/或肠壁以增加ICK基序蛋白扩散进入血淋巴。
750-1500aa (例如增强蛋白)之间。翻译稳定性蛋白由ORF中与编码杀虫蛋白的序列融合
在框中的蛋白质的DNA序列编码。融合蛋白可在杀虫蛋白的上游或下游，并且在两个序列间可具有任何间插序列，只要间插序列不导致任一DNA序列的移码。翻译稳定性蛋白还可具有增加ICK基序蛋白跨肠壁递送并进入昆虫血淋巴中的活性。这种递送可如下实现：通过跨肠壁主动运输整个ORF，或通过在肠环境内切割以分开ICK基序蛋白同时翻译稳定性
蛋白损坏围食膜和/或肠壁以增加ICK基序蛋白扩散进入血淋巴。
[0118] “sta”意指编码翻译稳定性蛋白的核苷酸。
[0119] “TMOF”、“TMOF基序”或“TMOF蛋白”意指“胰蛋白酶调节抑卵因子”蛋白序列。序列表中提供了实例。本文提供了许多实例和变体。SEQ ID NO：708是野生型TMOF序列。SEQ. ID. NO: 709-721提供了其它非限制性变体。其它实例是已知的或可通过本领域技术人员产生。
[0120] “TSP”或“总可溶性蛋白”意指可从植物组织样品中提取并溶于提取缓冲液中的蛋白质的总量。
[0121] “转基因”意指转化进入植物中的编码蛋白质的异源DNA序列。
[0122] “转基因宿主细胞”意指用基因转化并针对其转基因状态通过另外的选择基因选择的细胞。
[0123] “转基因植物”意指来源于用外源DNA转化的单细胞使得植物中的每个细胞都含有该转基因的植物。
[0124] “瞬时表达系统”意指基于根癌农杆菌的系统，其将编码无害的(disarmed)植物病毒的DNA递送到植物细胞中，在其中DNA进行表达。植物病毒被工程改造以表达高浓度的目标蛋白质，高达40%的TSP。在技术论证中，所采用的瞬时表达系统有两个，TRBO和FECT系统，植物细胞为烟草植物“Nicotiana benthamiana”的叶组织。
[0125] “TRBO”意指使用剔除病毒外被蛋白基因的烟草花叶病毒的瞬时植物表达系统。
[0126] “胰蛋白酶切割”意指使用蛋白酶胰蛋白酶(其识别暴露的赖氨酸和精氨酸氨基酸残基)将可切割接头在该切割位点上切断的体外测定。它还指胰蛋白酶切割该位点的作用。
[0127] “U肽”、“U蛋白”，亦称“U毒素”，亦称“天然U”，亦称“U-ACTX-Hv1a”，亦称“天然U-ACTX-Hv1a”以及“杂合肽”，亦称“杂合毒素”，亦称“杂合-ACTX-Hv1a”，亦称“天然杂合ACTX-Hv1a”全都是指天然蛋白质或天然毒素，其可存在于自然界或是以其它方式已知的，在“U-ACTX-Hv1a”，亦称“天然U-ACTX-Hv1a”的情况下，该蛋白质是天然蜘蛛毒素，最早发
2+ +
现于澳大利亚布鲁山脉起源的蜘蛛，并且是针对昆虫电压门控Ca 通道和K 通道的双重
拮抗剂。从中发现毒素的蜘蛛已知为澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛，学名为Hydronyche versuta。
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现于澳大利亚布鲁山脉起源的蜘蛛，并且是针对昆虫电压门控Ca 通道和K 通道的双重
拮抗剂。从中发现毒素的蜘蛛已知为澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛，学名为Hydronyche versuta。
[0128] “U+2肽”、“U+2蛋白”、“U+2毒素”或“U+2”或“U+2-ACTX-Hv1a”全都指具有与天然肽有效连接的另外二肽的任一毒素，并可指有时称为U肽和上述其它名称的蜘蛛毒素。与U肽有效连接并因此标为“+2”或“加2”的另外二肽可从数种肽中选择，其任一种可产生具有本文所述的独特性能的“U+2肽”。这些有时亦称“高产肽”。当使用术语“U+2-ACTX-Hv1a”时，它是指特定的高产毒肽，包括来自澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛(学名为Hydronyche versuta) 的天然存在的肽。
[0129] “VIP”蛋白自针对可能的杀虫活性筛选Bt的营养生长菌株的上清液而被发现。它们与cry蛋白几乎没有或没有相似性，且它们被命名为营养性杀虫蛋白(Vegetative
Insecticidal Protein)或VIP。具有鳞翅类活性的名为VIP3、Vip3蛋白或Vip毒素的是
本文件特别使用和优先使用的。它们被认为与Bt cry肽具有类似的作用方式。在本文件
中，VIP蛋白被归类为PFIP型的蛋白质。
Insecticidal Protein)或VIP。具有鳞翅类活性的名为VIP3、Vip3蛋白或Vip毒素的是
本文件特别使用和优先使用的。它们被认为与Bt cry肽具有类似的作用方式。在本文件
中，VIP蛋白被归类为PFIP型的蛋白质。
[0130] “酵母表达载体”或“表达载体”或“载体”意指可将异源基因和/或表达盒导入酵母细胞中以被转录和翻译的质粒。
[0131] “产量”是指肽的生产量，高的产量可意指生产量提高、生产率提高及平均产量或中值产量提高和较高产量的频率提高。
[0132] 第1部分. 植物结合肽或植物表达的肽“PIPS”和“PEPS”植物结合杀虫剂，或“PIPs”，为农民所面临的昆虫压力提出一种解决方法。现代农业
利用作为植物转基因蛋白表达的苏云金芽孢杆菌的基因以起PIPs的作用，但是天然抗性
昆虫品系已在田间检出，并且这个类别可能来临。需要开发具有新的作用方式的其它PIPs以控制抗性的发生。具有变成PIPs的潜力、有杀虫活性的新的蛋白质类别被称为富含半胱氨酸的杀虫蛋白(CRIPS)，这些蛋白质具有4、6或8个半胱氨酸和2、3或4个二硫键。这类化合物的一个实例被视为具有被称为抑制物半胱氨酸结(ICK)基序蛋白的类型。具有杀虫活性的ICK基序蛋白具有成为杀虫蛋白和PIPs的潜力。
利用作为植物转基因蛋白表达的苏云金芽孢杆菌的基因以起PIPs的作用，但是天然抗性
昆虫品系已在田间检出，并且这个类别可能来临。需要开发具有新的作用方式的其它PIPs以控制抗性的发生。具有变成PIPs的潜力、有杀虫活性的新的蛋白质类别被称为富含半胱氨酸的杀虫蛋白(CRIPS)，这些蛋白质具有4、6或8个半胱氨酸和2、3或4个二硫键。这类化合物的一个实例被视为具有被称为抑制物半胱氨酸结(ICK)基序蛋白的类型。具有杀虫活性的ICK基序蛋白具有成为杀虫蛋白和PIPs的潜力。
[0133] ICK基序蛋白是具有形成特定的ICK三级结构的至少6个半胱氨酸残基的一类蛋白质。ICK基序蛋白中半胱氨酸残基的共价交联形成导致这样的三级结构的二硫桥：使蛋白质对蛋白酶和有时对极端物理条件(pH、温度、紫外线等)相对有抗性，并赋予针对离子通道的活性，这可能对昆虫是特异性的。在使用ICK基序蛋白作为毒素使其捕食者或猎物不动或被杀死的无脊椎动物和脊椎动物毒液中，许多ICK基序蛋白发生进化。所述杀虫肽常常具有蝎、蜘蛛起源，有时具有蛇起源。在性质上，毒肽可通过注射流入昆虫的肠或内部器官。在PIP的情况下，递送通常通过昆虫摄食植物组织中表达的转基因蛋白。在从其食物摄食毒素时，例如昆虫摄食转基因植物，ICK基序蛋白可具有抑制生长、损害运动或甚至杀死昆虫的能力。
[0134] 然而，毒肽当在植物中表达时常常丧失其毒性。除非ICK基序蛋白作为正确折叠的蛋白质表达，否则其无法成功地保护植物或作物免遭虫害。在某些情况下，植物表达的肽需要在昆虫内或在植物中的表达过程期间通过切割而被激活以便有活性。对以下的方法和修饰的肽和核酸存在需要：使肽不仅仅能够在植物中表达，而且还能够表达、正确折叠并在某些情况下正确切割使得肽甚至在植物中表达后仍保留其针对昆虫的活性。在该部分中，我们提供了生产适宜在植物中表达的活性肽的几种方法。
[0135] 我们描述了有效连接在一起以获得新的蛋白质复合物的不同肽的各种组合。描述了下列蛋白质复合物。一种包含与富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)例如抑制物胱氨酸结
(ICK)基序蛋白有效连接的内质网信号肽(ERSP)的肽，其命名为ERSP-ICK，其中所述ERSP是所述肽的N端，且其中ERSP肽的长度为3-60个氨基酸、5-50个氨基酸、20-30个氨基酸和/或其中肽是BAAS、或烟草伸展蛋白信号肽、或修饰的烟草伸展蛋白信号肽、或Juniperus ashei 或J ashei 的Jun a 3信号肽。
(ICK)基序蛋白有效连接的内质网信号肽(ERSP)的肽，其命名为ERSP-ICK，其中所述ERSP是所述肽的N端，且其中ERSP肽的长度为3-60个氨基酸、5-50个氨基酸、20-30个氨基酸和/或其中肽是BAAS、或烟草伸展蛋白信号肽、或修饰的烟草伸展蛋白信号肽、或Juniperus ashei 或J ashei 的Jun a 3信号肽。
[0136] 一种包含与富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)例如抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白有效连接的内质网信号肽(ERSP)的肽，其命名为ERSP-ICK，其中ICK基序蛋白的长度介于
16和60个氨基酸之间、介于26和48个氨基酸之间、介于30和44个氨基酸之间和/或其
中ICK基序蛋白是U-ACTX-Hv1a、或ω-ACTX-Hv1a、或κ-ACTX-Hv1c。
16和60个氨基酸之间、介于26和48个氨基酸之间、介于30和44个氨基酸之间和/或其
中ICK基序蛋白是U-ACTX-Hv1a、或ω-ACTX-Hv1a、或κ-ACTX-Hv1c。
[0137] 一种包含与抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白有效连接的内质网信号肽(ERSP)的肽，命名为ERSP-ICK，其中所述ERSP和抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白是本文所述任何大小和长度的组合和/或包含本文件教导的任何已鉴定的序列。
[0138] 一种编码本文描述的作为内质网信号肽(ERSP)和/或富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)例如抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白的任何肽的核苷酸。一种包含编码这些肽的任何核苷酸的表达ORF。一种包含编码这些肽的任何核苷酸的表达ORF，其被转化至转基因植物基因组中。一种肽，其中所述ICK基序蛋白是杀虫蛋白。一种肽，其中所述杀虫肽是本文描述的任何ICK基序蛋白或肽。一种肽，其中所述杀虫肽是选自包括澳毒蜘蛛属(Atrax)
或Hadronyche的任何肽或肽源的任何肽。选自序列表的任何肽的杀虫肽及其片段，包括所述肽和序列号的成熟、前肽和肽原形式。一种肽，其中所述杀虫肽是描述或选自ACTX蛋白的任何所选的肽。一种TMOF蛋白。
或Hadronyche的任何肽或肽源的任何肽。选自序列表的任何肽的杀虫肽及其片段，包括所述肽和序列号的成熟、前肽和肽原形式。一种肽，其中所述杀虫肽是描述或选自ACTX蛋白的任何所选的肽。一种TMOF蛋白。
[0139] 本文所述任何肽或核苷酸制备或转化植物或植物基因组以在转化植物中表达正确折叠的毒肽的用途。本文所述任何肽或核苷酸制备或转化植物或植物基因组从而在转化植物中表达正确折叠的毒肽并使已表达的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积并使植物
对虫害的抗性提高的用途。
对虫害的抗性提高的用途。
[0140] 一种使用任何肽的核苷酸或在CRIP、ICK、非ICK、基序蛋白表达载体中的表达ORF产生转基因植物的方法。一种包含表达本文所述任何肽的任何核苷酸的ICK基序蛋白表达载体。一种掺入到转化植物中的ICK基序蛋白表达载体，其包含编码本文公开的任何肽或鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人员制备的核苷酸。一种生产具有或表达本文所述任何肽的转化植物的方法。一种由本文所述任何产品和处置方法产生的植物。
[0141] 一种包含与有效连接间插接头肽(L或接头)的抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白或富含半胱氨酸的肽有效连接的内质网信号肽(ERSP)的蛋白质，其命名为ERSP-接头-ICK (ERSP-L-ICK)或ERSP-ICK-接头(ERSP-ICK-L)，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，和所
述L或接头可位于ICK基序蛋白的N端一侧(上游)或ICK基序蛋白的C端一侧(下游)。
一种命名为ERSP-L-ICK或ERSP-ICK-L的蛋白质，其包含本文所述任何ERSP或ICK基序蛋
白，且其中所述L可以是不可切割的接头肽或可切割的接头肽，其在植物细胞中在蛋白质表达过程期间是可切割的或在昆虫肠环境和血淋巴环境中可被切割，且包含本文件描述或教导的任何间插接头肽(LINKER)，包括下列序列：IGER (SEQ ID NO. 1)、EEKKN (SEQ ID NO. 2)和ETMFKHGL (SEQ ID NO. 3)。
述L或接头可位于ICK基序蛋白的N端一侧(上游)或ICK基序蛋白的C端一侧(下游)。
一种命名为ERSP-L-ICK或ERSP-ICK-L的蛋白质，其包含本文所述任何ERSP或ICK基序蛋
白，且其中所述L可以是不可切割的接头肽或可切割的接头肽，其在植物细胞中在蛋白质表达过程期间是可切割的或在昆虫肠环境和血淋巴环境中可被切割，且包含本文件描述或教导的任何间插接头肽(LINKER)，包括下列序列：IGER (SEQ ID NO. 1)、EEKKN (SEQ ID NO. 2)和ETMFKHGL (SEQ ID NO. 3)。
[0142] 一种编码所述作为内质网信号肽(ERSP)、抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白和/或间插接头肽(LINKER)的任何肽的核苷酸和编码用于产生转基因植物的这些蛋白质的任一
种的任何和所有核苷酸。
种的任何和所有核苷酸。
[0143] 所述肽或编码内质网信号肽(ERSP)、抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白和/或间插接头肽(LINKER)的核苷酸的任一种在制备或转化植物或植物基因组从而在转化植物中表
达正确折叠的毒肽中的用途。所述肽或编码内质网信号肽(ERSP)、抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白和/或间插接头肽的核苷酸的任一个在制备或转化植物或植物基因组从而在转
化植物中表达正确折叠的毒肽并使已表达的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积并使植
物对虫害的抗性提高中的用途。
达正确折叠的毒肽中的用途。所述肽或编码内质网信号肽(ERSP)、抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白和/或间插接头肽的核苷酸的任一个在制备或转化植物或植物基因组从而在转
化植物中表达正确折叠的毒肽并使已表达的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积并使植
物对虫害的抗性提高中的用途。
[0144] 一种使用编码内质网信号肽(ERSP)、抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白和/或间插接头肽(LINKER)的核苷酸或表达ORF产生转基因植物的方法。一种表达ORF，其包含在ICK表达载体中的表达本文所述任何肽、ERSP、ICK基序蛋白和/或LINKER的任何核苷酸。一
种掺入转化植物中的ICK基序蛋白表达载体中的功能表达ORF，其包含编码本文公开的任
何肽的核苷酸；编码ERSP、ICK基序蛋白和/或LINKER的核苷酸；或鉴于本文公开的教导
内容可由本领域技术人员制备的核苷酸。一种生产具有或表达本文所述任何肽、ERSP、ICK基序蛋白和/或LINKER的转化植物的方法。一种由本文所述任何产品和处置方法产生的
植物。
种掺入转化植物中的ICK基序蛋白表达载体中的功能表达ORF，其包含编码本文公开的任
何肽的核苷酸；编码ERSP、ICK基序蛋白和/或LINKER的核苷酸；或鉴于本文公开的教导
内容可由本领域技术人员制备的核苷酸。一种生产具有或表达本文所述任何肽、ERSP、ICK基序蛋白和/或LINKER的转化植物的方法。一种由本文所述任何产品和处置方法产生的
植物。
[0145] 一种包含与有效连接翻译稳定性蛋白(STA)的抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白有效连接的内质网信号肽(ERSP)的蛋白质，其命名为ERSP-STA-ICK或ERSP-ICK-STA，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，所述STA可位于ICK基序蛋白的N端一侧(上游)或ICK基
序蛋白的C端一侧(下游)。一种命名为ERSP-STA-ICK或ERSP-ICK-STA的蛋白质，其包含
本文所述的任何ERSP或ICK基序蛋白，且其中STA包含本文件所述或教导的任何翻译稳定
性蛋白，包括GFP (绿色荧光蛋白)、GNA (雪花莲凝集素)、Jun a 3 (Juniperus ashei)和许多其它ICK基序蛋白。
序蛋白的C端一侧(下游)。一种命名为ERSP-STA-ICK或ERSP-ICK-STA的蛋白质，其包含
本文所述的任何ERSP或ICK基序蛋白，且其中STA包含本文件所述或教导的任何翻译稳定
性蛋白，包括GFP (绿色荧光蛋白)、GNA (雪花莲凝集素)、Jun a 3 (Juniperus ashei)和许多其它ICK基序蛋白。
[0146] 一种编码所述作为内质网信号肽(ERSP)、抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白和/或翻译稳定性蛋白(STA)的任何肽的核苷酸和具有编码用于产生转基因植物的这些蛋白质
的任一种的这些功能类型的任一个的任何和所有核苷酸。
的任一种的这些功能类型的任一个的任何和所有核苷酸。
[0147] 所述肽或编码内质网信号肽(ERSP)、抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白和/或翻译稳定性蛋白(STA)的核苷酸的任一个在制备或转化植物或植物基因组从而在转化植物
中表达正确折叠的毒肽中的用途。所述肽或编码内质网信号肽(ERSP)、抑制物胱氨酸结
(ICK)基序蛋白和/或翻译稳定性蛋白(STA)的核苷酸的任一个在制备或转化植物或植物
基因组从而在转化植物中表达正确折叠的毒肽并使已表达的和正确折叠的毒肽在所述植
物中蓄积并使植物对虫害的抗性提高中的用途。
中表达正确折叠的毒肽中的用途。所述肽或编码内质网信号肽(ERSP)、抑制物胱氨酸结
(ICK)基序蛋白和/或翻译稳定性蛋白(STA)的核苷酸的任一个在制备或转化植物或植物
基因组从而在转化植物中表达正确折叠的毒肽并使已表达的和正确折叠的毒肽在所述植
物中蓄积并使植物对虫害的抗性提高中的用途。
[0148] 一种使用在ICK表达载体中编码内质网信号肽(ERSP)、抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白和/或翻译稳定性蛋白(STA)的核苷酸或表达ORF以产生转基因植物的方法。一种
表达ORF，其包含表达ERSP、ICK基序蛋白和/或STA的任何核苷酸。一种掺入转化植物中
的ICK基序蛋白表达载体中的功能表达ORF，其包含编码ERSP、ICK基序蛋白和/或STA或
鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人员制备的核苷酸。一种产生具有或表达ERSP、ICK基序蛋白和/或STA的转化植物的方法。一种由本文所述任何产品和处置方法产生的
植物。
表达ORF，其包含表达ERSP、ICK基序蛋白和/或STA的任何核苷酸。一种掺入转化植物中
的ICK基序蛋白表达载体中的功能表达ORF，其包含编码ERSP、ICK基序蛋白和/或STA或
鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人员制备的核苷酸。一种产生具有或表达ERSP、ICK基序蛋白和/或STA的转化植物的方法。一种由本文所述任何产品和处置方法产生的
植物。
[0149] 一种包含与有效连接与间插接头肽(LINKER)有效连接的翻译稳定性蛋白(STA)的抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白有效连接的内质网信号肽(ERSP)的蛋白质，其命名为
ERSP-STA-LINKER-ICK、ERSP-ICK-LINKER-STA、ERSP-STA-L-ICK或ERSP-ICK-L-STA，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，所述STA可位于ICK基序蛋白的N端一侧(上游)或ICK
基序蛋白的C端一侧(下游)，且所述LINKER 介于STA和ICK基序蛋白之间。一种命名为
ERSP-STA-LINKER-ICK或ERSP-ICK-LINKER-STA的蛋白质，其包含本文所述ERSP、ICK基序蛋白、间插接头肽和翻译稳定性蛋白的任一种。
ERSP-STA-LINKER-ICK、ERSP-ICK-LINKER-STA、ERSP-STA-L-ICK或ERSP-ICK-L-STA，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，所述STA可位于ICK基序蛋白的N端一侧(上游)或ICK
基序蛋白的C端一侧(下游)，且所述LINKER 介于STA和ICK基序蛋白之间。一种命名为
ERSP-STA-LINKER-ICK或ERSP-ICK-LINKER-STA的蛋白质，其包含本文所述ERSP、ICK基序蛋白、间插接头肽和翻译稳定性蛋白的任一种。
[0150] 一种编码所述作为内质网信号肽(ERSP)、抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白、间插接头肽(LINKER)和/或翻译稳定性蛋白(STA)的任何肽的核苷酸和编码用于产生转基因植物的这些蛋白质的任一种的任何和所有核苷酸。
[0151] 所述肽或编码内质网信号肽(ERSP)、抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白、间插接头肽和/或翻译稳定性蛋白(STA)的核苷酸的任一种在制备或转化植物或植物基因组从而在转化植物中表达正确折叠的毒肽中的用途。所述肽或编码内质网信号肽(ERSP)、抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白、间插接头肽(LINKER)和/或翻译稳定性蛋白(STA)的核苷酸的任
一种在制备或转化植物或植物基因组从而在转化植物中表达正确折叠的毒肽并使已表达
的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积并使植物对虫害的抗性提高中的用途。
一种在制备或转化植物或植物基因组从而在转化植物中表达正确折叠的毒肽并使已表达
的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积并使植物对虫害的抗性提高中的用途。
[0152] 一种使用ICK表达载体中的编码内质网信号肽(ERSP)、抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白、间插接头肽和/或翻译稳定性蛋白(STA)的核苷酸或表达ORF以产生转基因植物
的方法。一种表达ORF，其包含在ICK表达载体中的表达ERSP、ICK基序蛋白、LINKER和/
或STA的任何核苷酸。一种掺入转化植物中的ICK表达载体中的功能表达ORF，其包含编
码ERSP、ICK基序蛋白、LINKER和/或STA或鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人
员制备的核苷酸。一种产生具有或表达ERSP、ICK基序蛋白、LINKER和/或STA的转化植
物的方法。一种由本文所述的任何产品和处置方法产生的植物。
的方法。一种表达ORF，其包含在ICK表达载体中的表达ERSP、ICK基序蛋白、LINKER和/
或STA的任何核苷酸。一种掺入转化植物中的ICK表达载体中的功能表达ORF，其包含编
码ERSP、ICK基序蛋白、LINKER和/或STA或鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人
员制备的核苷酸。一种产生具有或表达ERSP、ICK基序蛋白、LINKER和/或STA的转化植
物的方法。一种由本文所述的任何产品和处置方法产生的植物。
[0153] 一种包含与多个抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白结构域有效连接的内质网信号肽(ERSP)的蛋白质，所述抑制物胱氨酸结基序蛋白结构域被有效连接与间插接
头肽有效连接的翻译稳定性蛋白(STA)的间插接头肽(LINKER)有效连接，其命名为
ERSP-STA-(LINKERi-ICKj)N 或 ERSP-(ICKj-LINKERi)N-STA，有 时 为 ERSP-STA-(Li-ICKj)N或ERSP-(ICKj-Li)N-STA，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，所述STA可位于多个ICK
基序蛋白结构域((LINKERi-ICKj)N)的N端一侧(上游)或多个ICK基序蛋白结构域
((ICKj-LINKERi)N)的C端一侧(下游)，所述多个间插肽(LINKERi)介于STA和多个ICK基
序蛋白结构域之间和介于多个ICK基序蛋白结构域中的ICK基序蛋白之间。一种命名为
ERSP-STA-(LINKERi-ICKj)N或ERSP-(ICKj-LINKERi)N-STA的蛋白质，其包含本文所述ERSP、ICK基序蛋白、间插接头肽和翻译稳定性蛋白的任一种。
头肽有效连接的翻译稳定性蛋白(STA)的间插接头肽(LINKER)有效连接，其命名为
ERSP-STA-(LINKERi-ICKj)N 或 ERSP-(ICKj-LINKERi)N-STA，有 时 为 ERSP-STA-(Li-ICKj)N或ERSP-(ICKj-Li)N-STA，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，所述STA可位于多个ICK
基序蛋白结构域((LINKERi-ICKj)N)的N端一侧(上游)或多个ICK基序蛋白结构域
((ICKj-LINKERi)N)的C端一侧(下游)，所述多个间插肽(LINKERi)介于STA和多个ICK基
序蛋白结构域之间和介于多个ICK基序蛋白结构域中的ICK基序蛋白之间。一种命名为
ERSP-STA-(LINKERi-ICKj)N或ERSP-(ICKj-LINKERi)N-STA的蛋白质，其包含本文所述ERSP、ICK基序蛋白、间插接头肽和翻译稳定性蛋白的任一种。
[0154] 一种编码所述作为内质网信号肽(ERSP)、多个抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白结构域、间插接头肽(LINKER)和/或翻译稳定性蛋白(STA)的任何肽的核苷酸和编码用于产生转基因植物的这些蛋白质的任一种的任何和所有核苷酸。
[0155] 所述肽或编码内质网信号肽(ERSP)、多个抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白结构域、间插接头肽(LINKER)和/或翻译稳定性蛋白(STA)的核苷酸的任一种在制备或转化植
物或植物基因组从而在转化植物中表达正确折叠的毒肽中的用途。所述肽或编码内质网信号肽(ERSP)、多个抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白结构域、间插接头肽(LINKER)和/或翻
译稳定性蛋白(STA)的核苷酸的任一种在制备或转化植物或植物基因组从而在转化植物
中表达正确折叠的毒肽并使已表达的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积并使植物对虫
害的抗性提高中的用途。
物或植物基因组从而在转化植物中表达正确折叠的毒肽中的用途。所述肽或编码内质网信号肽(ERSP)、多个抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白结构域、间插接头肽(LINKER)和/或翻
译稳定性蛋白(STA)的核苷酸的任一种在制备或转化植物或植物基因组从而在转化植物
中表达正确折叠的毒肽并使已表达的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积并使植物对虫
害的抗性提高中的用途。
[0156] 一种使用编码内质网信号肽(ERSP)、多个抑制物胱氨酸结(ICK)基序蛋白结构域、间插接头肽(LINKER)和/或翻译稳定性蛋白(STA)的核苷酸或表达ORF以产生转基因
植物的方法。一种表达ORF，其包含表达ERSP、多个ICK基序蛋白结构域、L或LINKER和/
或STA的任何核苷酸。一种掺入转化植物中的功能表达ORF，其包含编码ERSP、多个ICK基序蛋白结构域、LINKER和/或STA或鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人员制备的
核苷酸。一种产生具有或表达ERSP、多个ICK基序蛋白结构域、LINKER和/或STA的转化
植物的方法。一种由本文所述的任何产品和处置方法产生的植物。
植物的方法。一种表达ORF，其包含表达ERSP、多个ICK基序蛋白结构域、L或LINKER和/
或STA的任何核苷酸。一种掺入转化植物中的功能表达ORF，其包含编码ERSP、多个ICK基序蛋白结构域、LINKER和/或STA或鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人员制备的
核苷酸。一种产生具有或表达ERSP、多个ICK基序蛋白结构域、LINKER和/或STA的转化
植物的方法。一种由本文所述的任何产品和处置方法产生的植物。
[0157] 一种嵌合基因，其包含与本文所述核苷酸的核酸或表达ORF有效连接的在植物中有活性的启动子。一种制备、生产或使用本文中描述的这些嵌合基因的方法。一种包含本文所述嵌合基因的重组载体。一种制备、生产或使用本文所述重组载体的方法。一种包含本文所述嵌合基因的转基因宿主细胞。一种制备、生产或使用本文所转基因宿主细胞的方法。一种本文所述的转基因宿主细胞，其是转基因植物细胞。一种制备、生产或使用本文所述的转基因植物细胞的方法。一种包含本文所述的转基因植物细胞的转基因植物。一种制备、生产或使用本文所述转基因植物的方法。一种本文所述的转基因植物，其由玉米、大豆、棉、稻、小麦、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、任何绿叶蔬菜或任何果树制备。一种得自本文所述转基因植物的种子，其中所述种子包含本文所述嵌合基因。一种制备、生产或使用本文所述转基因植物的方法。一种制备、生产或使用本文所述种子的方法。
[0158] 文献描述了来自蜘蛛和蝎的植物表达的抑制半胱氨酸结(ICK)基序蛋白(Khan等, Transgenic Res., 2006，15：349-357；Hernández-Campuzano等，Toxicon. 2009年1月;53(1):122-8)。我们描述了如何制备有活性的并且在植物中蓄积至杀虫剂量水平的植物表达的ICK基序蛋白。我们表明植物表达的ICK基序蛋白的之前的描述实际上是已丧失
其天然毒性的无活性蛋白质的描述。我们描述了提高植物表达的效能、增加植物表达的蛋白质的蓄积和显著提高植物表达的蛋白质的杀虫活性的方法。我们描述了如何由植物细胞中的内质网信号转导蛋白(ERSP)指导将植物表达的ICK基序蛋白引导进入内质网(ER)，
以便正确共价交联杀虫活性所需的基本三级ICK基序结构的肽二硫桥。我们还描述了植物表达的ER运输性含加入的翻译稳定性蛋白结构域(STA)的ICK基序蛋白复合物以增加所
得ICK融合蛋白的大小，所述ICK融合蛋白促进肽在植物中蓄积。我们还描述了植物表达
的ER运输性含上述加入的翻译稳定性蛋白和含加入的间插接头肽(LINKER)的ICK基序蛋
白，所述间插接头肽允许潜在切割和回收具有杀虫活性的ICK基序蛋白的活性形式。我们还描述了植物表达的多肽，其含有ER运输性的含被间插接头肽(LINKER)分隔的多个ICK
基序蛋白、含加入的间插接头肽、含加入的翻译稳定性蛋白的ICK基序蛋白结构域，所述翻译稳定性蛋白允许正确折叠的ICK基序蛋白在植物中蓄积至杀虫剂量。
其天然毒性的无活性蛋白质的描述。我们描述了提高植物表达的效能、增加植物表达的蛋白质的蓄积和显著提高植物表达的蛋白质的杀虫活性的方法。我们描述了如何由植物细胞中的内质网信号转导蛋白(ERSP)指导将植物表达的ICK基序蛋白引导进入内质网(ER)，
以便正确共价交联杀虫活性所需的基本三级ICK基序结构的肽二硫桥。我们还描述了植物表达的ER运输性含加入的翻译稳定性蛋白结构域(STA)的ICK基序蛋白复合物以增加所
得ICK融合蛋白的大小，所述ICK融合蛋白促进肽在植物中蓄积。我们还描述了植物表达
的ER运输性含上述加入的翻译稳定性蛋白和含加入的间插接头肽(LINKER)的ICK基序蛋
白，所述间插接头肽允许潜在切割和回收具有杀虫活性的ICK基序蛋白的活性形式。我们还描述了植物表达的多肽，其含有ER运输性的含被间插接头肽(LINKER)分隔的多个ICK
基序蛋白、含加入的间插接头肽、含加入的翻译稳定性蛋白的ICK基序蛋白结构域，所述翻译稳定性蛋白允许正确折叠的ICK基序蛋白在植物中蓄积至杀虫剂量。
[0159] 本发明描述了是植物表达的并可成功保护植物或作物免遭虫害的具有杀虫活性的ICK基序蛋白。本文所述ICK基序蛋白表达ORF是这样的核苷酸，其使植物翻译的肽不
仅能够在植物中表达，而且能够正确表达并折叠，而且在植物中蓄积至杀虫剂量。蛋白质表达ORF的一个实例可以是按以下等式形式描述和在附图或图表中的示图形式表示的ICK基
序蛋白表达ORF。
仅能够在植物中表达，而且能够正确表达并折叠，而且在植物中蓄积至杀虫剂量。蛋白质表达ORF的一个实例可以是按以下等式形式描述和在附图或图表中的示图形式表示的ICK基
序蛋白表达ORF。
[0160] ersp-sta-(接头 i-cripj)N，或ersp-(cripj-接头i)N-sta上述表达式只是一个实例，对于其它类型的CRIP表达ORF可写出类似表达式，例如ICK
表达ORF可写作：
ersp-sta-(接头 i-ickj)N，或ersp-(ickj-接头i)N-sta
这些表达式、等式或线性示图描述了一种类型的CRIP的多核苷酸开放阅读框
(ORF)，其是表达ICK基序蛋白复合物的一种，可写作ERSP-STA-(LINKERI-ICKJ)N或
ERSP-(ICKJ-LINKERI)N-STA，或ERSP-STA-(LI-ICKJ)N或ERSP-(ICKJ-LI)N-STA，含有用短划线符号将各个组分间隔开的4种可能的肽组分。在上图中，ersp 的核苷酸组分是编码植物内质网运输信号肽(ERSP)的多核苷酸区段。sta的组分是编码翻译稳定性蛋白(STA)的多核
苷酸区段，其有助于表达的ICK基序蛋白在植物中蓄积但可能不是ICK基序蛋白表达ORF
必需的。接头i的组分是编码使ICK基序蛋白彼此间隔和与翻译稳定性蛋白间隔开来的间
插接头肽(L或LINKER)的多核苷酸区段，下标“i”表示不同类型的接头肽可用于CRIP或
ICK基序蛋白表达ORF。在sta 不用于ICK基序蛋白表达ORF的情况下，ersp 可不用接头
与编码ICK基序蛋白的多核苷酸直接连接。icki的组分是编码ICK基序蛋白(ICK)的多核
苷酸区段，下标“j”表示不同的ICK基序蛋白；(接头 i-ickj)N”表示编码间插接头肽和ICK基序蛋白的核苷酸结构可在相同的ICK基序蛋白表达ORF的同一可读框中重复“N”次，其中N可以是1-10的任何整数。N可为1-10，具体地讲N可为1、2、3、4或5，而在一些实施方案中，N为6、7、8、9或10。重复序列可含有编码不同间插接头(LINKER)和不同ICK基序蛋白的多核苷酸区段。包括在相同ICK基序蛋白表达ORF内的重复序列的不同多核苷酸区段
全在同一翻译框内。
表达ORF可写作：
ersp-sta-(接头 i-ickj)N，或ersp-(ickj-接头i)N-sta
这些表达式、等式或线性示图描述了一种类型的CRIP的多核苷酸开放阅读框
(ORF)，其是表达ICK基序蛋白复合物的一种，可写作ERSP-STA-(LINKERI-ICKJ)N或
ERSP-(ICKJ-LINKERI)N-STA，或ERSP-STA-(LI-ICKJ)N或ERSP-(ICKJ-LI)N-STA，含有用短划线符号将各个组分间隔开的4种可能的肽组分。在上图中，ersp 的核苷酸组分是编码植物内质网运输信号肽(ERSP)的多核苷酸区段。sta的组分是编码翻译稳定性蛋白(STA)的多核
苷酸区段，其有助于表达的ICK基序蛋白在植物中蓄积但可能不是ICK基序蛋白表达ORF
必需的。接头i的组分是编码使ICK基序蛋白彼此间隔和与翻译稳定性蛋白间隔开来的间
插接头肽(L或LINKER)的多核苷酸区段，下标“i”表示不同类型的接头肽可用于CRIP或
ICK基序蛋白表达ORF。在sta 不用于ICK基序蛋白表达ORF的情况下，ersp 可不用接头
与编码ICK基序蛋白的多核苷酸直接连接。icki的组分是编码ICK基序蛋白(ICK)的多核
苷酸区段，下标“j”表示不同的ICK基序蛋白；(接头 i-ickj)N”表示编码间插接头肽和ICK基序蛋白的核苷酸结构可在相同的ICK基序蛋白表达ORF的同一可读框中重复“N”次，其中N可以是1-10的任何整数。N可为1-10，具体地讲N可为1、2、3、4或5，而在一些实施方案中，N为6、7、8、9或10。重复序列可含有编码不同间插接头(LINKER)和不同ICK基序蛋白的多核苷酸区段。包括在相同ICK基序蛋白表达ORF内的重复序列的不同多核苷酸区段
全在同一翻译框内。
[0161] 如ICK基序蛋白表达ORF示图中的4种主要组分ersp、sta、接头和crip或ick的任何组合，可用来产生PEP型ICK基序蛋白表达ORF，只要使用最小量的ersp和至少1拷贝
的crip 或ick。
的crip 或ick。
[0162] I. PEPs的ERSP或ersp 组分。
[0163] ICK基序蛋白表达ORF始于其5’端的ersp。对于正确折叠和有功能的ICK基序蛋白，当它从转基因植物表达时，它必须具有与编码ICK基序蛋白的多核苷酸在框中融合的ersp 核苷酸。在细胞翻译过程中，翻译的ERSP可通过与称为信号识别颗粒的细胞组分结合，指导正翻译的ICK基序蛋白插入植物细胞的内质网(ER)中。在ER内，ERSP肽被信
号肽酶切割，ICK基序蛋白被释放到ER中，其中ICK基序蛋白在翻译后修饰过程中正确折
叠，例如形成二硫键。在没有任何其它的保留蛋白质信号的情况下，该蛋白质通过ER转运到高尔基体，在此被最终分泌到质膜以外并进入质外体空间。ICK基序蛋白可在质外体空间蓄积以有效达到在植物中的杀虫剂量。图1表示由与ICK基序功能性连接的ERSP组成的
简单的两种组分肽或核苷酸的代表性示图。ICK可以是合适的CRIP。使用ERSP的更复杂
的蛋白质和多核苷酸见图2-5，将在STA或翻译稳定性蛋白的阐述中进一步讨论这些图。
号肽酶切割，ICK基序蛋白被释放到ER中，其中ICK基序蛋白在翻译后修饰过程中正确折
叠，例如形成二硫键。在没有任何其它的保留蛋白质信号的情况下，该蛋白质通过ER转运到高尔基体，在此被最终分泌到质膜以外并进入质外体空间。ICK基序蛋白可在质外体空间蓄积以有效达到在植物中的杀虫剂量。图1表示由与ICK基序功能性连接的ERSP组成的
简单的两种组分肽或核苷酸的代表性示图。ICK可以是合适的CRIP。使用ERSP的更复杂
的蛋白质和多核苷酸见图2-5，将在STA或翻译稳定性蛋白的阐述中进一步讨论这些图。
[0164] ERSP肽位于植物翻译的ICK基序蛋白复合物的N端区，且ERSP部分由大约3-60个氨基酸组成。在一些实施方案，为5-50个氨基酸。在一些实施方案，为10-40个氨基酸，但最通常由15-20、20-25或25-30个氨基酸组成。ERSP是所谓的信号肽，因为它指导蛋白质的转运。信号肽也可称为引导信号、信号序列、转运肽或定位信号。用于ER运输的信号肽的长度常常为15-30个氨基酸残基，具有由两侧接带正电荷的氨基端和极性但不带电荷的羧基端区域的疏水残基的核心组成的三联组构。(Zimmermann等, “Protein translocation across the ER membrane (跨ER膜的蛋白质转移)”, Biochimica et Biohysica Acta,
2011, 1808: 912-924)。
2011, 1808: 912-924)。
[0165] 许多ERSP是已知的。许多植物ERSP是已知的。ERSP来源于植物ERSP不是必须的，非植物ERSP将按本文所述方法运作。然而，许多植物ERSP是众所周知的，在此，我们描述了一些植物来源的ERSP。例如，BAAS来源于植物大麦(Hordeum vulgare)，并具有如下的氨基酸序列：
MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG (SEQ ID NO: 4)
植物ERSP，其选自已知表达并释放进入植物质外体空间的蛋白质的基因组序列，少数
实例为BAAS、胡萝卜伸展蛋白、烟草PR1。下列参考文献提供更多描述，并通过引用以其整体结合到本文中。De Loose, M.等, “The extensin signal peptide allows secretion of a heterologous protein from protoplasts (伸展蛋白信号肽允许异源蛋白质从
原生质体中分泌)” Gene, 99 (1991) 95-100。De Loose，M.等人描述了来自皱叶烟草
(Nicotiana plumbaginifolia)的伸展蛋白编码基因的结构分析，其序列含有用于蛋白
质易位到内质网的典型信号肽。Chen, M.H.等“Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids and extracellular
compartments of plant cells (稻α淀粉酶和货物蛋白质的信号肽依赖性引导至植物细胞的质体和胞外区室)” Plant Physiology, 2004年7月; 135(3): 1367-77. 电子出版
物2004年7月2日。Chen, M.H.等人通过分析转基因烟草中在有或没有其信号肽的情况
下α-淀粉酶的表达，研究了α-淀粉酶在植物细胞中的亚细胞定位。这些参考文献和其
它文献教导和公开了可用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的信号肽。
MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG (SEQ ID NO: 4)
植物ERSP，其选自已知表达并释放进入植物质外体空间的蛋白质的基因组序列，少数
实例为BAAS、胡萝卜伸展蛋白、烟草PR1。下列参考文献提供更多描述，并通过引用以其整体结合到本文中。De Loose, M.等, “The extensin signal peptide allows secretion of a heterologous protein from protoplasts (伸展蛋白信号肽允许异源蛋白质从
原生质体中分泌)” Gene, 99 (1991) 95-100。De Loose，M.等人描述了来自皱叶烟草
(Nicotiana plumbaginifolia)的伸展蛋白编码基因的结构分析，其序列含有用于蛋白
质易位到内质网的典型信号肽。Chen, M.H.等“Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids and extracellular
compartments of plant cells (稻α淀粉酶和货物蛋白质的信号肽依赖性引导至植物细胞的质体和胞外区室)” Plant Physiology, 2004年7月; 135(3): 1367-77. 电子出版
物2004年7月2日。Chen, M.H.等人通过分析转基因烟草中在有或没有其信号肽的情况
下α-淀粉酶的表达，研究了α-淀粉酶在植物细胞中的亚细胞定位。这些参考文献和其
它文献教导和公开了可用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的信号肽。
[0166] II. PEPs的CRIP和ICK基序蛋白组分或crip和ick。
[0167] 在我们的ICK基序蛋白表达ORF图中，“ick”意指编码“ICK基序蛋白”或“抑制物胱氨酸结基序蛋白”的多核苷酸，其为16-60个氨基酸肽，具有含3个二硫桥的至少6个半-胱氨酸核心氨基酸，其中3个二硫桥是共价键，6个半-胱氨酸残基中共价二硫键介于自N端氨基酸开始的6个核心半-胱氨酸氨基酸的第一和第四、第二和第五及第三和第
六个半-胱氨酸之间。ICK基序蛋白还包含β-发夹二级结构，通常由位于基序的第四和
第六核心半-胱氨酸间的残基组成，发夹通过由基序的3个二硫键提供的结构交联而被稳
定。注意其它的半胱氨酸/半胱氨酸或半-胱氨酸氨基酸可存在于抑制物半胱氨酸结基
序中，如图6所示。CRIP或ICK基序可以重复以增加毒肽在植物中的蓄积。参见图4和图
5。重复CRIP或ICK基序1-10次、有时高达15、20或25次的这种能力还见于本文描述为
ersp-sta-(接头i-ickj)N或ersp-(ickj-接头i)N-sta的CRIP或ICK蛋白质表达ORF的等
式样示图中，其中通过下标数值N给出重复LINKER-ICK基序的数目，且N通常为1-10，但在一些植物中甚至可以达到更高。
六个半-胱氨酸之间。ICK基序蛋白还包含β-发夹二级结构，通常由位于基序的第四和
第六核心半-胱氨酸间的残基组成，发夹通过由基序的3个二硫键提供的结构交联而被稳
定。注意其它的半胱氨酸/半胱氨酸或半-胱氨酸氨基酸可存在于抑制物半胱氨酸结基
序中，如图6所示。CRIP或ICK基序可以重复以增加毒肽在植物中的蓄积。参见图4和图
5。重复CRIP或ICK基序1-10次、有时高达15、20或25次的这种能力还见于本文描述为
ersp-sta-(接头i-ickj)N或ersp-(ickj-接头i)N-sta的CRIP或ICK蛋白质表达ORF的等
式样示图中，其中通过下标数值N给出重复LINKER-ICK基序的数目，且N通常为1-10，但在一些植物中甚至可以达到更高。
[0168] 可写出类似的表达式像ersp-sta-(接头 i-ickj)N或ersp-(ickj-接头i)N-sta，并可描述其它CRIP肽。在该部分中，一种表达ORF的实例是用来增加植物中的肽表达的表达ORF，并以ICK蛋白为最佳实例。在上图中，使用含有4个可能的肽组分(各组分
用短划线符号分隔)的表达ICK基序蛋白复合物的多核苷酸可读框(ORF)，其可描述为
ERSP-STA-(LINKERI-ICKJ)N 或ERSP-(ICKJ-LINKERI)N-STA，或 为ERSP-STA-(LI-ICKJ)N 或ERSP-(ICKJ-LI)N-STA。显示这种类型的构建体的替代方法可见图中。在示图和附图中，ersp的核苷酸组分是编码植物内质网运输信号肽(ERSP)的多核苷酸区段。sta 的组分是编码
翻译稳定性蛋白(STA)的多核苷酸区段，其有助于表达的ICK基序蛋白在植物中蓄积但可
能不是ICK基序蛋白表达ORF必需的。li的组分是编码将ICK基序蛋白彼此分隔和与翻译
稳定性蛋白分隔开来的间插接头肽(L或LINKER)的多核苷酸区段，下标“i”表示不同类型的接头肽可用于ICK基序蛋白表达ORF。在sta 不用于ICK基序蛋白表达ORF的情况下，
ersp 可不用接头与编码ICK基序蛋白的多核苷酸直接连接。icki的组分是编码ICK基序
蛋白(ICK)的多核苷酸区段，下标“j”表示不同的ICK基序蛋白；(接头i-ickj)N”表示编码间插接头肽和ICK基序蛋白的核苷酸结构可在相同的ICK基序蛋白表达ORF的同一可读框
中重复“N”次，其中N可以是1-10的任何整数，但可以变得甚至更高至15、20和25，这些重复序列可含有编码不同间插接头和不同ICK或CRIP基序蛋白的多核苷酸区段。在相同ICK
或CRIP基序蛋白表达ORF内包括重复序列的不同的多核苷酸区段全都在同一翻译框内。
用短划线符号分隔)的表达ICK基序蛋白复合物的多核苷酸可读框(ORF)，其可描述为
ERSP-STA-(LINKERI-ICKJ)N 或ERSP-(ICKJ-LINKERI)N-STA，或 为ERSP-STA-(LI-ICKJ)N 或ERSP-(ICKJ-LI)N-STA。显示这种类型的构建体的替代方法可见图中。在示图和附图中，ersp的核苷酸组分是编码植物内质网运输信号肽(ERSP)的多核苷酸区段。sta 的组分是编码
翻译稳定性蛋白(STA)的多核苷酸区段，其有助于表达的ICK基序蛋白在植物中蓄积但可
能不是ICK基序蛋白表达ORF必需的。li的组分是编码将ICK基序蛋白彼此分隔和与翻译
稳定性蛋白分隔开来的间插接头肽(L或LINKER)的多核苷酸区段，下标“i”表示不同类型的接头肽可用于ICK基序蛋白表达ORF。在sta 不用于ICK基序蛋白表达ORF的情况下，
ersp 可不用接头与编码ICK基序蛋白的多核苷酸直接连接。icki的组分是编码ICK基序
蛋白(ICK)的多核苷酸区段，下标“j”表示不同的ICK基序蛋白；(接头i-ickj)N”表示编码间插接头肽和ICK基序蛋白的核苷酸结构可在相同的ICK基序蛋白表达ORF的同一可读框
中重复“N”次，其中N可以是1-10的任何整数，但可以变得甚至更高至15、20和25，这些重复序列可含有编码不同间插接头和不同ICK或CRIP基序蛋白的多核苷酸区段。在相同ICK
或CRIP基序蛋白表达ORF内包括重复序列的不同的多核苷酸区段全都在同一翻译框内。
[0169] 该基序在自许多物种的毒液中分离的肽中是共有的。无脊椎动物物种包括蜘蛛、蝎、芋螺(cone snail)、海葵等，其它实例有很多，已知甚至蛇毒液都具有含ICK基序的肽。我们使用的蜘蛛中的一个实例是来自澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛的一类ACTX肽，但是
本文所述程序是有用的，可应用于含ICK基序的任何蛋白质。
本文所述程序是有用的，可应用于含ICK基序的任何蛋白质。
[0170] 含ICK基序的肽毒素的实例可见于下列参考文献。Lew, M.J.等人(“Structure-Function Relationships of ω-Conotoxin GVIA (ω-食 鱼 螺 毒 素
GVIA的结构-功能关系)” Journal of Biological Chemistry, 第272卷, 第18
期, 5月2日发行, 第12014-12023页, 1997)回顾了N型钙通道阻断剂ω-食鱼螺
毒素。Quintero-Hernandez, V.等人(“Scorpion and Spider Venom Peptides: Gene
Cloning and Peptide Expression (蝎和蜘蛛毒液肽：基因克隆和肽表达)” Toxicon,
58, 第644-663页, 2011)回顾了来自不同蜘蛛和蝎品种的许多节肢动物毒肽的概要。
在Takahashi, H.等. “Solution structure of hanatoxin1, a gating modifier of
voltage-dependent K+ channels: common surface features of gating modifier toxins (电压依赖性K+通道的门控调节剂hanatoxin1的溶液结构：门控调节剂毒素的一般表面
特征)” Journal of Molecular Biology, 第297卷, 第3期, 2000年3月31日, 第
771-780页中，使用NMR光谱法，将Hanatoxin1的三维结构鉴定为抑制物半胱氨酸结基序。
Zhu, S.等. “Evolutionary origin of inhibitor cystine knot peptides (抑制物胱氨酸结肽的进化起源) FASEB J., 2003年9月17日, (12):1765-7, 电子出版物2003
年7月3日发表了编码蝎毒液ICK毒素肽Opicalcine1的cDNA的分离和鉴定。Dauplais,
M.等人(“On the convergent evolution of animal toxins (有关动物毒素的趋同
进化)” Journal of Biological Chemistry. 1997年2月14日; 272(7): 4302-9)公
+
开了来自海葵Bunodosoma granulifera的K 通道阻断性毒素BgK的序列特异性排布和
二级结构鉴定。Escoubas, P.等人(“Structure and pharmacology of spider venom
neurotoxins (蜘蛛毒液神经毒素的结构和药理学)” Biochimie, 第82卷, 第9–10期,
2000年9月10日, 第893-907页)发表了强调表明半胱氨酸桥、半胱氨酸结形成和“成
结型(knotting-type)”折叠的多肽毒素结构、作用方式和分子进化的蜘蛛毒液的组成和药理学的综述。Galvez, A.等人(“Purification and characterization of a unique, potent, peptidyl probe for the high conductance calcium-activated potassium
channel from venom of the scorpion Buthus tamulus (来自蝎Buthus tamulus毒液的高传导性钙激活的钾通道的独特有效的肽基探针的纯化和表征)” Journal of Biological Chemistry, 1990年7月5日; 265(19): 11083-90)公开了纯化的肽iberiotoxin，一种
2+ +
来自蝎(Buthus tamulus)毒液的Ca 激活的K 通道的抑制剂。Gimenez-Gallego, G.等
人 (“Purification, sequence, and model structure of charybdotoxin, a potent selective inhibitor of calcium-activated potassium channels (一种钙激活的钾
通道的有效选择性抑制剂卡律蝎毒素的纯化、序列和模型结构)” Proc Natl Acad Sci,
1988年5月; 85(10): 3329–3333)公开了纯化的肽卡律蝎毒素，一种来自蝎Leiurus
2+ +
quinquestriatus 的毒液的Ca 激活的K 通道的抑制剂。根据这些和其它出版物，本领域的技术人员应能够容易地鉴定具有我们描述为ICK基序、ICK基序蛋白或“抑制物胱氨酸结基序”的蛋白质和肽。
GVIA的结构-功能关系)” Journal of Biological Chemistry, 第272卷, 第18
期, 5月2日发行, 第12014-12023页, 1997)回顾了N型钙通道阻断剂ω-食鱼螺
毒素。Quintero-Hernandez, V.等人(“Scorpion and Spider Venom Peptides: Gene
Cloning and Peptide Expression (蝎和蜘蛛毒液肽：基因克隆和肽表达)” Toxicon,
58, 第644-663页, 2011)回顾了来自不同蜘蛛和蝎品种的许多节肢动物毒肽的概要。
在Takahashi, H.等. “Solution structure of hanatoxin1, a gating modifier of
voltage-dependent K+ channels: common surface features of gating modifier toxins (电压依赖性K+通道的门控调节剂hanatoxin1的溶液结构：门控调节剂毒素的一般表面
特征)” Journal of Molecular Biology, 第297卷, 第3期, 2000年3月31日, 第
771-780页中，使用NMR光谱法，将Hanatoxin1的三维结构鉴定为抑制物半胱氨酸结基序。
Zhu, S.等. “Evolutionary origin of inhibitor cystine knot peptides (抑制物胱氨酸结肽的进化起源) FASEB J., 2003年9月17日, (12):1765-7, 电子出版物2003
年7月3日发表了编码蝎毒液ICK毒素肽Opicalcine1的cDNA的分离和鉴定。Dauplais,
M.等人(“On the convergent evolution of animal toxins (有关动物毒素的趋同
进化)” Journal of Biological Chemistry. 1997年2月14日; 272(7): 4302-9)公
+
开了来自海葵Bunodosoma granulifera的K 通道阻断性毒素BgK的序列特异性排布和
二级结构鉴定。Escoubas, P.等人(“Structure and pharmacology of spider venom
neurotoxins (蜘蛛毒液神经毒素的结构和药理学)” Biochimie, 第82卷, 第9–10期,
2000年9月10日, 第893-907页)发表了强调表明半胱氨酸桥、半胱氨酸结形成和“成
结型(knotting-type)”折叠的多肽毒素结构、作用方式和分子进化的蜘蛛毒液的组成和药理学的综述。Galvez, A.等人(“Purification and characterization of a unique, potent, peptidyl probe for the high conductance calcium-activated potassium
channel from venom of the scorpion Buthus tamulus (来自蝎Buthus tamulus毒液的高传导性钙激活的钾通道的独特有效的肽基探针的纯化和表征)” Journal of Biological Chemistry, 1990年7月5日; 265(19): 11083-90)公开了纯化的肽iberiotoxin，一种
2+ +
来自蝎(Buthus tamulus)毒液的Ca 激活的K 通道的抑制剂。Gimenez-Gallego, G.等
人 (“Purification, sequence, and model structure of charybdotoxin, a potent selective inhibitor of calcium-activated potassium channels (一种钙激活的钾
通道的有效选择性抑制剂卡律蝎毒素的纯化、序列和模型结构)” Proc Natl Acad Sci,
1988年5月; 85(10): 3329–3333)公开了纯化的肽卡律蝎毒素，一种来自蝎Leiurus
2+ +
quinquestriatus 的毒液的Ca 激活的K 通道的抑制剂。根据这些和其它出版物，本领域的技术人员应能够容易地鉴定具有我们描述为ICK基序、ICK基序蛋白或“抑制物胱氨酸结基序”的蛋白质和肽。
[0171] ICK基序蛋白可以是具有ICK基序且长度介于16和60个氨基酸之间的任何蛋白质，其具有产生正确顺序的共价交联二硫键的至少6个半胱氨酸残基。参见图6。一些ICK基序肽的长度介于26 -60个氨基酸之间。一些ICK基序蛋白的长度介于16-48个氨基酸
之间。一些ICK基序蛋白的长度介于26-48个氨基酸之间。一些ICK基序蛋白的长度介
于30-44个氨基酸之间。具有天然杀虫活性的ICK基序蛋白是优选的，但是具有其它类型
的活性(例如耐盐性和耐霜性)的ICK基序蛋白是本领域技术人员已知的和本文要求保护
的。杀虫ICK基序蛋白的实例包括ACTX肽和基因，并包括所有的肽及其称为Magi6的编码
基因。
之间。一些ICK基序蛋白的长度介于26-48个氨基酸之间。一些ICK基序蛋白的长度介
于30-44个氨基酸之间。具有天然杀虫活性的ICK基序蛋白是优选的，但是具有其它类型
的活性(例如耐盐性和耐霜性)的ICK基序蛋白是本领域技术人员已知的和本文要求保护
的。杀虫ICK基序蛋白的实例包括ACTX肽和基因，并包括所有的肽及其称为Magi6的编码
基因。
[0172] 如下图示的蛋白质表达ORF的一个实例可以是ICK基序蛋白表达ORF：ersp-sta-(接头 i-ickj)N或ersp-(ickj-接头i)N-sta
对于其它CRIP肽，可写出类似的表达式。在该部分中，表达ORF的这个实例是用于高
肽表达的表达ORF，并以ICK蛋白为最佳实例。上图为表达ICK基序蛋白复合物的多核苷
酸可读框(ORF)，所述复合物可描述为ERSP-STA-(LINKERI-ICKJ)N或ERSP-(ICKJ-LINKERI)N-STA，或ERSP-STA-(LI-ICKJ)N或ERSP-(ICKJ-LI)N-STA，含有4种可能的肽组分，各组分用短划线符号分隔。在该图中，ersp 的核苷酸组分是编码植物内质网运输信号肽(ERSP)的多核苷酸区段。sta的组分是编码翻译稳定性蛋白(STA)的多核苷酸区段，其有助于表达的ICK基序蛋白在植物中蓄积但可能不是ICK基序蛋白表达ORF必需的。li的组分是编码将
ICK基序蛋白彼此分隔和与翻译稳定性蛋白分隔开来的间插接头肽(L或LINKER)的多核苷
酸区段，下标“i”表示不同类型的接头肽可用于ICK基序蛋白表达ORF。在sta 不用于ICK基序蛋白表达ORF的情况下，ersp 可不用接头与编码ICK基序蛋白的多核苷酸直接连接。
icki的组分是编码ICK基序蛋白(ICK)的多核苷酸区段，下标“j”表示不同的ICK基序蛋
白；(接头i-ickj)N”表示编码间插接头肽和ICK基序蛋白的核苷酸结构可在相同的ICK基序蛋白表达ORF的同一可读框中重复“N”次，其中N可以是1-10的任何整数，且重复序列可含有编码不同间插接头和不同ICK或CRIP基序蛋白的多核苷酸区段。在相同ICK或CRIP
基序蛋白表达ORF内包括重复序列的不同的多核苷酸区段全都在同一翻译框内。
对于其它CRIP肽，可写出类似的表达式。在该部分中，表达ORF的这个实例是用于高
肽表达的表达ORF，并以ICK蛋白为最佳实例。上图为表达ICK基序蛋白复合物的多核苷
酸可读框(ORF)，所述复合物可描述为ERSP-STA-(LINKERI-ICKJ)N或ERSP-(ICKJ-LINKERI)N-STA，或ERSP-STA-(LI-ICKJ)N或ERSP-(ICKJ-LI)N-STA，含有4种可能的肽组分，各组分用短划线符号分隔。在该图中，ersp 的核苷酸组分是编码植物内质网运输信号肽(ERSP)的多核苷酸区段。sta的组分是编码翻译稳定性蛋白(STA)的多核苷酸区段，其有助于表达的ICK基序蛋白在植物中蓄积但可能不是ICK基序蛋白表达ORF必需的。li的组分是编码将
ICK基序蛋白彼此分隔和与翻译稳定性蛋白分隔开来的间插接头肽(L或LINKER)的多核苷
酸区段，下标“i”表示不同类型的接头肽可用于ICK基序蛋白表达ORF。在sta 不用于ICK基序蛋白表达ORF的情况下，ersp 可不用接头与编码ICK基序蛋白的多核苷酸直接连接。
icki的组分是编码ICK基序蛋白(ICK)的多核苷酸区段，下标“j”表示不同的ICK基序蛋
白；(接头i-ickj)N”表示编码间插接头肽和ICK基序蛋白的核苷酸结构可在相同的ICK基序蛋白表达ORF的同一可读框中重复“N”次，其中N可以是1-10的任何整数，且重复序列可含有编码不同间插接头和不同ICK或CRIP基序蛋白的多核苷酸区段。在相同ICK或CRIP
基序蛋白表达ORF内包括重复序列的不同的多核苷酸区段全都在同一翻译框内。
[0173] 杀虫ICK基序蛋白的实例包括ACTX肽和基因，并包括上文和本文提供的参考文献中描述的所有肽及其编码基因。所公开的用于提供实例的目的并且无意以任何方式限制的ICK基序蛋白和肽的具体实例，是上述肽及其同源物，特别是来源于澳大利亚漏斗网蜘蛛毒液的肽和核苷酸。下列美国的文件通过引用以其整体予以结合，是本领域技术人员已知的，并且全已发表。它们公开了许多ICK基序蛋白，其完整肽序列、其完整核苷酸序列已明确公开，并通过引用予以结合，此外完整的公开内容(包括其所有序列表)均通过引用予以结合。参见以下文献：2008年4月8日授予专利权的US 7,354,993 B2，具体地说来自
7,354,993 B2的作为序列1-39列于其中的肽和核苷酸序列，和名为U-ACTX多肽的那些、
可形成2-4个链内二硫桥的这些和其它毒素及其变体，以及7,354,993 B2的第4-9列和图
2中出现的肽。其它具体的序列可见于2008年10月8日公布和授予专利权的欧洲专利1
812 464 B1，参见Bulletin 2008/41，具体地说，序列表列出的肽和核苷酸序列，和可形成
2-4个链内二硫桥的那些其它毒素，和其中以1-39列出的那些序列，和名为U-ACTX多肽的序列及其变体，以及欧洲专利1 812 464 B1的段落0023-0055中出现的和图1中出现的肽。
7,354,993 B2的作为序列1-39列于其中的肽和核苷酸序列，和名为U-ACTX多肽的那些、
可形成2-4个链内二硫桥的这些和其它毒素及其变体，以及7,354,993 B2的第4-9列和图
2中出现的肽。其它具体的序列可见于2008年10月8日公布和授予专利权的欧洲专利1
812 464 B1，参见Bulletin 2008/41，具体地说，序列表列出的肽和核苷酸序列，和可形成
2-4个链内二硫桥的那些其它毒素，和其中以1-39列出的那些序列，和名为U-ACTX多肽的序列及其变体，以及欧洲专利1 812 464 B1的段落0023-0055中出现的和图1中出现的肽。
[0174] 参照本文鉴定的肽描述和予以结合的是所提及的序列的同源变体，与本文提及的这样的序列具有同源性，其按照本文所述处置方法也被鉴定为适于特别制备并要求保护，包括与本文公开的任何序列或与通过引用结合的任何序列具有至少任何下列百分比同一性的全部同源序列：与上述专利鉴定的任何和所有序列、与本文鉴定的任何其它序列(包括本申请序列表中的每一个序列)有50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、
97%、98%或99%或更大的同一性或100%同一性。当本文以数值(例如50%或更大)使用术
语同源或同源性时，则意味着是两个肽之间的百分比同一性或百分比相似性。当不用数字百分比使用同源或同源性时，则是指在进化或发育方面密切相关的两个肽序列，因为它们有共同的生理和功能方面，像局部毒性和类似的大小(即同源物在本文明确提及的或通过本文的上述参考文献鉴定的肽的长100%的长度或短50%的长度内)。
97%、98%或99%或更大的同一性或100%同一性。当本文以数值(例如50%或更大)使用术
语同源或同源性时，则意味着是两个肽之间的百分比同一性或百分比相似性。当不用数字百分比使用同源或同源性时，则是指在进化或发育方面密切相关的两个肽序列，因为它们有共同的生理和功能方面，像局部毒性和类似的大小(即同源物在本文明确提及的或通过本文的上述参考文献鉴定的肽的长100%的长度或短50%的长度内)。
[0175] 通过参照本文鉴定的肽描述和予以结合包括以下的毒肽：存在于、分离自或来源于以下蜘蛛的肽及其变体：澳毒蜘蛛属或Hadronyche属，包括属种Hadronyche versuta或布鲁山脉漏斗网蜘蛛、Atrax robustus、Atrax formidabilis、Atrax infensus；包括称为U-ACTX多肽、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b的毒素或突变体或变体，尤其这些类型任一种的肽和尤其小于约200个氨基酸但大于约10个氨基酸的肽，和尤其小于约150个氨基酸但大于约20个氨基酸的肽，尤其小于约100个氨基酸但大于约25氨基酸的
肽，尤其小于约65氨基酸但大于约25氨基酸的肽，尤其小于约55氨基酸但大于约25氨基
酸的肽，尤其约37或39或约36-42个氨基酸的肽，尤其具有小于约55个氨基酸但大于约
25个氨基酸的肽，尤其具有小于约45个氨基酸但大于约35个氨基酸的肽，尤其具有小于约
115个氨基酸但大于约75个氨基酸的肽，尤其具有小于约105个氨基酸但大于约85个氨基
酸的肽，尤其具有小于约100个氨基酸但大于约90个氨基酸的肽，包括可形成2、3和/或
4个或更多个链内二硫桥的本文提及的任何长度的肽毒素，包括破坏钙通道电流的毒素、包括破坏钾通道电流的毒素、尤其破坏昆虫钙通道或其Us的毒素、尤其任何这些类型的毒素或其变体，和具有口服或局部杀虫活性、可通过本文所述处置方法特别制备的本文所述任何类型的毒素的任何组合。
肽，尤其小于约65氨基酸但大于约25氨基酸的肽，尤其小于约55氨基酸但大于约25氨基
酸的肽，尤其约37或39或约36-42个氨基酸的肽，尤其具有小于约55个氨基酸但大于约
25个氨基酸的肽，尤其具有小于约45个氨基酸但大于约35个氨基酸的肽，尤其具有小于约
115个氨基酸但大于约75个氨基酸的肽，尤其具有小于约105个氨基酸但大于约85个氨基
酸的肽，尤其具有小于约100个氨基酸但大于约90个氨基酸的肽，包括可形成2、3和/或
4个或更多个链内二硫桥的本文提及的任何长度的肽毒素，包括破坏钙通道电流的毒素、包括破坏钾通道电流的毒素、尤其破坏昆虫钙通道或其Us的毒素、尤其任何这些类型的毒素或其变体，和具有口服或局部杀虫活性、可通过本文所述处置方法特别制备的本文所述任何类型的毒素的任何组合。
[0176] 来自澳大利亚漏斗网蜘蛛澳毒蜘蛛属和Hadronyche 属的U肽当通过本发明所述方法、程序或处置方法处理时特别适宜且运作良好。本文提供这类所测试并具有数据的合适肽的实例。还明确已知下列物种携带通过本发明的处置方法适于植物表达成为PIPs的
毒肽。下列物种具体命名为：Atrax formidabillis、Atrax infensus、Atrax robustus、Hadronyche infensa、Hadronyche versuta。来源于上列任何属和/或属种和与U肽同源
的任何毒肽适于按照本发明的处置方法植物表达成为PIPs。
毒肽。下列物种具体命名为：Atrax formidabillis、Atrax infensus、Atrax robustus、Hadronyche infensa、Hadronyche versuta。来源于上列任何属和/或属种和与U肽同源
的任何毒肽适于按照本发明的处置方法植物表达成为PIPs。
[0178] 如上所述，许多肽是作为用于植物表达成为PIP的处置方法主题的合适候选物。上文、下文和序列表中所述序列是可在植物中作为PIP表达的特别合适的肽，且这些肽中的一些已经作为本发明的PIP在植物中表达，其结果见下列实例。
[0179] GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A (SEQ ID NO. 5)名为“U+2-ACTX-Hv1a”，在5-20、12-25、19-39位上具有二硫桥。分子量为4564.85道
尔顿。ICK基序杀虫蛋白的另一个实例：
QYCVP VDQPC SLNTQ PCCDD ATCTQ ERNEN GHTVYYCRA (SEQ ID NO: 6)
名为“U-ACTX-Hv1a”，在3-18、10-23、17-37位上具有二硫桥。分子量为4426.84道尔
顿。
尔顿。ICK基序杀虫蛋白的另一个实例：
QYCVP VDQPC SLNTQ PCCDD ATCTQ ERNEN GHTVYYCRA (SEQ ID NO: 6)
名为“U-ACTX-Hv1a”，在3-18、10-23、17-37位上具有二硫桥。分子量为4426.84道尔
顿。
[0180] 其它实例包括序列表中的许多序列。
[0181] III. 翻译稳定性蛋白组分STA或sta。
[0182] ICK基序蛋白表达ORF之一ERSP-ICK，足以在转化植物中表达正确折叠的ICK基序肽，但为了有效地保护植物免遭害虫损害，植物表达的ICK基序蛋白必须蓄积到杀虫水平。随着正确构建的ICK基序蛋白表达ORF的转化，转基因植物可表达并蓄积更大量的正
确折叠的ICK基序蛋白。当植物蓄积更大量的正确折叠的毒肽时，可更容易地对抗或杀死攻击和摄食植物的昆虫。翻译稳定性蛋白可用来显著增加毒肽在植物中的蓄积，因此提高PIP的效能(尤其当PIP具有自身的翻译稳定性蛋白时)。参见图2-5中和下文所用各种
线性示图或等式样表达式中STA如何可用于表达ORF的各种表述。翻译稳定性蛋白可为另
一种蛋白质的结构域或可包含完整的蛋白质序列。翻译稳定性蛋白是一种具有充足三级结构的蛋白质，它可在细胞中蓄积而又不会成为蛋白质降解的细胞过程的目标。蛋白质可介于5和50aa之间(例如另一种ICK基序蛋白)、50-250aa (GNA)、250-750aa (例如几丁质
酶)和750-1500aa (例如增强蛋白)。
确折叠的ICK基序蛋白。当植物蓄积更大量的正确折叠的毒肽时，可更容易地对抗或杀死攻击和摄食植物的昆虫。翻译稳定性蛋白可用来显著增加毒肽在植物中的蓄积，因此提高PIP的效能(尤其当PIP具有自身的翻译稳定性蛋白时)。参见图2-5中和下文所用各种
线性示图或等式样表达式中STA如何可用于表达ORF的各种表述。翻译稳定性蛋白可为另
一种蛋白质的结构域或可包含完整的蛋白质序列。翻译稳定性蛋白是一种具有充足三级结构的蛋白质，它可在细胞中蓄积而又不会成为蛋白质降解的细胞过程的目标。蛋白质可介于5和50aa之间(例如另一种ICK基序蛋白)、50-250aa (GNA)、250-750aa (例如几丁质
酶)和750-1500aa (例如增强蛋白)。
[0183] 除图2-5以外，下面的线性示图描述了编码与ICK基序蛋白融合的稳定性蛋白的ICK基序蛋白表达ORF的一个实例：
ersp-sta-l-ick
该蛋白质或蛋白质结构域可含有除翻译稳定以外没有有用特性的蛋白质，或它们可具
有除翻译稳定以外的其它有用特性。有用特性可包括：另外的杀虫活性，例如对围食膜是破坏性的活性、对肠壁是破坏性的活性和/或主动将ICK基序蛋白跨过肠壁转运的活性。翻
译稳定性蛋白的一个实施方案可以是包括ICK基序蛋白的融合蛋白的聚合物。本文提供翻译稳定性蛋白的一个具体实例以说明翻译稳定性蛋白的用途。该实例无意以任何方式限制本公开内容或权利要求书。有用的翻译稳定性蛋白是本领域众所周知的，如本文所公开的，可以使用这种类型的任何蛋白质。评价和测试肽产生的程序均是本领域已知的，并且在本文中予以描述。一种翻译稳定性蛋白的一个实例是SEQ ID NO:7，一字母代码如下：
ASKGE ELFTG VVPIL VELDG DVNGH KFSVS GEGEG DATYG KLTLK FICTT
GKLPV PWPTL VTTFS YGVQC FSRYP DHMKR HDFFK SAMPE GYVQE RTISF
KDDGN YKTRA EVKFE GDTLV NRIEL KGIDF KEDGN ILGHK LEYNY NSHNV
YITAD KQKNG IKANF KIRHN IEDGS VQLAD HYQQN TPIGD GPVLL PDNHY
LSTQS ALSKD PNEKR DHMVL LEFVT AAGIT HGMDE LYK (SEQ ID NO: 7)。名为“GFP”。
分子量为26736.02道尔顿。
ersp-sta-l-ick
该蛋白质或蛋白质结构域可含有除翻译稳定以外没有有用特性的蛋白质，或它们可具
有除翻译稳定以外的其它有用特性。有用特性可包括：另外的杀虫活性，例如对围食膜是破坏性的活性、对肠壁是破坏性的活性和/或主动将ICK基序蛋白跨过肠壁转运的活性。翻
译稳定性蛋白的一个实施方案可以是包括ICK基序蛋白的融合蛋白的聚合物。本文提供翻译稳定性蛋白的一个具体实例以说明翻译稳定性蛋白的用途。该实例无意以任何方式限制本公开内容或权利要求书。有用的翻译稳定性蛋白是本领域众所周知的，如本文所公开的，可以使用这种类型的任何蛋白质。评价和测试肽产生的程序均是本领域已知的，并且在本文中予以描述。一种翻译稳定性蛋白的一个实例是SEQ ID NO:7，一字母代码如下：
ASKGE ELFTG VVPIL VELDG DVNGH KFSVS GEGEG DATYG KLTLK FICTT
GKLPV PWPTL VTTFS YGVQC FSRYP DHMKR HDFFK SAMPE GYVQE RTISF
KDDGN YKTRA EVKFE GDTLV NRIEL KGIDF KEDGN ILGHK LEYNY NSHNV
YITAD KQKNG IKANF KIRHN IEDGS VQLAD HYQQN TPIGD GPVLL PDNHY
LSTQS ALSKD PNEKR DHMVL LEFVT AAGIT HGMDE LYK (SEQ ID NO: 7)。名为“GFP”。
分子量为26736.02道尔顿。
[0184] 在一些实施方案中，STA甚至可以是CRIP或ICK，如图5所示。在这些实施方案中，没有单独的STA蛋白，STA蛋白与所用的CRIP或ICK相同。可以是同一个ICK与LINKER结合，或可能有不同的ICK，一种类型与LINKER结合，另一种类型起STA的作用。在LINKER部分还论述了这些替代的排布。
[0185] 翻译稳定性蛋白的其它实例可见于下列参考文献，通过引用以其整体予以结合：Kramer, K.J.等. “Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta (编码Manduca sexta 表皮和肠几
丁质酶的基因的cDNA序列和表达)” Insect Biochemistry and Molecular Biology,
第23卷, 第6期, 1993年9月, 第691-701页。Kramer，K.J.等人从烟草天蛾幼虫
Manduca sexta 中分离出几丁质酶编码cDNA并测序。Hashimoto, Y.等. “Location and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the
Trichoplusia ni granulosis virus (编码粉纹夜蛾颗粒体病病毒的病毒增强因子的基
因的定位和核苷酸序列)” Journal of General Virology, (1991), 72, 2645-2651。
Hashimoto，Y.等人克隆了编码粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)颗粒体病病毒的病毒增强因
子的基因并测定了完整的核苷酸序列。Van Damme, E.J.M.等. “Biosynthesis, primary structure and molecular cloning of snowdrop (Galanthus nivalis L.) lectin (雪花莲(Galanthus nivalis L.)凝集素的生物合成、一级结构和分子克隆)” European
Journal of Biochemistry, 202, 23-30 (1991)。Van Damme，E.J.M.等人从成熟子房中分离出雪花莲凝集素(GNA)的富含Poly(A)的RNA，当在无麦胚细胞系统中翻译时产生单一的17-kDa凝集素多肽，称为凝集素(agglutin)。这些参考文献和其它文献教导和公开了可用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的翻译稳定性蛋白。
丁质酶的基因的cDNA序列和表达)” Insect Biochemistry and Molecular Biology,
第23卷, 第6期, 1993年9月, 第691-701页。Kramer，K.J.等人从烟草天蛾幼虫
Manduca sexta 中分离出几丁质酶编码cDNA并测序。Hashimoto, Y.等. “Location and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the
Trichoplusia ni granulosis virus (编码粉纹夜蛾颗粒体病病毒的病毒增强因子的基
因的定位和核苷酸序列)” Journal of General Virology, (1991), 72, 2645-2651。
Hashimoto，Y.等人克隆了编码粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)颗粒体病病毒的病毒增强因
子的基因并测定了完整的核苷酸序列。Van Damme, E.J.M.等. “Biosynthesis, primary structure and molecular cloning of snowdrop (Galanthus nivalis L.) lectin (雪花莲(Galanthus nivalis L.)凝集素的生物合成、一级结构和分子克隆)” European
Journal of Biochemistry, 202, 23-30 (1991)。Van Damme，E.J.M.等人从成熟子房中分离出雪花莲凝集素(GNA)的富含Poly(A)的RNA，当在无麦胚细胞系统中翻译时产生单一的17-kDa凝集素多肽，称为凝集素(agglutin)。这些参考文献和其它文献教导和公开了可用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的翻译稳定性蛋白。
[0186] IV. PEPs的间插接头肽组分LINKER、接头、L或如果为多核苷酸：接头或l本发明所述的ICK基序蛋白表达ORF还在编码ICK基序蛋白(ick)和翻译稳定性蛋白
(sta)的多核苷酸序列之间，或在编码多个ICK基序蛋白结构域的多核苷酸序列((l-ick)N或(ick-l)N)之间(如果表达ORF包括多个ICK基序蛋白结构域表达)掺入了编码间插接
头肽的多核苷酸序列。间插接头肽(LINKERS)将表达的ICK基序蛋白复合物分隔成不同的
部分，有助于在表达过程期间复合物的不同部分的正确折叠。在表达的ICK基序蛋白复合物中，不同的间插接头肽可涉及隔开不同的功能结构域。具有LINKER的蛋白质的各种表述见(图3-5)。LINKER与CRIP (例如ICK)连接，并且该二价体类型(bivalent group)可
重复至多10次(N=1-10)，可能甚至超过10次，以利于正确折叠的杀虫肽在被保护的植物中蓄积。
(sta)的多核苷酸序列之间，或在编码多个ICK基序蛋白结构域的多核苷酸序列((l-ick)N或(ick-l)N)之间(如果表达ORF包括多个ICK基序蛋白结构域表达)掺入了编码间插接
头肽的多核苷酸序列。间插接头肽(LINKERS)将表达的ICK基序蛋白复合物分隔成不同的
部分，有助于在表达过程期间复合物的不同部分的正确折叠。在表达的ICK基序蛋白复合物中，不同的间插接头肽可涉及隔开不同的功能结构域。具有LINKER的蛋白质的各种表述见(图3-5)。LINKER与CRIP (例如ICK)连接，并且该二价体类型(bivalent group)可
重复至多10次(N=1-10)，可能甚至超过10次，以利于正确折叠的杀虫肽在被保护的植物中蓄积。
[0187] 间插接头肽的长度通常介于1和30个氨基酸之间。在植物中在表达的ICK基序蛋白复合物中它不是必需的基本组分。可将可切割的接头肽设计到ICK基序蛋白表达ORF
中，以在转化的植物中从表达的ICK基序蛋白复合物中释放正确折叠的ICK基序蛋白，来
改进ICK基序蛋白对植物保护免遭虫害。间插接头肽的一种类型是植物可切割的接头肽。
在植物细胞中在翻译后表达过程中，这种类型的接头肽可从表达的ICK基序蛋白表达复合物中完全去除。因此，通过这种类型的间插接头肽连接的正确折叠的ICK基序蛋白可在翻译后表达过程期间，在植物细胞中从表达的ICK基序蛋白复合物中释放。在此我们显示了LINKER的许多实例。
中，以在转化的植物中从表达的ICK基序蛋白复合物中释放正确折叠的ICK基序蛋白，来
改进ICK基序蛋白对植物保护免遭虫害。间插接头肽的一种类型是植物可切割的接头肽。
在植物细胞中在翻译后表达过程中，这种类型的接头肽可从表达的ICK基序蛋白表达复合物中完全去除。因此，通过这种类型的间插接头肽连接的正确折叠的ICK基序蛋白可在翻译后表达过程期间，在植物细胞中从表达的ICK基序蛋白复合物中释放。在此我们显示了LINKER的许多实例。
[0188] 可切割的间插接头肽的另一种类型在植物中在表达过程中是不可切割的。然而，它具有对丝氨酸、苏氨酸、光胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶有特异性的蛋白酶切割位点。该类型的可切割接头肽被存在于昆虫和鳞翅类肠环境和/或昆虫血淋巴和鳞翅类血淋巴环境中的蛋白酶消化，以将ICK基序蛋白释放到昆虫肠或血淋巴中。在此我们显示了LINKER的许多实例。这些接头只作为实例提供，并不应视为限制本发明。利用本公开内容所教导的信息，对于本领域的技术人员而言，制备或发现可用于本发明的LINKER的其它实例应是一个常规事件。
[0189] 说明本发明的间插接头的可切割类型的一个实例列于SEQ ID NO: 1中，但是可切割接头不限于该实例。SEQ ID NO: 1 (一字母代码)为IGER，在本文我们将其命名为
“IGER”。该间插接头或LINKER的分子量为473.53道尔顿。
“IGER”。该间插接头或LINKER的分子量为473.53道尔顿。
[0190] 间插接头肽(LINKER)还可以是没有任何类型的蛋白酶切割位点的间插接头，即不可切割的间插接头肽。其一个实例为接头ETMFKHGL (SEQ ID NO. 3)。
[0191] 间插接头肽的其它实例可见于下列参考文献，其通过引用以其整体予以结合：在Heath等. “Characterization of the protease processing sites in a multidomain proteinase inhibitor precursor from Nicotiana alata (来自Nicotiana alata 的多结构域蛋白水解酶抑制物前体中蛋白酶加工位点的表征)” European Journal of
Biochemistry, 1995; 230: 250-257中发现植物表达的丝氨酸蛋白水解酶抑制物前体含
有被6个相同接头肽分隔的5种同源的蛋白质抑制物。在Chang, H.C.等. “De novo
folding of GFP fusion proteins: high efficiency in eukaryotes but not in bacteria (GFP融合蛋白的从头折叠：在真核生物但非细菌中高效率)” Journal of Molecular
Biology, 2005年10月21日; 353(2): 397-409中，探索了绿色荧光蛋白通过6种不同
接头的折叠行为的比较。在Daskalova, S.M.等人“Engineering of N. benthamiana
L. plants for production of N-acetylgalactosamine-glycosylated proteins (用
于产生N-乙酰半乳糖胺糖基化蛋白质的N. benthamiana L.植物的工程改造)” BMC
Biotechnology, 2010年8月24日; 10: 62中表明人GalNAc-Ts家族的同种型GalNAc-T2
在N. benthamiana植物中表达时保持其定位和功能性。在Kwok, E.Y.等. “GFP-labelled Rubisco and aspartate aminotransferase are present in plastid stromules and
traffic between plastids (GFP标记的核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶和天冬氨酸氨基转移酶存在于质体基质填充小管中并在质体间运输)” Journal of Experimental Botany,
2004年3月; 55(397): 595-604. 电子出版物2004年1月30日中，表明了内源质
体蛋白质通过基质填充小管移动的能力。Borovsky, D.等人“Expression of Aedes
trypsin-modulating oostatic factor on the virion of TMV: A potential larvicide (TMV病毒体中伊蚊胰蛋白酶-调节抑卵因子的表达：潜在的杀幼虫剂)” Proc Natl Acad Sci, 2006年12月12日; 103(50): 18963–18968提交了有关用蚊十肽激素胰蛋白酶-调
节抑卵因子(TMOF)对烟草花叶病毒(TMV)病毒体表面的工程改造的报告。这些参考文献
和其它文献教导和公开了可用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的间插接头。
Biochemistry, 1995; 230: 250-257中发现植物表达的丝氨酸蛋白水解酶抑制物前体含
有被6个相同接头肽分隔的5种同源的蛋白质抑制物。在Chang, H.C.等. “De novo
folding of GFP fusion proteins: high efficiency in eukaryotes but not in bacteria (GFP融合蛋白的从头折叠：在真核生物但非细菌中高效率)” Journal of Molecular
Biology, 2005年10月21日; 353(2): 397-409中，探索了绿色荧光蛋白通过6种不同
接头的折叠行为的比较。在Daskalova, S.M.等人“Engineering of N. benthamiana
L. plants for production of N-acetylgalactosamine-glycosylated proteins (用
于产生N-乙酰半乳糖胺糖基化蛋白质的N. benthamiana L.植物的工程改造)” BMC
Biotechnology, 2010年8月24日; 10: 62中表明人GalNAc-Ts家族的同种型GalNAc-T2
在N. benthamiana植物中表达时保持其定位和功能性。在Kwok, E.Y.等. “GFP-labelled Rubisco and aspartate aminotransferase are present in plastid stromules and
traffic between plastids (GFP标记的核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶和天冬氨酸氨基转移酶存在于质体基质填充小管中并在质体间运输)” Journal of Experimental Botany,
2004年3月; 55(397): 595-604. 电子出版物2004年1月30日中，表明了内源质
体蛋白质通过基质填充小管移动的能力。Borovsky, D.等人“Expression of Aedes
trypsin-modulating oostatic factor on the virion of TMV: A potential larvicide (TMV病毒体中伊蚊胰蛋白酶-调节抑卵因子的表达：潜在的杀幼虫剂)” Proc Natl Acad Sci, 2006年12月12日; 103(50): 18963–18968提交了有关用蚊十肽激素胰蛋白酶-调
节抑卵因子(TMOF)对烟草花叶病毒(TMV)病毒体表面的工程改造的报告。这些参考文献
和其它文献教导和公开了可用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的间插接头。
[0192] 上述ICK基序蛋白表达ORF可瞬时或稳定地克隆到任何植物表达载体中用于植物中的ICK基序蛋白表达。
[0193] 瞬时植物表达系统对于植物中的一些特殊ICK基序蛋白表达，瞬时植物表达系统可用来迅速优化ICK基
序蛋白表达ORF的结构，包括一些组分的必要性，一些组分的密码子优化，各组分的顺序的优化等。瞬时植物表达载体常常来源于植物病毒基因组。由于植物病毒的感染性质所致，植物病毒载体在植物中提供快速和高水平的外源基因表达的优势。全长的植物病毒基因组可用作载体，但常常剔除病毒组分，例如外被蛋白，将转基因ORF亚克隆到该位置上。ICK基序蛋白表达ORF可亚克隆至这个位点以产生病毒载体。这些病毒载体可被机械地导入植物中，因为它们本身是感染性的，例如通过植物伤口、喷射等。它们还可通过农杆菌感染法，通过将病毒载体克隆至根癌细菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根细菌发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的T-DNA中，来转化至植物中。该载体中ICK基序蛋
白的表达受RNA病毒复制的控制，而将病毒翻译成mRNA用于复制受强病毒启动子的控制，例如，来自花椰菜花叶病毒的35S启动子。具有ICK基序蛋白表达ORF的病毒载体通常克
隆至二元载体中的T-DNA区域，所述二元载体自身可在大肠杆菌菌株和农杆菌属菌株两者中重复。植物的瞬时转化可通过用含有用于ICK基序蛋白表达的病毒载体的农杆菌细胞浸润植物叶来进行。在瞬时转化的植物中，由于转录后基因沉默(PTGS)所致，外源蛋白质表达在短时间内停止是常见的。有时PTGS抑制性蛋白质基因必须与用ICK基序蛋白表达ORF
驱动表达的相同类型的病毒载体一起瞬时共转化植物。这改进和延长ICK基序蛋白在植物中的表达。最常用的PTGS抑制性蛋白质是自番茄丛矮病毒(TBSV)发现的P19蛋白。
序蛋白表达ORF的结构，包括一些组分的必要性，一些组分的密码子优化，各组分的顺序的优化等。瞬时植物表达载体常常来源于植物病毒基因组。由于植物病毒的感染性质所致，植物病毒载体在植物中提供快速和高水平的外源基因表达的优势。全长的植物病毒基因组可用作载体，但常常剔除病毒组分，例如外被蛋白，将转基因ORF亚克隆到该位置上。ICK基序蛋白表达ORF可亚克隆至这个位点以产生病毒载体。这些病毒载体可被机械地导入植物中，因为它们本身是感染性的，例如通过植物伤口、喷射等。它们还可通过农杆菌感染法，通过将病毒载体克隆至根癌细菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根细菌发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的T-DNA中，来转化至植物中。该载体中ICK基序蛋
白的表达受RNA病毒复制的控制，而将病毒翻译成mRNA用于复制受强病毒启动子的控制，例如，来自花椰菜花叶病毒的35S启动子。具有ICK基序蛋白表达ORF的病毒载体通常克
隆至二元载体中的T-DNA区域，所述二元载体自身可在大肠杆菌菌株和农杆菌属菌株两者中重复。植物的瞬时转化可通过用含有用于ICK基序蛋白表达的病毒载体的农杆菌细胞浸润植物叶来进行。在瞬时转化的植物中，由于转录后基因沉默(PTGS)所致，外源蛋白质表达在短时间内停止是常见的。有时PTGS抑制性蛋白质基因必须与用ICK基序蛋白表达ORF
驱动表达的相同类型的病毒载体一起瞬时共转化植物。这改进和延长ICK基序蛋白在植物中的表达。最常用的PTGS抑制性蛋白质是自番茄丛矮病毒(TBSV)发现的P19蛋白。
[0194] 瞬时植物表达的证明可见于图7。
[0195] 图7显示瞬时表达的植物转基因蛋白。图7中报告了通过ELISA测定的与% TSP相比ICK蛋白的相对蓄积。在图7中，有4种变化的ICK表达ORF，说明ERSP对得到正确
折叠的ICK和STA对得到蛋白质蓄积的必要性。条形柱A报告了表达SEQ ID NO: 8即无
任何融合的ω肽(ICK)的FECT表达系统。条形柱B报告了表达SEQ ID NO: 9即与ω肽
(ICK)融合的BAAS ERSP的TRBO表达系统。条形柱C报告了表达SEQ ID NO: 10即与融
合杂合毒素(ICK)的IGER (接头)融合的GFP (STA)的FECT表达系统。条形柱D报告了
表达SEQ ID NO:11即与融合与杂合毒素(ICK)融合的IGER (接头)的GFP (STA)融合的
BAAS (ERSP)的FECT表达系统。条形柱A和B的检测水平显示可忽略的蛋白质检测。在
条形柱A中，这可能是因在ER中发生的ICK的未正确折叠所致，在条形柱B中，这可能是因正确折叠但因缺乏STA而无蓄积所致。在条形柱C和D中有可检测水平。当进行条形柱C
[(SEQ ID NO: 10)，一种与融合杂合毒素(ICK)的IGER (接头)融合的GFP (STA)]的实
验时，有检出的高水平的GFP荧光(数据未显示)，表明了大量TSP是融合蛋白，然而，当进行ELISA时，只检出0.01%的TSP，这可能是由于缺乏正确折叠所致，所述正确折叠未发生，因为这种蛋白质没有导向在其中发生折叠的ER。用于ELISA的抗体只检测正确折叠的蛋
白质的三级结构。当进行条形柱D [SEQ ID NO:11，一种与融合与杂合毒素(ICK)融合的
IGER (接头)的GFP (STA)融合的BAAS (ERSP)]的实验时，有一些检出的GFP荧光和蓄积
0.1%的TSP即与GFP融合的ICK肽。当条形柱A、B、C和D的数据合在一起时，显然，为了
得到正确折叠，ICK表达ORF中的ERSP是必需的，而对于增加肽的蓄积，STA是必需的。
折叠的ICK和STA对得到蛋白质蓄积的必要性。条形柱A报告了表达SEQ ID NO: 8即无
任何融合的ω肽(ICK)的FECT表达系统。条形柱B报告了表达SEQ ID NO: 9即与ω肽
(ICK)融合的BAAS ERSP的TRBO表达系统。条形柱C报告了表达SEQ ID NO: 10即与融
合杂合毒素(ICK)的IGER (接头)融合的GFP (STA)的FECT表达系统。条形柱D报告了
表达SEQ ID NO:11即与融合与杂合毒素(ICK)融合的IGER (接头)的GFP (STA)融合的
BAAS (ERSP)的FECT表达系统。条形柱A和B的检测水平显示可忽略的蛋白质检测。在
条形柱A中，这可能是因在ER中发生的ICK的未正确折叠所致，在条形柱B中，这可能是因正确折叠但因缺乏STA而无蓄积所致。在条形柱C和D中有可检测水平。当进行条形柱C
[(SEQ ID NO: 10)，一种与融合杂合毒素(ICK)的IGER (接头)融合的GFP (STA)]的实
验时，有检出的高水平的GFP荧光(数据未显示)，表明了大量TSP是融合蛋白，然而，当进行ELISA时，只检出0.01%的TSP，这可能是由于缺乏正确折叠所致，所述正确折叠未发生，因为这种蛋白质没有导向在其中发生折叠的ER。用于ELISA的抗体只检测正确折叠的蛋
白质的三级结构。当进行条形柱D [SEQ ID NO:11，一种与融合与杂合毒素(ICK)融合的
IGER (接头)的GFP (STA)融合的BAAS (ERSP)]的实验时，有一些检出的GFP荧光和蓄积
0.1%的TSP即与GFP融合的ICK肽。当条形柱A、B、C和D的数据合在一起时，显然，为了
得到正确折叠，ICK表达ORF中的ERSP是必需的，而对于增加肽的蓄积，STA是必需的。
[0196] 我们证实并记载了在使用设计用于引导表达的不同FECT载体瞬时转化的烟草叶中GFP-杂合融合蛋白构建体的绿色荧光的GFP发射。我们在使用用于APO (质外体定位)
蓄积的pFECT-BGIH载体、用于CYTO (胞质定位)蓄积的pFECT-GIH载体和用于ER (内质
网定位)蓄积的pFECT-BGIH-ER载体中获得成功。数据未显示。
蓄积的pFECT-BGIH载体、用于CYTO (胞质定位)蓄积的pFECT-GIH载体和用于ER (内质
网定位)蓄积的pFECT-BGIH-ER载体中获得成功。数据未显示。
[0197] 我们证实并记载了用在不同类型的ERSP瞬时转化的烟草叶中GFP-杂合融合蛋白构建体的绿色荧光的GFP发射。我们在证实用pFECT-BGIH载体的表达、用FECT-EGIH载体
的表达和用pFECT-E*GIH载体的表达中获得成功。数据未显示。
的表达和用pFECT-E*GIH载体的表达中获得成功。数据未显示。
[0198] 我们测量了肽蓄积的水平，这显示于图8和9中。图8是具有不同蓄积定位的烟草瞬时表达的GFP融合的U-ACTX-Hv1a的iELISA检测的%TSP图。APO：质外体定位；CYTO：
胞质定位；ER：内质网定位。图9是使用编码具有3种不同ERSP序列的翻译融合物的FECT
表达载体，烟草叶瞬时表达GFP融合的U-ACTX-Hv1a的iELISA检测的%TSP图：BAAS信号
肽(BGIH)、伸展蛋白信号肽(EGIH)和修饰的伸展蛋白信号肽(E*GIH)。
胞质定位；ER：内质网定位。图9是使用编码具有3种不同ERSP序列的翻译融合物的FECT
表达载体，烟草叶瞬时表达GFP融合的U-ACTX-Hv1a的iELISA检测的%TSP图：BAAS信号
肽(BGIH)、伸展蛋白信号肽(EGIH)和修饰的伸展蛋白信号肽(E*GIH)。
[0199] 采用稳定植物转化技术使蛋白质表达ORF整合至植物基因组采用稳定植物转化技术，ICK基序蛋白表达ORF还可整合至植物基因组，因此，ICK基序
蛋白可在植物中稳定表达，并世世代代保护转化的植物。对于植物的稳定转化，ICK基序蛋白表达载体可以是环状的或线性的。几个关键组分必须包括在载体DNA中。为了稳定植物转化，可根据上述瞬时植物表达中的研究，应仔细设计用于在植物中最佳表达的ICK基序蛋白表达ORF。ICK基序蛋白的表达通常受在转基因植物所有细胞的一些中启动转录的启
动子控制。启动子可以是强植物病毒启动子，例如，来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的组成型
35S启动子；它也可以是强植物启动子，例如来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的氢过氧化物裂解酶启动子(pHPL)、来自大豆的Glycine max多聚遍在蛋白(Gmubi)启动子、来自不同植物物种(稻、玉米、马铃薯等)等的遍在蛋白启动子等。植物转录终止子常常出现在ORF的终止密码子之后以停止RNA聚合酶和mRNA的转录。为了评价ICK基序蛋白表达，报
道基因可包括在ICK基序蛋白表达载体中，例如用于GUS染色测定的β-葡糖醛酸糖苷酶
基因(GUS)、用于紫外线下的绿色荧光检测的绿色荧光蛋白(GFP)基因等。对于转化植物的选择，选择标记基因通常包括在ICK基序蛋白表达载体中。标记基因表达产物可提供对特定抗生素(例如卡那霉素、潮霉素等)或特定除草剂(例如草甘膦等)有抗性的转化植物。
如果农杆菌感染法技术用于植物转化，则T-DNA左边界和右边界序列也包括在ICK基序蛋
白表达载体中以将T-DNA部分转运到植物中。可采用多种转化技术，将构建的ICK基序蛋
白表达载体转化到植物细胞或组织中。农杆菌感染法是一种使用根癌农杆菌菌株或发根农杆菌菌株转化植物的非常普遍的方法。粒子轰击(亦称基因枪或生物射弹(Biolistics))
技术也非常普遍地用于植物转化。其它不太常用的转化方法包括组织电穿孔、碳化硅晶须、DNA直接注射等。在转化后，将转化的植物细胞或组织放入植物再生培养基中，以将转化的植物细胞或组织成功地再生为转基因植物。转化的植物中ICK基序蛋白表达ORF的整合和
表达的评价可如下进行。
蛋白可在植物中稳定表达，并世世代代保护转化的植物。对于植物的稳定转化，ICK基序蛋白表达载体可以是环状的或线性的。几个关键组分必须包括在载体DNA中。为了稳定植物转化，可根据上述瞬时植物表达中的研究，应仔细设计用于在植物中最佳表达的ICK基序蛋白表达ORF。ICK基序蛋白的表达通常受在转基因植物所有细胞的一些中启动转录的启
动子控制。启动子可以是强植物病毒启动子，例如，来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的组成型
35S启动子；它也可以是强植物启动子，例如来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的氢过氧化物裂解酶启动子(pHPL)、来自大豆的Glycine max多聚遍在蛋白(Gmubi)启动子、来自不同植物物种(稻、玉米、马铃薯等)等的遍在蛋白启动子等。植物转录终止子常常出现在ORF的终止密码子之后以停止RNA聚合酶和mRNA的转录。为了评价ICK基序蛋白表达，报
道基因可包括在ICK基序蛋白表达载体中，例如用于GUS染色测定的β-葡糖醛酸糖苷酶
基因(GUS)、用于紫外线下的绿色荧光检测的绿色荧光蛋白(GFP)基因等。对于转化植物的选择，选择标记基因通常包括在ICK基序蛋白表达载体中。标记基因表达产物可提供对特定抗生素(例如卡那霉素、潮霉素等)或特定除草剂(例如草甘膦等)有抗性的转化植物。
如果农杆菌感染法技术用于植物转化，则T-DNA左边界和右边界序列也包括在ICK基序蛋
白表达载体中以将T-DNA部分转运到植物中。可采用多种转化技术，将构建的ICK基序蛋
白表达载体转化到植物细胞或组织中。农杆菌感染法是一种使用根癌农杆菌菌株或发根农杆菌菌株转化植物的非常普遍的方法。粒子轰击(亦称基因枪或生物射弹(Biolistics))
技术也非常普遍地用于植物转化。其它不太常用的转化方法包括组织电穿孔、碳化硅晶须、DNA直接注射等。在转化后，将转化的植物细胞或组织放入植物再生培养基中，以将转化的植物细胞或组织成功地再生为转基因植物。转化的植物中ICK基序蛋白表达ORF的整合和
表达的评价可如下进行。
[0200] 转化植物的评价转化植物的评价可在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平上进行。稳定转化的植物可在所
有这些水平上评价，而瞬时转化的植物通常只在蛋白质水平上评价。为了确保ICK表达基序蛋白表达ORF整合到稳定转化的植物的基因组中，可从稳定转化的植物组织中提取基因组DNA用于PCR评价或DNA印迹法应用。稳定转化的植物中ICK基序蛋白的表达可在RNA
水平上评价，即可从转化的植物组织中提取总mRNA，并可将RNA印迹法技术和RT-PCR技术应用于定性或定量评价ICK基序蛋白的mRNA水平。转化植物中ICK基序蛋白的表达也可
直接在蛋白质水平上评价。存在许多评价在转化植物中表达的ICK基序蛋白的方法。如果报道基因连同ICK基序蛋白表达ORF转化到植物中，则可进行报道基因测定法以初步评价
转化的ICK基序蛋白表达ORF的表达，例如用于GUS报道基因表达的GUS染色测定、用于
GFP报道基因表达的绿色荧光检测实验、用于萤光素酶报道基因表达的萤光素酶测定等。此外，可从转化的植物组织中提取的表达的总蛋白质用于直接评价转化的植物中的ICK基序蛋白的表达。提取的表达的总蛋白质样品可用于Bradford测定法以评价样品中总的蛋白
质水平。分析型HPLC色谱技术、蛋白质印迹技术或iELISA测定法可用于定性或定量评价
从转化的植物组织中提取的总蛋白质样品中的ICK基序蛋白。还可在昆虫生物测定中，通过使用从转化的植物组织中提取的总蛋白质样品，来评价ICK基序蛋白表达。最后，可在昆虫生物测定中测试转化的植物组织或完整的转化植物以评价ICK基序蛋白表达及其对植
物的保护。
有这些水平上评价，而瞬时转化的植物通常只在蛋白质水平上评价。为了确保ICK表达基序蛋白表达ORF整合到稳定转化的植物的基因组中，可从稳定转化的植物组织中提取基因组DNA用于PCR评价或DNA印迹法应用。稳定转化的植物中ICK基序蛋白的表达可在RNA
水平上评价，即可从转化的植物组织中提取总mRNA，并可将RNA印迹法技术和RT-PCR技术应用于定性或定量评价ICK基序蛋白的mRNA水平。转化植物中ICK基序蛋白的表达也可
直接在蛋白质水平上评价。存在许多评价在转化植物中表达的ICK基序蛋白的方法。如果报道基因连同ICK基序蛋白表达ORF转化到植物中，则可进行报道基因测定法以初步评价
转化的ICK基序蛋白表达ORF的表达，例如用于GUS报道基因表达的GUS染色测定、用于
GFP报道基因表达的绿色荧光检测实验、用于萤光素酶报道基因表达的萤光素酶测定等。此外，可从转化的植物组织中提取的表达的总蛋白质用于直接评价转化的植物中的ICK基序蛋白的表达。提取的表达的总蛋白质样品可用于Bradford测定法以评价样品中总的蛋白
质水平。分析型HPLC色谱技术、蛋白质印迹技术或iELISA测定法可用于定性或定量评价
从转化的植物组织中提取的总蛋白质样品中的ICK基序蛋白。还可在昆虫生物测定中，通过使用从转化的植物组织中提取的总蛋白质样品，来评价ICK基序蛋白表达。最后，可在昆虫生物测定中测试转化的植物组织或完整的转化植物以评价ICK基序蛋白表达及其对植
物的保护。
[0201] 我们如下提供了第I部分的详细描述和摘要：我们描述了包含与富含半胱氨酸的杀虫蛋白(CRIP)例如抑制物半胱氨酸结(ICK)
基序蛋白有效连接的内质网信号肽(ERSP)的蛋白质，其中所述ERSP是所述蛋白质
(ERSP-ICK)的N端。ERSP是将表达的CRIP导向植物细胞的内质网的任何信号肽。CRIP
可以是抑制物半胱氨酸结(ICK)蛋白或非ICK蛋白。ERSP是来源于植物的长度为5-50个
氨基酸的肽，其与翻译稳定性蛋白(STA)有效连接，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，
并且间插STA序列可在CRIP的N端一侧，CRIP任选为ICK基序蛋白(ERSP-STA-ICK)或非
ICK基序蛋白(ERSP-STA-非ICK)；或间插STA序列可在ICK或非ICK基序蛋白的C端一侧
(ERSP-ICK-STA)或(ERSP--非ICK-STA)。ERSP是长度介于3-60个氨基酸之间的肽，或长
度介于5-50个氨基酸之间的肽，或长度介于20-30个氨基酸之间的肽。它可来源于植物，具有SEQ ID NO 4的大麦α淀粉酶信号肽(BAAS)。ERSP可以是具有SEQ ID NO 18的烟
草伸展蛋白信号肽的肽。ERSP可以是具有SEQ ID NO 19的修饰的烟草伸展蛋白信号肽或
来自Juniperus ashei 的具有SEQ ID NO 27的Jun a 3信号肽。
基序蛋白有效连接的内质网信号肽(ERSP)的蛋白质，其中所述ERSP是所述蛋白质
(ERSP-ICK)的N端。ERSP是将表达的CRIP导向植物细胞的内质网的任何信号肽。CRIP
可以是抑制物半胱氨酸结(ICK)蛋白或非ICK蛋白。ERSP是来源于植物的长度为5-50个
氨基酸的肽，其与翻译稳定性蛋白(STA)有效连接，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，
并且间插STA序列可在CRIP的N端一侧，CRIP任选为ICK基序蛋白(ERSP-STA-ICK)或非
ICK基序蛋白(ERSP-STA-非ICK)；或间插STA序列可在ICK或非ICK基序蛋白的C端一侧
(ERSP-ICK-STA)或(ERSP--非ICK-STA)。ERSP是长度介于3-60个氨基酸之间的肽，或长
度介于5-50个氨基酸之间的肽，或长度介于20-30个氨基酸之间的肽。它可来源于植物，具有SEQ ID NO 4的大麦α淀粉酶信号肽(BAAS)。ERSP可以是具有SEQ ID NO 18的烟
草伸展蛋白信号肽的肽。ERSP可以是具有SEQ ID NO 19的修饰的烟草伸展蛋白信号肽或
来自Juniperus ashei 的具有SEQ ID NO 27的Jun a 3信号肽。
[0202] 我们描述了一个CRIP实例，其是长度介于16和60个氨基酸之间、长度介于26和48个氨基酸之间、长度介于30和44个氨基酸之间的ICK基序蛋白，其中它选自具有抑制性半胱氨酸结基序的任何肽或肽源，或杀虫肽，且其中它是包括澳毒蜘蛛属或Hadronyche 属的任何肽或肽源、来源于Hadronyche versuta 的任何肽，为一种ACTX肽。ICK基序蛋白是任何杀虫肽及其片段，包括所述肽和序列号的成熟、前肽和肽原形式以及肽区段的任何突变或缺失或添加但仍保持抑制性半胱氨酸结结构。ICK基序蛋白可以是具有SEQ ID NO: 6的U-ACTX-Hv1a、具有SEQ ID NO:24的ω-ACTX-Hv1a、κ-ACTX-Hv1c。一种表达ORF，其包含编码这些肽的任何核苷酸。一种表达ORF，其包含编码整合到转基因植物基因组中的肽的任何核苷酸。本文所述任何肽或核苷酸在制备或转化植物或植物基因组从而在转化的植物中表达正确折叠的杀虫肽，和/或制备或转化植物或植物基因组从而在转化的植物中表达正确折叠的杀虫肽并引起表达和正确折叠的杀虫肽在所述植物中蓄积并使植物对虫害的
抗性提高中的用途。我们描述了使用核苷酸产生具有或表达本文所述任何肽的转基因植物和转化植物的程序。我们描述了由这些产物和处置方法的任一种制备的转化植物。
抗性提高中的用途。我们描述了使用核苷酸产生具有或表达本文所述任何肽的转基因植物和转化植物的程序。我们描述了由这些产物和处置方法的任一种制备的转化植物。
[0203] 我们描述了包含与任选为与翻译稳定性蛋白(STA)有效连接的抑制物半胱氨酸结(ICK)基序蛋白或非ICK蛋白的CRIP有效连接的内质网信号肽(ERSP)的蛋白质，其中
所述ERSP是所述蛋白质的N端，间插翻译稳定性蛋白序列可以在ICK基序蛋白的N端一侧
(ERSP-STA-ICK)或任选(ERSP-非ICK-STA)或ICK基序蛋白的C端一侧(ERSP-ICK-STA)
或ERSP-STA-非ICK)。
所述ERSP是所述蛋白质的N端，间插翻译稳定性蛋白序列可以在ICK基序蛋白的N端一侧
(ERSP-STA-ICK)或任选(ERSP-非ICK-STA)或ICK基序蛋白的C端一侧(ERSP-ICK-STA)
或ERSP-STA-非ICK)。
[0204] 我们描述了分子量为12 kD和12 kD以上的这类STA，其中所述STA可以是多种蛋白质，包括分子量为12 kD和12 kD以上的ICK基序蛋白，或分子量为12 kD和12 kD以
上的与接头肽(L)连接的多个ICK基序蛋白，例如ERSP-ICK-(Li-ICKj)N或ERSP-(ICKj-Li)N-ICK。我们解释了接头肽可以是相同的或不同的。我们表明一种STA是来源于水母的具
有SEQ ID NO 13的绿色荧光蛋白质(GFP)，STA可以是具有SEQ ID NO 28的雪花莲凝集素
Galanthus nivalis凝集素(GNA)，并且STA可以是具有SEQ ID NO 26的Juniperus ashei
蛋白质Jun a 3。
上的与接头肽(L)连接的多个ICK基序蛋白，例如ERSP-ICK-(Li-ICKj)N或ERSP-(ICKj-Li)N-ICK。我们解释了接头肽可以是相同的或不同的。我们表明一种STA是来源于水母的具
有SEQ ID NO 13的绿色荧光蛋白质(GFP)，STA可以是具有SEQ ID NO 28的雪花莲凝集素
Galanthus nivalis凝集素(GNA)，并且STA可以是具有SEQ ID NO 26的Juniperus ashei
蛋白质Jun a 3。
[0205] 我们描述了LINKER是长度为4-20个氨基酸的任何肽。我们描述了作为含有蛋白酶识别位点的任何肽的LINKER。我们描述了LINKER为含有植物蛋白酶切割位点的任何肽。
我们描述了LINKER是含有IGER (SEQ ID NO:1)、EEKKN (SEQ ID NO:2)和(SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列的肽。我们描述了LINKER为可在昆虫消化系统中或在昆虫血淋巴中被切割
的任何肽。我们描述了LINKER，其中所述LINKER是含有胰蛋白酶切割位点的肽。
我们描述了LINKER是含有IGER (SEQ ID NO:1)、EEKKN (SEQ ID NO:2)和(SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列的肽。我们描述了LINKER为可在昆虫消化系统中或在昆虫血淋巴中被切割
的任何肽。我们描述了LINKER，其中所述LINKER是含有胰蛋白酶切割位点的肽。
[0206] 我们描述了编码所述任何蛋白质的核苷酸，包括包含编码所述肽的任何核苷酸的表达ORF，以及包含编码所述肽的任何核苷酸的表达ORF，其整合到转基因植物基因组中，以及转化到植物或植物基因组中从而在转化的植物中表达正确折叠的杀虫肽，以及转化到植物或植物基因组中从而在转化的植物中表达正确折叠的杀虫肽并引起表达和正确折叠的杀虫肽在所述植物中蓄积并使植物对虫害的抗性提高。我们描述了产生于这些描述的转基因植物和具有或表达本文所述任何肽的转化植物。
[0207] 我们解释和描述了包含编码本文所述肽的任何核苷酸的表达ORF以及整合到转基因植物基因组中的表达ORF，这样做的一个原因是制备或转化植物或植物基因组从而在转化的植物中表达正确折叠的杀虫肽，且这样做的一个原因是使转化的植物引起表达和正确折叠的杀虫肽在所述植物中蓄积并使植物对虫害的抗性提高。我们教导了如何使用这些程序，并表达本文所述肽和本领域的技术人员鉴于本文教导和使用本文所述任何产物和处置方法使用的任何其它肽，来制备转基因植物。
[0208] 我们教导了如何制备这样的蛋白质，其包含有效连接与有效连接间插接头肽(L)的翻译稳定性蛋白(STA)有效连接的抑制物半胱氨酸结(ICK)基序蛋白的内质网信号肽(ERSP)，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，且所述LINKER介于STA和ICK基序蛋白之
间，所述翻译稳定性蛋白可位于ICK基序蛋白的N端一侧(上游)或ICK基序蛋白的C端
一侧(下游)，并描述为ERSP-STA-L-ICK或ERSP-ICK-L-STA。我们解释了上述ERSP、CRIP
和ICK、LINKER、STA可以是本文描述的任何肽和本领域的技术人员鉴于本文教导内容并使用本文所述任何产物和处置方法使用的任何其它肽。
间，所述翻译稳定性蛋白可位于ICK基序蛋白的N端一侧(上游)或ICK基序蛋白的C端
一侧(下游)，并描述为ERSP-STA-L-ICK或ERSP-ICK-L-STA。我们解释了上述ERSP、CRIP
和ICK、LINKER、STA可以是本文描述的任何肽和本领域的技术人员鉴于本文教导内容并使用本文所述任何产物和处置方法使用的任何其它肽。
[0209] 我们教导了如何制备这样的蛋白质，其包含有效连接与有效连接间插接头肽(L)的翻译稳定性蛋白(STA)有效连接的多个抑制物半胱氨酸结(ICK)基序蛋白结构域(其中ICK基序蛋白通过间插接头肽(L)彼此连接)的内质网信号肽(ERSP)，其中所述ERSP是所
述蛋白质的N端，所述LINKER介于STA和多个ICK基序蛋白结构域之间，且所述STA可位于
多个ICK基序蛋白结构域的N端一侧(上游)或多个ICK基序蛋白结构域的C端一侧(下
游)，并描述为ERSP-STA-(Li-ICKj)N或ERSP-(ICKj-Li)N-STA。
述蛋白质的N端，所述LINKER介于STA和多个ICK基序蛋白结构域之间，且所述STA可位于
多个ICK基序蛋白结构域的N端一侧(上游)或多个ICK基序蛋白结构域的C端一侧(下
游)，并描述为ERSP-STA-(Li-ICKj)N或ERSP-(ICKj-Li)N-STA。
[0210] 我们教导了如何制备编码这些蛋白质的核苷酸，即表达ORF；如何制备并将所述核苷酸整合至转基因植物基因组、嵌合基因、重组载体、转基因宿主细胞、转基因植物细胞、转基因植物，所述转基因植物为玉米、大豆、棉、稻、小麦、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、任何绿叶蔬菜或任何果树或本文提及的任何植物和物种和来自这些程序的转基因植物的种子，其中所述种子包含嵌合基因。实施例
[0211] 本说明书中的实施例无意且不应用来限制本发明；它们仅供说明本发明。
[0212] 实施例1两个瞬时植物表达系统之间的表达比较。
[0213] 采用瞬时植物转化技术以快速优化ICK基序蛋白表达ORF用于植物表达。用植物病毒载体的农杆菌感染法技术因其高效率、简易和便宜而在此处被用于瞬时植物转化。本文针对植物中的ICK基序蛋白表达，评价了两个病毒瞬时植物表达系统。一个是烟草花叶病毒过量表达系统(TRBO, Lindbo JA, Plant Physiology, 2007, V145: 1232-1240)。
TRBO DNA载体具有用于农杆菌感染法的T-DNA区域，其含有驱动没有编码病毒外被蛋白的基因的烟草花叶病毒RNA表达的CaMV 35S启动子。另一个病毒瞬时植物表达系统是FECT
表达系统(Liu Z和Kearney CM, BMC Biotechnology, 2010, 10:88)。FECT载体也含有
用于农杆菌感染法的T-DNA区域，其含有驱动没有编码病毒外被蛋白的基因和三基因框的狐尾草花叶病毒RNA表达的CaMV 35S启动子。两个表达系统使用“无害的”病毒基因组，因此，可有效地防止病毒植物-植物间的传递。为了有效表达所导入的异源基因，FECT表达系统还需要共表达P19，一种来自番茄丛矮病毒的RNA沉默抑制蛋白，以防止所导入的T-DNA的转录后基因沉默(PTGS)。(TRBO表达系统不需要P19的共表达)。如下文所述，通过烟
草(Nicotiana benthamiana)中ICK基序蛋白的瞬时表达，对两个瞬时植物表达系统进行
了测试和比较。
TRBO DNA载体具有用于农杆菌感染法的T-DNA区域，其含有驱动没有编码病毒外被蛋白的基因的烟草花叶病毒RNA表达的CaMV 35S启动子。另一个病毒瞬时植物表达系统是FECT
表达系统(Liu Z和Kearney CM, BMC Biotechnology, 2010, 10:88)。FECT载体也含有
用于农杆菌感染法的T-DNA区域，其含有驱动没有编码病毒外被蛋白的基因和三基因框的狐尾草花叶病毒RNA表达的CaMV 35S启动子。两个表达系统使用“无害的”病毒基因组，因此，可有效地防止病毒植物-植物间的传递。为了有效表达所导入的异源基因，FECT表达系统还需要共表达P19，一种来自番茄丛矮病毒的RNA沉默抑制蛋白，以防止所导入的T-DNA的转录后基因沉默(PTGS)。(TRBO表达系统不需要P19的共表达)。如下文所述，通过烟
草(Nicotiana benthamiana)中ICK基序蛋白的瞬时表达，对两个瞬时植物表达系统进行
了测试和比较。
[0214] ICK基序蛋白表达ORF被设计成可编码一系列翻译融合的结构基序，描述如下：N’-ERSP-Sta-L-ICK-C’。在此用于表达的ICK基序蛋白是U-ACTX-Hv1a，其具有下列氨基酸序列(N’至C’，一字母代码)：
QYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID NO: 12)
在此所用的ERSP基序为大麦α淀粉酶信号肽(BAAS)，其包含如下所示的24个氨基酸
(N’至C’，一字母代码)：
MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG (SEQ ID NO: 4)
在该表达ORF中的稳定性蛋白(Sta)是绿色荧光蛋白(GFP)，其具有如下的氨基酸序列
(N’至C’，一字母代码)：
MASKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCF
SRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK (SEQ ID NO: 13)
GFP和U-ACTX-Hv1a间的接头肽含有胰蛋白酶切割位点并具有以下所示的氨基酸序列
(N’至C’，一字母代码)：
IGER (SEQ ID NO: 1)
按照ICK基序表达ORF式，该特定的ICK表达ORF可描述为BAAS-GFP-IGER-杂合体或
BGIH。BGIH ORF通过在其5’端加入Pac I限制位点和在其3’端加入Avr II限制位点来
化学合成。合成BGIH的序列如下：
TTAATTAAATGGCTAATAAACACCTGAGTTTGTCACTATTCCTCGTGTTGCTCGGGTTATCTGCTTCACTTG
CAAGCGGAGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 14)
将BGIH ORF克隆至FECT表达载体的Pac I和Avr II限制位点中以产生BGIH表达载
体用于FECT 瞬时植物表达系统(pFECT-BGIH)。为了使FECT表达系统中的BGIH表达最大
化，产生表达RNA沉默抑制蛋白P19的FECT载体(pFECT-P19)用于共转化。为了产生用于
TRBO瞬时植物表达系统的BGIH表达载体，进行常规PCR程序以将Not I限制位点加至上述
BGIH ORF的3’端。然后将新的BGIH ORF克隆至TRBO表达载体的Pac I和Not I限制位
点中以产生BGIH表达载体用于TRBO瞬时植物表达系统(pTRBO-BGIH)。
QYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID NO: 12)
在此所用的ERSP基序为大麦α淀粉酶信号肽(BAAS)，其包含如下所示的24个氨基酸
(N’至C’，一字母代码)：
MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG (SEQ ID NO: 4)
在该表达ORF中的稳定性蛋白(Sta)是绿色荧光蛋白(GFP)，其具有如下的氨基酸序列
(N’至C’，一字母代码)：
MASKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCF
SRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK (SEQ ID NO: 13)
GFP和U-ACTX-Hv1a间的接头肽含有胰蛋白酶切割位点并具有以下所示的氨基酸序列
(N’至C’，一字母代码)：
IGER (SEQ ID NO: 1)
按照ICK基序表达ORF式，该特定的ICK表达ORF可描述为BAAS-GFP-IGER-杂合体或
BGIH。BGIH ORF通过在其5’端加入Pac I限制位点和在其3’端加入Avr II限制位点来
化学合成。合成BGIH的序列如下：
TTAATTAAATGGCTAATAAACACCTGAGTTTGTCACTATTCCTCGTGTTGCTCGGGTTATCTGCTTCACTTG
CAAGCGGAGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 14)
将BGIH ORF克隆至FECT表达载体的Pac I和Avr II限制位点中以产生BGIH表达载
体用于FECT 瞬时植物表达系统(pFECT-BGIH)。为了使FECT表达系统中的BGIH表达最大
化，产生表达RNA沉默抑制蛋白P19的FECT载体(pFECT-P19)用于共转化。为了产生用于
TRBO瞬时植物表达系统的BGIH表达载体，进行常规PCR程序以将Not I限制位点加至上述
BGIH ORF的3’端。然后将新的BGIH ORF克隆至TRBO表达载体的Pac I和Not I限制位
点中以产生BGIH表达载体用于TRBO瞬时植物表达系统(pTRBO-BGIH)。
[0215] 通过FECT和TRBO表达系统，将根癌农杆菌菌株GV3101用于BGIH在烟草叶中的瞬时表达。为了制备感受态GV3101细胞，进行了下列程序：使用GV3101的过夜培养物接种
200 mL Luria-Bertani (LB)培养基。然后使细胞生长到其OD600介于0.5和0.8之间的
对数期。然后通过在4℃下以5000 rpm离心10分钟使细胞沉淀。细胞然后用10 mL预冷
的TE缓冲液(Tris-HCl 10 mM，EDTA 1mM，pH8.0)洗涤1次，然后重新悬浮于20 mL LB培
养基中。GV3101细胞重悬液然后以250 µL部分等分入1.5 mL微管中。然后将等分试样在
液氮中速冻并保存在-80℃冰箱中以备未来转化。
200 mL Luria-Bertani (LB)培养基。然后使细胞生长到其OD600介于0.5和0.8之间的
对数期。然后通过在4℃下以5000 rpm离心10分钟使细胞沉淀。细胞然后用10 mL预冷
的TE缓冲液(Tris-HCl 10 mM，EDTA 1mM，pH8.0)洗涤1次，然后重新悬浮于20 mL LB培
养基中。GV3101细胞重悬液然后以250 µL部分等分入1.5 mL微管中。然后将等分试样在
液氮中速冻并保存在-80℃冰箱中以备未来转化。
[0216] 然后如下采用冻融方法，将pFECT-BGIH和pTRBO-BGIH载体转化到感受态GV3101细胞中：将保存的感受态GV3101细胞在冰上融化，然后与1-5 µg纯DNA (pFECT-BGIH或
pTRBO-BGIH载体)混合。之后将细胞-DNA混合物保持在冰上5分钟，然后转移到-80℃下
5分钟，随后在37℃水浴中温育5分钟。冻融处理的细胞然后被稀释入1 mL LB培养基中，在振动台上在室温下振荡2-4小时。200 µL细胞-DNA混合物的等分试样然后铺于具有适
当抗生素(10 µg/mL利福平、25 µg/mL庆大霉素和50 µg/mL卡那霉素用于pFECT-BGIH转
化和pTRBO-BGIH转化两者)的LB琼脂板上，并在28℃下温育2天。然后挑选出所得转化
体菌落，在6 mL等分的具有合适抗生素的LB培养基的中培养用于转化DNA分析，并制备转化GV3101细胞的甘油贮液。
pTRBO-BGIH载体)混合。之后将细胞-DNA混合物保持在冰上5分钟，然后转移到-80℃下
5分钟，随后在37℃水浴中温育5分钟。冻融处理的细胞然后被稀释入1 mL LB培养基中，在振动台上在室温下振荡2-4小时。200 µL细胞-DNA混合物的等分试样然后铺于具有适
当抗生素(10 µg/mL利福平、25 µg/mL庆大霉素和50 µg/mL卡那霉素用于pFECT-BGIH转
化和pTRBO-BGIH转化两者)的LB琼脂板上，并在28℃下温育2天。然后挑选出所得转化
体菌落，在6 mL等分的具有合适抗生素的LB培养基的中培养用于转化DNA分析，并制备转化GV3101细胞的甘油贮液。
[0217] 用3 mL无针注射器进行叶注射来进行烟草叶的瞬时转化。将转化的GV3101细胞在具有合适抗生素(如上所述)的LB板上划痕，在28℃下温育2天。将转化的GV3101细
胞的一个菌落接种至5 ml LB-MESA培养基(补充10 mM MES、20 μM乙酰丁香酮的LB培养
基)和上述相同的抗生素中，在28℃下过夜。通过以5000 rpm离心10分钟收集过夜培养
物的细胞，以1.0的最终OD600重新悬浮于诱导培养基(10 mM MES、10 mM MgCl2、100 μM乙酰丁香酮)中。然后将细胞在诱导培养基中在室温下温育2小时至过夜，然后准备就绪用于烟草叶的瞬时转化。使用3 mL未附带针的注射器通过注射，使处理细胞侵润Nicotiana benthamiana 植物的连接的叶的底面。对于FECT瞬时转化，将等量的pFECT-BGIH转化的
GV3101细胞和pFECT-P19转化的GV3101细胞混合在一起用于通过用3 mL注射器注射侵润
烟草叶。对于TRBO瞬时转化，仅使pTRBO-BGIH转化的GV3101细胞侵润烟草叶。在浸润后
6-8天评价烟草叶中的ICK基序蛋白表达。
胞的一个菌落接种至5 ml LB-MESA培养基(补充10 mM MES、20 μM乙酰丁香酮的LB培养
基)和上述相同的抗生素中，在28℃下过夜。通过以5000 rpm离心10分钟收集过夜培养
物的细胞，以1.0的最终OD600重新悬浮于诱导培养基(10 mM MES、10 mM MgCl2、100 μM乙酰丁香酮)中。然后将细胞在诱导培养基中在室温下温育2小时至过夜，然后准备就绪用于烟草叶的瞬时转化。使用3 mL未附带针的注射器通过注射，使处理细胞侵润Nicotiana benthamiana 植物的连接的叶的底面。对于FECT瞬时转化，将等量的pFECT-BGIH转化的
GV3101细胞和pFECT-P19转化的GV3101细胞混合在一起用于通过用3 mL注射器注射侵润
烟草叶。对于TRBO瞬时转化，仅使pTRBO-BGIH转化的GV3101细胞侵润烟草叶。在浸润后
6-8天评价烟草叶中的ICK基序蛋白表达。
[0218] BGIH表达ORF含有GFP (STA)与U-ACTX-Hv1a (ICK)的融合蛋白，在GFP与U-ACTX-Hv1a之间具有IGER (SEQ ID NO: 1)接头肽(LINKER)。如图3所示，在紫外线下
检测用FECT和TRBO载体转化的烟草叶中转基因的表达GFP部分的绿色荧光。引人关注的
是，绿色荧光显得均匀分布在FECT载体转化的烟草叶(维管组织除外)中，而TRBO载体转
化的烟草叶中的绿色荧光显得在维管组织中蓄积，这是由于TRBO保留其病毒运动蛋白而
FECT不保留所致。
检测用FECT和TRBO载体转化的烟草叶中转基因的表达GFP部分的绿色荧光。引人关注的
是，绿色荧光显得均匀分布在FECT载体转化的烟草叶(维管组织除外)中，而TRBO载体转
化的烟草叶中的绿色荧光显得在维管组织中蓄积，这是由于TRBO保留其病毒运动蛋白而
FECT不保留所致。
[0219] 为了定量评价ICK基序蛋白表达，通过此处所述的下列程序，提取转化烟草叶中的表达的蛋白质。通过用大开孔的1000 µL移液管头钻取叶片，来收集100 mg转化的叶组织圆盘。将所收集的叶组织放入具有532”直径不锈钢磨球的2 mL微管中，并在-80℃下冰冻1小时，然后使用Troemner-Talboys高通量匀浆器匀浆。将750 µL冰冷的TSP-SE1
提取溶液(磷酸钠溶液50 mM、1:100稀释的蛋白酶抑制剂混合物、EDTA 1mM、DIECA 10mM、PVPP 8%，pH 7.0)加入管中并涡旋混合。然后将微管静置在室温下15分钟，然后在4℃下以
16,000 g离心15分钟。取出100 µL所得上清液，加载到0.45 µm Millipore MultiScreen过滤器微量滴定板中的预装填Sephadex G-50的柱中，其底部具有接受Costar微量滴定板的空间。微量滴定板然后在4℃下以800 g离心2分钟。所得滤液，本文称为烟草叶的总可溶性蛋白提取物(TSP提取物)，准备就绪用于定量分析。
提取溶液(磷酸钠溶液50 mM、1:100稀释的蛋白酶抑制剂混合物、EDTA 1mM、DIECA 10mM、PVPP 8%，pH 7.0)加入管中并涡旋混合。然后将微管静置在室温下15分钟，然后在4℃下以
16,000 g离心15分钟。取出100 µL所得上清液，加载到0.45 µm Millipore MultiScreen过滤器微量滴定板中的预装填Sephadex G-50的柱中，其底部具有接受Costar微量滴定板的空间。微量滴定板然后在4℃下以800 g离心2分钟。所得滤液，本文称为烟草叶的总可溶性蛋白提取物(TSP提取物)，准备就绪用于定量分析。
[0220] 采用Pierce Coomassie Plus蛋白质测定法，估算TSP提取物的总可溶性蛋白浓度。具有已知浓度的BSA蛋白质标准品用来产生蛋白质定量标准曲线。将2 µL的各TSP
提取物混合入Coomassie Plus蛋白质测定试剂盒的200 µL显色试剂(CPPA试剂)中，使
其反应10分钟。然后采用SpectroMax-M2读板仪，使用SoftMax Pro作为控制软件，通过
读取OD595来评价显色反应。来自FECT-BGIH表达叶和TRBO-BGIH表达叶的TSP提取物中
的总可溶性蛋白的浓度分别为0.788 ± 0.20 µg/µL和0.533 ± 0.03 µg/µL。这些结果
用来计算在iELISA测定法中TSP (%TSP)中表达的U-ACTX-Hv1a的百分比。
提取物混合入Coomassie Plus蛋白质测定试剂盒的200 µL显色试剂(CPPA试剂)中，使
其反应10分钟。然后采用SpectroMax-M2读板仪，使用SoftMax Pro作为控制软件，通过
读取OD595来评价显色反应。来自FECT-BGIH表达叶和TRBO-BGIH表达叶的TSP提取物中
的总可溶性蛋白的浓度分别为0.788 ± 0.20 µg/µL和0.533 ± 0.03 µg/µL。这些结果
用来计算在iELISA测定法中TSP (%TSP)中表达的U-ACTX-Hv1a的百分比。
[0221] 如下进行间接ELISA (iELISA)测定法以定量评价用FECT和TRBO表达系统瞬时转化的烟草叶中的ICK基序蛋白。将5 µL叶TSP提取物稀释在Immulon 2HD 96孔板的孔
中的95 µL CB2溶液(Immunochemistry Technologies)中，按需进行系列稀释。然后使来自提取物样品中的叶蛋白质在室温下避光包被孔壁3小时，随后除去CB2溶液，各孔用200 µL PBS (Gibco)洗涤两次。之后将150 µL封闭溶液(含5%脱脂奶粉的Block BSA/PBS)
加入各孔中，在室温下避光温育1小时。在除去封闭溶液和PBS洗涤各孔后，将100 µL的
兔抗U-ACTX-Hv1a抗体(第一抗体) (1:250稀释于封闭溶液)加入各孔中，在室温下避光
温育1小时。随后除去第一抗体，各孔用PBS洗涤4次。然后将100 µL HRP缀合的山羊抗
兔抗体(第二抗体，按1:1000稀释于封闭溶液中使用)加入各孔中，在室温下避光温育1
小时。在除去第二抗体并用PBS洗涤孔后，将100 µL底物溶液(ABTS过氧化物酶底物溶液
A和溶液B的1:1混合物，KPL)加入各孔中，使显色反应进行直到出现足够的显色。然后将
100 µL过氧化物酶终止溶液加入各孔中以终止反应。使用SpectroMax-M2读板仪，SoftMax Pro用作控制软件，在405 nm处读取板中各反应混合物的吸光度。在iELISA测定中按如上所述的相同方式，处理系列稀释的已知浓度的纯U-ACTX-Hv1a样品以生成质量-吸光度标
准曲线用于定量分析。通过iELISA检测表达的U-ACTX-Hv1a，在来自FECT-BGIH转化的烟
草的叶TSP提取物中为3.09 ± 1.83 ng/µL；在来自TRBO-BGIH转化的烟草的叶TSP提取
物中为3.56 ± 0.74 ng/µL。或对于FECT-BGIH转化体，表达的U-ACTX-Hv1a为0.40%总
可溶性蛋白(%TSP)，在TRBO-BGIH转化体中为0.67% TSP。
中的95 µL CB2溶液(Immunochemistry Technologies)中，按需进行系列稀释。然后使来自提取物样品中的叶蛋白质在室温下避光包被孔壁3小时，随后除去CB2溶液，各孔用200 µL PBS (Gibco)洗涤两次。之后将150 µL封闭溶液(含5%脱脂奶粉的Block BSA/PBS)
加入各孔中，在室温下避光温育1小时。在除去封闭溶液和PBS洗涤各孔后，将100 µL的
兔抗U-ACTX-Hv1a抗体(第一抗体) (1:250稀释于封闭溶液)加入各孔中，在室温下避光
温育1小时。随后除去第一抗体，各孔用PBS洗涤4次。然后将100 µL HRP缀合的山羊抗
兔抗体(第二抗体，按1:1000稀释于封闭溶液中使用)加入各孔中，在室温下避光温育1
小时。在除去第二抗体并用PBS洗涤孔后，将100 µL底物溶液(ABTS过氧化物酶底物溶液
A和溶液B的1:1混合物，KPL)加入各孔中，使显色反应进行直到出现足够的显色。然后将
100 µL过氧化物酶终止溶液加入各孔中以终止反应。使用SpectroMax-M2读板仪，SoftMax Pro用作控制软件，在405 nm处读取板中各反应混合物的吸光度。在iELISA测定中按如上所述的相同方式，处理系列稀释的已知浓度的纯U-ACTX-Hv1a样品以生成质量-吸光度标
准曲线用于定量分析。通过iELISA检测表达的U-ACTX-Hv1a，在来自FECT-BGIH转化的烟
草的叶TSP提取物中为3.09 ± 1.83 ng/µL；在来自TRBO-BGIH转化的烟草的叶TSP提取
物中为3.56 ± 0.74 ng/µL。或对于FECT-BGIH转化体，表达的U-ACTX-Hv1a为0.40%总
可溶性蛋白(%TSP)，在TRBO-BGIH转化体中为0.67% TSP。
[0222] 综上所述，两个FECT和TRBO瞬时植物表达系统可用来在植物中表达ICK基序蛋白。两个系统中的ICK基序蛋白表达水平非常接近。然而，在FECT系统中，表达均匀分布在农杆菌侵润的叶中，而在TRBO系统中，表达蓄积在农杆菌侵润的叶的维管组织中。
[0223] 实施例2烟草叶中ICK基序蛋白瞬时表达伴随在不同的亚细胞目标中蓄积。
[0224] 植物表达的ICK基序蛋白需要在植物中蓄积到一定水平以有效保护植物免遭虫害。植物表达的ICK基序蛋白的蓄积水平可受其在植物细胞中的最终定位影响。在该实施例中，我们研究了植物表达的ICK基序蛋白的不同亚细胞定位对植物中的蛋白质蓄积水平的影响(使用FECT瞬时植物表达系统)。在该实施例中，研究了3个亚细胞目标，植物细胞壁质外体(APO)、内质网(ER)和胞质(CYTO)。
[0225] APO导向的ICK基序蛋白表达ORF被设计成编码一系列翻译融合的结构基序，可如下描述：N’-ERSP-Sta-L-ICK-C’。本研究中ICK基序蛋白再次为U-ACTX-Hv1a，并使用实施例1的BGIH表达ORF。此处使用与实施例1相同的载体，pFECT-BGIH。
[0226] CYTO导向的ICK基序蛋白表达ORF被设计成编码一系列翻译融合的结构基序，可如下描述：N’-Sta-L-ICK-C’。本研究中，从BGIH表达ORF中剔除编码大麦α-淀粉酶信号肽的DNA序列，变成GIH表达ORF，其可读框序列如下：
ATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAAT
GGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAGAGCTTAA (SEQ ID NO: 15)
将GIH表达ORF克隆至FECT表达载体的Pac I和Avr II限制位点中以产生GIH表达
载体用于FECT瞬时植物表达系统(pFECT-GIH)，以用于U-ACTX-Hv1a的CYTO引导表达。
ATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAAT
GGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAGAGCTTAA (SEQ ID NO: 15)
将GIH表达ORF克隆至FECT表达载体的Pac I和Avr II限制位点中以产生GIH表达
载体用于FECT瞬时植物表达系统(pFECT-GIH)，以用于U-ACTX-Hv1a的CYTO引导表达。
[0227] 通过在BGIH表达ORF的C’端加入编码ER引导信号肽的DNA序列设计ER导向的ICK基序蛋白表达ORF，其被命名为BGIH-ER表达ORF。此处所用的ER引导信号肽具有下列
氨基酸序列(氨基酸的一字母代码)：
KDEL (SEQ ID NO: 16)
BGIH-ER表达ORF的DNA序列如下：
ATGGCTAATAAACACCTGAGTTTGTCACTATTCCTCGTGTTGCTCGGGTTATCTGCTTCACTTGCAAGCGG
AGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCAC
AAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTG
GAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGA
TCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAA
AGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAA
AGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATA
CATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGT
TCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCT
GTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGC
TGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACC
ATGTTCTATTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGT
TTATTATTGTAGAGCTAAAGATGAGCTCTAA (SEQ ID NO: 17)
将BGIH-ER表达ORF克隆至FECT表达载体的Pac I和Avr II限制位点中以产生
BGIH-ER表达载体用于FECT瞬时植物表达系统(pFECT-BGIH-ER)，用于U-ACTX-Hv1a的ER
导向表达。
氨基酸序列(氨基酸的一字母代码)：
KDEL (SEQ ID NO: 16)
BGIH-ER表达ORF的DNA序列如下：
ATGGCTAATAAACACCTGAGTTTGTCACTATTCCTCGTGTTGCTCGGGTTATCTGCTTCACTTGCAAGCGG
AGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCAC
AAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTG
GAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGA
TCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAA
AGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAA
AGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATA
CATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGT
TCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCT
GTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGC
TGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACC
ATGTTCTATTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGT
TTATTATTGTAGAGCTAAAGATGAGCTCTAA (SEQ ID NO: 17)
将BGIH-ER表达ORF克隆至FECT表达载体的Pac I和Avr II限制位点中以产生
BGIH-ER表达载体用于FECT瞬时植物表达系统(pFECT-BGIH-ER)，用于U-ACTX-Hv1a的ER
导向表达。
[0228] 将所有3种载体pFECT-BGIH、pFECT-GIH和pFECT-BGIH-ER转化至农杆菌菌株GV3101中，并采用实施例1所述方法，使用所得的转化GV3101细胞瞬时转化至
Nicotiana benthamiana叶中。所有3种表达ORF应瞬时表达融合蛋白，其包含GFP融合的
U-ACTX-Hv1a，在所述两个结构结构域之间具有胰蛋白酶可切割接头。
Nicotiana benthamiana叶中。所有3种表达ORF应瞬时表达融合蛋白，其包含GFP融合的
U-ACTX-Hv1a，在所述两个结构结构域之间具有胰蛋白酶可切割接头。
[0229] 在瞬时烟草转化6天后，通过检测紫外线下的绿色荧光，初步检查GFP融合的U-ACTX-Hv1a的表达。在所有转化的烟草叶中检测到不同水平的绿色荧光。具有GFP融合
的U-ACTX-Hv1a的CYTO导向蓄积的转化叶显示最强的绿色荧光，而具有APO或ER导向的
融合蛋白蓄积的那些叶显示较弱的绿色荧光。因此，结果表明烟草叶中与APO和ER导向表达相比，CYTO导向表达可促进转基因GFP融合的U-ACTX-Hv1a蛋白的更大蓄积。在该实验
的3次重复中，具有CYTO导向表达的转化烟草叶总是显示类似或强于具有APO导向表达的
叶的绿色荧光，且用ER导向构建体转化的烟草叶中检出最弱的绿色荧光。这些初步结果表明CYTO导向表达可蓄积同样或高于APO导向表达的转基因融合蛋白，且ER导向表达产生
最少的蓄积。
的U-ACTX-Hv1a的CYTO导向蓄积的转化叶显示最强的绿色荧光，而具有APO或ER导向的
融合蛋白蓄积的那些叶显示较弱的绿色荧光。因此，结果表明烟草叶中与APO和ER导向表达相比，CYTO导向表达可促进转基因GFP融合的U-ACTX-Hv1a蛋白的更大蓄积。在该实验
的3次重复中，具有CYTO导向表达的转化烟草叶总是显示类似或强于具有APO导向表达的
叶的绿色荧光，且用ER导向构建体转化的烟草叶中检出最弱的绿色荧光。这些初步结果表明CYTO导向表达可蓄积同样或高于APO导向表达的转基因融合蛋白，且ER导向表达产生
最少的蓄积。
[0230] 从用不同FECT载体转化的烟草叶提取总可溶性蛋白样品(方案详细描述于实施例1)。如实施例1中所述进行Pierce Coomassie Plus蛋白质测定法以测定TSP提取物
中总可溶性蛋白的浓度，对于APO导向、CYTO导向和ER导向表达，分别得到下列浓度估值：
0.31 ± 0.04 µg/µL、0.31 ± 0.03 µg/µL和0.34 ± 0.05 µg/µL (N = 3)。
中总可溶性蛋白的浓度，对于APO导向、CYTO导向和ER导向表达，分别得到下列浓度估值：
0.31 ± 0.04 µg/µL、0.31 ± 0.03 µg/µL和0.34 ± 0.05 µg/µL (N = 3)。
[0231] 然后使用TSP提取物按实施例1中所述进行间接ELISA方案以定量测定U-ACTX-Hv1a蛋白的表达水平为总可溶性蛋白的百分比(%TSP)，对于APO导向、CYTO导向和ER导向表达，分别得到下列百分比估值：0.126 ± 0.032%、0.049 ± 0.085%和0.025 ±
0.018% (N = 3)。图8概括了上述各种转化烟草叶的表达的U-ACTX-Hv1a的量化 (为%TSP
值)。这些结果表明APO导向转基因表达导致叶中表达的正确折叠的ICK基序蛋白的最大
蓄积。
0.018% (N = 3)。图8概括了上述各种转化烟草叶的表达的U-ACTX-Hv1a的量化 (为%TSP
值)。这些结果表明APO导向转基因表达导致叶中表达的正确折叠的ICK基序蛋白的最大
蓄积。
[0232] 总的来说，虽然经转化产生CYTO导向的转基因GFP融合的U-ACTX-Hv1a的烟草叶呈现最强的绿色荧光信号，但实际上iELISA结果发现这些转基因烟草叶中U-ACTX-Hv1a肽最少，大大小于对ER导向表达的转化叶(其具有最弱的绿色荧光信号)所检出的肽。在
iELISA测定法中，第一抗体(兔抗U-ACTX-Hv1a抗体)仅可与正确折叠的U-ACTX-Hv1a肽
结合。
iELISA测定法中，第一抗体(兔抗U-ACTX-Hv1a抗体)仅可与正确折叠的U-ACTX-Hv1a肽
结合。
[0233] 实施例3用于ICK基序蛋白在植物中表达的替代信号肽。
[0234] 因为ER信号肽可以蛋白质表达水平中起作用，所以使用之前实施例中所述的FECT表达系统测试了两种其它的ERSP。两种ERSP候选物为烟草伸展蛋白信号肽，本研究
中简写为“E” (Memelink等, the Plant Journal, 1993, V4: 1011-1022)，其变体之一简写为“E*” (Pogue GP等, Plant Biotechnology Journal, 2010, V8: 638-654)。它们的氨基酸序列列举如下(N’至C’，一字母代码，非相同的残基用粗体字表示)：
伸展蛋白信号肽(EMGKMASLFASLLVVLVSLSLASESSA (SEQ ID NO: 18)
伸展蛋白信号肽变体(E*)：MGKMASLFATFLVVLVSLSLASESSA (SEQ ID NO: 19)
如下设计编码E的DNA序列用于烟草表达：
ATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTTCTCTGCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTTCTGAATCTT
CTGCT (SEQ ID NO: 20)
采用寡核苷酸延伸PCR (oligo extension PCR)，用4个合成DNA引物产生E DNA序
列。然后，为了将Pac I限制位点加至其5’端并将GFP 5’端DNA序列的一部分加至其
3’端，使用E DNA序列作为模板进行进一步的PCR，得到117 bp DNA片段。然后使用该
片段作为正向PCR引物以扩增编码来自载体pFECT-BGIH的GFP-IGER接头-U-ACTX-Hv1a
ORF的DNA序列(参见实施例1和实施例2)，因此在我们的ICK基序蛋白表达ORF之一
设计为ERSP-Sta-L-ICK后，产生编码(自N’至C’端)伸展蛋白信号肽-GFP-IGER接
头-U-ACTX-Hv1a的U-ACTX-Hv1a表达ORF。这个表达ORF，称为“EGIH”，在其5’端具有Pac I限制位点，在其3’端具有Avr II限制位点。EGIH具有下列DNA序列：
TTAATTAAATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTTCTCTGCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTT
CTGAATCTTCTGCTGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 21)
将EGIH DNA序列克隆至FECT载体的Pac I和Avr II限制位点中以产生pFECT-EGIH
载体用于GFP融合的U-ACTX-Hv1a蛋白的瞬时植物表达。
中简写为“E” (Memelink等, the Plant Journal, 1993, V4: 1011-1022)，其变体之一简写为“E*” (Pogue GP等, Plant Biotechnology Journal, 2010, V8: 638-654)。它们的氨基酸序列列举如下(N’至C’，一字母代码，非相同的残基用粗体字表示)：
伸展蛋白信号肽(EMGKMASLFASLLVVLVSLSLASESSA (SEQ ID NO: 18)
伸展蛋白信号肽变体(E*)：MGKMASLFATFLVVLVSLSLASESSA (SEQ ID NO: 19)
如下设计编码E的DNA序列用于烟草表达：
ATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTTCTCTGCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTTCTGAATCTT
CTGCT (SEQ ID NO: 20)
采用寡核苷酸延伸PCR (oligo extension PCR)，用4个合成DNA引物产生E DNA序
列。然后，为了将Pac I限制位点加至其5’端并将GFP 5’端DNA序列的一部分加至其
3’端，使用E DNA序列作为模板进行进一步的PCR，得到117 bp DNA片段。然后使用该
片段作为正向PCR引物以扩增编码来自载体pFECT-BGIH的GFP-IGER接头-U-ACTX-Hv1a
ORF的DNA序列(参见实施例1和实施例2)，因此在我们的ICK基序蛋白表达ORF之一
设计为ERSP-Sta-L-ICK后，产生编码(自N’至C’端)伸展蛋白信号肽-GFP-IGER接
头-U-ACTX-Hv1a的U-ACTX-Hv1a表达ORF。这个表达ORF，称为“EGIH”，在其5’端具有Pac I限制位点，在其3’端具有Avr II限制位点。EGIH具有下列DNA序列：
TTAATTAAATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTTCTCTGCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTT
CTGAATCTTCTGCTGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 21)
将EGIH DNA序列克隆至FECT载体的Pac I和Avr II限制位点中以产生pFECT-EGIH
载体用于GFP融合的U-ACTX-Hv1a蛋白的瞬时植物表达。
[0235] 如下设计编码变体伸展蛋白信号肽(E*)的DNA序列用于烟草表达：ATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTACTTTTCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTTCTGAATCTT
CTGCT (SEQ ID NO: 22)
采用上述用于EGIH ORF的相同技术产生“E*GIH” DNA序列，其编码(自N’至C’列
出)变体伸展蛋白信号肽-GFP-IGER接头-U-ACTX-Hv1a蛋白的翻译融合物。所得E*GIH
ORF具有下列DNA序列：
TTAATTAAATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTACTTTTCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTT
CTGAATCTTCTGCTGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 23)
将E*GIH DNA序列克隆至FECT载体的Pac I和Avr II限制位点以产生pFECT-E*GIH
载体用于GFP融合的U-ACTX-Hv1a蛋白的瞬时植物表达。
CTGCT (SEQ ID NO: 22)
采用上述用于EGIH ORF的相同技术产生“E*GIH” DNA序列，其编码(自N’至C’列
出)变体伸展蛋白信号肽-GFP-IGER接头-U-ACTX-Hv1a蛋白的翻译融合物。所得E*GIH
ORF具有下列DNA序列：
TTAATTAAATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTACTTTTCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTT
CTGAATCTTCTGCTGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 23)
将E*GIH DNA序列克隆至FECT载体的Pac I和Avr II限制位点以产生pFECT-E*GIH
载体用于GFP融合的U-ACTX-Hv1a蛋白的瞬时植物表达。
[0236] 使用3种不同的FECT表达载体pFECT-BGIH、pFECT-EGIH和pFECT-E*GIH，在烟草植物中瞬时表达GFP融合的U-ACTX-Hv1a蛋白以评价蛋白质表达水平如何受不同ERSP的
影响。将3种FECT表达载体转化至农杆菌GV3101中，然后采用实施例1中所述技术，将转
化的GV3101注射入烟草叶中用于GFP融合的U-ACTX-Hv1a蛋白在烟草叶中的瞬时表达。
影响。将3种FECT表达载体转化至农杆菌GV3101中，然后采用实施例1中所述技术，将转
化的GV3101注射入烟草叶中用于GFP融合的U-ACTX-Hv1a蛋白在烟草叶中的瞬时表达。
[0237] 首先通过视觉检查紫外线下的绿色荧光，评价来自上述3种不同的FECT表达载体的GFP融合的U-ACTX-Hv1a的表达水平。来自3种不同FECT载体的瞬时转化的烟草叶的绿色荧光是肉眼可见的。所有叶显示相似的绿色荧光水平，表明了所测试的3种ERSP无一引起GFP融合的U-ACTX-Hv1a蛋白表达水平的显著增加。
[0238] 从用上述3种ERSP FECT载体转化的烟草叶提取总可溶性蛋白样品(方案详细描述于实施例1)。然后进行Pierce Coomassie Plus蛋白质测定法(按实施例1中所述)以
测定所得TSP样品中总可溶性蛋白的浓度，对于对应于BGIH、EGIH和E*GIH表达ORF的样
品分别得到0.85 ± 0.68 µg/µL、0.70 ± 0.47 µg/µL和0.76 ± 0.77 µg/µL的值(N =
4)。
测定所得TSP样品中总可溶性蛋白的浓度，对于对应于BGIH、EGIH和E*GIH表达ORF的样
品分别得到0.85 ± 0.68 µg/µL、0.70 ± 0.47 µg/µL和0.76 ± 0.77 µg/µL的值(N =
4)。
[0239] 然后使用TSP提取物进行间接ELISA(按实施例1中所述)以定量测定U-ACTX-Hv1a蛋白的表达水平为总可溶性蛋白的百分比(%TSP)，对于对应于具有BGIH、
EGIH和E*GIH表达ORF的FECT载体的样品，分别得到0.39 ± 0.17% (N=3，因为一个数据
点被作为无关项剔除)、0.48 ± 0.26% (N=4)和0.62 ± 0.38% (N=4)的值。图9概括了
对从用上述3种ERSP ORF转化的烟草叶得到的所有样品估算的U-ACTX-Hv1a水平，为总可
溶性蛋白的百分比(%TSP)。虽然来自3种FECT载体转化的%TSP数据看上去不同，但通过
Student's t检验它们没有统计学上地不同。换句话说，在瞬时转化的烟草叶中，3种ERSP在U-ACTX-Hv1a的表达水平上并无不同。
EGIH和E*GIH表达ORF的FECT载体的样品，分别得到0.39 ± 0.17% (N=3，因为一个数据
点被作为无关项剔除)、0.48 ± 0.26% (N=4)和0.62 ± 0.38% (N=4)的值。图9概括了
对从用上述3种ERSP ORF转化的烟草叶得到的所有样品估算的U-ACTX-Hv1a水平，为总可
溶性蛋白的百分比(%TSP)。虽然来自3种FECT载体转化的%TSP数据看上去不同，但通过
Student's t检验它们没有统计学上地不同。换句话说，在瞬时转化的烟草叶中，3种ERSP在U-ACTX-Hv1a的表达水平上并无不同。
[0240] 实施例4作为与ICK基序蛋白的融合蛋白表达的稳定性蛋白有助于ICK基序蛋白在转化植物中
蓄积。
蓄积。
[0241] 在该实施例中，用于植物表达的ICK基序蛋白是ω-ACTX-Hv1a，来源于澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛Hadronyche versuta。ω-ACTX-Hv1a具有下列氨基酸序列(一字母代码)：
SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO: 24)
使用FECT表达系统在烟草植物Nicotiana benthamiana 中表达ω-ACTX-Hv1a。对编
码不同ω-ACTX-Hv1a表达ORF的2种FECT载体进行了工程改造。这些表达ORF之一编码
在其N’端具有大麦α淀粉酶信号肽(BAAS)而无任何稳定性蛋白的ω-ACTX-Hv1a。将这个表达ORF (本文亦称“BO”)亚克隆以产生FECT表达载体pFECT-BO。另一种ω-ACTX-Hv1a
表达ORF编码ω-ACTX-Hv1a与蛋白质Jun a 3的翻译融合物。成熟的Jun a 3是一种约
30 kDa植物防御蛋白，也是某些人的变应原，由Juniperus ashei 乔木产生，并用于该ORF中作为翻译稳定性蛋白(STA)。下面列出其氨基酸序列(一字母代码)：
MARVSELAFLLAATLAISLHMQEAGVVKFDIKNQCGYTVWAAGLPGGGKRLDQGQTWTVNLAAGTASARFWG
RTGCTFDASGKGSCQTGDCGGQLSCTVSGAVPATLAEYTQSDQDYYDVSLVDGFNIPLAINPTNAQCTAPACKADI
NAVCPSELKVDGGCNSACNVFKTDQYCCRNAYVDNCPATNYSKIFKNQCPQAYSYAKDDTATFACASGTDYSIVFC (SEQ ID NO:25)
下面以SEQ ID NO: 26提供成熟的Jun a 3蛋白。
SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO: 24)
使用FECT表达系统在烟草植物Nicotiana benthamiana 中表达ω-ACTX-Hv1a。对编
码不同ω-ACTX-Hv1a表达ORF的2种FECT载体进行了工程改造。这些表达ORF之一编码
在其N’端具有大麦α淀粉酶信号肽(BAAS)而无任何稳定性蛋白的ω-ACTX-Hv1a。将这个表达ORF (本文亦称“BO”)亚克隆以产生FECT表达载体pFECT-BO。另一种ω-ACTX-Hv1a
表达ORF编码ω-ACTX-Hv1a与蛋白质Jun a 3的翻译融合物。成熟的Jun a 3是一种约
30 kDa植物防御蛋白，也是某些人的变应原，由Juniperus ashei 乔木产生，并用于该ORF中作为翻译稳定性蛋白(STA)。下面列出其氨基酸序列(一字母代码)：
MARVSELAFLLAATLAISLHMQEAGVVKFDIKNQCGYTVWAAGLPGGGKRLDQGQTWTVNLAAGTASARFWG
RTGCTFDASGKGSCQTGDCGGQLSCTVSGAVPATLAEYTQSDQDYYDVSLVDGFNIPLAINPTNAQCTAPACKADI
NAVCPSELKVDGGCNSACNVFKTDQYCCRNAYVDNCPATNYSKIFKNQCPQAYSYAKDDTATFACASGTDYSIVFC (SEQ ID NO:25)
下面以SEQ ID NO: 26提供成熟的Jun a 3蛋白。
[0242] KFDIKNQCGYTVWAAGLPGGGKRLDQGQTWTVNLAAGTASARFWGRTGCTFDASGKGSCQTGDCGGQLSCTVSGAVPATLAEYTQSDQDYYDVSLVDGFNIPLAINPTNAQCTAPACKADINAVCPSELKVDGGCNSACNVFKTDQYCCRNAYVDNCPATNYSKIFKNQCPQAYSYAKDDTATFACASGTDYSIVFC (SEQ ID NO: 26)SEQ. ID. 25的ORF中编码的ERSP是Jun a 3天然信号肽，如以下SEQ. ID 27所示。
MARVSELAFLLAATLAISLHMQEAGVV SEQ. ID. 27。
MARVSELAFLLAATLAISLHMQEAGVV SEQ. ID. 27。
[0243] 实施例1详细描述了通过在ORF中编码的介于ω-ACTX-Hv1a结构域和Juna 3结构域之间的序列编码的IGER接头。总之，这个ω-ACTX-Hv1a表达ORF称为
S-Juna3-IGER-ω或SJIO。同样，SJIO表达ORF所插入的FECT载体命名为pFECT-SJIO。
S-Juna3-IGER-ω或SJIO。同样，SJIO表达ORF所插入的FECT载体命名为pFECT-SJIO。
[0244] 使用2种ω-ACTX-Hv1a FECT表达载体pFECT-BO和pFECT-SJIO在烟草植物中瞬时表达ω-ACTX-Hv1a蛋白。采用实施例1中详细描述的技术，将2种FECT表达载体转化
进入农杆菌菌株GV3101，并将所得GV3101转化体注入烟草叶中用于在烟草叶中瞬时表达
ω-ACTX-Hv1a。
进入农杆菌菌株GV3101，并将所得GV3101转化体注入烟草叶中用于在烟草叶中瞬时表达
ω-ACTX-Hv1a。
[0245] 在烟草转化后第6天，收集转化的烟草叶，从叶中提取叶总可溶性蛋白质(有关详细方法参见实施例1)。然后进行Pierce Coomassie Plus蛋白质测定法以测定叶总可溶性蛋白质的浓度，对于用编码pFECT-SJIO和pFECT-BO的构建体转化的叶，分别得到3.047 ± 0.176 µg/µL (N=2)和2.473 ± 0.209 µg/µL的值(N=2)。
[0246] 然后按实施例1中所述，使用上述TSP提取物进行间接ELISA方案以定量评价ω-ACTX-Hv1a蛋白的表达水平作为总可溶性蛋白的百分比(%TSP)，对于用pFECT-SJIO和
pFECT-BO载体转化的叶，分别得到0.133 ± 0.014% (N=2)和0.0004 ± 0.0003%的值
(N=2)。这些数据表明，作为与Jun a 3的翻译融合物表达的ω-ACTX-Hv1a蓄积至未以与
Jun a 3蛋白的翻译融合物表达的ω-ACTX-Hv1a的300倍以上的较高稳态水平。
pFECT-BO载体转化的叶，分别得到0.133 ± 0.014% (N=2)和0.0004 ± 0.0003%的值
(N=2)。这些数据表明，作为与Jun a 3的翻译融合物表达的ω-ACTX-Hv1a蓄积至未以与
Jun a 3蛋白的翻译融合物表达的ω-ACTX-Hv1a的300倍以上的较高稳态水平。
[0247] 上述实施例4，STA的作用还可用具有下列序列的雪花莲凝集素(GNA)进行：DNILYSGETLSTGEFLNYGSFVFIMQEDCNLVLYDVDKPIWATNTGGLSRSCFLSMQTDGNLVVYNPSNKPIW
ASNTGGQNGNYVCILQKDRNVVIYGTDRWATG(SEQ ID NO: 28)。
ASNTGGQNGNYVCILQKDRNVVIYGTDRWATG(SEQ ID NO: 28)。
[0248] 实施例5ICK基序融合蛋白表达ORF中稳定性蛋白结构域和ICK基序蛋白结构域间的可切割接
头提高在转基因植物中表达的所得ICK基序蛋白的杀虫活性。
头提高在转基因植物中表达的所得ICK基序蛋白的杀虫活性。
[0249] 因为大多数咀嚼式口器昆虫分泌胰蛋白酶进入其肠中以消化食物，我们设计了编码在融合物的稳定性蛋白结构域和ICK基序蛋白结构域之间的胰蛋白酶可切割接头的融合蛋白表达ORF，以促进昆虫肠中ICK基序结构域从完整融合蛋白中释放。
[0250] 此处植物表达的ICK基序蛋白是ω-ACTX-Hv1a，其氨基酸序列如下(一字母代码)：
SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO: 24)。
SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO: 24)。
[0251] 所使用的ω-ACTX-Hv1a表达ORF编码包含下列结构域的融合蛋白(N’至C’)：Jun a 3信号肽::Jun a 3::IGER接头::ω-ACTX-Hv1a，如上述结构式ERSP-Sta-L-ICK中
一样。Jun a 3的起源和序列如上述实施例4中所述。
一样。Jun a 3的起源和序列如上述实施例4中所述。
[0252] 在此所用的ERSP是Jun a 3天然信号肽，如上文实施例中所述。
[0253] 实施例1详细描述了由在ORF中编码的ω-ACTX-Hv1a结构域和Jun a 3结构域之间的序列编码的IGER接头。总之，这个ω-ACTX-Hv1a表达ORF称为S-Juna3-IGER-ω
或SJIO。同样，SJIO表达ORF所插入的FECT载体命名为pFECT-SJIO。
或SJIO。同样，SJIO表达ORF所插入的FECT载体命名为pFECT-SJIO。
[0254] 然后使用载体pFECT-SJIO在烟草植物中瞬时表达ω-ACTX-Hv1a蛋白。采用实施例1中详细描述的技术，将载体转化至农杆菌GV3101中，之后将转化的GV3101注入烟草叶用于在叶中ω-ACTX-Hv1a的瞬时表达。
[0255] 烟草叶转化后第6天，收集3.3 g转化的烟草叶，在液氮中研磨。按照实施例1描述的程序，使用50 mL TSP-Se1缓冲液从研磨叶提取总可溶性蛋白(TSP)。从TSP提取程序中回收总共26 mL提取物，然后将其均匀地分成2个样品A和B，每组13 mL提取物。通过在37℃下加入1.3 mL含1 mg/mL胰蛋白酶的1 mM HCl，用胰蛋白酶处理样品A 1小时以
从融合的Jun a 3蛋白中释放ω-ACTX-Hv1a。样品B不通过胰蛋白酶切割处理。为了得到
生物活性浓度范围中的ω-ACTX-Hv1a，按如下相同方式将2组浓缩。第一，将提取物加载到具有10 kD截止值滤膜的浓缩器中，以3200 g离心2小时。然后保存1.4 mL来自样品
A的截留物和1.1 mL来自样品B的截留物以备稍后的试验。12.5 mL来自样品A的滤液和
12.5 mL来自样品B的滤液通过具有1 kD截止值滤膜的浓缩器以3200 g离心16小时进一
步浓缩。从样品A中回收1.3 mL截留物，从样品B中回收1.1 mL截留物。保存两种1 kD
截止值过滤截留物以备稍后的试验。该样品浓缩程序概述于图10。将从pFECT-SJIO转化
的烟草叶的总TSP提取物均匀地分成2个样品。一个样品(A)用胰蛋白酶切割处理，另一
个(B)不处理。两组通过在具有10 kD然后1 kD截止值滤膜的浓缩器中离心浓缩，保存自
10 kD和1 kD截止值过滤的截留物用于进一步试验。
从融合的Jun a 3蛋白中释放ω-ACTX-Hv1a。样品B不通过胰蛋白酶切割处理。为了得到
生物活性浓度范围中的ω-ACTX-Hv1a，按如下相同方式将2组浓缩。第一，将提取物加载到具有10 kD截止值滤膜的浓缩器中，以3200 g离心2小时。然后保存1.4 mL来自样品
A的截留物和1.1 mL来自样品B的截留物以备稍后的试验。12.5 mL来自样品A的滤液和
12.5 mL来自样品B的滤液通过具有1 kD截止值滤膜的浓缩器以3200 g离心16小时进一
步浓缩。从样品A中回收1.3 mL截留物，从样品B中回收1.1 mL截留物。保存两种1 kD
截止值过滤截留物以备稍后的试验。该样品浓缩程序概述于图10。将从pFECT-SJIO转化
的烟草叶的总TSP提取物均匀地分成2个样品。一个样品(A)用胰蛋白酶切割处理，另一
个(B)不处理。两组通过在具有10 kD然后1 kD截止值滤膜的浓缩器中离心浓缩，保存自
10 kD和1 kD截止值过滤的截留物用于进一步试验。
[0256] SJIO表达ORF表达如下融合蛋白，Jun a 3::IGER::ω-ACTX-Hv1a，其包含总共266个氨基酸残基，预测分子量为28,204.28 Da。该融合蛋白的胰蛋白酶切割应释放分子量为4049.2 Da的ω-ACTX-Hv1a和分子量为24,155.1 Da的Jun a 3::IGER融合蛋白。因
此，如果胰蛋白酶切割反应在处理中完成，则预期过滤样品的主要组分如下：
样品A 10 kD过滤截留物：Jun a 3::IGER融合物。
此，如果胰蛋白酶切割反应在处理中完成，则预期过滤样品的主要组分如下：
样品A 10 kD过滤截留物：Jun a 3::IGER融合物。
[0257] 样品A 1 kD过滤截留物：ω-ACTX-Hv1a。
[0258] 样品B 10 kD过滤截留物：Jun a 3::IGER::ω-ACTX-Hv1a融合物。
[0259] 样品B 1 kD过滤截留物：无SJIO表达的蛋白质。
[0260] 为了定量测定截留物样品中的ω-ACTX-Hv1a肽，按实施例1中所述进行iELISA。样品中所检出的ω-ACTX-Hv1a浓度如下：
样品A 10 kD过滤截留物：1.328 ng/µL的ω-ACTX-Hv1a，共1.86 µg。
样品A 10 kD过滤截留物：1.328 ng/µL的ω-ACTX-Hv1a，共1.86 µg。
[0261] 样品A 1 kD过滤截留物：2.768 ng/µL的ω-ACTX-Hv1a，共3.60 µg。
[0262] 样品B 10 kD过滤截留物：12.656 ng/µL的ω-ACTX-Hv1a，共13.92 µg。
[0263] 样品B 1 kD过滤截留物：0.752 ng/µL的ω-ACTX-Hv1a，共0.83 µg。
[0264] 如所表明的，在所分析的所有过滤样品中检出ω-ACTX-Hv1a。在A组10 kD过滤截留物中检出的ω-ACTX-Hv1a推测主要是因为未切割的融合蛋白的物理保留所致。同样，B组1 kD过滤截留物样品中检出的ω-ACTX-Hv1a可能是由于未切割的融合蛋白通过10 kD
截止值滤膜的低速率的假过滤所致。
截止值滤膜的低速率的假过滤所致。
[0265] 为了证实胰蛋白酶-切割反应是成功的，进行了反向高效液相色谱法(rpHPLC)以分析所保留的过滤样品中的组分。使用具有Onyx 100 monolithic C18柱(4.6 x 100 mm)的Varian E218 HPLC系统，使用含0.1%三氟乙酸的水(溶剂A)和含0.1%三氟乙酸的乙腈(溶剂B)为流动相组分，进行HPLC。使用10分钟内10-20%溶剂B的线性梯度，以2 mL/
分钟的流速，将ω-ACTX-Hv1a肽从柱上洗脱。将99%纯的合成ω-ACTX-Hv1a的样品用于
rpHPLC以生成标准曲线(使峰面积与所注入的肽质量关联)。图11表示3个不同的洗脱
图11A、11B、11C。如图11A所示，ω-ACTX-Hv1a肽在注入后6.5分钟洗脱出。当将来自B
组1 kD过滤截留物的500 µL样品加载到HPLC系统中时，在注入后6和7分钟间，在相应
的HPLC色谱图中没有蛋白质峰(图11B)。当将来自A组1 kD过滤截留物的500 µL样品
加载到HPLC系统中时，在相应色谱图的6.3分钟保留时间上有峰(参见图11中的虚线)，
这就表示通过胰蛋白酶切割从融合蛋白中释放的ω-ACTX-Hv1a (图11C)。该峰的面积相
当于样品A 1 kD过滤截留物中ω-ACTX-Hv1a的浓度介于16-70 ng/µL之间(取决于对峰
积分所采用的方法)。
分钟的流速，将ω-ACTX-Hv1a肽从柱上洗脱。将99%纯的合成ω-ACTX-Hv1a的样品用于
rpHPLC以生成标准曲线(使峰面积与所注入的肽质量关联)。图11表示3个不同的洗脱
图11A、11B、11C。如图11A所示，ω-ACTX-Hv1a肽在注入后6.5分钟洗脱出。当将来自B
组1 kD过滤截留物的500 µL样品加载到HPLC系统中时，在注入后6和7分钟间，在相应
的HPLC色谱图中没有蛋白质峰(图11B)。当将来自A组1 kD过滤截留物的500 µL样品
加载到HPLC系统中时，在相应色谱图的6.3分钟保留时间上有峰(参见图11中的虚线)，
这就表示通过胰蛋白酶切割从融合蛋白中释放的ω-ACTX-Hv1a (图11C)。该峰的面积相
当于样品A 1 kD过滤截留物中ω-ACTX-Hv1a的浓度介于16-70 ng/µL之间(取决于对峰
积分所采用的方法)。
[0266] 使用储备的过滤样品进行家蝇注射生物测定以测试呈融合蛋白形式和呈从融合蛋白中释放的形式的ω-ACTX-Hv1a的活性。家蝇蛹(Musca domestica)购自Benzon
Research，Inc.，并保持在25℃的塑料盒中，盒盖上有气孔，盒中有蝇食物(1:1比率糖和奶粉)和浸于水中的棉球。成体家蝇羽化的当天，使用CO2线(CO2 line)将蝇固定，然后使用CO2浸渍垫(infusion pad)保持不动。选择重为12-18 mg的蝇用于注射生物测定。为了
进行家蝇注射，使用加载了带有30号针的1 cc玻璃注射器(其中加载了注射溶液)的微
型给药器(microapplicator)，将0.5 µL剂量递送至蝇的后胸。然后把经注射的蝇放入经标记的带有气孔的盒中，并对注入后24小时的死亡率评分。给家蝇注射下列样品(10只蝇的各组用于各样品)：
水注射为阴性对照。
Research，Inc.，并保持在25℃的塑料盒中，盒盖上有气孔，盒中有蝇食物(1:1比率糖和奶粉)和浸于水中的棉球。成体家蝇羽化的当天，使用CO2线(CO2 line)将蝇固定，然后使用CO2浸渍垫(infusion pad)保持不动。选择重为12-18 mg的蝇用于注射生物测定。为了
进行家蝇注射，使用加载了带有30号针的1 cc玻璃注射器(其中加载了注射溶液)的微
型给药器(microapplicator)，将0.5 µL剂量递送至蝇的后胸。然后把经注射的蝇放入经标记的带有气孔的盒中，并对注入后24小时的死亡率评分。给家蝇注射下列样品(10只蝇的各组用于各样品)：
水注射为阴性对照。
[0267] A组10 kD过滤截留物。
[0268] A组1 kD过滤截留物。
[0269] B组10 kD过滤截留物。
[0270] B组1 kD过滤截留物。
[0271] 0.13 mg/mL胰蛋白酶溶液为阴性对照。
[0272] 在注射后24小时，样品A 10 kD过滤截留物和样品A 1 kD过滤截留物引起100%的家蝇死亡率，而注射其它样品的蝇观察到0%死亡率。纯的天然序列ω-ACTX-Hv1a显示在该家蝇注射生物测定中LD50为100 pmol/克家蝇；因此，为在该示例中引起100%死亡率，注射的ω-ACTX-Hv1a的浓度必须至少25 ng/µL。这与生物测定结果一致，因为样品A 1 kD
过滤截留物的HPLC分析表明ω-ACTX-Hv1a浓缩物的浓度为16-70 ng/µL。在家蝇注射生
物测定中，不包含用胰蛋白酶切割处理的材料的过滤样品不引起死亡，这表明了与被胰蛋白酶从融合构建体切除的天然-序列ω-ACTX-Hv1a相比，Jun a 3融合的ω-ACTX-Hv1a的
活性要小得多。因此，当设计成可切割的，使得ICK融合蛋白的ICK基序结构域可通过蛋白酶解从蛋白质的其它结构结构域中释放时，植物ICK基序蛋白表达ORF的接头区可显示杀
虫功能提高。
过滤截留物的HPLC分析表明ω-ACTX-Hv1a浓缩物的浓度为16-70 ng/µL。在家蝇注射生
物测定中，不包含用胰蛋白酶切割处理的材料的过滤样品不引起死亡，这表明了与被胰蛋白酶从融合构建体切除的天然-序列ω-ACTX-Hv1a相比，Jun a 3融合的ω-ACTX-Hv1a的
活性要小得多。因此，当设计成可切割的，使得ICK融合蛋白的ICK基序结构域可通过蛋白酶解从蛋白质的其它结构结构域中释放时，植物ICK基序蛋白表达ORF的接头区可显示杀
虫功能提高。
[0273] 第II部分. 高产肽在商业规模上成功生产具有可再现的肽形成和折叠并具有成本控制的杀虫肽的能力
可能是富有挑战性的。肽的种类繁多、性能独特且性质特殊，结合极其多种的可能的生产技术，可提供肽生产的众多方法。
可能是富有挑战性的。肽的种类繁多、性能独特且性质特殊，结合极其多种的可能的生产技术，可提供肽生产的众多方法。
[0274] 然而，有不多(如有任何描述的话)描述了如何改变肽使得它将以比改变前通常生产肽的生产率高得多的生产率在生物系统中生产。在此我们提供了改变肽的组成的方
法，并且如此进行以提高肽生产的速率和量，同时降低肽生产的成本。我们描述了改变或“转化”一种肽成为一种不同的更有成本效益、但出人意料地仍具有正如其转化前一样毒性的肽的新方法。
法，并且如此进行以提高肽生产的速率和量，同时降低肽生产的成本。我们描述了改变或“转化”一种肽成为一种不同的更有成本效益、但出人意料地仍具有正如其转化前一样毒性的肽的新方法。
[0275] 我们描述了这些新的转化肽的实例，而且我们表明这些用于改变或转化肽的方法如何可使肽的产量产生重大改进而不引起其活性显著改变。本文描述并要求保护用于产生这些肽的新的处置方法、新的肽、新的制剂和新的生物。描述了通过在杀虫肽的N端加入二肽来增加酵母表达系统的杀虫肽产量的方法。加入二肽不会不利地影响杀虫肽的杀虫活性。
[0276] 我们描述了这些新的转化肽的实例，而且我们表明这些改变或转化肽的方法如何可在肽的产量中产生重大改进而不引起其活性显著改变。本文描述并要求保护用于生产这些肽的新的处置方法、新的肽、新的制剂和新的生物。
[0277] 用于生产高产肽的详细程序。
[0278] 我们描述了可增加肽产量的处置方法和肽。当遵循这些技术时，可通过在天然肽的N端加入二肽提供转化肽，所述转化肽在3个不同的方面具有比天然肽更好的生产率。第一，二肽-天然肽类(dipeptide-native peptide strain)的总平均产量好于天然类的总平均产量；第二，二肽-天然肽类的中值产量好于天然的中值产量；第三，在较高的生产率范围下有比对于天然肽类而言更多的二肽类。此处所述方法可用于各种体内系统，包括植物、动物和微生物。本发明需要在天然肽的N端加入二肽，所述天然肽在加入二肽之前是已知的肽。已知肽然后被“转化”，并且它随后可以比之前料想的更高产量生产。在一个实施方案中，杀虫肽与二肽连接。这些二肽-天然肽系统可用于可产生所述肽的植物。植物生产的肽具有各种用途，从生产到仅产生通过害虫采食而获得的毒肽，因此保护植物或可能提供其它益处。
[0279] 在一个实施方案中，我们描述了用于通过在杀虫肽的N端加入任何二肽在酵母表达系统中提高杀虫肽产量的方法。二肽由非极性氨基酸和极性氨基酸组成。非极性氨基酸可选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。甘氨酸是优选的非极性氨基酸。极性氨基酸可选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸和酪氨酸。丝氨酸是优选的极性氨基酸。描述了其中非极性氨基酸位于二肽的N端的处置方法和氨基酸，在一个实施方案中，优选的二肽N端是甘氨酸。描述了其中极性氨基酸位于二肽的C端的处置方法和氨基酸，在一个实施方案中，优选的二肽C端为丝氨酸。
[0280] 在本发明的一个实施方案中，二肽为甘氨酸-丝氨酸、gly-ser或GS。这些氨基酸通常由下列密码子编码：Gly可通过密码子例如GGT、GGC、GGA、GGG编码，Ser可通过密码子例如TCT、TCC、TCA、TCG、AGT和AGC编码。
[0281] 设计杀虫肽的转基因使得其转基因序列被优化以用于可能需要的特殊表达。例如，可优化杀虫肽的转基因用于在酵母、植物、细菌和病毒中表达。本发明的这类用途的实例可包括作物像玉米和大豆的转基因的工程改造和优化，其目的是保护它们免遭虫害。在一个实例中，我们设计杀虫肽的转基因，使得其转基因序列被优化用于在酵母表达系统的特殊表达，例如使用乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。其它合适的酵母表达系统是本领域已知的。二肽例如甘氨酸-丝氨酸(gly-ser)的核苷酸密码子被加在成熟杀虫肽的转基因
序列的5’端。然后将转基因序列与合适的表达载体连接，所述表达载体可提供合适的选择标记、用于特定酵母表达系统的强启动子-终止子组、用于分泌的信号序列和介于各自的信号序列和成熟肽序列之间的切割位点。然后通过本领域技术人员已知方法，包括电穿孔或化学转化方法，将杀虫肽表达载体转化到酵母细胞中，以产生稳定肽表达酵母菌株。当这些酵母菌株在合适的培养基中生长时，产生通过将二肽序列甘氨酸-丝氨酸加至成熟杀虫肽的N端而修饰的杀虫肽，其被分泌到生长培养基中。二肽甘氨酸-丝氨酸加到成熟杀虫
肽的N端显著增加杀虫肽的产量，对肽的杀虫活性无不利作用。
序列的5’端。然后将转基因序列与合适的表达载体连接，所述表达载体可提供合适的选择标记、用于特定酵母表达系统的强启动子-终止子组、用于分泌的信号序列和介于各自的信号序列和成熟肽序列之间的切割位点。然后通过本领域技术人员已知方法，包括电穿孔或化学转化方法，将杀虫肽表达载体转化到酵母细胞中，以产生稳定肽表达酵母菌株。当这些酵母菌株在合适的培养基中生长时，产生通过将二肽序列甘氨酸-丝氨酸加至成熟杀虫肽的N端而修饰的杀虫肽，其被分泌到生长培养基中。二肽甘氨酸-丝氨酸加到成熟杀虫
肽的N端显著增加杀虫肽的产量，对肽的杀虫活性无不利作用。
[0282] 我们的数据表明，使用我们在此描述了的程序，可制备以比别的方式可能的显著更高的产量生产的任何富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)。我们证实了使用我们描述了的高产量技术，ICK和非ICK两种类型的CRIP的产量可显著增加。在此我们提供了两种非常不同的CRIP类型的产量引人注目并出乎意料地提高的证据。
[0283] 可被转化的杀虫肽可选自杀虫毒液，例如蜘蛛的毒液。蜘蛛可以是澳大利亚漏斗网蜘蛛。来自澳毒蜘蛛属或Hadronyche属的肽是U-ACTX-Hv1a及其类似物，并且采用本文所述程序特别易于制备。本文提供的序列表中描述了来自蜘蛛的具体肽实例。这些肽和其它肽可采用本文所述程序转化。
[0284] 可转化的杀虫肽可选自海葵毒素例如实施例3描述的Anemone viridis。海葵在其正常生境中与澳毒蜘蛛属或Hadronyche 属的漏斗网蜘蛛相距甚远，来自Anemone
viridis 的毒液不被视为与来自澳毒蜘蛛属或Hadronyche的有毒肽一样的ICK类型的毒
液，但是虽然海胆的毒液，像U-ACTX-Hv1a毒肽和其它杀虫毒液一样，是ICK类型的毒液，但它们全都是我们称为富含半胱氨酸的杀虫肽或CRIP的毒液类型，并在此首次如此鉴定出。
在所有部分中，本文所述程序预期并被认为与序列表的所有肽和与所述序列有关的本领域技术人员将理解为是富含半胱氨酸的杀虫肽或CRIP的所有肽一起运作。所有的这类肽和
其它肽可采用本文所述程序转化。
viridis 的毒液不被视为与来自澳毒蜘蛛属或Hadronyche的有毒肽一样的ICK类型的毒
液，但是虽然海胆的毒液，像U-ACTX-Hv1a毒肽和其它杀虫毒液一样，是ICK类型的毒液，但它们全都是我们称为富含半胱氨酸的杀虫肽或CRIP的毒液类型，并在此首次如此鉴定出。
在所有部分中，本文所述程序预期并被认为与序列表的所有肽和与所述序列有关的本领域技术人员将理解为是富含半胱氨酸的杀虫肽或CRIP的所有肽一起运作。所有的这类肽和
其它肽可采用本文所述程序转化。
[0285] 除所述方法以外，我们还公开了包含与肽的一端结合的二肽的新的高产肽，本文为“HP肽”。在我们的实施方案中，所述肽是杀虫肽。在一个实施方案中，将二肽加到肽的N端。我们证实了生产具有ICK和非ICK CRIP肽两者的高产量菌株的成功。在另一个实施方案中，二肽由非极性氨基酸和极性氨基酸组成。在另一个实施方案中，非极性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸和酪氨酸。在一个具体的实施方案中，HP肽包括被修饰以具有二肽甘氨酸-丝氨酸作为本未修饰的成熟肽的前2个氨
基酸的肽。HP肽可通过将甘氨酸-丝氨酸加到U肽及其类似物以产生HP肽来产生。
基酸的肽。HP肽可通过将甘氨酸-丝氨酸加到U肽及其类似物以产生HP肽来产生。
[0286] 通过本文所述方法制备的修饰肽是新的，并且分别被要求保护。这些肽通过其全部性质而不仅仅是其序列来描述。这些肽是新的，并具有独特性质。本文公开并要求保护HP肽及其制备方法两者。
[0287] 有用肽的实例是众所周知的，并可见于许多参考文献。有用肽的一个类别是杀虫肽。杀虫肽可通过其肽性质及其活性、通常为口服或注射杀虫活性鉴定。在此我们提供几个实例以更好地说明和描述本发明，但本发明不限于这些实例。所有的这些实例和在此未显示的其它实例是对新的材料的描述，在此其首次被描述并要求保护。
[0288] HP (高产)肽在此定义为采用本文所述技术能够以大于正常生产率生产的任何肽。所述肽可具有杀虫活性。通常，当给昆虫注射时，杀虫肽显示活性，但局部施用于昆虫时，大多数没有明显活性。以多种方式测定HP肽的杀虫活性。测量的常用方法广为本领域技术人员所知。所述方法包括但不限于根据各个参数例如瘫痪、死亡率、无法增加体重等的计分，通过剂量反应图拟合，确定中值反应剂量(例如LD50、PD50、LC50、ED50)。可针对暴露于不同剂量的所述杀虫制剂中的昆虫组群进行测量。可通过产生由概率单位分析和/或希尔方程等限定的曲线进行数据分析。在这种情况下，剂量可通过皮下注射、通过高压输注、通过提供杀虫制剂作为食物或诱饵样品的一部分等来给予。
[0289] 所公开的用于提供实例的目的且无意以任何方式限制的HP肽的具体实例为来源于澳大利亚漏斗网蜘蛛毒液的U肽及其同源物。这些肽的描述可参见本文件较早的部分。
[0290] 本说明书中的实例无意且不应用来限制本发明，它们仅供说明本发明。
[0291] 如上所述，许多肽是作为特别制备的处置方法主题的合适候选物。上文、下文和序列表中所述序列是可特别制备的尤其合适的肽，且这些的一些已按照本发明特别制备，其结果见下列实例。
[0292] GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR ASEQ ID NO: 5 (一字母代码)。
[0293] 命名为“U+2-ACTX-Hv1a”，在以下位置具有二硫桥：5-20、12-25、19-39。分子量为4564.85道尔顿。
[0294] GSRSC CPCYW GGCPW GQNCY PEGCS GPKVSEQ ID NO: 29 (一字母代码)。命名为“Av3+2”，在以下位置具有二硫桥：5-19、6-13、
8-24。分子量为3076.47道尔顿。
8-24。分子量为3076.47道尔顿。
[0295] HP肽的制备本文所述HP肽可如下制备。设计杀虫肽的可读框(ORF)使得将其核苷酸序列优化用
于物种特异性表达。下面显示的是通过将二肽加至杀虫肽的N端以提高来自酵母表达系统的杀虫肽产量的方法的一个具体实例。二肽由非极性氨基酸和极性氨基酸组成。非极性氨基酸可选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，甘氨酸是优选的非极性氨基酸。极性氨基酸可选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，丝氨酸是优选的极性氨基酸。在下面的实例中，非极性氨基酸位于二肽的N端，并且是甘氨酸。在下面的实例中，极性氨基酸位于二肽的C端，并且是丝氨酸。
于物种特异性表达。下面显示的是通过将二肽加至杀虫肽的N端以提高来自酵母表达系统的杀虫肽产量的方法的一个具体实例。二肽由非极性氨基酸和极性氨基酸组成。非极性氨基酸可选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，甘氨酸是优选的非极性氨基酸。极性氨基酸可选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，丝氨酸是优选的极性氨基酸。在下面的实例中，非极性氨基酸位于二肽的N端，并且是甘氨酸。在下面的实例中，极性氨基酸位于二肽的C端，并且是丝氨酸。
[0296] 如下设计杀虫肽ORF用于从宿主酵母细胞中分泌：ORF以信号肽序列开始，接着编码Kex 2切割位点(赖氨酸-精氨酸)的DNA序列，接着在5’端加入甘氨酸-丝氨酸密码子的杀虫肽转基因，最后以3’端的终止密码子结束。所有这些元件可在酵母细胞中作为单一可读框表达成融合肽。α-交配因子信号序列最常用于促进重组杀虫肽通过重组酵母的内源分泌途径的代谢加工，即表达的融合肽通常进入内质网，在其中α-交配因子信号序列被信号肽酶活性除去，然后所得杀虫肽原可运输到高尔基体中，上述赖氨酸-精氨酸二肽在其中被Kex 2内切蛋白酶完全除去，之后在其N端包含另外的非天然甘氨酸-丝氨酸
二肽的成熟的HP杀虫肽从细胞中分泌出来。
二肽的成熟的HP杀虫肽从细胞中分泌出来。
[0297] 为了提高杀虫肽在重组酵母细胞中的表达水平，杀虫肽ORF的密码子常被优化以在特定的宿主酵母菌种中表达。指定宿主生物的内源可读框内观察到的天然存在的密码子频率不一定被优化用于高效率表达。此外，不同的酵母菌种(例如乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母等)具有用于高效率表达的不同最优密码子。因此，应对肽ORF包括编码信号序列的序列元件、Kex2切割位点和杀虫肽，考虑密码子优化，因为它们在重组酵母细胞中最初作为一个融合肽翻译。
[0298] 然后将密码子优化肽表达DNA连接至合适的表达载体用于酵母表达。有许多可用于酵母表达的表达载体，包括附加型载体和整合载体，并且它们常被设计成用于特定的酵母菌株。鉴于将用于肽生产的特定的酵母表达系统，应仔细选择合适的表达载体。我们在此使用整合载体，其整合至转化酵母细胞的染色体中，并在整个细胞分裂和增殖周期中是稳定的。
[0299] 表达载体通常含有用于在大肠杆菌中DNA制备的一些大肠杆菌元件，例如大肠杆菌复制起点、抗生素选择标记等。载体还含有用于目标转基因表达所需的一系列序列元件，例如转录启动子、终止子、酵母选择标记、与宿主酵母DNA同源的整合DNA序列等。有许多可利用的合适的酵母启动子，包括天然和改造的启动子。在我们的工作中，使用了酵母启动子例如pLAC4、pAOX1、pUPP、pADH1、pTEF、pGal1等。我们还使用下列常用的酵母选择标记：乙酰胺原养型选择、zeocin抗性选择、遗传霉素抗性选择、诺尔丝菌素抗性选择、尿嘧啶缺乏选择。还可使用本领域的技术人员已知的其它标记。整合DNA序列与转化酵母菌种中的定向基因组DNA基因座同源，所述整合序列包括pLAC4、25S rDNA、pAOX1和TRP2等。杀虫肽转基因的位置可在整合DNA序列附近(插入载体)或在整合DNA序列内(置换载体)。
[0300] 为了得到更多拷贝的整合至宿主酵母染色体的杀虫肽ORF，可设计并产生含有2个或3个拷贝的杀虫肽表达盒的表达载体。表达载体中杀虫肽表达盒的每个拷贝可含有包括启动子、信号序列、Kex2切割序列和杀虫肽转基因、终止密码子、转录终止子的独立和完整的表达结构。
[0301] 然后将肽表达载体转化至酵母细胞中。首先，表达载体通常通过特定的限制性内切酶切割线性化以利于通过同源重组的染色体整合。线性表达载体然后通过化学或电穿孔转化方法转化至酵母细胞中，并通过同源重组整合至酵母基因组的定向基因座。整合可多次发生在相同的染色体基因座；因此，转化酵母细胞的基因组可含有杀虫肽转基因的多个拷贝。可利用有利于经工程改造进入表达载体并与杀虫肽转基因共整合至酵母染色体中的选择标记的生长条件，来鉴定成功的转化体；这类标记的实例包括但不限于乙酰胺原养型、zeocin抗性、遗传霉素抗性、诺尔丝菌素抗性和尿嘧啶原养型。
[0302] 由于不可预测和可变因素 (例如基因和基因网络的后天修饰和进行转化程序的群体中各个细胞中发生的整合事件数目的变化)的影响，指定转化过程的各个酵母转化体在其产生转基因杀虫肽的能力上将不同。因此，可针对高产量菌株筛选携带杀虫肽转基因的酵母转化体。用于这种筛选的两种有效方法(各依赖于转化体的小规模培养物的生长以提供条件培养基样品用于后续分析)，使用反向HPLC或家蝇注射程序以分析来自转化体的条件培养基样品。
[0303] 转化体培养通常在14 mL圆底聚丙烯培养管(含5-10 mL确定成分培养基加入各管中)或48孔深孔培养板(含1-2 mL确定成分培养基加入各孔)中进行。确定成分培养
基，不含未加工的蛋白质性提取物或副产物例如酵母提取物或蛋白胨，被用于培养以降低收获用于稍后筛选步骤的条件培养基的蛋白质背景。培养在最适温度(例如对于乳酸克鲁维酵母为23.5℃)下进行5-6天，直到达到最大细胞密度。杀虫肽此时由转化体产生，并分沁到细胞以外进入生长培养基。为了制备用于筛选的样品，通过离心从培养物中除去细胞，收集上清液作为条件培养基，然后使其通过0.22 µm滤膜过滤澄清，之后使之准备就绪用于杀虫肽生产菌株筛选，下面描述了所述筛选方法的两个实例。
基，不含未加工的蛋白质性提取物或副产物例如酵母提取物或蛋白胨，被用于培养以降低收获用于稍后筛选步骤的条件培养基的蛋白质背景。培养在最适温度(例如对于乳酸克鲁维酵母为23.5℃)下进行5-6天，直到达到最大细胞密度。杀虫肽此时由转化体产生，并分沁到细胞以外进入生长培养基。为了制备用于筛选的样品，通过离心从培养物中除去细胞，收集上清液作为条件培养基，然后使其通过0.22 µm滤膜过滤澄清，之后使之准备就绪用于杀虫肽生产菌株筛选，下面描述了所述筛选方法的两个实例。
[0304] 筛选方法之一是转化体的反向HPLC (rpHPLC)筛选。在这种筛选方法中，使用具有C18键合相的HPLC分析柱。乙腈和水用作流动相溶剂，设置在220 nm处的UV吸光度检测器用于肽检测。将适量的条件培养基样品加载到rpHPLC系统中，用线性梯度的流动相溶剂洗脱。HPLC色谱仪中相应的杀虫肽峰面积用来定量测定条件培养基中的杀虫肽浓度。以相同的HPLC方案，使已知量的纯杀虫肽通过相同的rpHPLC柱运行以证实肽的保留时间，以生成用于定量的标准肽HPLC曲线。
[0305] 第二种筛选方法是家蝇注射测定法。当以实测剂量通过后胸体壁注射时，杀虫肽可杀死家蝇。杀虫肽的效能可通过肽的致死剂量中值(LD50)定义，所述死剂量中值引起已注射家蝇的50%死亡率。纯的杀虫肽通常用于家蝇注射测定法以生成标准剂量反应曲线，从该曲线中可求出LD50值。利用来自所述纯的杀虫肽的标准剂量反应曲线分析的LD50值，采用用系列稀释的相应条件培养基进行的家蝇注射测定法，可实现由酵母转化体产生的杀虫肽的定量。
[0306] 杀虫肽生产菌株筛选可从数百个转化体中鉴定出高产量酵母菌株。当使用优化发酵培养基和发酵条件时，可将这些菌株在生物反应器发酵以达到高达6 g/L的杀虫肽产量。与采用在转化前用来生产肽的相同或类似生产方法的转化前的肽可能达到的产量相比，更高的生产率可以是介于20-400、20-100、20-200、20-300、40-100、40-200、40-300、40-400、
60-100、60-200、60-300、60-400、80-100、80-200、80-300、80-400、100-150、100-200、
150-200、200-250、250-300、250-350、250-400、300-350、300-400%和350-400或所提供的任何值的任何范围或甚至更高的产量。
60-100、60-200、60-300、60-400、80-100、80-200、80-300、80-400、100-150、100-200、
150-200、200-250、250-300、250-350、250-400、300-350、300-400%和350-400或所提供的任何值的任何范围或甚至更高的产量。
[0307] 利用此处教导的程序和本领域的普通技术人员的知识，来自序列表的任何序列，和据我们所知任何CRIP全都可用来制备类似于下文所述的我们称其为“U+2”肽的来自澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛的ACTX基序或我们在以下实施例中教导和描述的毒海葵
Anemone viridis 的Av3+2肽的高产肽。另外，任何其它合适的CRIP肽都可以类似的方式用于生产高产肽或加2 (即+ 2)肽。
Anemone viridis 的Av3+2肽的高产肽。另外，任何其它合适的CRIP肽都可以类似的方式用于生产高产肽或加2 (即+ 2)肽。
[0308] 高产肽的实施例本说明书中的实施例无意且不应用来限制本发明，它们仅供说明本发明。
[0309] 实施例1天然U和U+2-ACTX-Hv1a在乳酸克鲁维酵母中(K. lactis)中的表达。
[0310] 待表达的杀虫肽：U+2-ACTX-Hv1a：
GSQYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID NO:5)和
天然U-ACTX-Hv1a：
QYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID NO:6)。
GSQYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID NO:5)和
天然U-ACTX-Hv1a：
QYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID NO:6)。
[0311] 为了在乳酸克鲁维酵母中表达上述两种杀虫肽，使用表达载体pKLAC1和乳酸克鲁维酵母菌株YCT306，其可获自New England Biolabs，Ipswich，MA，USA。pKLAC1载体是一种整合表达载体。一旦将U+2和天然U-ACTX-Hv1转基因克隆至pKLAC1并转化至YCT306
中，其表达受LAC4启动子控制。所得的转化体产生包含α-交配因子信号肽、Kex2切割位点和成熟杀虫肽的前肽原(pre-propeptide)。α-交配因子信号肽引导前肽原完成内源分泌途径，最后将成熟杀虫肽释放到生长培养基中。
中，其表达受LAC4启动子控制。所得的转化体产生包含α-交配因子信号肽、Kex2切割位点和成熟杀虫肽的前肽原(pre-propeptide)。α-交配因子信号肽引导前肽原完成内源分泌途径，最后将成熟杀虫肽释放到生长培养基中。
[0312] 在两轮中进行U+2-ACTX-Hv1a表达的密码子优化。在第一轮中，根据高表达DNA序列的一些共同特征，设计了表达α-交配因子信号肽、Kex2切割位点和U+2-ACTX-Hv1a肽的肽ORF的33个变体，并在乳酸克鲁维酵母的YCT306菌株中评价其表达水平，得到初步的乳酸克鲁维酵母表达算法。在第2轮优化中，根据初步乳酸克鲁维酵母表达算法设计了5个更多的变体U+2-ACTX-Hv1a肽ORF以进一步细调乳酸克鲁维酵母表达算法，并鉴定出用于
在乳酸克鲁维酵母中U+2-ACTX-Hv1a肽表达的最佳ORF。该DNA序列具有编码α-交配因
子信号肽、Kex2切割位点和U+2-ACTX-Hv1a肽的可读框。使用Hind III和Not I限制位
点，将优化的DNA序列克隆至pKLAC1载体，得到U+2-ACTX-Hv1a表达载体pLB10V5。
在乳酸克鲁维酵母中U+2-ACTX-Hv1a肽表达的最佳ORF。该DNA序列具有编码α-交配因
子信号肽、Kex2切割位点和U+2-ACTX-Hv1a肽的可读框。使用Hind III和Not I限制位
点，将优化的DNA序列克隆至pKLAC1载体，得到U+2-ACTX-Hv1a表达载体pLB10V5。
[0313] 为了使更多拷贝的优化U+2-ACTX-Hv1a转基因在转化期间能够整合至乳酸克鲁维酵母基因组，如下进行含有2拷贝的U+2-ACTX-Hv1a表达盒的U+2-ACTX-Hv1a表达载体
的产生：合成了3,306 bp完整U+2-ACTX-Hv1a表达盒DNA序列，其包含完整LAC4启动子元
件、密码子优化的U+2-ACTX-Hv1a肽ORF元件和pLAC4终止子元件。然后将该完整的表达
盒在pLB10V5的pLAC4终止子下游的Sal I和Kpn I限制位点之间连接至pLB10V5载体，
得到双重转基因U+2-ACTX-Hv1a表达载体pLB10V5D。
的产生：合成了3,306 bp完整U+2-ACTX-Hv1a表达盒DNA序列，其包含完整LAC4启动子元
件、密码子优化的U+2-ACTX-Hv1a肽ORF元件和pLAC4终止子元件。然后将该完整的表达
盒在pLB10V5的pLAC4终止子下游的Sal I和Kpn I限制位点之间连接至pLB10V5载体，
得到双重转基因U+2-ACTX-Hv1a表达载体pLB10V5D。
[0314] 为了产生天然U-ACTX-Hv1a表达载体，使用Stratagene位点定向诱变试剂盒，通过使U+2-ACTX-Hv1a转基因区的5’端的甘氨酸-丝氨酸密码子缺失，使pLB10V5载体诱变。这种诱变得到含有单拷贝的密码子优化的天然U-ACTX-Hv1a表达盒的新的载体pLB12。
为了产生双重转基因天然U-ACTX-Hv1a表达载体，再次使用Stratagene位点定向诱变试
剂盒，以除去之前合成的3,306 bp U+2-ACTX-Hv1a表达盒转基因中U+2-ACTX-Hv1a转基
因区的5’端的甘氨酸-丝氨酸密码子，接着通过连接将该诱变盒在Sal I和Kpn I限制
位点之间插入pLB12载体，得到质粒pLB12D，一种包含2个完整拷贝的密码子优化的天然
U-ACTX-Hv1a表达盒的表达载体。
为了产生双重转基因天然U-ACTX-Hv1a表达载体，再次使用Stratagene位点定向诱变试
剂盒，以除去之前合成的3,306 bp U+2-ACTX-Hv1a表达盒转基因中U+2-ACTX-Hv1a转基
因区的5’端的甘氨酸-丝氨酸密码子，接着通过连接将该诱变盒在Sal I和Kpn I限制
位点之间插入pLB12载体，得到质粒pLB12D，一种包含2个完整拷贝的密码子优化的天然
U-ACTX-Hv1a表达盒的表达载体。
[0315] 然后按照乳酸克鲁维酵母蛋白质表达试剂盒所提供的说明书，使用Sac II限制性内切核酸酶使双重转基因载体pLB10V5D和pLB12D线性化，并化学转化至乳酸克鲁维酵
母的YCT306菌株中。使所得的转化体在补充5 mM乙酰胺的YCB琼脂板上生长，仅乙酰胺
酶-表达的转化体可有效利用乙酰胺作为氮的代谢源。
母的YCT306菌株中。使所得的转化体在补充5 mM乙酰胺的YCB琼脂板上生长，仅乙酰胺
酶-表达的转化体可有效利用乙酰胺作为氮的代谢源。
[0316] 对于杀虫肽产量评价，从pLB10V5D转化体板中挑选出316个菌落，从pLB12D转化体板中挑出40个菌落。将菌落的接种物各自培养在6 mL加入2%纯甘油作为碳源的确定成分的乳酸克鲁维酵母培养基中。在280 rpm下振荡的同时，将培养物在23.5℃下温育6
天，届时培养物中的细胞密度达到最大水平，如通过600 nm处的吸光度(OD600)所表明。然后通过以4,000 rpm离心10分钟，从培养物中除去细胞。所得上清液(条件培养基)通过
0.2 μm膜过滤用于HPLC产量分析。
天，届时培养物中的细胞密度达到最大水平，如通过600 nm处的吸光度(OD600)所表明。然后通过以4,000 rpm离心10分钟，从培养物中除去细胞。所得上清液(条件培养基)通过
0.2 μm膜过滤用于HPLC产量分析。
[0317] 对于肽产量评价，在配备Onyx monolithic 4.5 x 100 mm、C18反向分析型HPLC柱和自动注射器的Agilent 1100 HPLC系统中分析经过滤的条件培养基样品。HPLC级水和乙腈，两者都含有0.1%三氟乙酸，构成用于HPLC分析的两种流动相溶剂。使用HPLC色谱仪测量天然U和U+2-ACTX-Hv1两者的峰面积，然后用来计算在条件培养基中的肽浓度，然后进一步将其归一化至相应的最终细胞密度(如通过OD600测量所测定)作为归一化肽产
量。
量。
[0318] 采用家蝇注射生物测定评价肽的杀虫活性。将条件培养基系列稀释以生成来自家蝇注射生物测定的完整剂量反应曲线。在注射前，成年家蝇(Musca domestica)用CO2固定，选择12-18 mg家蝇用于注射。使用加载1cc注射器和30号针的微型给药器，将0.5µL/蝇剂量的系列稀释的条件培养基样品通过后胸体壁给家蝇注射。将经注射的蝇放入具有潮湿滤纸和盖上有呼吸孔的封闭容器中，在注入后24小时，通过死亡率评分对其进行检测。
[0319] 计算归一化产量。肽产量意指条件培养基中的肽浓度，单位为mg/L。但是肽产量不总是足以精确比较菌株的生产率。各菌株可能具有不同的生长速率，因此在收获培养物时，不同培养物的细胞密度可能改变。具有高细胞密度的培养物可能在培养基中产生较高浓度的肽，即使菌株的肽生产率低于具有较高的生产率的另一个菌株。因此术语“归一化产量”通过肽产量除以相应培养物中的细胞密度产生，这允许更好地比较菌株间的肽生产率。细胞密度用600 nm处单位为“A” (吸光度单位)的吸光度表示。
[0320] 表1、图12和图13概括了来自乳酸克鲁维酵母菌株的U+2-和天然U-ACTX-Hv1a归一化肽产量分布。来自乳酸克鲁维酵母菌株的总体平均U+2-ACTX-Hv1a归一化肽产量为
4.06 ± 3.05 mg/L.A，通过99%置信水平的Stuent’s t检验，这统计显著性地高于平均的天然U-ACTX-Hv1a归一化肽产量2.73 ± 1.25 mg/L.A。U+2-ACTX-Hv1a乳酸克鲁维酵母
菌株的归一化肽产量中值为9.36 mg/L.A，这几乎是天然U-ACTX-Hv1a菌株产量中值(3.35 mg/L.A)的3倍。与天然U-ACTX-Hv1a菌株相比，在高产量水平下U+2-ACTX-Hv1a肽表达菌
株具有高得多的菌株计数比率。所有这些结果表明甘氨酸-丝氨酸二肽加至U-ACTX-Hv1a
肽的N端有助于表达该肽的酵母转化体的预测产量的显著增加。
4.06 ± 3.05 mg/L.A，通过99%置信水平的Stuent’s t检验，这统计显著性地高于平均的天然U-ACTX-Hv1a归一化肽产量2.73 ± 1.25 mg/L.A。U+2-ACTX-Hv1a乳酸克鲁维酵母
菌株的归一化肽产量中值为9.36 mg/L.A，这几乎是天然U-ACTX-Hv1a菌株产量中值(3.35 mg/L.A)的3倍。与天然U-ACTX-Hv1a菌株相比，在高产量水平下U+2-ACTX-Hv1a肽表达菌
株具有高得多的菌株计数比率。所有这些结果表明甘氨酸-丝氨酸二肽加至U-ACTX-Hv1a
肽的N端有助于表达该肽的酵母转化体的预测产量的显著增加。
[0321] 表1表示来自乳酸克鲁维酵母菌株的肽产量的比较。
[0322] 表1. U+2和天然U-ACTX-Hv1a肽产量比较图12表示U+2和天然U菌株的归一化肽产量分布的直方图。X标度表示归一化肽产
量的范围。左边的Y标度表示在归一化产量的特定范围内U+2生产菌株的频率，右边的Y
标度表示在归一化产量的特定范围内天然U生产菌株的频率。黑色条形柱表示U+2产量分
布，灰色条形柱表示天然U产量分布。例如，第一个黑色条形柱显示约0.03 (3%)的总U+2生产菌株的归一化产量介于0和0.5 mg/L.A之间。菌株计数在天然和+2菌株中不同，因
为对于U+2筛选了316个菌株，而对于天然肽筛选了40个菌株。
量的范围。左边的Y标度表示在归一化产量的特定范围内U+2生产菌株的频率，右边的Y
标度表示在归一化产量的特定范围内天然U生产菌株的频率。黑色条形柱表示U+2产量分
布，灰色条形柱表示天然U产量分布。例如，第一个黑色条形柱显示约0.03 (3%)的总U+2生产菌株的归一化产量介于0和0.5 mg/L.A之间。菌株计数在天然和+2菌株中不同，因
为对于U+2筛选了316个菌株，而对于天然肽筛选了40个菌株。
[0323] 图13表示自乳酸克鲁维酵母菌株产生的U+2和天然U-ACTX-Hv1a的肽产量的分布。U+2数据用黑色表示，天然U数据用灰色表示。x轴表示单位为毫克/升的产量，y标
度表示自乳酸克鲁维酵母菌株生产的总U+2或天然U的分数。与天然U菌株相比，对于U+2
菌株，U+2菌株的产量和可获得的可产生高产量的U+2菌株的数目远高得多。
度表示自乳酸克鲁维酵母菌株生产的总U+2或天然U的分数。与天然U菌株相比，对于U+2
菌株，U+2菌株的产量和可获得的可产生高产量的U+2菌株的数目远高得多。
[0324] 通常可预期对肽序列进行显著增加其产量的变化可能影响其毒性。出人意料地是，这未发生在本公开内容的二肽中。我们的数据表明将二肽(尤其是甘氨酸-丝氨酸
二肽)加至U-ACTX-Hv1a肽的N端，不会降低肽的杀虫活性的有效性。图14表示用天
然和U+2-ACTX-Hv1a条件培养基样品进行的家蝇注射生物测定法的两条剂量反应曲线。
U+2-ACTX-Hv1a的中值致死剂量(LD50)为76.8 pmol/g，这与天然U-ACTX-Hv1a的LD50
77.6 pmol/g一致。
二肽)加至U-ACTX-Hv1a肽的N端，不会降低肽的杀虫活性的有效性。图14表示用天
然和U+2-ACTX-Hv1a条件培养基样品进行的家蝇注射生物测定法的两条剂量反应曲线。
U+2-ACTX-Hv1a的中值致死剂量(LD50)为76.8 pmol/g，这与天然U-ACTX-Hv1a的LD50
77.6 pmol/g一致。
[0325] 实施例2对表达U+2-ACTX-Hv1a或U-ACTX-Hv1a的酵母巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)的转化
体的肽产量进行了研究。
体的肽产量进行了研究。
[0326] 对于在巴斯德毕赤酵母中的U+2-ACTX-Hv1a或天然U-ACTX-Hv1a肽表达，使用两种巴斯德毕赤酵母载体pJUGαKR和pJUZαKR。pJUGαKR和pJUZαKR可获自
Biogrammatics，Carlsbad，California，USA。两个载体是整合载体，并使用尿嘧啶磷酸核糖基转移酶启动子(pUPP)以提高异源转基因表达。载体间唯一的差异是pJUGαKR对宿主
酵母提供G418抗性，而pJUZαKR提供Zeocin抗性。
Biogrammatics，Carlsbad，California，USA。两个载体是整合载体，并使用尿嘧啶磷酸核糖基转移酶启动子(pUPP)以提高异源转基因表达。载体间唯一的差异是pJUGαKR对宿主
酵母提供G418抗性，而pJUZαKR提供Zeocin抗性。
[0327] 分别设计和合成了编码天然U-ACTX-Hv1a和U+2-ACTX-Hv1a的互补寡核苷酸对用于亚克隆至2个酵母表达载体。通过将相应的互补寡核苷酸在30 mM NaCl、10 mM Tris-Cl (全部为终浓度)，pH 8中混合至20 µM的终浓度，然后在95℃下温育20分钟，接着从92℃开始以17℃结束，每20分钟温度下降3℃温育9小时，来进行杂交反应。杂交反应得到分
别编码U+2-ACTX-Hv1a和天然U-ACTX-Hv1a肽的2个DNA片段。2种巴斯德毕赤酵母载体
用BsaI-HF限制性内切酶消化，然后采用标准程序，将Uization反应的双链产物亚克隆至线性巴斯德毕赤酵母载体中。在证实4个亚克隆的序列后，通过电穿孔将质粒等分试样转化至巴斯德毕赤酵母菌株Bg08中。如下所述，培养并筛选根据工程改造进入载体pJUZαKR和pJUGαKR的元件所赋予的Zeocin或G418抗性分别选择的所得的转化酵母。由于无转
化体菌株具有一个以上的抗生素抗性标记，并且因为对用U+2-ACTX-Hv1a转基因转化的酵母细胞进行与用天然U-ACTX-Hv1a转基因转化的酵母细胞相同的转化程序，因此有理由假定转基因拷贝数的分布对于下面将比较的两个转化体群而言是类似的。
别编码U+2-ACTX-Hv1a和天然U-ACTX-Hv1a肽的2个DNA片段。2种巴斯德毕赤酵母载体
用BsaI-HF限制性内切酶消化，然后采用标准程序，将Uization反应的双链产物亚克隆至线性巴斯德毕赤酵母载体中。在证实4个亚克隆的序列后，通过电穿孔将质粒等分试样转化至巴斯德毕赤酵母菌株Bg08中。如下所述，培养并筛选根据工程改造进入载体pJUZαKR和pJUGαKR的元件所赋予的Zeocin或G418抗性分别选择的所得的转化酵母。由于无转
化体菌株具有一个以上的抗生素抗性标记，并且因为对用U+2-ACTX-Hv1a转基因转化的酵母细胞进行与用天然U-ACTX-Hv1a转基因转化的酵母细胞相同的转化程序，因此有理由假定转基因拷贝数的分布对于下面将比较的两个转化体群而言是类似的。
[0328] 用于巴斯德毕赤酵母培养的培养基和贮液的配方描述如下：MSM培养基配方
2 g/L二水柠檬酸钠
1 g/L二水硫酸钙(0.79 g/L无水硫酸钙)
42.9g/L磷酸二氢钾
5.17g/L硫酸铵
14.33 g/L硫酸钾
11.7 g/L七水硫酸镁
2 mL/L PTM1痕量盐溶液
0.4 ppm生物素(来自500X，200 ppm贮液)
1-2%纯甘油或其它碳源
PTM1痕量盐溶液：
硫酸铜-5H2O 6.0 g
碘化钠0.08 g
硫酸锰-H2O 3.0 g
钼酸钠-2H2O 0.2 g
硼酸0.02 g
氯化钴0.5 g
氯化锌20.0 g
硫酸亚铁-7H2O 65.0 g
生物素0.2 g
硫酸5.0 ml
加水至1升的最终体积
使用在温育后用无菌的可透气带密封的48孔深孔板以培养杀虫肽巴斯德毕赤酵母转
化体。挑出巴斯德毕赤酵母转化体板上的菌落，以1mL培养基/孔接种深孔板，所述培养基由MSM + 0.2% PTM1 +生物素(自200 ppm贮液500X稀释) +1%甘油(纯的)组成。在以
220 rpm振荡的同时，使接种的板在23.5℃下在冷藏培养箱-振荡器中生长5天。在接种
后2、3和4天，将100 µL 5%甘油加入板的各孔。接种后第5天，通过以3700 rpm离心15
分钟收获条件培养基，接着使用具有0.22 µM膜的滤板过滤。经过滤的培养基保存在-20℃下用于进一步分析。
2 g/L二水柠檬酸钠
1 g/L二水硫酸钙(0.79 g/L无水硫酸钙)
42.9g/L磷酸二氢钾
5.17g/L硫酸铵
14.33 g/L硫酸钾
11.7 g/L七水硫酸镁
2 mL/L PTM1痕量盐溶液
0.4 ppm生物素(来自500X，200 ppm贮液)
1-2%纯甘油或其它碳源
PTM1痕量盐溶液：
硫酸铜-5H2O 6.0 g
碘化钠0.08 g
硫酸锰-H2O 3.0 g
钼酸钠-2H2O 0.2 g
硼酸0.02 g
氯化钴0.5 g
氯化锌20.0 g
硫酸亚铁-7H2O 65.0 g
生物素0.2 g
硫酸5.0 ml
加水至1升的最终体积
使用在温育后用无菌的可透气带密封的48孔深孔板以培养杀虫肽巴斯德毕赤酵母转
化体。挑出巴斯德毕赤酵母转化体板上的菌落，以1mL培养基/孔接种深孔板，所述培养基由MSM + 0.2% PTM1 +生物素(自200 ppm贮液500X稀释) +1%甘油(纯的)组成。在以
220 rpm振荡的同时，使接种的板在23.5℃下在冷藏培养箱-振荡器中生长5天。在接种
后2、3和4天，将100 µL 5%甘油加入板的各孔。接种后第5天，通过以3700 rpm离心15
分钟收获条件培养基，接着使用具有0.22 µM膜的滤板过滤。经过滤的培养基保存在-20℃下用于进一步分析。
[0329] 使用实施例1中描述的rpHPLC分析如上文所述制备的条件巴斯德毕赤酵母培养基的0.3 mL等分试样，以测定培养基中存在的天然U-ACTX-Hv1a或U+2-ACTX-Hv1a肽的浓
度。该分析的结果概括于表2、图15和图16。具有公共均值和标准差的肽平均产量对于
U+2-ACTX-Hv1a巴斯德毕赤酵母菌株为67.0 ± 27.9 mg/L，对于天然U-ACTX-Hv1a菌株
为42.9 ± 18.3 mg/L。Student’s t检验表明，产量的这种差异性分布的概率远低于1%。
U+2-ACTX-Hv1a菌株的产量中值为79.0 mg/L，远高于天然U-ACTX-Hv1a菌株的产量中值
(44.7 mg/L)。观察到与天然U-ACTX-Hv1a菌株相比，在高肽产量水平下，U+2-ACTX-Hv1a菌株具有高得多的菌株计数比率。所有这些结果支持以下结论：U+2-ACTX-Hv1a的N端处额外的甘氨酸-丝氨酸二肽显著改进酵母转化体产生该肽并将其分泌到条件培养基中的能力。
度。该分析的结果概括于表2、图15和图16。具有公共均值和标准差的肽平均产量对于
U+2-ACTX-Hv1a巴斯德毕赤酵母菌株为67.0 ± 27.9 mg/L，对于天然U-ACTX-Hv1a菌株
为42.9 ± 18.3 mg/L。Student’s t检验表明，产量的这种差异性分布的概率远低于1%。
U+2-ACTX-Hv1a菌株的产量中值为79.0 mg/L，远高于天然U-ACTX-Hv1a菌株的产量中值
(44.7 mg/L)。观察到与天然U-ACTX-Hv1a菌株相比，在高肽产量水平下，U+2-ACTX-Hv1a菌株具有高得多的菌株计数比率。所有这些结果支持以下结论：U+2-ACTX-Hv1a的N端处额外的甘氨酸-丝氨酸二肽显著改进酵母转化体产生该肽并将其分泌到条件培养基中的能力。
[0330] 表2显示来自巴斯德毕赤酵母菌株的肽产量的比较。
[0331] 表2. U+2和天然U-ACTX-Hv1a肽产量比较实施例3
自Anemone viridis发现的3型海葵毒素天然之一Av3和Av3+2在酵母菌株乳酸克鲁
维酵母中的表达。
自Anemone viridis发现的3型海葵毒素天然之一Av3和Av3+2在酵母菌株乳酸克鲁
维酵母中的表达。
[0332] 待表达的杀虫肽：Av3+2：
GSRSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKV (SEQ ID NO. 29)
天然Av3:
RSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKV (SEQ ID NO. 30)
为了在乳酸克鲁维酵母中表达上述2种非ICK CRIP肽，如实施例1使用pKLAC1载体
和乳酸克鲁维酵母菌株YCT306。
GSRSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKV (SEQ ID NO. 29)
天然Av3:
RSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKV (SEQ ID NO. 30)
为了在乳酸克鲁维酵母中表达上述2种非ICK CRIP肽，如实施例1使用pKLAC1载体
和乳酸克鲁维酵母菌株YCT306。
[0333] 使用之前确定的乳酸克鲁维酵母表达算法，使编码α-MF::Kex2切割位点::Av3 (或Av3+2)的Av3和Av3+2肽ORF进行密码子优化。
[0334] 优化的Av3+2表达ORF序列如下：aagcttgaaaaaaatgaaattttccactattttagcagcatctacagctttaatcagtgttgtcatggctgc
acctgtgagtaccgaaacagatatagacgaccttccaatctctgttccagaagaggctttgataggattcatcgatttgactggtgatgaagtttcattgttaccagtgaataatggtacccatactggtattttgttcctaaacaccacaat
tgctgaagctgcttttgcagataaggatgatttggagaaaagaggttctagatcatgctgcccttgttactggggt
ggttgtccatggggacaaaactgttatcctgaaggatgttctggtccaaaggtatgagcggccgc (SEQ ID NO.
31)
使用Hind III和Not I限制位点，将该优化的DNA序列克隆至pKLAC1载体中，得到
Av3+2表达载体pLB102。
acctgtgagtaccgaaacagatatagacgaccttccaatctctgttccagaagaggctttgataggattcatcgatttgactggtgatgaagtttcattgttaccagtgaataatggtacccatactggtattttgttcctaaacaccacaat
tgctgaagctgcttttgcagataaggatgatttggagaaaagaggttctagatcatgctgcccttgttactggggt
ggttgtccatggggacaaaactgttatcctgaaggatgttctggtccaaaggtatgagcggccgc (SEQ ID NO.
31)
使用Hind III和Not I限制位点，将该优化的DNA序列克隆至pKLAC1载体中，得到
Av3+2表达载体pLB102。
[0335] 优化的天然Av3表达ORF序列如下：AAGCTTGAAAAAAATGAAATTTTCCACAATCTTAGCTGCAAGTACTGCTCTTATTTCTGTTGTGATGGCTGC
TCCAGTATCTACCGAAACAGATATCGATGATTTGCCAATTTCAGTCCCTGAAGAGGCACTAATCGGATTCATTGACTTAACCGGTGATGAAGTGAGTTTGTTGCCAGTTAACAACGGTACTCATACAGGTATATTGTTTTTGAATACCACTATAGCTGAAGCAGCATTCGCTGATAAAGATGACTTAGAAAAGAGAAGATCATGCTGCCCTTGTTACTGGGGTGGTTGTCCATGGGGTCAAAATTGTTATCCAGAGGGTTGTTCTGGACCTAAGGTTTGAGCGGCCGC (SEQ ID NO. 32)
使用Hind III和Not I限制位点，将该优化的DNA序列克隆至pKLAC1载体中，得到天
然Av3表达载体pLB103。
TCCAGTATCTACCGAAACAGATATCGATGATTTGCCAATTTCAGTCCCTGAAGAGGCACTAATCGGATTCATTGACTTAACCGGTGATGAAGTGAGTTTGTTGCCAGTTAACAACGGTACTCATACAGGTATATTGTTTTTGAATACCACTATAGCTGAAGCAGCATTCGCTGATAAAGATGACTTAGAAAAGAGAAGATCATGCTGCCCTTGTTACTGGGGTGGTTGTCCATGGGGTCAAAATTGTTATCCAGAGGGTTGTTCTGGACCTAAGGTTTGAGCGGCCGC (SEQ ID NO. 32)
使用Hind III和Not I限制位点，将该优化的DNA序列克隆至pKLAC1载体中，得到天
然Av3表达载体pLB103。
[0336] 然后使用Sac II限制性内切核酸酶使表达载体pLB102和pLB103线性化，并使用电穿孔转化方法转化至乳酸克鲁维酵母的YCT306菌株中。使所得的转化体生长在补充5
mM乙酰胺的YCB琼脂板上，仅乙酰胺酶-表达的转化体可有效地将乙酰胺用作氮的代谢源。
mM乙酰胺的YCB琼脂板上，仅乙酰胺酶-表达的转化体可有效地将乙酰胺用作氮的代谢源。
[0337] 对于杀虫肽产量评价，挑出pLB102转化体的48个菌落和pLB103转化体的48个菌落，并接种在每孔容量为5 mL的48孔深孔板中的2.2 mL添加2%山梨糖醇作为碳源的确
定成分的乳酸克鲁维酵母培养基中。在以280 rpm振荡的同时，在23.5℃下处理培养物6
天，届时通过600nm处的吸光度(OD600)测定培养物中的细胞密度。然后以4000 rpm离心
10分钟，从培养物中除去细胞。所得上清液(条件培养基)通过0.2 μm膜过滤用于HPLC
产量分析。
定成分的乳酸克鲁维酵母培养基中。在以280 rpm振荡的同时，在23.5℃下处理培养物6
天，届时通过600nm处的吸光度(OD600)测定培养物中的细胞密度。然后以4000 rpm离心
10分钟，从培养物中除去细胞。所得上清液(条件培养基)通过0.2 μm膜过滤用于HPLC
产量分析。
[0338] 对于肽产量评价，在配备Onyx monolithic 4.5 x 100 mm、C18反向分析型HPLC柱和自动注射器的Agilent 1100 HPLC系统中分析经过滤的条件培养基样品。HPLC级水和乙腈，两者都含有0.1%三氟乙酸，构成用于HPLC分析的两种流动相溶剂。使用所得HPLC色谱图中的天然Av3或Av3+2峰面积作为条件培养基中肽浓度的指示，然后将其进一步归
一化至相应的最终细胞密度(如通过OD600测量所测定)作为归一化肽产量。
一化至相应的最终细胞密度(如通过OD600测量所测定)作为归一化肽产量。
[0339] 表3、图17和图18概括了来自乳酸克鲁维酵母菌株的Av3+2和天然Av3归一化肽产量分布。归一化肽产量用HPLC色谱图中的肽UV峰面积除以在细胞培养结束时相应的
细胞密度(用OD600表示)表示。来自Av3+2菌株的总平均的归一化肽产量为117.5 ±
50.1 mAu.sec/A，通过99%置信水平的Student’s t检验，其在统计上显著高于天然Av3的归一化肽产量(29.8 ± 16.1 mAu.sec/A)。Av3+2乳酸克鲁维酵母菌株的归一化肽产量中
值为106.7 mAu.sec/A，这是天然Av3菌株 (31.7 mAu.sec/A)的3倍以上。与天然Av3菌
株相比，在高产量水平下，Av3+2表达菌株具有高得多的菌株计数比率(表3)。如图18所
示，总的来说，在肽产量的任何百分数上，Av3+2菌株具有高于天然Av3菌株的产量。所有这些结果表明将甘氨酸-丝氨酸二肽加至Av3肽的N端有助于表达该肽的酵母转化体的肽
产量的显著增加。
细胞密度(用OD600表示)表示。来自Av3+2菌株的总平均的归一化肽产量为117.5 ±
50.1 mAu.sec/A，通过99%置信水平的Student’s t检验，其在统计上显著高于天然Av3的归一化肽产量(29.8 ± 16.1 mAu.sec/A)。Av3+2乳酸克鲁维酵母菌株的归一化肽产量中
值为106.7 mAu.sec/A，这是天然Av3菌株 (31.7 mAu.sec/A)的3倍以上。与天然Av3菌
株相比，在高产量水平下，Av3+2表达菌株具有高得多的菌株计数比率(表3)。如图18所
示，总的来说，在肽产量的任何百分数上，Av3+2菌株具有高于天然Av3菌株的产量。所有这些结果表明将甘氨酸-丝氨酸二肽加至Av3肽的N端有助于表达该肽的酵母转化体的肽
产量的显著增加。
[0340] 表3. Av3+2和天然Av3肽产量比较作物和昆虫
可通过这些方法控制的具体作物和昆虫包括以下：
本发明可用于转化任何植物品种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。转基因方
法或PEP可能是对之特别有用的方法的作物包括但不限于：苜蓿、棉、番茄、玉米(maize)、小麦、玉米(corn)、甜玉米、紫花苜蓿、大豆、高粱、紫花豌豆、亚麻籽、红花、油菜籽、含油种子油菜(oil seed rape)、稻、大豆、大麦、向日葵、乔木(包括松类和落叶类)、花(包括包括商业化和温室种植的花)、田野羽扇豆(field lupin)、柳枝稷、甘蔗、马铃薯、番茄、烟草、十字花科植物、胡椒、甜菜、大麦和含油种子油菜、芸苔(Brassica sp.)、黑麦、小米、花生、甘薯、木薯(cassaya)、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、扁桃、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
可通过这些方法控制的具体作物和昆虫包括以下：
本发明可用于转化任何植物品种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。转基因方
法或PEP可能是对之特别有用的方法的作物包括但不限于：苜蓿、棉、番茄、玉米(maize)、小麦、玉米(corn)、甜玉米、紫花苜蓿、大豆、高粱、紫花豌豆、亚麻籽、红花、油菜籽、含油种子油菜(oil seed rape)、稻、大豆、大麦、向日葵、乔木(包括松类和落叶类)、花(包括包括商业化和温室种植的花)、田野羽扇豆(field lupin)、柳枝稷、甘蔗、马铃薯、番茄、烟草、十字花科植物、胡椒、甜菜、大麦和含油种子油菜、芸苔(Brassica sp.)、黑麦、小米、花生、甘薯、木薯(cassaya)、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、扁桃、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
[0341] “害虫”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。
[0342] 昆虫害虫包括但不限于选自以下目的昆虫：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等。更特别地，昆虫害虫包括鞘翅目、鳞翅目和双翅目。
[0343] 对于用杀虫多肽处理而言，具有合适的农业、家庭和/或医学/兽医学重要性的昆虫包括但不限于下列纲和目的成员：鞘翅目包括肉食亚目(Adephaga)和多食亚目(Polyphaga)。肉食亚目包括步甲总科
(Caraboidea)和豉甲总科(Gyrinoidea)。多食亚目包括水龟甲总科(Hydrophiloidea)、
隐翅虫总科(Staphylinoidea)、花萤总科(Cantharoidea)、郭公甲总科(Cleroidea)、叩甲总科(Elateroidea)、花甲总科(Dascilloidea)、泥甲总科(Dryopoidea)、丸甲总科
(Byrrhoidea)、扁甲总科(Cucujoidea)、芫菁总科(Meloidea)、花蚤总科(Mordelloidea)、拟步甲总科(Tenebrionoidea)、长蠢总科(Bostrichoidea)、金龟总科(Scarabaeoidea)、天牛总科(Cerambycoidea)、叶甲总科(Chrysomeloidea)和象甲总科(Curculionoidea)。
步甲总科包括虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)和龙虱科(Dytiscidae)。豉
甲总科包括豉甲科(Gyrinidae)。水龟甲总科包括水龟甲科(Hydrophilidae)。隐翅虫
总科包括埋葬甲科(Silphidae)和隐翅虫科(Staphylinidae)。花萤总科包括花萤科
(Cantharidae)和萤科(Lampyridae)。郭公甲总科包括郭公甲科(Cleridae)和皮蠹科
(Dermestidae)。叩甲总科包括叩甲科(Elateridae)和吉丁科(Buprestidae)。扁甲总科
包括瓢虫科(Coccinellidae)。芫菁总科包括芫菁科(Meloidae)。拟步甲总科包括拟步甲科(Tenebrionidae)。金龟总科包括黑蜣科(Passalidae)和金龟科(Scarabaeidae)。天
牛总科包括天牛科(Cerambycidae)。叶甲总科包括叶甲科(Chrysomelidae)。象甲总科包括象甲科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)。
(Caraboidea)和豉甲总科(Gyrinoidea)。多食亚目包括水龟甲总科(Hydrophiloidea)、
隐翅虫总科(Staphylinoidea)、花萤总科(Cantharoidea)、郭公甲总科(Cleroidea)、叩甲总科(Elateroidea)、花甲总科(Dascilloidea)、泥甲总科(Dryopoidea)、丸甲总科
(Byrrhoidea)、扁甲总科(Cucujoidea)、芫菁总科(Meloidea)、花蚤总科(Mordelloidea)、拟步甲总科(Tenebrionoidea)、长蠢总科(Bostrichoidea)、金龟总科(Scarabaeoidea)、天牛总科(Cerambycoidea)、叶甲总科(Chrysomeloidea)和象甲总科(Curculionoidea)。
步甲总科包括虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)和龙虱科(Dytiscidae)。豉
甲总科包括豉甲科(Gyrinidae)。水龟甲总科包括水龟甲科(Hydrophilidae)。隐翅虫
总科包括埋葬甲科(Silphidae)和隐翅虫科(Staphylinidae)。花萤总科包括花萤科
(Cantharidae)和萤科(Lampyridae)。郭公甲总科包括郭公甲科(Cleridae)和皮蠹科
(Dermestidae)。叩甲总科包括叩甲科(Elateridae)和吉丁科(Buprestidae)。扁甲总科
包括瓢虫科(Coccinellidae)。芫菁总科包括芫菁科(Meloidae)。拟步甲总科包括拟步甲科(Tenebrionidae)。金龟总科包括黑蜣科(Passalidae)和金龟科(Scarabaeidae)。天
牛总科包括天牛科(Cerambycidae)。叶甲总科包括叶甲科(Chrysomelidae)。象甲总科包括象甲科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)。
[0344] 鞘翅目的实例包括但不限于：美国豆象Acanthoscelides obtectus、叶甲Agelastica alni、叩甲(Agriotes lineatus、Agriotes obscurus、Agriotes bicolor)、谷物甲虫Ahasverus advena、summer schafer Amphimallon solstitialis、窃蠹Anobium punctatum、Anthonomus spp. (象甲)、Pygmy mangold beetle Atomaria linearis、皮蠹(Anthrenus spp.、Attagenus spp.)、四纹象豆Callosobruchus maculates、fried fruit beetle Carpophilus hemipterus、甘蓝荚象甲Ceutorhynchus assimilis、rape winter stem weevil Ceutorhynchus picitarsis、金针虫Conoderus vespertinus 和Conoderus falli、香蕉象甲Cosmopolites sordidus、新西兰草金龟Costelytra zealandica、六月金龟Cotinis nitida、向日葵茎象甲Cylindrocopturus adspersus、火腿皮蠹Dermestes lardarius、玉 米 食 虫Diabrotica virgifera、Diabrotica virgifera virgifera 和Diabrotica barberi、墨西哥豆瓢虫Epilachna varivestis、家天牛Hylotropes bajulus、苜蓿象甲Hypera postica、shiny spider beetle Gibbium psylloides、烟草甲虫
Lasioderma serricorne、科罗拉多马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata、Lyctus
beetles' (Lyctus spp.)、pollen bettle Meligethes aeneus、common cockshafer
Melolontha melolontha、美洲蛛甲Mezium americanum、金黄蛛甲Niptus hololeucus、谷物甲虫Oryzaephilus surinamensis和Oryzaephilus mercator、葡萄黑象甲Otiorhynchus sulcatus、辣根猿叶甲虫Phaedon cochleariae、crucifer flea beetle Phyllotreta
cruciferae、striped flea bettle Phyllotreta striolata、cabbage steam flea bettle Psylliodes chrysocephala、Ptinus spp. (蛛甲)、谷蠹Rhizopertha dominica、豌豆象Sitona lineatus、稻谷象Sitophilus oryzae和Sitophilus granaries、red sunflower seed weevil Smicronyx fulvus、drugstore bettle Stegobium paniceum、黄 粉 虫
Tenebrio molitor、面粉甲虫Tribolium castaneum和Tribolium confusum、warehouse和cabinet beetles (Trogoderma spp.)和向日葵甲Zygogramma exclamation's。
Lasioderma serricorne、科罗拉多马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata、Lyctus
beetles' (Lyctus spp.)、pollen bettle Meligethes aeneus、common cockshafer
Melolontha melolontha、美洲蛛甲Mezium americanum、金黄蛛甲Niptus hololeucus、谷物甲虫Oryzaephilus surinamensis和Oryzaephilus mercator、葡萄黑象甲Otiorhynchus sulcatus、辣根猿叶甲虫Phaedon cochleariae、crucifer flea beetle Phyllotreta
cruciferae、striped flea bettle Phyllotreta striolata、cabbage steam flea bettle Psylliodes chrysocephala、Ptinus spp. (蛛甲)、谷蠹Rhizopertha dominica、豌豆象Sitona lineatus、稻谷象Sitophilus oryzae和Sitophilus granaries、red sunflower seed weevil Smicronyx fulvus、drugstore bettle Stegobium paniceum、黄 粉 虫
Tenebrio molitor、面粉甲虫Tribolium castaneum和Tribolium confusum、warehouse和cabinet beetles (Trogoderma spp.)和向日葵甲Zygogramma exclamation's。
[0345] 革翅目(蠼螋)的实例包括但不限于：欧洲蠼螋Forficula auricularia和条纹蠼螋Labidura riparia。
[0346] Dictvontera的实例包括但不限于：东方蜚蠊Blatta orientalis、德国小蠊Blatella germanica、马德拉蜚蠊Leucophaea maderae、美洲大蠊Periplaneta americana和烟色大蠊Periplaneta fuliginosa。
[0347] Diplonoda的 实 例 包 括但 不 限 于：spotted snake millipede Blaniulus guttulatus、flat-back millipede Brachydesmus superus 和 温 室 千 足 虫Oxidus gracilis。
[0348] 双翅目包括长角亚目(Nematocera)、短角亚目(Brachycera)和环裂亚目(Cyclorrhapha)。长角亚目包括大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科
(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、搖蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)和癭蚋科(Cecidomyiidae)。短角亚目包括水虻科(Stratiomyidae)、虻
科(Tabanidae)、剑虻科(Therevidae)、食虫虻科(Asilidae)、拟食虫虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)和长足虻科(Dolichopodidae)。环裂亚目包括无缝组(Aschiza)和无缝
组。无缝组包括蚤蝇科(Phoridae)、食蚜蝇科(Syrphidae)和眼蝇科(Conopidae)。无缝组包括无瓣类(Acalyptratae)和有瓣类(Calyptratae)。无瓣类包括斑蝇科(Otitidae)、实蝇科(Tephritidae)、潜蝇科(Agromyzidae)和果蝇科(Drosophilidae)。有瓣类包括虱蝇科(Hippoboscidae)、狂蝇科(Oestridae)、寄蝇科(Tachinidae)、花蝇科(Anthomyiidae)、蝇科(Muscidae)、丽蝇科(Calliphoridae)和麻蝇科(Sarcophagidae)。
(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、搖蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)和癭蚋科(Cecidomyiidae)。短角亚目包括水虻科(Stratiomyidae)、虻
科(Tabanidae)、剑虻科(Therevidae)、食虫虻科(Asilidae)、拟食虫虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)和长足虻科(Dolichopodidae)。环裂亚目包括无缝组(Aschiza)和无缝
组。无缝组包括蚤蝇科(Phoridae)、食蚜蝇科(Syrphidae)和眼蝇科(Conopidae)。无缝组包括无瓣类(Acalyptratae)和有瓣类(Calyptratae)。无瓣类包括斑蝇科(Otitidae)、实蝇科(Tephritidae)、潜蝇科(Agromyzidae)和果蝇科(Drosophilidae)。有瓣类包括虱蝇科(Hippoboscidae)、狂蝇科(Oestridae)、寄蝇科(Tachinidae)、花蝇科(Anthomyiidae)、蝇科(Muscidae)、丽蝇科(Calliphoridae)和麻蝇科(Sarcophagidae)。
[0349] 双翅目的实例包括但不限于：家蝇(Musca domestica)、非洲食肉蝇蝇(Cordylobia anthropophaga)、拟蚊蠓(Culicoides spp.)、蜂虱(Braula spp.)、甜菜
浅叶花蝇Pegomyia betae、黑蝇(Cnephia spp.、Eusimulium spp.、Simulium spp.)、胃蝇(Cuterebra spp.、Gastrophilus spp.、Oestrus spp.)、大蚊(Tipula spp.)、眼潜蝇(Hippelates spp.)、污物繁殖蝇(Calliphora spp.、Fannia spp.、Hermetia spp.、Lucilia spp.、Musca spp.、Muscina spp.、Phaenicia spp.、Phormia spp.)、麻蝇(Sarcophaga spp.、Wohlfahrtia spp.)；欧小 蝇Oscinella frit、果蝇 (Dacus spp.、Drosophila spp.)、head and canon fly (Hydrotea spp.)、黑森瘿蚊Mayetiola destructor、horn and buffalo fly (Haematobia spp.)、马蝇和斑虻(Chrysops spp.、Haematopota spp.、Tabanus spp.)、虱蝇(Lipoptena spp.、Lynchia spp.和Pseudolynchia spp.)、地中海果蝇(Ceratitus spp.)、蚊(Aedes spp.、Anopheles spp.、Culex spp.、Psorophora spp.)、白蛉(Phlebotomus spp.、Lutzomyia spp.)、旋丽蝇(Chtysomya bezziana和Cochliomyia hominivorax)、绵羊蜱(Melophagus spp.)；厩螫蝇(Stomoxys spp.)、采采蝇(Glossina spp.)和皮蝇(Hypoderma spp.)。
浅叶花蝇Pegomyia betae、黑蝇(Cnephia spp.、Eusimulium spp.、Simulium spp.)、胃蝇(Cuterebra spp.、Gastrophilus spp.、Oestrus spp.)、大蚊(Tipula spp.)、眼潜蝇(Hippelates spp.)、污物繁殖蝇(Calliphora spp.、Fannia spp.、Hermetia spp.、Lucilia spp.、Musca spp.、Muscina spp.、Phaenicia spp.、Phormia spp.)、麻蝇(Sarcophaga spp.、Wohlfahrtia spp.)；欧小 蝇Oscinella frit、果蝇 (Dacus spp.、Drosophila spp.)、head and canon fly (Hydrotea spp.)、黑森瘿蚊Mayetiola destructor、horn and buffalo fly (Haematobia spp.)、马蝇和斑虻(Chrysops spp.、Haematopota spp.、Tabanus spp.)、虱蝇(Lipoptena spp.、Lynchia spp.和Pseudolynchia spp.)、地中海果蝇(Ceratitus spp.)、蚊(Aedes spp.、Anopheles spp.、Culex spp.、Psorophora spp.)、白蛉(Phlebotomus spp.、Lutzomyia spp.)、旋丽蝇(Chtysomya bezziana和Cochliomyia hominivorax)、绵羊蜱(Melophagus spp.)；厩螫蝇(Stomoxys spp.)、采采蝇(Glossina spp.)和皮蝇(Hypoderma spp.)。
[0350] Isontera(白 蚁 )的 实 例 包 括 但 不 限 于 以 下 科 的 种：草 白 蚁 科(Hodotennitidae)、木白蚁科(Kalotermitidae)、澳白蚁科(Mastotermitidae)、鼻白蚁科(Rhinotennitidae)、毛白蚁科(Serritermitidae)、白蚁科(Termitidae)、原白蚁科(Termopsidae)；
异翅亚目(Heteroptera)的实例包括但不限于：臭虫Cimex lectularius、污棉
虫Dysdercus intermedius、Sunn pest Eurygaster integriceps、牧 草 盲 蝽Lygus
lineolaris、喜绿蝽Nezara antennata、稻绿蝽Nezara viridula 和锥猎蝽Panstrogylus megistus、Rhodnius ecuadoriensis、Rhodnius pallescans、Rhodnius prolixus、Rhodnius robustus、Triatoma dimidiata、Triatoma infestans 和Triatoma sordida。
异翅亚目(Heteroptera)的实例包括但不限于：臭虫Cimex lectularius、污棉
虫Dysdercus intermedius、Sunn pest Eurygaster integriceps、牧 草 盲 蝽Lygus
lineolaris、喜绿蝽Nezara antennata、稻绿蝽Nezara viridula 和锥猎蝽Panstrogylus megistus、Rhodnius ecuadoriensis、Rhodnius pallescans、Rhodnius prolixus、Rhodnius robustus、Triatoma dimidiata、Triatoma infestans 和Triatoma sordida。
[0351] 同翅目的实例包括但不限于：加利福尼亚红圆蚧Aonidiella aurantii、蚕豆蚜Aphis fabae、棉蚜Aphis gossypii、苹果蚜Aphis pomi、黑刺粉虱Aleurocanthus
spiniferus、夹 竹桃 圆 蚧Aspidiotus hederae、棉 粉 虱Bemesia tabaci、甘 蓝 蚜Brevicoryne brassicae、梨黄木虱Cacopsylla pyricola、醋栗蚜Cryptomyzus ribis、葡萄根瘤蚜Daktulosphaira vitifoliae、桔木虱Diaphorina citri、马铃薯微叶蝉Empoasca fabae、蚕豆微叶蝉Empoasca solana、葡萄微叶蝉Empoasca vitis、绵蚜Eriosoma
lanigerum、欧洲果圆蚧Eulecanium corni、桃大尾蚜Hyalopterus arundinis、稻灰飞虱Laodelphax striatellus、马铃薯长管蚜Macrosiphum euphorbiae、桃蚜Myzus persicae、稻叶蝉Nephotettix cinticeps、稻褐飞虱Nilaparvata lugens、成瘿瘤蚜(Pemphigus
spp.)、忽布疣额蚜Phorodon humuli、粟缢蚜Rhopalosiphum padi、乌盔蚧Saissetia
oleae、麦二岔蚜Schizaphis graminum、燕麦长管蚜Sitobion avenae 和温室白粉虱
Trialeurodes vaporariorum。
spiniferus、夹 竹桃 圆 蚧Aspidiotus hederae、棉 粉 虱Bemesia tabaci、甘 蓝 蚜Brevicoryne brassicae、梨黄木虱Cacopsylla pyricola、醋栗蚜Cryptomyzus ribis、葡萄根瘤蚜Daktulosphaira vitifoliae、桔木虱Diaphorina citri、马铃薯微叶蝉Empoasca fabae、蚕豆微叶蝉Empoasca solana、葡萄微叶蝉Empoasca vitis、绵蚜Eriosoma
lanigerum、欧洲果圆蚧Eulecanium corni、桃大尾蚜Hyalopterus arundinis、稻灰飞虱Laodelphax striatellus、马铃薯长管蚜Macrosiphum euphorbiae、桃蚜Myzus persicae、稻叶蝉Nephotettix cinticeps、稻褐飞虱Nilaparvata lugens、成瘿瘤蚜(Pemphigus
spp.)、忽布疣额蚜Phorodon humuli、粟缢蚜Rhopalosiphum padi、乌盔蚧Saissetia
oleae、麦二岔蚜Schizaphis graminum、燕麦长管蚜Sitobion avenae 和温室白粉虱
Trialeurodes vaporariorum。
[0352] 等足目(Isopoda)的实例包括但不限于：common pillbug Armadillidiumvulgare 和common woodlouse Oniscus asellus。
[0353] 鳞翅目包括凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、大 蚕蛾科(Saturniidae)、尺 蛾科(Geometridae)、灯蛾 科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)和谷蛾科(Tineidae)。
[0354] 鳞翅目的实例包括但不限于：Adoxophyes orana (茶小卷叶蛾)、Agrotisipsolon (小地老虎)、Archips podana (苹褐长翅卷蛾)、Bucculatrix pyrivorella
(pear leafminer)、Bucculatrix thurberiella (棉叶穿孔潜蛾)、Bupalus piniarius (松尺蠖)、Carpocapsa pomonella (苹果蠹蛾)、Chilo suppressalis (二化螟)、
Choristoneura fumiferana (eastern spruce budworm)、Cochylis hospes (向日葵
细圈叶蛾)、Diatraea grandiosella (西南玉米秆草螟)、Earls insulana (埃及金刚
钻)、Euphestia kuehniella (地中海粉螟)、Eupoecilia ambiguella (欧洲葡萄卷叶
蛾)、Euproctis chrysorrhoea (黄毒蛾)、Euproctis subflava (东方毒蛾)、Galleria mellonella (大蜡螟)、Helicoverpa armigera (棉铃虫)、Helicoverpa zea (棉铃
虫)、Heliothis virescens (烟夜蛾)、Hofmannophila pseudopretella (褐织叶蛾)、
Homeosoma electellum (向日葵斑螟)、Homona magnanima (oriental tea tree tortrix moth)、Lithocolletis blancardella (spotted tentiform leafminer)、Lymantria
dispar (舞毒蛾)、Malacosoma neustria (黄褐天幕毛虫)、Mamestra brassicae (甘
蓝夜蛾)、Mamestra configurata (披肩粘虫)、天蛾幼虫Manduca sexta 和Manuduca
quinquemaculata、Operophtera brumata (冬尺蠖)、Ostrinia nubilalis (欧洲玉米螟)、Panolis flammea (小眼夜蛾)、Pectinophora gossypiella (棉红铃虫)、Phyllocnistis citrella (桔细潜蛾)、Pieris brassicae (菜粉蝶)、Plutella xylostella (小菜蛾)、Rachiplusia ni (大豆尺夜蛾)、Spilosoma virginica (yellow bear moth)、Spodoptera exigua (甜菜夜蛾)、Spodoptera frugiperda (秋夜蛾)、Spodoptera littoralis
(cotton leafworin)、Spodoptera litura (斜纹夜蛾)、Spodoptera praefica (黄纹夜蛾)、Sylepta derogata (cotton leaf roller)、Tineola bisselliella (负袋衣蛾)、Tineola pellionella (网 衣蛾 )、Tortrix viridana (European oak leafroller)、
Trichoplusia ni (粉纹夜蛾)和Yponomeuta padella (巢蛾)。
(pear leafminer)、Bucculatrix thurberiella (棉叶穿孔潜蛾)、Bupalus piniarius (松尺蠖)、Carpocapsa pomonella (苹果蠹蛾)、Chilo suppressalis (二化螟)、
Choristoneura fumiferana (eastern spruce budworm)、Cochylis hospes (向日葵
细圈叶蛾)、Diatraea grandiosella (西南玉米秆草螟)、Earls insulana (埃及金刚
钻)、Euphestia kuehniella (地中海粉螟)、Eupoecilia ambiguella (欧洲葡萄卷叶
蛾)、Euproctis chrysorrhoea (黄毒蛾)、Euproctis subflava (东方毒蛾)、Galleria mellonella (大蜡螟)、Helicoverpa armigera (棉铃虫)、Helicoverpa zea (棉铃
虫)、Heliothis virescens (烟夜蛾)、Hofmannophila pseudopretella (褐织叶蛾)、
Homeosoma electellum (向日葵斑螟)、Homona magnanima (oriental tea tree tortrix moth)、Lithocolletis blancardella (spotted tentiform leafminer)、Lymantria
dispar (舞毒蛾)、Malacosoma neustria (黄褐天幕毛虫)、Mamestra brassicae (甘
蓝夜蛾)、Mamestra configurata (披肩粘虫)、天蛾幼虫Manduca sexta 和Manuduca
quinquemaculata、Operophtera brumata (冬尺蠖)、Ostrinia nubilalis (欧洲玉米螟)、Panolis flammea (小眼夜蛾)、Pectinophora gossypiella (棉红铃虫)、Phyllocnistis citrella (桔细潜蛾)、Pieris brassicae (菜粉蝶)、Plutella xylostella (小菜蛾)、Rachiplusia ni (大豆尺夜蛾)、Spilosoma virginica (yellow bear moth)、Spodoptera exigua (甜菜夜蛾)、Spodoptera frugiperda (秋夜蛾)、Spodoptera littoralis
(cotton leafworin)、Spodoptera litura (斜纹夜蛾)、Spodoptera praefica (黄纹夜蛾)、Sylepta derogata (cotton leaf roller)、Tineola bisselliella (负袋衣蛾)、Tineola pellionella (网 衣蛾 )、Tortrix viridana (European oak leafroller)、
Trichoplusia ni (粉纹夜蛾)和Yponomeuta padella (巢蛾)。
[0355] 直翅目的实例包括但不限于：家蟋Acheta domesticus、树蝗(Anacridium spp.)、飞蝗Locusta migratoria、双带蚱蜢Melanoplus bivittatus、长额负蝗Melanoplusdfferentialis、赤腿蚱蜢Melanoplus femurrubrum、迁徙蚱蜢Melanoplus sanguinipes、北美蝼蛄Neocurtilla hexadectyla、松红翅蝗Nomadacris septemfasciata、短翅蝼蛄
Scapteriscus abbreviatus、南美蝼蛄Scapteriscus borellii、tawny mole cricket
Scapteriscus vicinus 和沙漠蝗Schistocerca gregaria。
Scapteriscus abbreviatus、南美蝼蛄Scapteriscus borellii、tawny mole cricket
Scapteriscus vicinus 和沙漠蝗Schistocerca gregaria。
[0356] 虱目(Phthiraptera)的实例包括但不限于：牛羽虱Bovicola bovis、咬虱(Damalinia spp.)、猫羽虱Felicola subrostrata、短鼻牛虱Haematopinus eloysternus、tail-switch louse Haematopinus quadriperiussus、猪虱Haematopinus suis、面虱
Linognathus ovillus、足虱Linognathus pedalis、狗长颚虱Linognathus setosus、长鼻牛虱Linognathus vituli、鸡体虱Menacanthus stramineus、poultry shaft louse
Menopon gallinae、人体虱Pediculus humanus、阴虱Phthirus pubis、牛管虱Solenopotes capillatus 和狗羽虱Trichodectes canis。
Linognathus ovillus、足虱Linognathus pedalis、狗长颚虱Linognathus setosus、长鼻牛虱Linognathus vituli、鸡体虱Menacanthus stramineus、poultry shaft louse
Menopon gallinae、人体虱Pediculus humanus、阴虱Phthirus pubis、牛管虱Solenopotes capillatus 和狗羽虱Trichodectes canis。
[0357] 啮虫目(Psocoptera)的实例包括但不限于：书虱Liposcelis bostrychophila、Liposcelis decolor、Liposcelis entomophila和Trogium pulsatorium。
[0358] 蚤目的实例包括但不限于：禽蚤Ceratophyllus gallinae、狗蚤Ctenocephalides canis、猫蚤Ctenocephalides fells、人蚤Pulex irritans 和东方鼠蚤Xenopsyllacheopis。
[0359] Symphyla的实例包括但不限于：庭院么蚰Scutigerella immaculate。
[0360] 缨尾目(Thysanura)的实例包括但不限于：gray silverfish Ctenolepismalongicaudata、four-lined silverfish Ctenolepisma quadriseriata、common silverfish Lepisma saccharina 和firebrat Thennobia domestica ；
缨翅目的实例包括但不限于：烟草蓟马Frankliniella fusca、花蓟马Frankliniella
intonsa、苜蓿蓟马Frankliniella occidentalis、棉芽蓟马Frankliniella schultzei、温室条蓟马Hercinothrips femoralis、大豆蓟马Neohydatothrips variabilis、Kelly's citrus thrips Pezothrips kellyanus、鳄梨蓟马Scirtothrips perseae、南黄蓟马
Thrips palmi 和棉蓟马Thrips tabaci。
缨翅目的实例包括但不限于：烟草蓟马Frankliniella fusca、花蓟马Frankliniella
intonsa、苜蓿蓟马Frankliniella occidentalis、棉芽蓟马Frankliniella schultzei、温室条蓟马Hercinothrips femoralis、大豆蓟马Neohydatothrips variabilis、Kelly's citrus thrips Pezothrips kellyanus、鳄梨蓟马Scirtothrips perseae、南黄蓟马
Thrips palmi 和棉蓟马Thrips tabaci。
[0361] 线虫的实例包括但不限于：寄生线虫例如根结线虫、孢囊线虫和根斑线虫，包括异皮线虫(Heterodera spp.)、根结线虫(Meloidogyne spp.)和球异皮线虫(Globoderaspp.)；特别是孢囊线虫的成员，包括但不限于：Heterodera glycines (大豆胞囊线虫)；
Heterodera schachtii (甜菜孢囊线虫)；Heterodera avenae (禾谷孢囊线虫)；以及
Globodera rostochiensis 和Globodera pailida (马铃薯孢囊线虫)。根斑线虫包括但
不限于：短体线虫(Pratylenchus spp)。
Heterodera schachtii (甜菜孢囊线虫)；Heterodera avenae (禾谷孢囊线虫)；以及
Globodera rostochiensis 和Globodera pailida (马铃薯孢囊线虫)。根斑线虫包括但
不限于：短体线虫(Pratylenchus spp)。
[0362] 在一个实施方案中，包含所述多肽、多核苷酸、细胞、载体等的杀虫组合物可用来治疗外寄生物。外寄生物包括但不限于：蚤、蜱、疥癣、螨、蚊、令人讨厌和叮咬人的蝇、虱和包含前述外寄生物的一种或多种的组合。术语“蚤”包括蚤目寄生蚤的普通种或偶然种，特别是栉头蚤种(Ctenocephalides)，特别是猫栉头蚤(C. fells)和犬栉头蚤(C.cams)、鼠蚤(印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis))和人蚤(Pulex irritans)。
[0363] 针于主要作物的本发明的昆虫害虫包括但不限于：玉米：Ostrinia nubilalis，欧洲玉米螟；Agrotis ipsilon，小地老虎；Helicoverpa zea，谷实夜蛾；Spodoptera frugiperda，秋 夜 蛾；Diatraea grandiosella，西 南 玉 米 秆 草 螟；Elasmopalpus lignosellus，小玉米茎蛀虫；Diatraea saccharalis，蔗螟；Diabrotica virgifera，玉米根叶甲；Diabrotica longicornis barberi，长角叶甲；Diabrotica undecimpunctata howardi，南方玉米根叶甲；Melanotus spp.，捻转血矛线虫；Cyclocephala borealis，圆头犀金龟(蛴螬)；Cyclocephala immaculata，南方圆头犀金龟(蛴螬)；Popilliajaponica，日本丽金龟；Chaetocnema pulicaria，玉米跳甲；Sphenophorus maidis，玉米谷象；Rhopalosiphum maidis，玉米缢管蚜；Anuraphis maidiradicis，玉米根蚜；Blissus leucopterus leucopterus，白翅长蝽；Melanoplus femurrubrum，赤腿蚱蜢；Melanoplus sanguinipes，迁徙蚱蜢；Hylemya platura，玉米种蝇；Agromyza parvicornis，玉米斑潜蝇；Anaphothrips obscrurus，草蓟马；Solenopsis milesta，窃蚁；Tetranychus urticae，荨麻叶螨；高粱：Chilo partellus，高粱螟(sorghum borer)；Spodoptera frugiperda，秋夜蛾；Helicoverpa zea，谷实夜蛾；Elasmopalpus lignosellus，小玉米茎蛀虫；Feltia subterranea，粒肤地老虎；Phyllophaga crinita，蛴螬；Eleodes、Conoderus 和Aeolus spp.，捻转血矛线虫；Oulema melanopus，橙足负尼虫；Chaetocnema pulicaria，玉米跳甲；Sphenophorus maidis，玉米谷象；Rhopalosiphum maidis，玉米缢管蚜；Sipha flava，蔗黄伪毛蚜；Blissus leucopterus leucopterus，白翅长蝽；Contarinia sorghicola，高粱瘿蚊；Tetranychus cinnabarinus，朱砂叶螨；Tetranychus urticae，荨麻叶螨；小麦：Pseudaletia unipunctata，粘虫；Spodoptera frugiperda，秋夜蛾；Elasmopalpus lignosellus，小玉米茎蛀虫；Agrotis orthogonia，西方地老虎(western cutworm)；
Elasmopalpus lignosellus，小玉米茎蛀虫；Oulema melanopus，橙足负尼虫；Hypera punctata，车轴草叶象甲；Diabrotica undecimpunctata howardi，南方玉米根叶甲；
Russian wheat aphid；Schizaphis graminum，麦二岔蚜；Macrosiphum avenae，麦长
管蚜；Melanoplus femurrubrum，赤腿蚱蜢；Melanoplus differentialis，长额负蝗；
Melanoplus sanguinipes，迁徙蚱蜢；Mayetiola destructor，小麦瘿蚊；Sitodiplosis mosellana，麦红吸浆虫；Meromyza americana，美洲麦秆蝇；Hylemya coarctata，冬作种蝇；Frankliniella fusca，烟草蓟马；Cephus cinctus，麦茎蜂；Aceria tulipae，郁金香瘤瘿螨；向日葵：Suleima helianthana，sunflower bud moth；Homoeosoma electellum，向日葵斑螟；Zygogramma exclamationis，向日葵叶甲；Bothyrus gibbosus，胡萝卜
金龟；Neolasioptera murtfeldtiana，向日葵籽瘿蚊；棉：Heliothis virescens，棉
芽虫(cotton budworm)；Helicoverpa zea，美洲棉铃虫；Spodoptera exigua，甜菜
夜蛾；Pectinophora gossypiella，棉红铃虫；Anthonomus grandis，棉铃象甲；Aphis gossypii，棉蚜；Pseudatomoscelis seriatus，棉跳盲蝽；Trialeurodes abutilonea，结翅粉虱；Lygus lineolaris，牧草盲蝽；Melanoplus femurrubrum，赤腿蚱蜢；Melanoplus differentialis，长额负蝗；Thrips tabaci，棉蓟马；Franklinkiella fusca，烟草蓟马；
Tetranychus cinnabarinus，朱砂叶螨；Tetranychus urticae，荨麻叶螨；稻：Diatraea saccharalis，蔗螟；Spodoptera frugiperda，秋夜蛾；Helicoverpa zea，谷实夜蛾；
Colaspis brunnea，葡萄肖叶甲；Lissorhoptrus oryzophilus，稻象甲；Sitophilus
oryzae，米象；Nephotettix nigropictus，黑尾叶蝉；Blissus leucopterus leucopterus，白翅长蝽；Acrosternum hilare，喜绿蝽；大豆：Pseudoplusia includens，大豆尺夜
蛾；Anticarsia gemmatalis，黎豆夜蛾；Plathypena scabra，苜蓿绿夜蛾；Ostrinia nubilalis，欧洲玉米螟；Agrotis ipsilon，小地老虎；Spodoptera exigua，甜菜夜蛾；
Heliothis virescens，棉蚜虫；Helicoverpa zea，美洲棉铃虫；Epilachna varivestis，墨西哥豆瓢虫；Myzus persicae，桃蚜；Empoasca fabae，马铃薯微叶蝉；Acrosternum hilare，喜绿蝽；Melanoplus femurrubrum，赤腿蚱蜢；Melanoplus differentialis，长额负蝗；Hylemya platura，玉米种蝇；Sericothrips variabilis，大豆蓟马；Thrips tabaci，棉蓟马；Tetranychus turkestani，土耳其斯坦叶螨；Tetranychus urticae，荨麻叶螨；大麦：Ostrinia nubilalis，欧洲玉米螟；Agrotis ipsilon，小地老虎；
Schizaphis graminum，麦 二 岔蚜；Blissus leucopterus leucopterus，白翅 长 蝽；
Acrosternum hilare，喜绿蝽；Euschistus servus，褐臭蝽；Delia platura，玉米种蝇；
Mayetiola destructor，小麦瘿蚊；Petrobia latens，麦岩螨；含油种子油菜：Brevicoryne brassicae，甘蓝蚜；Phyllotreta cruciferae，蔬菜黄条跳甲(Flea beetle)；Mamestra configurata，披肩粘虫；Plutella xylostella，小菜蛾；Delia ssp.，根蛆。
Elasmopalpus lignosellus，小玉米茎蛀虫；Oulema melanopus，橙足负尼虫；Hypera punctata，车轴草叶象甲；Diabrotica undecimpunctata howardi，南方玉米根叶甲；
Russian wheat aphid；Schizaphis graminum，麦二岔蚜；Macrosiphum avenae，麦长
管蚜；Melanoplus femurrubrum，赤腿蚱蜢；Melanoplus differentialis，长额负蝗；
Melanoplus sanguinipes，迁徙蚱蜢；Mayetiola destructor，小麦瘿蚊；Sitodiplosis mosellana，麦红吸浆虫；Meromyza americana，美洲麦秆蝇；Hylemya coarctata，冬作种蝇；Frankliniella fusca，烟草蓟马；Cephus cinctus，麦茎蜂；Aceria tulipae，郁金香瘤瘿螨；向日葵：Suleima helianthana，sunflower bud moth；Homoeosoma electellum，向日葵斑螟；Zygogramma exclamationis，向日葵叶甲；Bothyrus gibbosus，胡萝卜
金龟；Neolasioptera murtfeldtiana，向日葵籽瘿蚊；棉：Heliothis virescens，棉
芽虫(cotton budworm)；Helicoverpa zea，美洲棉铃虫；Spodoptera exigua，甜菜
夜蛾；Pectinophora gossypiella，棉红铃虫；Anthonomus grandis，棉铃象甲；Aphis gossypii，棉蚜；Pseudatomoscelis seriatus，棉跳盲蝽；Trialeurodes abutilonea，结翅粉虱；Lygus lineolaris，牧草盲蝽；Melanoplus femurrubrum，赤腿蚱蜢；Melanoplus differentialis，长额负蝗；Thrips tabaci，棉蓟马；Franklinkiella fusca，烟草蓟马；
Tetranychus cinnabarinus，朱砂叶螨；Tetranychus urticae，荨麻叶螨；稻：Diatraea saccharalis，蔗螟；Spodoptera frugiperda，秋夜蛾；Helicoverpa zea，谷实夜蛾；
Colaspis brunnea，葡萄肖叶甲；Lissorhoptrus oryzophilus，稻象甲；Sitophilus
oryzae，米象；Nephotettix nigropictus，黑尾叶蝉；Blissus leucopterus leucopterus，白翅长蝽；Acrosternum hilare，喜绿蝽；大豆：Pseudoplusia includens，大豆尺夜
蛾；Anticarsia gemmatalis，黎豆夜蛾；Plathypena scabra，苜蓿绿夜蛾；Ostrinia nubilalis，欧洲玉米螟；Agrotis ipsilon，小地老虎；Spodoptera exigua，甜菜夜蛾；
Heliothis virescens，棉蚜虫；Helicoverpa zea，美洲棉铃虫；Epilachna varivestis，墨西哥豆瓢虫；Myzus persicae，桃蚜；Empoasca fabae，马铃薯微叶蝉；Acrosternum hilare，喜绿蝽；Melanoplus femurrubrum，赤腿蚱蜢；Melanoplus differentialis，长额负蝗；Hylemya platura，玉米种蝇；Sericothrips variabilis，大豆蓟马；Thrips tabaci，棉蓟马；Tetranychus turkestani，土耳其斯坦叶螨；Tetranychus urticae，荨麻叶螨；大麦：Ostrinia nubilalis，欧洲玉米螟；Agrotis ipsilon，小地老虎；
Schizaphis graminum，麦 二 岔蚜；Blissus leucopterus leucopterus，白翅 长 蝽；
Acrosternum hilare，喜绿蝽；Euschistus servus，褐臭蝽；Delia platura，玉米种蝇；
Mayetiola destructor，小麦瘿蚊；Petrobia latens，麦岩螨；含油种子油菜：Brevicoryne brassicae，甘蓝蚜；Phyllotreta cruciferae，蔬菜黄条跳甲(Flea beetle)；Mamestra configurata，披肩粘虫；Plutella xylostella，小菜蛾；Delia ssp.，根蛆。
[0364] 在一些实施方案中，杀虫组合物可用来处理包含一种或多种前述昆虫的组合。
[0365] 易受本发明的肽影响的昆虫包括但不限于：Cyt毒素影响以下科，例 如：蜚 蠊 目(Blattaria)、鞘 翅 目、弹 尾 目(Collembola)、双 翅 目、棘 口 目(Echinostomida)、半翅 目、膜 翅目、等翅目、鳞翅 目、脉 翅目(Neuroptera)、直
翅目、小杆目(Rhabditida)、蚤目(Siphonoptera)、缨翅目。 属-种表示如 下：
Actebia-fennica、Agrotis-ipsilon、A. -segetum、Anticarsia-gemmatalis、
Argyrotaenia-citrana、Artogeia-rapae、Bombyx-mori、Busseola-fusca、
Cacyreus-marshall、Chilo-suppressalis、Christoneura-fumiferana、
C.-occidentalis、C.-pinus pinus、C.-rosacena、Cnaphalocrocis-medinalis、
Conopomorpha-cramerella、Ctenopsuestis-obliquana、Cydia-pomonella、
Danaus-plexippus、Diatraea-saccharallis、D.-grandiosella、Earias-vittella、
Elasmolpalpus-lignoselius、Eldana-saccharina、Ephestia-kuehniella、
Epinotia-aporema、Epiphyas-postvittana、Galleria-mellonella、Genus-Species、
Helicoverpa-zea、H.-punctigera、H.-armigera、Heliothis-virescens、
Hyphantria-cunea、Lambdina-fiscellaria、Leguminivora-glycinivorella、
Lobesia-botrana、Lymantria-dispar、Malacosoma-disstria、Mamestra-brassicae、M. configurata、Manduca-sexta、Marasmia-patnalis、Maruca-vitrata、Orgyia-leucostigma、Ostrinia-nubilalis、O.-furnacalis、Pandemis-pyrusana、Pectinophora-gossypiella、Perileucoptera-coffeella、Phthorimaea-opercullela、Pianotortrix-octo、
Piatynota-stultana、Pieris-brassicae、Plodia-interpunctala、Plutella-xylostella、Pseudoplusia-includens、Rachiplusia-nu、Sciropophaga-incertulas、
Sesamia-calamistis、Spilosoma-virginica、Spodoptera-exigua、S.-frugiperda、
S.-littoralis、S.-exempta、S.-litura、Tecia-solanivora、Thaumetopoea-pityocampa、Trichoplusia-ni、Wiseana-cervinata、Wiseana-copularis、Wiseana-jocosa、
Blattaria-Blattella、Collembola-Xenylla、C.-Folsomia、Echinostomida-Fasciola、Hemiptera-Oncopeltrus、He. -Bemisia、He. -Macrosiphum、He. -Rhopalosiphum、
He. -Myzus、Hymenoptera-Diprion、Hy. -Apis、Hy. -Macrocentrus、Hy. -Meteorus、Hy. -Nasonia、Hy. -Solenopsis、Isopoda-Porcellio、Isoptera-Reticulitermes、
Orthoptera-Achta、Prostigmata-Tetranychus、Rhabitida-Acrobeloides、R.
-Caenorhabditis、R. -Distolabrellus、R. -Panagrellus、R. -Pristionchus、
R. -Pratylenchus、R. -Ancylostoma、R. -Nippostrongylus、R. -Panagrellus、R.
-Haemonchus、R. -Meloidogyne和Siphonaptera-Ctenocephalides。
翅目、小杆目(Rhabditida)、蚤目(Siphonoptera)、缨翅目。 属-种表示如 下：
Actebia-fennica、Agrotis-ipsilon、A. -segetum、Anticarsia-gemmatalis、
Argyrotaenia-citrana、Artogeia-rapae、Bombyx-mori、Busseola-fusca、
Cacyreus-marshall、Chilo-suppressalis、Christoneura-fumiferana、
C.-occidentalis、C.-pinus pinus、C.-rosacena、Cnaphalocrocis-medinalis、
Conopomorpha-cramerella、Ctenopsuestis-obliquana、Cydia-pomonella、
Danaus-plexippus、Diatraea-saccharallis、D.-grandiosella、Earias-vittella、
Elasmolpalpus-lignoselius、Eldana-saccharina、Ephestia-kuehniella、
Epinotia-aporema、Epiphyas-postvittana、Galleria-mellonella、Genus-Species、
Helicoverpa-zea、H.-punctigera、H.-armigera、Heliothis-virescens、
Hyphantria-cunea、Lambdina-fiscellaria、Leguminivora-glycinivorella、
Lobesia-botrana、Lymantria-dispar、Malacosoma-disstria、Mamestra-brassicae、M. configurata、Manduca-sexta、Marasmia-patnalis、Maruca-vitrata、Orgyia-leucostigma、Ostrinia-nubilalis、O.-furnacalis、Pandemis-pyrusana、Pectinophora-gossypiella、Perileucoptera-coffeella、Phthorimaea-opercullela、Pianotortrix-octo、
Piatynota-stultana、Pieris-brassicae、Plodia-interpunctala、Plutella-xylostella、Pseudoplusia-includens、Rachiplusia-nu、Sciropophaga-incertulas、
Sesamia-calamistis、Spilosoma-virginica、Spodoptera-exigua、S.-frugiperda、
S.-littoralis、S.-exempta、S.-litura、Tecia-solanivora、Thaumetopoea-pityocampa、Trichoplusia-ni、Wiseana-cervinata、Wiseana-copularis、Wiseana-jocosa、
Blattaria-Blattella、Collembola-Xenylla、C.-Folsomia、Echinostomida-Fasciola、Hemiptera-Oncopeltrus、He. -Bemisia、He. -Macrosiphum、He. -Rhopalosiphum、
He. -Myzus、Hymenoptera-Diprion、Hy. -Apis、Hy. -Macrocentrus、Hy. -Meteorus、Hy. -Nasonia、Hy. -Solenopsis、Isopoda-Porcellio、Isoptera-Reticulitermes、
Orthoptera-Achta、Prostigmata-Tetranychus、Rhabitida-Acrobeloides、R.
-Caenorhabditis、R. -Distolabrellus、R. -Panagrellus、R. -Pristionchus、
R. -Pratylenchus、R. -Ancylostoma、R. -Nippostrongylus、R. -Panagrellus、R.
-Haemonchus、R. -Meloidogyne和Siphonaptera-Ctenocephalides。
[0366] 我们以下列描述和摘要描述了第II部分：我们描述了具有添加至已知肽并与已知肽有效连接的N端二肽的肽，其中所述N端
二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成，其中所述肽选自
CRIP (富含半胱氨酸的杀虫肽)，例如选自ICK肽或非ICK肽。添加至已知肽并与已知肽
有效连接的N端二肽，其中所述N端二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一
个极性氨基酸组成。N端二肽具有可选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的非极性氨基酸作为N端二肽的N端氨基酸和可选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸的N端肽的C端氨基酸的极性氨基酸。
二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成，其中所述肽选自
CRIP (富含半胱氨酸的杀虫肽)，例如选自ICK肽或非ICK肽。添加至已知肽并与已知肽
有效连接的N端二肽，其中所述N端二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一
个极性氨基酸组成。N端二肽具有可选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的非极性氨基酸作为N端二肽的N端氨基酸和可选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸的N端肽的C端氨基酸的极性氨基酸。
[0367] N端二肽可具有选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的非极性氨基酸作为N端二肽的N端氨基酸，N端肽的C端氨基酸的所述极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸。N端二肽可以并且优选由甘氨酸-丝氨酸组成。
[0368] 我们描述了具有添加至已知肽并与已知肽有效连接的N端二肽的肽，其中所述N端二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成，其中所述肽选
自PFIP (成孔杀虫蛋白)，或可选自CRIP (富含半胱氨酸的杀虫肽)，例如选自ICK肽或
非ICK肽。非ICK肽可以是海葵来源肽，像Av2或Av3，优选的二肽由甘氨酸-丝氨酸组成。
ICK肽可来自蜘蛛，像ACTX肽，优选的二肽由甘氨酸-丝氨酸组成。PFIP可以是Bt蛋白，
像在本文公开的、在序列表中的和阅读这些描述的本领域技术人员已知的任何Bt蛋白，优选的二肽由甘氨酸-丝氨酸组成。
自PFIP (成孔杀虫蛋白)，或可选自CRIP (富含半胱氨酸的杀虫肽)，例如选自ICK肽或
非ICK肽。非ICK肽可以是海葵来源肽，像Av2或Av3，优选的二肽由甘氨酸-丝氨酸组成。
ICK肽可来自蜘蛛，像ACTX肽，优选的二肽由甘氨酸-丝氨酸组成。PFIP可以是Bt蛋白，
像在本文公开的、在序列表中的和阅读这些描述的本领域技术人员已知的任何Bt蛋白，优选的二肽由甘氨酸-丝氨酸组成。
[0369] 如上所述，我们解释了N端二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成，来自N端二肽的N端氨基酸的非极性氨基酸可选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，优选非极性氨基酸为甘氨酸。而且我们解释并要求保护下文段落中的任何肽，和该段落的任何肽可独立地起作用，应独立地处理，并且独立地要求保护所有可能的组合。
[0370] 如上所述，我们解释了N端二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成，N端肽的C端氨基酸的极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸，优选极性氨基酸为丝氨酸。我们解释并要求保护上文段落中的任何肽，并且该段落的任何肽可独立地起作用，应独立地处理，并且独立地要求保护所有可能的组合。
[0371] N端二肽与之连接的肽可以是任何肽、任何毒肽、任何杀虫肽、任何PFIP、任何CRIP、作为ACTX肽(其是ICK肽的一个实例)的CRIP，CRIP是海葵肽(其是非ICK肽的一个实例)，它可以是PFIP，PFIP可以是Bt蛋白，Bt蛋白可以是cry、cyt、VIP，且它可像本文公开的或序列表中的或为阅读这些描述并理解所述文件的本领域技术人员已知的这些肽
的任一种。
的任一种。
[0372] 我们特别注意到这些程序是有用的，并且我们要求保护所述程序本身和所述程序的产品两者作为独立权利要求，和作为制备任何杀虫肽、特别是选自以下的任何肽的产品定义方法(process by product)的权利要求：本文或别处公开的任何肽或肽源(包括澳毒蜘蛛属或Hadronyche)，以及具有其片段的任何杀虫肽，包括所述肽和序列号及SEQ. ID. NO. 5的肽的成熟、前肽和肽原形式。
[0373] 这些肽是有用的，其中在N末端有一个非极性氨基酸和在C末端有一个极性氨基酸的情况下，均可进行和使用所述程序，且二肽的所述非极性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，优选甘氨酸或gly，而极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸和酪氨酸，优选丝氨酸或ser。二肽gly-ser是最优选的。二肽可有效连接任何已知肽、任何毒肽、任何杀虫肽、包括澳毒蜘蛛属或Hadronyche的任何肽、本文公开的具有其片段的任何杀虫肽，包括所述肽和序列号的成熟、前肽和肽原形式、任何成熟杀虫肽。毒肽包含SEQ. ID. NO: 6，或毒肽包含GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A (SEQ ID NO: 5)。
[0374] 我们还描述并要求保护二肽Gly-Ser、编码二肽Gly-Ser的选自GGT、GGC、GGA或GGG的核苷酸(其任一个编码Gly)及选自TCT、TCC、TCA、TCG、AGT和AGC的核苷酸(其任一个编码Ser)及与所述蛋白质、所述处置方法和所述方法的产物的任一种有关的核苷酸。
我们描述并要求保护编码这些肽的核苷酸，其与编码本文公开的任何肽的DNA序列的5’端有效连接。
我们描述并要求保护编码这些肽的核苷酸，其与编码本文公开的任何肽的DNA序列的5’端有效连接。
[0375] 我们解释并公开了用于增加从酵母表达系统产生的杀虫肽产量的方法，所述方法包括将任何二肽加到任何杀虫肽的N端。用于增加产量的处置方法和通过方法得到的产物使用以上段落中论述的二肽。
[0376] 我们具体论述了用抑制昆虫的电压门控钙通道和钙激活的钾通道两者的任何杀虫肽的程序、产物、处置方法和通过该方法得到的产物，其中肽来源于澳大利亚漏斗网蜘蛛的任何种，其选自澳毒蜘蛛属或Hadronyche 属的澳大利亚漏斗网蜘蛛(包括hadronyche versuta)。我们还具体描述和要求保护不是ICK基序肽的杀虫肽，例如具有来自毒海葵的任何种的起源的肽，我们提及所述蛋白作为是非ICK的CRIP基序肽的实例。我们公开、测试并表明用海葵属Anemonia、特别是选定的种Anemonia viridi 的蛋白质使程序起作用。我们以科学确定性地认为所述方法用含有20-100个氨基酸和2-6二硫键的杀虫肽起作用，且杀虫肽是与SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6即Av2和Av3有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、
80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大序列同一性的任何杀虫肽。
80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大序列同一性的任何杀虫肽。
[0377] 我们具体描述并要求保护当使用时用酵母的任何菌种的程序，包括但不限于以下属的任何菌种：酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母
属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、亚罗酵母属(Yarrowia)或裂殖酵母属
(Schizosaccharomyces)，酵母属菌种包括酵母属的任何菌种，优选我们公开了酵母属菌种酿酒酵母。我们具体公开了选自下列菌株的酿酒酵母菌种：INVSc1、YNN27、S150-2B、W303-1B、CG25、W3124、JRY188、BJ5464、AH22、GRF18、W303-1A和BJ3505。我们具体公开了毕赤酵母菌种，包括毕赤酵母属的任何菌种，优选毕赤酵母菌种巴斯德毕赤酵母，优选巴斯德毕赤酵母选自下列菌株：Bg08、Y-11430、X-33、GS115、GS190、JC220、JC254、GS200、JC227、JC300、JC301、JC302、JC303、JC304、JC305、JC306、JC307、JC308、YJN165、KM71、MC100-3、SMD1163、SMD1165、SMD1168、GS241、MS105、pep4 敲除菌株和任何prb1 敲除菌株，以及巴斯德毕赤酵母选自下列菌株：Bg08、X-33、SMD1168和KM71。我们具体公开了克鲁维酵母属菌种包括克鲁维酵母属的任何菌种，优选乳酸克鲁维酵母，并且我们教导了乳酸克鲁维酵母的菌株可选自但不一定选自下列菌株：GG799、YCT306、YCT284、YCT389、YCT390、YCT569、YCT598、MW98-8C、MS1、CBS293.91、Y721、MD2/1、PM6-7A、WM37、K6、K7、22AR1、22A295-1、SD11、MG1/2、MSK110、JA6、CMK5、HP101、HP108和PM6-3C，此外，乳酸克鲁维酵母菌种选自GG799和YCT306。
属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、亚罗酵母属(Yarrowia)或裂殖酵母属
(Schizosaccharomyces)，酵母属菌种包括酵母属的任何菌种，优选我们公开了酵母属菌种酿酒酵母。我们具体公开了选自下列菌株的酿酒酵母菌种：INVSc1、YNN27、S150-2B、W303-1B、CG25、W3124、JRY188、BJ5464、AH22、GRF18、W303-1A和BJ3505。我们具体公开了毕赤酵母菌种，包括毕赤酵母属的任何菌种，优选毕赤酵母菌种巴斯德毕赤酵母，优选巴斯德毕赤酵母选自下列菌株：Bg08、Y-11430、X-33、GS115、GS190、JC220、JC254、GS200、JC227、JC300、JC301、JC302、JC303、JC304、JC305、JC306、JC307、JC308、YJN165、KM71、MC100-3、SMD1163、SMD1165、SMD1168、GS241、MS105、pep4 敲除菌株和任何prb1 敲除菌株，以及巴斯德毕赤酵母选自下列菌株：Bg08、X-33、SMD1168和KM71。我们具体公开了克鲁维酵母属菌种包括克鲁维酵母属的任何菌种，优选乳酸克鲁维酵母，并且我们教导了乳酸克鲁维酵母的菌株可选自但不一定选自下列菌株：GG799、YCT306、YCT284、YCT389、YCT390、YCT569、YCT598、MW98-8C、MS1、CBS293.91、Y721、MD2/1、PM6-7A、WM37、K6、K7、22AR1、22A295-1、SD11、MG1/2、MSK110、JA6、CMK5、HP101、HP108和PM6-3C，此外，乳酸克鲁维酵母菌种选自GG799和YCT306。
[0378] 我们具体描述并要求保护当使用时用酵母的任何菌种的程序，包括但不限于汉逊酵母属菌种的任何菌种，包括汉逊酵母属的任何菌种和优选多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。我们具体描述并要求保护当使用时用酵母的任何菌种的程序，包括但不限于亚罗酵母属菌种的任何菌种，包括亚罗酵母属的任何菌种，优选解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)。我们具体描述并要求保护当使用时用酵母的任何菌种的程序，包括但
不限于裂殖酵母属菌种的任何菌种，包括裂殖酵母属的任何菌种，优选粟酒裂殖酵母
(Schizosaccharomycespombe)。
不限于裂殖酵母属菌种的任何菌种，包括裂殖酵母属的任何菌种，优选粟酒裂殖酵母
(Schizosaccharomycespombe)。
[0379] 第3部分. 在该部分中我们描述了“CRIPS”和“PFIPS”的组合很多毒液肽被称为“杀虫的”。然而，尽管许多报告，但很少已发现在市场上作为实际
或有效的杀虫剂的任何实用性。实际上，只报道了通过口服将ω-ACTX-Hv1a给予美洲花蜱Amblyomma americanum 是有毒的。未报告其它蜘蛛毒素具有口服活性，甚至在改性的蜱肠中。有报告称，可通过将这些肽与载体蛋白例如雪花莲凝集素(Galanthus nivalis凝集
素，GNA)偶联而提高它们的生物利用度。Mukherjee, A.K.; Sollod, B.L.; Wikel, S.K.; King, G.F. “Orally active acaricidal peptide tosins from spider venom (来自蜘蛛毒液的口服活性杀螨肽毒素).” Toxicon 2006, 47, 182-187。据报告大蒜凝集素增加毒素穿过昆虫中肠的吸收(Fitches, E等. Insect Sci., 2008, 15, 483-495；Fitches, E.等, Insect Biochem. Mol. Biol. 2008, 38, 905-915；Firches, E.等, J. Insect Physiol. 2004, 50, 61-71)。例如，杀虫蜘蛛毒素U2-SGTX-Sf1a (SFI1)与GNA的融合物显著增加其对番茄夜蛾Laconobia oleracea (Down, R.E.等, Pest Manag. Sci. 2006,
62,77-85)以及稻褐飞虱Nilaparvata lugens和桃-马铃薯蚜Myzus persicae的口服毒
性。出乎意料的是，发现硫氧还蛋白-ω-HXTX-Hv1a融合蛋白通过局部施用在Helicoverpa armigera 和Spodoptera littoralis毛虫中是杀虫的(Khan , S. A. Transgenic Res.
2006, 15, 349-357)，尽管该融合蛋白在含有高水平的咪唑(一种已知具有接触性杀虫活性的化合物)的溶液中局部施用(Pence, R. J. California Agric.1965, 13-15)。这些
努力和研究结果清楚表明开发提高毒液毒素的口服生物利用度的方法的重要性。我们认为这些努力也被误导了。在本公开内容中，我们教导了结合至昆虫肠的杀虫肽与载体蛋白的融合物是不必要的。我们描述了将杀虫肽中的“毒素”递送给昆虫的更好方法。不希望受理论的约束，我们的理论是PFIPS或成孔杀虫蛋白通过与昆虫肠中的受体选择性结合而起作用。然后，在后续事件中，PFIPS起破坏内衬肠的上皮细胞的膜电位的作用。当合适的CRIP或TMOF在PFIPS正在昆虫肠中起作用的同时也被及时引入肠时，结果是内衬肠的细胞的细胞凋亡和死亡。因此，肠内衬被穿孔，同时有毒肽，通常是自毒液分离的大的肽，可穿过肠，并使目标昆虫染病或将其杀死。出乎意料的是，当PFIP像Bt与CRIP或TMOF (其为毒肽，
但具有不像PFIPS例如Bt一样起作用的性质)组合给予昆虫时，对Bt蛋白产生抗性的昆
虫没有防御，并且对甚至低水平的Bt都完全不显示抗性。我们提供数据表明，自单独施用CRIP或PFIPS任一的相似浓度施用所预期的相比，共同给予CRIPS和PFIPS的某些组合可
提供超过2倍的杀死和阻止能力。
或有效的杀虫剂的任何实用性。实际上，只报道了通过口服将ω-ACTX-Hv1a给予美洲花蜱Amblyomma americanum 是有毒的。未报告其它蜘蛛毒素具有口服活性，甚至在改性的蜱肠中。有报告称，可通过将这些肽与载体蛋白例如雪花莲凝集素(Galanthus nivalis凝集
素，GNA)偶联而提高它们的生物利用度。Mukherjee, A.K.; Sollod, B.L.; Wikel, S.K.; King, G.F. “Orally active acaricidal peptide tosins from spider venom (来自蜘蛛毒液的口服活性杀螨肽毒素).” Toxicon 2006, 47, 182-187。据报告大蒜凝集素增加毒素穿过昆虫中肠的吸收(Fitches, E等. Insect Sci., 2008, 15, 483-495；Fitches, E.等, Insect Biochem. Mol. Biol. 2008, 38, 905-915；Firches, E.等, J. Insect Physiol. 2004, 50, 61-71)。例如，杀虫蜘蛛毒素U2-SGTX-Sf1a (SFI1)与GNA的融合物显著增加其对番茄夜蛾Laconobia oleracea (Down, R.E.等, Pest Manag. Sci. 2006,
62,77-85)以及稻褐飞虱Nilaparvata lugens和桃-马铃薯蚜Myzus persicae的口服毒
性。出乎意料的是，发现硫氧还蛋白-ω-HXTX-Hv1a融合蛋白通过局部施用在Helicoverpa armigera 和Spodoptera littoralis毛虫中是杀虫的(Khan , S. A. Transgenic Res.
2006, 15, 349-357)，尽管该融合蛋白在含有高水平的咪唑(一种已知具有接触性杀虫活性的化合物)的溶液中局部施用(Pence, R. J. California Agric.1965, 13-15)。这些
努力和研究结果清楚表明开发提高毒液毒素的口服生物利用度的方法的重要性。我们认为这些努力也被误导了。在本公开内容中，我们教导了结合至昆虫肠的杀虫肽与载体蛋白的融合物是不必要的。我们描述了将杀虫肽中的“毒素”递送给昆虫的更好方法。不希望受理论的约束，我们的理论是PFIPS或成孔杀虫蛋白通过与昆虫肠中的受体选择性结合而起作用。然后，在后续事件中，PFIPS起破坏内衬肠的上皮细胞的膜电位的作用。当合适的CRIP或TMOF在PFIPS正在昆虫肠中起作用的同时也被及时引入肠时，结果是内衬肠的细胞的细胞凋亡和死亡。因此，肠内衬被穿孔，同时有毒肽，通常是自毒液分离的大的肽，可穿过肠，并使目标昆虫染病或将其杀死。出乎意料的是，当PFIP像Bt与CRIP或TMOF (其为毒肽，
但具有不像PFIPS例如Bt一样起作用的性质)组合给予昆虫时，对Bt蛋白产生抗性的昆
虫没有防御，并且对甚至低水平的Bt都完全不显示抗性。我们提供数据表明，自单独施用CRIP或PFIPS任一的相似浓度施用所预期的相比，共同给予CRIPS和PFIPS的某些组合可
提供超过2倍的杀死和阻止能力。
[0380] PFIP的实例包括来自Bt生物的cry和VIP蛋白。Bt蛋白像cry蛋白破坏昆虫肠膜，允许因肠菌丛引起的昆虫的偶发感染(脓毒病)。在没有肠微生物时，Bt不是杀虫的
(Broderick，Nichole PNAS 第103卷，第41期(2006))。因此可以预期，显示引起Bt死亡(感染)的机制可在显示Bt抗性的那些昆虫中减轻，并且它在那些昆虫中减轻。Bt抗性昆
虫显示几乎无肠破坏，甚至当饲喂高水平的Bt蛋白像cry时。我们出人意料地发现，不知何故即使这些昆虫肠不再显示Bt对肠的明显作用，也就是说它们是有真实抗性的，但当它们暴露于某种类型的杀虫肽像与PFIPS (像Bt)相比具有非常不同的作用方式的CRIPS和
TMOF时，则这些极具抗性的昆虫完全不具有抗性。“Bt抗性”昆虫中抗性的消失是出乎意料的，我们在本文提供的实施例中用我们的数据表明这种情况的发生。这个结果是完全意料不到的。然而，目前我们了解，而且我们可利用这个知识解释亚致死量的PFIP蛋白像Bt如何可“转化”成致死混合物，使得如果共同给予两(2)种或更多种亚致死量的杀虫蛋白，则蛋白质的组合对昆虫变成致死的，所述昆虫否则被认为太大或太具抗性而对毒肽不敏感。
(Broderick，Nichole PNAS 第103卷，第41期(2006))。因此可以预期，显示引起Bt死亡(感染)的机制可在显示Bt抗性的那些昆虫中减轻，并且它在那些昆虫中减轻。Bt抗性昆
虫显示几乎无肠破坏，甚至当饲喂高水平的Bt蛋白像cry时。我们出人意料地发现，不知何故即使这些昆虫肠不再显示Bt对肠的明显作用，也就是说它们是有真实抗性的，但当它们暴露于某种类型的杀虫肽像与PFIPS (像Bt)相比具有非常不同的作用方式的CRIPS和
TMOF时，则这些极具抗性的昆虫完全不具有抗性。“Bt抗性”昆虫中抗性的消失是出乎意料的，我们在本文提供的实施例中用我们的数据表明这种情况的发生。这个结果是完全意料不到的。然而，目前我们了解，而且我们可利用这个知识解释亚致死量的PFIP蛋白像Bt如何可“转化”成致死混合物，使得如果共同给予两(2)种或更多种亚致死量的杀虫蛋白，则蛋白质的组合对昆虫变成致死的，所述昆虫否则被认为太大或太具抗性而对毒肽不敏感。
[0381] 令人惊讶的是，昆虫对仅PFIPs的抗性不赋予对PFIPS与CRIPS和/或TMOF的组合的抗性。因为PFIPS的作用机制，可以预期PFIP (像Bt蛋白)将不再促进PFIPS与
CRIPS和/或TMOF的组合的毒性作用。取而代之的是相反的情况发生，并且组合具有大于
所预期的活性水平，如我们的数据所显示的一样。
CRIPS和/或TMOF的组合的毒性作用。取而代之的是相反的情况发生，并且组合具有大于
所预期的活性水平，如我们的数据所显示的一样。
[0382] 昆虫已发生对Bt的抗性。对抗这种抗性的努力导致使用许多不同的Bt亚型。我们在此教导了昆虫抗性可通过毒液肽的共同施用来克服。因为最常见的抗性方式(方式1，之前的参考文献) (Pence, R. J. “The antimetabolite imidazole as a pesticide (作为杀虫剂的抗代谢物咪唑).” California Agric. 1965, 13-15)是内衬肠的Bt受体的减量调节作用，所以可预期在Bt抗性昆虫中可保持昆虫抗性，因为受体的数目不足以赋予昆虫易感因肠菌丛产生的脓毒病。我们发现并认为，并且我们的数据以给人深刻印象的方式支持我们的理论(参见下面的实施例)，与保留足够的膜异常的Bt抗性昆虫一样，暴露于
甚至低水平的Bt (当与具有不同于Bt的作用方式类型的某些小的“有毒”杀虫肽组合时)中，会出人意料地引起Bt抗性昆虫停止摄食或死亡，我们认为这是因为在这些抗性昆虫中肠内衬仍受恰好足够的破坏，足以允许杀虫肽的CRIP和TMOF类型特有的更小的毒液肽通
过。
甚至低水平的Bt (当与具有不同于Bt的作用方式类型的某些小的“有毒”杀虫肽组合时)中，会出人意料地引起Bt抗性昆虫停止摄食或死亡，我们认为这是因为在这些抗性昆虫中肠内衬仍受恰好足够的破坏，足以允许杀虫肽的CRIP和TMOF类型特有的更小的毒液肽通
过。
[0383] 在本文件中，我们不把被鉴定为潜在的杀幼虫剂的TMOF肽或胰蛋白酶调节抑卵因子(TMOF)肽(参见D. Borovsky, Journal of Experimental Biology 206, 3869-3875)视为CRIP类型的杀虫肽。按照我们在本文中的定义，我们把CRIP肽定义为具有多个半胱
氨酸的肽。TMOF肽不符合我们描述为CRIP肽的基序。有关CRIP和TMOF的定义，请参见接
近这些文件开始时的定义部分。我们论述了将CRIP和/或TMOF类型的蛋白质与我们描述
为PFIPS的不同类型的蛋白质组合。
氨酸的肽。TMOF肽不符合我们描述为CRIP肽的基序。有关CRIP和TMOF的定义，请参见接
近这些文件开始时的定义部分。我们论述了将CRIP和/或TMOF类型的蛋白质与我们描述
为PFIPS的不同类型的蛋白质组合。
[0384] PFIPS是成孔杀虫蛋白，在定义部分也做出定义。PFIP的一种类型的一个实例是广泛使用的来源于Bt的蛋白质类的各种蛋白质，例如cry、cyt和VIP。这些是以植物结合杀虫剂和叶面喷撒两种形式用于作物保护的有效的杀虫剂。所述Bt蛋白的商业制剂广泛用于控制幼虫期的昆虫。
[0385] 与PFIPS相反，CRIPS例如抑制性半胱氨酸结或ICK肽是也具有杀虫活性但以非常不同的作用方式起作用的非常不同的肽类。在本文件中，PFIP蛋白与CRIP蛋白没有重叠，两类是单独的和完全不同的。ICK肽和甚至非ICK肽在本文件中都被视为CRIPS。CRIPS常常对天然存在的生物目标物种、通常为某种类型的昆虫或蜘蛛类动物是有毒的。CRIP肽常常可具有节肢动物起源，例如蝎或蜘蛛的毒液，这种毒液来源以ICK非常普遍。CRIP可以各种方式递送至其生理作用部位，例如通过注射将毒素直接递送到昆虫的肠或内部器官，通过施用至昆虫所在地和自表面接触吸收，或通过诱使昆虫从其食物中食入毒素，例如昆虫摄食转基因植物。
[0386] 本文所述肽可配制成应用产品或通过转基因植物面对挑战。可能难以按商业规模成功生产具有可再现的肽形成和折叠的所述肽。成本控制可能富于挑战性。肽的种类繁多、性能独特且性质特殊，结合极其多种的可能的生产技术，提供了肽生产的众多方法。商品具有其自身的重大挑战。当施用于作物的环境中时，肽常常不稳定。UV照射和其它因素可引起环境中的Bt杀虫剂快速衰变，常常短至几小时。此外，商业有效性可能改变。Bt喷洒产品和用作植物结合杀虫剂的转基因Bt蛋白都面临新出现的昆虫抗性。
[0387] 需要提高急速活性、改进抗性性能或延长作用持续时间以提高昆虫控制和作物保护的产品。
[0388] 在此我们提供各种组合中Bt蛋白与ICK和TMOF肽的组合。我们描述了这些新的组合的实例。本文描述并要求保护新的组合、产品、方法及其配制及其用途。
[0389] 协同组合中富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIPS)富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIPS)是富含形成二硫键的半胱氨酸的肽。半胱氨酸-半胱
氨酸二硫键在这些杀虫肽的毒性中起重要作用，所述杀虫肽的实例为抑制性半胱氨酸结或ICK肽，且实例为具有二硫键的不视为ICK肽(非ICK CRIPS)的毒肽(例如来自海葵的肽
像Av2和Av3肽)。这些半胱氨酸-半胱氨酸二硫键稳定化的毒肽(CRIPS)当暴露于环境
时可具有显著的稳定性。许多ICK肽自分泌毒液的动物例如蜘蛛、蝎和蛇分离，并且对昆虫是有毒的。已知TMOF肽具有杀幼虫活性。Av2和Av3肽自海葵分离。我们还描述了作用于
昆虫肠内衬的不同肽类。我们称这些PFIPS为成孔杀虫蛋白。PFIPS的最众所周知的实例
是Bt蛋白，因其特殊的杀虫活性和商业应用而众所周知。令人惊讶的是，我们发现，当这些肽的组合，将PFIPS和CRIPS组合并给予时，它们在肠中共同作用(所述组合的共同给予不是必须的，仅需要在肠中活性的组合)，变得对控制昆虫十分有效。例如，优选的组合之一可为将Bt蛋白与ICK肽或海葵肽组合，它们以比所能预期的高得多的效力产生非常有效的杀虫剂。
氨酸二硫键在这些杀虫肽的毒性中起重要作用，所述杀虫肽的实例为抑制性半胱氨酸结或ICK肽，且实例为具有二硫键的不视为ICK肽(非ICK CRIPS)的毒肽(例如来自海葵的肽
像Av2和Av3肽)。这些半胱氨酸-半胱氨酸二硫键稳定化的毒肽(CRIPS)当暴露于环境
时可具有显著的稳定性。许多ICK肽自分泌毒液的动物例如蜘蛛、蝎和蛇分离，并且对昆虫是有毒的。已知TMOF肽具有杀幼虫活性。Av2和Av3肽自海葵分离。我们还描述了作用于
昆虫肠内衬的不同肽类。我们称这些PFIPS为成孔杀虫蛋白。PFIPS的最众所周知的实例
是Bt蛋白，因其特殊的杀虫活性和商业应用而众所周知。令人惊讶的是，我们发现，当这些肽的组合，将PFIPS和CRIPS组合并给予时，它们在肠中共同作用(所述组合的共同给予不是必须的，仅需要在肠中活性的组合)，变得对控制昆虫十分有效。例如，优选的组合之一可为将Bt蛋白与ICK肽或海葵肽组合，它们以比所能预期的高得多的效力产生非常有效的杀虫剂。
[0390] 我们描述了杀虫组合肽组合物，其包含PFIP (成孔杀虫蛋白)与CRIP和/或TMOF类型的杀虫蛋白两者的组合。注意CRIP包括如ICK (抑制物胱氨酸结)肽和非ICK蛋白
的杀虫蛋白，但是TMOF肽不被视为CRIP蛋白。CRIP蛋白可包括非ICK蛋白，像最早在海葵中鉴定的蛋白质，例如Av2或Av3。以干重基础计，组合物中PFIP:CRIP和/或TMOF的比率
可为大致下列比率的任一个或全部：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、
60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和 1:99或这些值的任两个的任何组合。我们还描述了其中以干重基础计，PFIP：CRIP或TMOF的
比率选自大致下列比率的组合物：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、
10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。
CRIP、ICK、非ICK CRIP和TMOF可为与Bt组合的任一100%的肽，或为在总共100%的ICK
+TMOF两种肽可与Bt组合的任何组合中的任一种肽。
的杀虫蛋白，但是TMOF肽不被视为CRIP蛋白。CRIP蛋白可包括非ICK蛋白，像最早在海葵中鉴定的蛋白质，例如Av2或Av3。以干重基础计，组合物中PFIP:CRIP和/或TMOF的比率
可为大致下列比率的任一个或全部：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、
60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和 1:99或这些值的任两个的任何组合。我们还描述了其中以干重基础计，PFIP：CRIP或TMOF的
比率选自大致下列比率的组合物：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、
10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。
CRIP、ICK、非ICK CRIP和TMOF可为与Bt组合的任一100%的肽，或为在总共100%的ICK
+TMOF两种肽可与Bt组合的任何组合中的任一种肽。
[0391] 在另一个实施方案中，PFIP与CRIP和TMOF肽组合的混合物的组合包括来源于对于PFIP、ICK和TMOF肽的任一种或两种的一种以上不同类型或细菌菌株来源的PFIP和
CRIP、ICK和非ICK肽的任一种或两种。所谓细菌菌株来源，我们意指肽可描述为由表达所述肽的细菌菌株表达，要理解，许多肽就它们不再全由动物或细菌菌株产生的意义而言还是人工的。
CRIP、ICK和非ICK肽的任一种或两种。所谓细菌菌株来源，我们意指肽可描述为由表达所述肽的细菌菌株表达，要理解，许多肽就它们不再全由动物或细菌菌株产生的意义而言还是人工的。
[0392] 我们还公开了这样的组合物，其中PFIP与CRIP或TMOF肽组合的混合物和/或与CRIP加上或具有TMOF肽组合的PFIP的混合物的任一种或两种来源于所述蛋白质的任一种
或两种的2-5、2-15、2-30、5-10、5-15、5-30、5-50种和各种其它不同的类型或细菌菌株来源。我们公开了这样的组合物，其中蛋白质的任一种或两种由PFIP与CRIP或TMOF肽组合
的任一种或两种的2-15种不同类型或细菌菌株来源编码。PFIP与CRIP或TMOF肽组合的
这些2-5、2-15、2-30、5-10、5-15、5-30、5-50种和各种其它不同的类型和混合物的组合的任一种可为该组合物提供至少1%以上的各菌株类型。
或两种的2-5、2-15、2-30、5-10、5-15、5-30、5-50种和各种其它不同的类型或细菌菌株来源。我们公开了这样的组合物，其中蛋白质的任一种或两种由PFIP与CRIP或TMOF肽组合
的任一种或两种的2-15种不同类型或细菌菌株来源编码。PFIP与CRIP或TMOF肽组合的
这些2-5、2-15、2-30、5-10、5-15、5-30、5-50种和各种其它不同的类型和混合物的组合的任一种可为该组合物提供至少1%以上的各菌株类型。
[0393] 我们公开了权利要求1-6的Bt和ICK、Bt和TMOF肽或BT和ICK + TMOF肽的组合物，其中组合物中Bt和ICK肽、Bt和TMOF肽或BT和ICK + TMOF肽的总浓度选自下列
百分比浓度：0、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或
100%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。我们公开了其中杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生
的组合物，其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接。我们公开了其中杀虫组合肽使用还包
含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的组合物，其中所述ERSP
在杀虫ICK肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。
百分比浓度：0、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或
100%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。我们公开了其中杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生
的组合物，其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接。我们公开了其中杀虫组合肽使用还包
含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的组合物，其中所述ERSP
在杀虫ICK肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。
[0394] 我们公开了其中所述肽的组合使用还包含与杀虫ICK和TMOF肽有效连接的二肽的遗传盒产生的组合物，其中所述二肽在杀虫ICK肽的N端连接；其中二肽由二肽N端的
一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成，包括其中二肽为甘氨酸-丝氨酸的
实施方案，包括其中杀虫ICK肽是抑制昆虫的电压门控钙通道和钙激活的钾通道两者的
任何杀虫肽的实施方案，包括其中杀虫ICK肽来源于澳大利亚漏斗网蜘蛛的任何种的实
施方案，包括其中蜘蛛选自澳毒蜘蛛属或Hadronyche 属的澳大利亚漏斗网蜘蛛的实施方案，包括其中蜘蛛选自Hadronyche属的澳大利亚漏斗网蜘蛛的实施方案，包括其中蜘蛛选自澳大利亚布鲁山脉漏斗网Hadronyche versuta 的实施方案，包括其中杀虫ICK肽是杂
合-ACTX-Hv1a的实施方案，包括其中杀虫ICK肽含有20-100个氨基酸和2-4个二硫键的实
施方案，包括其中所述杀虫ICK肽是与本文公开的任何ICK序列有至少50%、55%、60%、65%、
70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性的任何杀虫肽的实施方案，包括其中杀虫ICK肽选自通过引用予以结合的出版物的实施方案，包括其中Bt蛋白是任何杀虫Bt蛋白的实施方案，包括其中Bt蛋白是Cry或Cyt蛋白的实施方案，包括其中
Bt蛋白选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫
蛋白TIC810或TIC812的组合和二元杀虫蛋白PS149B1的实施方案，包括其中Bt蛋白选自
Cry蛋白、Cry1A蛋白或Cry1F蛋白的实施方案，包括其中Bt蛋白是组合Cry1F-Cry1A蛋白
的实施方案，包括其中Bt蛋白包含与美国专利号7,304,206的SEQ ID NO: 10、12、14、26、
28或34有至少90%同一性的氨基酸序列的实施方案，包括其中Bt蛋白是Dipel的实施方
案，包括其中Bt蛋白是Thuricide的实施方案。
一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成，包括其中二肽为甘氨酸-丝氨酸的
实施方案，包括其中杀虫ICK肽是抑制昆虫的电压门控钙通道和钙激活的钾通道两者的
任何杀虫肽的实施方案，包括其中杀虫ICK肽来源于澳大利亚漏斗网蜘蛛的任何种的实
施方案，包括其中蜘蛛选自澳毒蜘蛛属或Hadronyche 属的澳大利亚漏斗网蜘蛛的实施方案，包括其中蜘蛛选自Hadronyche属的澳大利亚漏斗网蜘蛛的实施方案，包括其中蜘蛛选自澳大利亚布鲁山脉漏斗网Hadronyche versuta 的实施方案，包括其中杀虫ICK肽是杂
合-ACTX-Hv1a的实施方案，包括其中杀虫ICK肽含有20-100个氨基酸和2-4个二硫键的实
施方案，包括其中所述杀虫ICK肽是与本文公开的任何ICK序列有至少50%、55%、60%、65%、
70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性的任何杀虫肽的实施方案，包括其中杀虫ICK肽选自通过引用予以结合的出版物的实施方案，包括其中Bt蛋白是任何杀虫Bt蛋白的实施方案，包括其中Bt蛋白是Cry或Cyt蛋白的实施方案，包括其中
Bt蛋白选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫
蛋白TIC810或TIC812的组合和二元杀虫蛋白PS149B1的实施方案，包括其中Bt蛋白选自
Cry蛋白、Cry1A蛋白或Cry1F蛋白的实施方案，包括其中Bt蛋白是组合Cry1F-Cry1A蛋白
的实施方案，包括其中Bt蛋白包含与美国专利号7,304,206的SEQ ID NO: 10、12、14、26、
28或34有至少90%同一性的氨基酸序列的实施方案，包括其中Bt蛋白是Dipel的实施方
案，包括其中Bt蛋白是Thuricide的实施方案。
[0395] 我们公开了在转化的植物或植物基因组中包含Bt (苏云金芽孢杆菌)蛋白；和杀虫ICK (抑制物胱氨酸结)肽、Bt和TMOF肽或BT和ICK + TMOF肽的核苷酸的组合物；其中以干重基础计，Bt与ICK、Bt和TMOF肽或BT和ICK + TMOF肽的比率选自大致下列比率：
99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、
35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99或这些值的任两个的任何组合。
99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、
35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99或这些值的任两个的任何组合。
[0396] 我们公开了转化的植物或植物基因组，其中以干重基础计，Bt与ICK、Bt和TMOF肽或BT和ICK + TMOF肽的比率选自大致下列比率：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。转化的植物或植物基因组可具有来源于Bt或ICK肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源的Bt和ICK肽的任一种或两种，或Bt和ICK肽任一种或两种来源于Bt
或ICK肽的2-5种不同类型或细菌菌株来源，或Bt和ICK肽两者都来源于2-5种不同类型
或菌株来源，或Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK肽任一种或两种的2-15种不
同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK的任一种或Bt和ICK肽两种的至少一个菌株由超过1
拷贝的Bt或ICK基因编码，或Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和/或ICK肽的一种
以上不同类型或细菌菌株来源，其中Bt和/或ICK肽的所有菌株向所述组合物提供超过至
少1%的各菌株类型，或Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK肽的任一种或两种的
2-5种不同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK的任一种或Bt和ICK肽两种的至少一个菌株
由超过1拷贝的Bt或ICK基因编码，或组合物中Bt和ICK肽的总浓度可选自下列百分比
浓度：0、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。
或ICK肽的2-5种不同类型或细菌菌株来源，或Bt和ICK肽两者都来源于2-5种不同类型
或菌株来源，或Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK肽任一种或两种的2-15种不
同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK的任一种或Bt和ICK肽两种的至少一个菌株由超过1
拷贝的Bt或ICK基因编码，或Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和/或ICK肽的一种
以上不同类型或细菌菌株来源，其中Bt和/或ICK肽的所有菌株向所述组合物提供超过至
少1%的各菌株类型，或Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK肽的任一种或两种的
2-5种不同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK的任一种或Bt和ICK肽两种的至少一个菌株
由超过1拷贝的Bt或ICK基因编码，或组合物中Bt和ICK肽的总浓度可选自下列百分比
浓度：0、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。
[0397] 本文所述组合物和植物包括使用还包含与杀虫ICK肽或与TMOF肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的杀虫组合肽，其中所述ERSP在杀虫ICK或TMOF肽
的N端连接。在另一个实施方案中，杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生，其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接，其中ERSP为
BAAS。在另一个实施方案中，掺入和表达来自本文所述核苷酸的组合肽的转基因植物，其中所述组合肽使用还包含表达与杀虫ICK或TMOF肽有效连接的二肽的核苷酸的遗传盒产生，其中所述二肽在杀虫ICK肽的N端连接；且其中二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二
肽C端的一个极性氨基酸组成。在另一个实施方案中，转基因植物具有是甘氨酸-丝氨酸
的二肽。在另一个实施方案中，转基因植物具有所表达的由ICK和Bt蛋白的杀虫肽组合组成的杀虫ICK肽。转基因植物可具有来源于澳大利亚漏斗网蜘蛛的任何种或澳毒蜘蛛属或Hadronyche 属的澳大利亚漏斗网蜘蛛和澳大利亚布鲁山脉漏斗网Hadronyche versuta 的杀虫ICK肽。
的N端连接。在另一个实施方案中，杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生，其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接，其中ERSP为
BAAS。在另一个实施方案中，掺入和表达来自本文所述核苷酸的组合肽的转基因植物，其中所述组合肽使用还包含表达与杀虫ICK或TMOF肽有效连接的二肽的核苷酸的遗传盒产生，其中所述二肽在杀虫ICK肽的N端连接；且其中二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二
肽C端的一个极性氨基酸组成。在另一个实施方案中，转基因植物具有是甘氨酸-丝氨酸
的二肽。在另一个实施方案中，转基因植物具有所表达的由ICK和Bt蛋白的杀虫肽组合组成的杀虫ICK肽。转基因植物可具有来源于澳大利亚漏斗网蜘蛛的任何种或澳毒蜘蛛属或Hadronyche 属的澳大利亚漏斗网蜘蛛和澳大利亚布鲁山脉漏斗网Hadronyche versuta 的杀虫ICK肽。
[0398] 我们描述并要求保护转基因植物，其中所表达的杀虫ICK肽是杂合-ACTX-Hv1a，和/或所表达的杀虫ICK肽可含有20-100个氨基酸和2-4个二硫键和/或杀虫ICK肽是与本文所述的任何ICK肽有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性的任何杀虫肽。所公开的转基因植物可含有任何已知的Bt蛋
白，包括这样的肽，其中Bt蛋白为Cry或Cyt蛋白，和/或Bt蛋白选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫蛋白TIC810或TIC812的组合和
二元杀虫蛋白PS149B1。Bt蛋白可选自Cry蛋白、Cry1A蛋白或Cry1F蛋白或Cry1F-Cry1A
蛋白的组合，或它包含与美国专利号7,304,206的序列10、12、14、26、28或34有至少90%同一性的氨基酸序列。我们描述了转基因植物，其中Bt蛋白是Dipel，和我们描述了转基因植物，其中Bt蛋白是Thuricide。
白，包括这样的肽，其中Bt蛋白为Cry或Cyt蛋白，和/或Bt蛋白选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫蛋白TIC810或TIC812的组合和
二元杀虫蛋白PS149B1。Bt蛋白可选自Cry蛋白、Cry1A蛋白或Cry1F蛋白或Cry1F-Cry1A
蛋白的组合，或它包含与美国专利号7,304,206的序列10、12、14、26、28或34有至少90%同一性的氨基酸序列。我们描述了转基因植物，其中Bt蛋白是Dipel，和我们描述了转基因植物，其中Bt蛋白是Thuricide。
[0399] 我们具体描述并要求保护表达本文所述肽的转化植物，其中转化植物平均叶片中Bt和ICK肽、Bt和TMOF肽或BT和ICK + TMOF肽的平均浓度为约：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围。我们具体描述并要求保护在转化植物中表达正确折叠的毒肽的转化植物。我们具体描述并要求保护在转化植物中表达正确折叠的组合毒肽、使已表达的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积、引起植物的产量或对虫害的抗性增加并且控制作物和林业的虫害的转化植物。我们描述了通过本文所述任何产品和处置方法生产的植物。
[0400] 我们描述了包含表达本文所述任何肽的任何核苷酸的表达盒，包括具有掺入转化植物的功能表达盒的实施方案，包含编码本文公开的任何肽或鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人员制备的核苷酸的表达盒。我们描述并要求保护用于产生具有或表达本文所述任何肽的转化植物的程序。
[0401] 我们描述了本文所述任何肽或核苷酸产生植物或将这些肽或核苷酸转化至植物中的用途；用于在植物中产生这些蛋白质的方法和技术；和/或包含任何肽的表达盒和将所述表达盒转化至植物基因组中的方法；以及使用、制备任何所述肽或核苷酸或将其转化至植物中的任何方法；用于在包含任何所公开的肽及其相应核苷酸的植物中产生具有或表达任何肽和功能表达盒的转化植物的方法和技术；和通过本文所述产品和处置方法制备的任何植物。
[0402] 在一些实施方案中，我们公开了包含与本文所述核酸或表达盒有效连接的在植物中有活性的启动子的嵌合基因。我们公开了制备、生产或使用本文所述基因的组合的方法。我们公开了包含本文所述基因的组合的重组载体。我们公开了制备、生产或使用重组载体的方法。我们公开了包含本文所述基因的组合的转基因宿主细胞和制备、生产或使用转基因宿主细胞的方法，所述转基因宿主细胞可以是转基因植物细胞，并且我们公开了制备、生产或使用所述转基因植物细胞的方法以及包含转基因植物细胞的转基因植物和如何制备
和使用转基因植物。我们公开了具有本文所述性质的来源于以下的转基因植物和种子：玉米、大豆、棉、稻、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、马铃薯或番茄。转基因种子可具有我们在本文描述的嵌合基因。我们描述了制备、生产或使用本公开内容的转基因植物和/或种子的方法。
和使用转基因植物。我们公开了具有本文所述性质的来源于以下的转基因植物和种子：玉米、大豆、棉、稻、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、马铃薯或番茄。转基因种子可具有我们在本文描述的嵌合基因。我们描述了制备、生产或使用本公开内容的转基因植物和/或种子的方法。
[0403] 我们还描述了使用本发明的方法并提供新的制剂。本发明对控制昆虫最为有用。我们描述了控制昆虫的方法，所述方法包括：向所述昆虫施用Bt (苏云金芽孢杆菌)蛋白；
并向所述昆虫施用杀虫ICK (抑制物胱氨酸结)肽。当Bt蛋白和杀虫ICK肽、Bt和TMOF
肽或BT和ICK + TMOF肽在同一组合物中在同时一起施用或在不同的组合物中在不同时间
单独施用时，可采用该方法。Bt蛋白和杀虫ICK肽和/或TMOF肽可序贯施用，并且可施用于(Bt蛋白)抗性昆虫。以干重基础计，Bt与ICK或TMOF的比率可选自至少大致下列比率：
99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、
35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99或这些值的任两个的任何组合。以干重基础计，Bt与ICK的比率可选自大致下列比率：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、
25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK肽、Bt和TMOF肽或BT和
ICK + TMOF肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源。Bt和ICK、Bt和TMOF肽或BT和
ICK + TMOF肽的任一种或两种来源于Bt或ICK肽的任一种或Bt和ICK肽两种的2-5种
不同类型或细菌菌株来源。Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK肽任一种或两种
的2-15种不同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK任一种或Bt和ICK肽两种的至少一个菌
株由1拷贝以上的Bt或ICK基因编码。Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和/或ICK
肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源，其Bt和/或ICK肽的所有菌株为所述组合物提
供超过至少1%的来自各菌株类型的肽。Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK肽
的任一种或两种的2-5种不同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK任一种或Bt和ICK肽两种
的至少一个菌株由1拷贝以上的Bt或ICK基因编码。组合物中Bt和ICK、Bt和TMOF肽或
BT和ICK + TMOF肽的总浓度选自下列百分比浓度：0、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、
55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。
并向所述昆虫施用杀虫ICK (抑制物胱氨酸结)肽。当Bt蛋白和杀虫ICK肽、Bt和TMOF
肽或BT和ICK + TMOF肽在同一组合物中在同时一起施用或在不同的组合物中在不同时间
单独施用时，可采用该方法。Bt蛋白和杀虫ICK肽和/或TMOF肽可序贯施用，并且可施用于(Bt蛋白)抗性昆虫。以干重基础计，Bt与ICK或TMOF的比率可选自至少大致下列比率：
99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、
35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99或这些值的任两个的任何组合。以干重基础计，Bt与ICK的比率可选自大致下列比率：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、
25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK肽、Bt和TMOF肽或BT和
ICK + TMOF肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源。Bt和ICK、Bt和TMOF肽或BT和
ICK + TMOF肽的任一种或两种来源于Bt或ICK肽的任一种或Bt和ICK肽两种的2-5种
不同类型或细菌菌株来源。Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK肽任一种或两种
的2-15种不同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK任一种或Bt和ICK肽两种的至少一个菌
株由1拷贝以上的Bt或ICK基因编码。Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和/或ICK
肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源，其Bt和/或ICK肽的所有菌株为所述组合物提
供超过至少1%的来自各菌株类型的肽。Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK肽
的任一种或两种的2-5种不同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK任一种或Bt和ICK肽两种
的至少一个菌株由1拷贝以上的Bt或ICK基因编码。组合物中Bt和ICK、Bt和TMOF肽或
BT和ICK + TMOF肽的总浓度选自下列百分比浓度：0、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、
55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。
[0404] 在使用还包含与杀虫ICK肽或TMOF肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生杀虫组合肽时，可采用该方法；其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接。在一些实
施方案中，所用的杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)
的遗传盒产生，其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。
施方案中，所用的杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)
的遗传盒产生，其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。
[0405] 本文所述的任何肽和植物可用来控制昆虫、其生长和损害，尤其其对植物的损害。可通过喷洒在植物，或昆虫所在地，或需要保护的植物的所在地来施用Bt蛋白和杀虫ICK组合肽。
[0406] 我们还描述了包含Bt蛋白；和杀虫ICK和/或杀虫TMOF肽的制剂，其可包括本文描述的或鉴于本公开内容本领域的技术人员能够制备的任何组合物。所述制剂的一些包括使用极性非质子溶剂和/或水，和/或其中极性非质子溶剂以1-99 wt%的量存在，极性质
子溶剂以1-99 wt%的量存在，水以0-98 wt%的量存在。制剂包括其中Bt蛋白是Dipel且
其中杀虫ICK肽是杂合-ACTX-Hv1a肽的制剂。极性非质子溶剂制剂当含有MSO时尤其有
效。MSO是甲基化种子油和表面活性剂混合物，其使用约80-85%石油和15-20%表面活性剂的量的大豆油的甲酯。
子溶剂以1-99 wt%的量存在，水以0-98 wt%的量存在。制剂包括其中Bt蛋白是Dipel且
其中杀虫ICK肽是杂合-ACTX-Hv1a肽的制剂。极性非质子溶剂制剂当含有MSO时尤其有
效。MSO是甲基化种子油和表面活性剂混合物，其使用约80-85%石油和15-20%表面活性剂的量的大豆油的甲酯。
[0407] 除许多类型的PFIP型肽(例如Bt和VIP蛋白和肽)以外，本公开内容还提供了合适的CRIP型肽、ICK肽、非ICK CRIP肽和TMOF肽的许多实例，当组合时，提供新的杀虫产品，这些在本文亦称“组合肽”。在本文件中描述了适用于本发明的肽，并且在序列表中公开了具体实例。序列表中的肽仅作为实例提供以说明本发明并为本领域技术人员提供指导和意义。应理解，序列表不提供全部CRIPS、ICK、非ICK CRIPS和TMOF的完全和完整的列表，也不提供全部PFIPS的完全和完整的列表。昆虫可用直接施用的组合肽处理，例如喷洒在昆虫上或其所在地，或组合肽可间接施用，例如在转基因植物中递送。首先我们提供了CRIP肽像ICK的详细书面描述和实例(第I节)，这些也在上文中提供。然后我们提供TMOF肽
的详细书面描述和实例(第II节)。接下来我们提供Bt蛋白的详细书面描述和实例(第
III节)。应理解，本申请提供这些实例作为说明手段，不限制本专利和要求保护的发明的界限。任何合适的Bt蛋白和ICK肽或TMOF肽可按所述方式组合，并产生有效的杀虫剂。在描述ICK和Bt蛋白后，申请人描述了各种杀虫组合物(第IV节)。描述了使用ICK和Bt
蛋白两者的植物转化(第V节)。CRIP和Bt组合的描述和实例(第VI节)。描述了TMOF
和Bt蛋白组合(第VII节)。我们提供ICK和Bt蛋白如何组合以产生高效杀虫剂的非限
制性实例和描述，本文提供了其结果和数据。
的详细书面描述和实例(第II节)。接下来我们提供Bt蛋白的详细书面描述和实例(第
III节)。应理解，本申请提供这些实例作为说明手段，不限制本专利和要求保护的发明的界限。任何合适的Bt蛋白和ICK肽或TMOF肽可按所述方式组合，并产生有效的杀虫剂。在描述ICK和Bt蛋白后，申请人描述了各种杀虫组合物(第IV节)。描述了使用ICK和Bt
蛋白两者的植物转化(第V节)。CRIP和Bt组合的描述和实例(第VI节)。描述了TMOF
和Bt蛋白组合(第VII节)。我们提供ICK和Bt蛋白如何组合以产生高效杀虫剂的非限
制性实例和描述，本文提供了其结果和数据。
[0408] 第I节. ICK基序肽或ICK肽。
[0409] “ICK基序”、“ICK基序蛋白”、“抑制物胱氨酸结基序”、“毒性昆虫ICK肽”或“ICK肽”意指含至少6个半-胱氨酸核心氨基酸、具有3个二硫桥的16-60个氨基酸肽，其中3个二硫桥是共价键，6个半-胱氨酸残基中共价二硫键介于自N端氨基酸开始的6个核心
半-胱氨酸氨基酸的第一和第四、第二和第五及第三和第六个半-胱氨酸之间。ICK基序
还包含β-发夹二级结构，通常由位于基序的第四和第六个核心半-胱氨酸之间的残基组
成，发夹通过由基序的3个二硫键提供的结构交联而被稳定。注意其它半胱氨酸/胱氨酸
或半-胱氨酸氨基酸可存在于抑制物胱氨酸结基序内。
半-胱氨酸氨基酸的第一和第四、第二和第五及第三和第六个半-胱氨酸之间。ICK基序
还包含β-发夹二级结构，通常由位于基序的第四和第六个核心半-胱氨酸之间的残基组
成，发夹通过由基序的3个二硫键提供的结构交联而被稳定。注意其它半胱氨酸/胱氨酸
或半-胱氨酸氨基酸可存在于抑制物胱氨酸结基序内。
[0410] 该基序在自许多物种的毒液中分离的肽中是共有的。无脊椎动物物种包括蜘蛛和蝎，其它实例有很多，已知甚至蛇毒液都具有含ICK基序的肽。杀虫ICK肽的具体实例是本文公开的及已公开的专利和专利申请中的“U肽”及其同源物，其具有来自澳大利亚漏斗网蜘蛛的毒液起源。这些蛋白质亦称为来自澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛的ACTX肽，但是本文所述程序是有用的并且可适用于含ICK基序的任何蛋白质。下列文件在美国通过引用以其整体予以结合，是本领域技术人员已知的，并且全已公开。
[0411] 含ICK基序蛋白的肽毒素的实例可见于下列参考文献。Lew, M.J.等人“Structure-Function Relationships of ω-Conotoxin GVIA (ω-食鱼螺毒素GVIA的结构-功能关系)” Journal of Biological Chemistry, 第272卷, 第18期, 5月2日发行, 第12014-12023页, 1997回顾了N型钙通道阻断剂ω-食鱼螺毒素。Quintero-Hernandez, V.等人“Scorpion and Spider Venom Peptides: Gene Cloning and Peptide Expression (蝎和蜘蛛毒液肽：基因克隆和肽表达)” Toxicon, 58, 第644-663页, 2011回顾了来自不同蜘蛛和蝎物种的许多节肢动物毒素ICK肽的概要。在Takahashi, H.等.“Solution
structure of hanatoxin1, a gating modifier of voltage-dependent K+ channels: common surface features of gating modifier toxins (电压依赖性K+通道的门控调节剂hanatoxin1的溶液结构：门控调节剂毒素的共同表面特征)” Journal of Molecular Biology, 第297卷, 第3期, 2000年3月31日, 第771-780页中，使用NMR光谱法，将
Hanatoxin1的三维结构鉴定为抑制物胱氨酸结基序。Zhu, S.等. “Evolutionary origin of inhibitor cystine knot peptides (抑制物胱氨酸结肽的进化起源) FASEB J., 2003年9月17日, (12):1765-7, 电子出版物2003年7月3日发表了编码蝎毒液ICK毒素肽
Opicalcine1的cDNA的分离和鉴定。Dauplais, M.等人“On the convergent evolution of animal toxins (有关动物毒素的趋同进化)” Journal of Biological Chemistry. +
1997年2月14日; 272(7): 4302-9公开了来自海葵Bunodosoma granulifera 的K 通
道阻断性毒素BgK的序列特异性排布和二级结构鉴定。Escoubas, P.等人“Structure
and pharmacology of spider venom neurotoxins (蜘蛛毒液神经毒素的结构和药理
学)” Biochimie, 第82卷, 第9–10期, 2000年9月10日, 第893-907页发表了强
调表明胱氨酸桥、胱氨酸结形成和“成结型(knotting-type)”折叠的多肽毒素结构、作用方式和分子进化的蜘蛛毒液的组成和药理学的综述。Galvez, A.等人“Purification and characterization of a unique, potent, peptidyl probe for the high conductance calcium-activated potassium channel from venom of the scorpion Buthus tamulus (来自蝎Buthus tamulus 的毒液的高传导性钙激活的钾通道的独特有效的肽基探针的纯
化和表征)” Journal of Biological Chemistry, 1990年7月5日; 265(19): 11083-90
2+ +
公开了纯化的肽iberiotoxin，一种来自蝎(Buthus tamulus)毒液的Ca 激活的K 通道
的抑制剂。Gimenez-Gallego, G.等人“Purification, sequence, and model structure of charybdotoxin, a potent selective inhibitor of calcium-activated potassium channels (一种钙激活的钾通道的有效选择性抑制剂卡律蝎毒素(charybdotoxin)的纯
化、序列和模型结构)” Proc Natl Acad Sci, 1988年5月; 85(10): 3329–3333公开了
2+ +
纯化的肽卡律蝎毒素，一种来自蝎Leiurus quinquestriatus毒液的Ca 激活的K 通道的
抑制剂。根据这些和其它出版物，本领域的技术人员应能够容易地鉴定具有我们描述为ICK基序、ICK基序蛋白或“抑制物胱氨酸结基序”的蛋白质和肽。
structure of hanatoxin1, a gating modifier of voltage-dependent K+ channels: common surface features of gating modifier toxins (电压依赖性K+通道的门控调节剂hanatoxin1的溶液结构：门控调节剂毒素的共同表面特征)” Journal of Molecular Biology, 第297卷, 第3期, 2000年3月31日, 第771-780页中，使用NMR光谱法，将
Hanatoxin1的三维结构鉴定为抑制物胱氨酸结基序。Zhu, S.等. “Evolutionary origin of inhibitor cystine knot peptides (抑制物胱氨酸结肽的进化起源) FASEB J., 2003年9月17日, (12):1765-7, 电子出版物2003年7月3日发表了编码蝎毒液ICK毒素肽
Opicalcine1的cDNA的分离和鉴定。Dauplais, M.等人“On the convergent evolution of animal toxins (有关动物毒素的趋同进化)” Journal of Biological Chemistry. +
1997年2月14日; 272(7): 4302-9公开了来自海葵Bunodosoma granulifera 的K 通
道阻断性毒素BgK的序列特异性排布和二级结构鉴定。Escoubas, P.等人“Structure
and pharmacology of spider venom neurotoxins (蜘蛛毒液神经毒素的结构和药理
学)” Biochimie, 第82卷, 第9–10期, 2000年9月10日, 第893-907页发表了强
调表明胱氨酸桥、胱氨酸结形成和“成结型(knotting-type)”折叠的多肽毒素结构、作用方式和分子进化的蜘蛛毒液的组成和药理学的综述。Galvez, A.等人“Purification and characterization of a unique, potent, peptidyl probe for the high conductance calcium-activated potassium channel from venom of the scorpion Buthus tamulus (来自蝎Buthus tamulus 的毒液的高传导性钙激活的钾通道的独特有效的肽基探针的纯
化和表征)” Journal of Biological Chemistry, 1990年7月5日; 265(19): 11083-90
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公开了纯化的肽iberiotoxin，一种来自蝎(Buthus tamulus)毒液的Ca 激活的K 通道
的抑制剂。Gimenez-Gallego, G.等人“Purification, sequence, and model structure of charybdotoxin, a potent selective inhibitor of calcium-activated potassium channels (一种钙激活的钾通道的有效选择性抑制剂卡律蝎毒素(charybdotoxin)的纯
化、序列和模型结构)” Proc Natl Acad Sci, 1988年5月; 85(10): 3329–3333公开了
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纯化的肽卡律蝎毒素，一种来自蝎Leiurus quinquestriatus毒液的Ca 激活的K 通道的
抑制剂。根据这些和其它出版物，本领域的技术人员应能够容易地鉴定具有我们描述为ICK基序、ICK基序蛋白或“抑制物胱氨酸结基序”的蛋白质和肽。
[0412] ICK基序蛋白可以是具有ICK基序和长度介于16和60个氨基酸之间的任何蛋白质，其具有产生正确顺序的共价交联二硫键的至少6个半胱氨酸残基。一些ICK基序肽的
长度介于26-60个氨基酸之间。一些ICK基序蛋白的长度介于16-48个氨基酸之间。一些
ICK基序蛋白的长度介于26-48个氨基酸之间。一些ICK基序蛋白的长度介于30-44个氨
基酸之间。具有天然杀虫活性的ICK基序蛋白是优选的，但是具有其它类型的活性(例如
耐盐性和耐霜性)的ICK基序蛋白是本领域技术人员已知的和本文要求保护的。杀虫ICK
基序蛋白的实例包括ACTX肽和基因，并包括称为Magi6的所有的肽及其的编码基因。
长度介于26-60个氨基酸之间。一些ICK基序蛋白的长度介于16-48个氨基酸之间。一些
ICK基序蛋白的长度介于26-48个氨基酸之间。一些ICK基序蛋白的长度介于30-44个氨
基酸之间。具有天然杀虫活性的ICK基序蛋白是优选的，但是具有其它类型的活性(例如
耐盐性和耐霜性)的ICK基序蛋白是本领域技术人员已知的和本文要求保护的。杀虫ICK
基序蛋白的实例包括ACTX肽和基因，并包括称为Magi6的所有的肽及其的编码基因。
[0413] 杀虫ICK基序蛋白的实例包括ACTX肽和基因，并包括上文和本文提供的参考文献中描述的所有肽及其编码基因。所公开的用于提供实例的目的并且无意以任何方式限制的ICK基序蛋白和肽的具体实例是上述肽及其同源物，特别是来源于澳大利亚漏斗网蜘蛛毒液的肽和核苷酸。下列文件在美国通过引用以其整体予以结合，是本领域技术人员已知的，并且全已公开。它们公开了许多ICK基序蛋白，其完整肽序列、其完整核苷酸序列已明确公开，并通过引用予以结合，此外完整的公开内容(包括其所有序列表)均通过引用予以结合。其序列表是已知的并且已公开。参见：2008年4月8日授予专利权的US 7,354,993 B2，具体地说，列于序列表中并由来自7,354,993 B2的SEQ ID NO: 33-71编号的肽和核苷酸序列，和名为U-ACTX多肽的那些，和可形成2-4个链内二硫桥的这些和其它毒素及其变体，和出现在7,354,993 B2的第4-9列和图2中的肽。其它具体的序列可见于2008年10
月8日公布和授予专利权的欧洲专利1 812 464 B1，参见Bulletin 2008/41，具体地说，序列表列出的肽和核苷酸序列，和可形成2-4个链内二硫桥的其它毒素，和编号为SEQ ID NO:
33-71的那些序列，和名为U-ACTX多肽及其变体的序列，和出现在段落0023-0055中和出现在欧洲专利1 812 464 B1中的肽，参见EP 1，1 812 464 B1的图1。
月8日公布和授予专利权的欧洲专利1 812 464 B1，参见Bulletin 2008/41，具体地说，序列表列出的肽和核苷酸序列，和可形成2-4个链内二硫桥的其它毒素，和编号为SEQ ID NO:
33-71的那些序列，和名为U-ACTX多肽及其变体的序列，和出现在段落0023-0055中和出现在欧洲专利1 812 464 B1中的肽，参见EP 1，1 812 464 B1的图1。
[0414] 所描述的和通过引用予以结合以公开本文鉴定的肽是所提及的序列的同源变体，与所述序列或本文提及的序列具有同源性，其按照本文所述处置方法还被鉴定为适于特别制备并要求保护，包括与本文公开的任何序列或与通过引用结合的任何序列具有至少任何下列百分比同一性的全部同源序列：与上述专利中鉴定的任何和所有序列、与本文鉴定的任何其它序列(包括本申请序列表中的每一个序列)有50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的同一性或100%同一性。当本文以数值(例如
50%或更大)使用术语同源或同源性时，则意味着是两个肽之间的百分比同一性或百分比
相似性。当不用数字百分比使用同源或同源性时，则是指在进化或发育方面密切相关的两个肽序列，因为它们有共同的生理和功能方面，像局部毒性和类似的大小(即，同源物在本文明确提及的或通过本文的上述参考文献鉴定的肽的长100%长度或短50%长度内)。
50%或更大)使用术语同源或同源性时，则意味着是两个肽之间的百分比同一性或百分比
相似性。当不用数字百分比使用同源或同源性时，则是指在进化或发育方面密切相关的两个肽序列，因为它们有共同的生理和功能方面，像局部毒性和类似的大小(即，同源物在本文明确提及的或通过本文的上述参考文献鉴定的肽的长100%长度或短50%长度内)。
[0415] 所描述的和通过引用予以结合以描述本文鉴定的肽是包括以下的毒性ICK肽：U肽及其变体；存在于、分离自或来源于澳毒蜘蛛属或Hadronyche属的蜘蛛，包括所述属的种Hadronyche versuta 或布鲁山脉漏斗网蜘蛛、Atrax robustus、Atrax formidabilis、Atrax infensus，包括称为U-ACTX多肽、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b的毒素或突变体或变体，尤其这些类型任一种的肽和尤其小于约200个氨基酸但大于约10个氨基酸的肽，和尤其小于约150个氨基酸但大于约20个氨基酸的肽，尤其小于约100个氨基
酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其小于约65个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其小
于约55个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其约37或39或约36-42个氨基酸的肽，尤
其具有小于约55个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其具有小于约45个氨基酸但大于
约35个氨基酸的肽，尤其具有小于约115个氨基酸但大于约75个氨基酸的肽，尤其具有小于约105个氨基酸但大于约85个氨基酸的肽，尤其具有小于约100个氨基酸但大于约90
个氨基酸的肽，包括可形成2、3和/或4个或更多个链内二硫桥的本文提及的任何长度的
肽毒素，包括破坏钙通道电流的毒素，包括破坏钾通道电流的毒素，尤其破坏昆虫钙通道的毒素或其Us，尤其任何这些类型的毒素或其变体和具有口服或局部杀虫活性的本文所述任何类型的毒素的任何组合，可通过本文所述处置方法特别制备。
酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其小于约65个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其小
于约55个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其约37或39或约36-42个氨基酸的肽，尤
其具有小于约55个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其具有小于约45个氨基酸但大于
约35个氨基酸的肽，尤其具有小于约115个氨基酸但大于约75个氨基酸的肽，尤其具有小于约105个氨基酸但大于约85个氨基酸的肽，尤其具有小于约100个氨基酸但大于约90
个氨基酸的肽，包括可形成2、3和/或4个或更多个链内二硫桥的本文提及的任何长度的
肽毒素，包括破坏钙通道电流的毒素，包括破坏钾通道电流的毒素，尤其破坏昆虫钙通道的毒素或其Us，尤其任何这些类型的毒素或其变体和具有口服或局部杀虫活性的本文所述任何类型的毒素的任何组合，可通过本文所述处置方法特别制备。
[0416] 来自澳大利亚漏斗网蜘蛛澳毒蜘蛛属和Hadronyche 属的U肽当按照本发明所述方法、程序或处置方法组合安排时是特别合适的并运作良好。本文提供了所测试的并具有数据的这类合适肽的实例。还明确已知下列物种携带适于通过本发明的处置方法特别制
备的毒性ICK肽。下列物种具体命名为：Atrax formidabillis、Atrax infensus、Atrax robustus、Hadronyche infensa、Hadronyche versuta。来源于任何上述属和/或属种和与U肽同源的任何毒性ICK肽适于按照本发明的处置方法特别制备。
备的毒性ICK肽。下列物种具体命名为：Atrax formidabillis、Atrax infensus、Atrax robustus、Hadronyche infensa、Hadronyche versuta。来源于任何上述属和/或属种和与U肽同源的任何毒性ICK肽适于按照本发明的处置方法特别制备。
[0417] 本说明书中的实例无意且不应用来限制本发明，它们仅供说明本发明。
[0418] 如上所述，许多肽是与Bt蛋白组合的合适候选物。上文、下文和序列表中所述序列是可特别制备的尤其合适的肽，且这些的一些已按照本发明特别制备，其结果见下列实例。
[0419] 有毒的ICK昆虫肽的实例是众所周知的，并可见于许多参考文献。它们可通过其肽性质及其活性，通常为口服或注射杀虫活性来鉴定。在此我们提供几个实例以更好地说明和描述本发明，但本发明不限于这些实例。所有的这些实例和在此未显示的其它实例是新材料的描述，在此首次描述并要求保护。
[0420] 有毒的ICK昆虫肽是大于5个氨基酸残基和小于3,000个氨基酸残基的肽。其分子范围为约550 Da至约350,000 Da。有毒的ICK昆虫肽具有某种类型的杀虫活性。通
常它们当给昆虫注射时显示活性，但是当局部施用于昆虫时大多数不具有明显活性。有毒ICK昆虫肽的杀虫活性以多种方法测量。测量的常用方法广为本领域技术人员所知。所述方法包括但不限于根据各个参数例如瘫痪、死亡、无法增加体重等的计分，通过剂量反应图拟合，确定中值反应剂量(例如LD50、PD50、LC50、ED50)。可针对暴露于不同剂量的所述杀虫制剂中的昆虫组群进行测量。可通过产生由概率单位分析和/或希尔方程等限定的曲线进行数据分析。在这种情况下，剂量可通过皮下注射，通过高压输注，通过提供杀虫制剂作为食物或诱饵样品的一部分等来给予。
常它们当给昆虫注射时显示活性，但是当局部施用于昆虫时大多数不具有明显活性。有毒ICK昆虫肽的杀虫活性以多种方法测量。测量的常用方法广为本领域技术人员所知。所述方法包括但不限于根据各个参数例如瘫痪、死亡、无法增加体重等的计分，通过剂量反应图拟合，确定中值反应剂量(例如LD50、PD50、LC50、ED50)。可针对暴露于不同剂量的所述杀虫制剂中的昆虫组群进行测量。可通过产生由概率单位分析和/或希尔方程等限定的曲线进行数据分析。在这种情况下，剂量可通过皮下注射，通过高压输注，通过提供杀虫制剂作为食物或诱饵样品的一部分等来给予。
[0421] 有毒的ICK昆虫肽或ICK肽在此定义为通过皮下注射、高压输注递送给昆虫时，或经口递送给昆虫(即通过作为给昆虫提供的食物样品的一部分消化)时显示是杀虫的所有肽。这类肽因此包含但不限于作为蜘蛛、螨、蝎、蛇、蜗牛等的毒液组分天然产生的许多肽。
该类别还包含但不限于由植物产生的各种肽(例如各种凝集素、核糖体灭活蛋白和半胱氨酸蛋白酶)和由昆虫病原微生物产生的各种肽(例如由各种芽孢杆菌(Bacillus species)
产生的Cry1/Bt蛋白家族的蛋白质)。
该类别还包含但不限于由植物产生的各种肽(例如各种凝集素、核糖体灭活蛋白和半胱氨酸蛋白酶)和由昆虫病原微生物产生的各种肽(例如由各种芽孢杆菌(Bacillus species)
产生的Cry1/Bt蛋白家族的蛋白质)。
[0422] 杀虫肽可选自杀虫毒液，例如蜘蛛的毒液。蜘蛛可以是澳大利亚漏斗网蜘蛛。肽可来自澳毒蜘蛛属或Hadronyche属，包括U-ACTX-Hv1a及其类似物。来自蜘蛛的具体肽实例描述于本文提供的序列表。这些肽可采用本文所述程序与Bt蛋白组合。
[0423] ICK肽序列实例下列文件在美国、在得到允许的其它权限下，通过引用以其整体予以结合，并且鉴于其
公布，它们为公众所知。此外，它们通过引用予以结合，且对它们的序列表而言，明确已知至它们描述肽序列的程度。见下文：
美国专利：
1998年6月9日授予专利权的US 5,763,568 (以其整体结合到本文中)，特别是序列
表中的序列，和编号为33-58的那些，和称为“κ”或“ω”毒素的那些，包括可形成2-4个链内二硫桥的那些，和出现在第2和4列、和表5、和图5、图15、图16、图17、图18中的肽。
公布，它们为公众所知。此外，它们通过引用予以结合，且对它们的序列表而言，明确已知至它们描述肽序列的程度。见下文：
美国专利：
1998年6月9日授予专利权的US 5,763,568 (以其整体结合到本文中)，特别是序列
表中的序列，和编号为33-58的那些，和称为“κ”或“ω”毒素的那些，包括可形成2-4个链内二硫桥的那些，和出现在第2和4列、和表5、和图5、图15、图16、图17、图18中的肽。
[0424] 1999年9月28日授予专利权的US 5,959,182 (以其整体结合到本文中)，特别是序列表中的序列，编号为33-58的那些和称为“κ”或“ω”毒素的那些，包括可形成2-4个链内二硫桥的毒素，和出现在第2和4列、和表5、和图5、图15、图16、图17、图18中的肽。
[0425] 2003年6月24日授予专利权的US 6,583,264 B2和2007年2月6日授予专利权的US 7,173,106 B2 (以其整体结合到本文中)，特别是1号序列，称为
omega-atracotoxin-Hv2a或ω-atracotoxin-Hv2a，包括可形成2-4个链内二硫桥的毒素。
omega-atracotoxin-Hv2a或ω-atracotoxin-Hv2a，包括可形成2-4个链内二硫桥的毒素。
[0426] 2007年10月9日授予专利权的US 7,279,547 B2 (以其整体结合到本文中)，特别是序列表中的序列，和编码为33-67的那些，和ω-atracotoxin-Hv2a的变体，可形成2-4个链内二硫桥的毒素，和出现在该说明书第4-8栏和图3和图4中的肽。
[0427] 2008年4月8日授予专利权的US 7,354,993 B2 (以其整体结合到本文中)，特别是序列表中列举的肽序列，和编码为33-71的那些，和名为U-ACTX多肽的那些，可形成2-4个链内二硫桥的毒素及其变体，和出现在该说明书第4-9列和图1中的肽。
[0428] 08.10.2008 Bulletin 2008/41公布和授予专利权的欧洲专利1 812 464 B1 (以其整体结合到本文中)，特别是序列表中列举的肽序列，可形成2-4个链内二硫桥的毒素，和编号为33-71的那些，和名为U-ACTX多肽的那些及其变体，和出现在段落0023-0055和出现在图1中的肽。
[0429] 描述和通过引用予以结合的本文鉴定的肽是所提及的序列的同源变体，与所述序列或本文提及的序列具有同源性，其按照本文所述处置方法还被鉴定为适于特别制备并要求保护，包括但不限于所有同源序列，包括与此处所公开的任何序列或与通过引用结合的任何序列有至少任何的下列百分比同一性的同源序列：与上述专利鉴定的任何和所有序列、与本文鉴定的任何其它序列(包括本申请序列表中的每一个序列)有30%、35%、40%、
45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大的同一性。当本文以数值(例如
30%或更高)使用术语同源或同源性时，则意味着是两个肽之间的百分比同一性或百分比
相似性。当不用数字百分比使用同源或同源性时，则是指在进化或发育方面密切相关的两个肽序列，因为它们有共同的生理和功能方面，像局部毒性和在肽的长100%长度或短50%长度内的类似大小。
45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大的同一性。当本文以数值(例如
30%或更高)使用术语同源或同源性时，则意味着是两个肽之间的百分比同一性或百分比
相似性。当不用数字百分比使用同源或同源性时，则是指在进化或发育方面密切相关的两个肽序列，因为它们有共同的生理和功能方面，像局部毒性和在肽的长100%长度或短50%长度内的类似大小。
[0430] 描述和通过引用结合的本文鉴定的肽来源于上文引用的美国和欧洲专利文件提及的任何来源，包括但不限于：自植物和昆虫分离的毒素，尤其来自蜘蛛、蝎和捕食昆虫或防御自身免遭昆虫的植物的毒素，例如漏斗网蜘蛛，尤其澳大利亚漏斗网蜘蛛，包括存在于、分离自或来源于澳毒蜘蛛属或Hadronyche 属的毒素，包括属种Hadronyche versuta或布鲁山脉漏斗网蜘蛛、Atrax robustus、Atrax formidabilis、Atrax infensus，包括称 为“atracotoxin”、“co-atracotoxin”、“κ” atracotoxin、“ω” atracotoxin(亦 称ω-atracotoxin)、U-ACTX多肽、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b的毒素或突变体或变体，尤其这些类型任一种的肽和尤其小于约200个氨基酸但大于约10个氨基酸的
肽，尤其小于约150个氨基酸但大于约20个氨基酸的肽，尤其小于约100个氨基酸但大于
约25个氨基酸的肽，尤其小于约65个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其小于约55个
氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其约37或39或约36-42个氨基酸的肽，尤其具有小
于约55个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其具有小于约45个氨基酸但大于约35个
氨基酸的肽，尤其具有小于约115个氨基酸但大于约75个氨基酸的肽，尤其具有小于约105个氨基酸但大于约85个氨基酸的肽，尤其具有小于约100个氨基酸但大于约90个氨基酸
的肽，包括肽可形成2、3和/或4个或更多个链内二硫桥的此处提及的任何长度的肽毒素，包括破坏钙通道电流的毒素，包括破坏钾通道电流，尤其昆虫钙通道的毒素或其杂合体，尤其任何这些类型的毒素或其变体，以及具有局部杀虫活性的本文所述任何类型的毒素的任何组合，可通过本文所述的处置方法特别制备。
肽，尤其小于约150个氨基酸但大于约20个氨基酸的肽，尤其小于约100个氨基酸但大于
约25个氨基酸的肽，尤其小于约65个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其小于约55个
氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其约37或39或约36-42个氨基酸的肽，尤其具有小
于约55个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其具有小于约45个氨基酸但大于约35个
氨基酸的肽，尤其具有小于约115个氨基酸但大于约75个氨基酸的肽，尤其具有小于约105个氨基酸但大于约85个氨基酸的肽，尤其具有小于约100个氨基酸但大于约90个氨基酸
的肽，包括肽可形成2、3和/或4个或更多个链内二硫桥的此处提及的任何长度的肽毒素，包括破坏钙通道电流的毒素，包括破坏钾通道电流，尤其昆虫钙通道的毒素或其杂合体，尤其任何这些类型的毒素或其变体，以及具有局部杀虫活性的本文所述任何类型的毒素的任何组合，可通过本文所述的处置方法特别制备。
[0431] 来自澳大利亚漏斗网蜘蛛澳毒蜘蛛属和Hadronyche 属的有毒肽当通过本发明所述方法、程序或处置方法处理时是特别合适的且运作良好。这些蜘蛛肽，像许多其它毒性ICK肽，尤其包括毒蝎和有毒植物肽，当通过本发明所述的处置方法处理时变成有局部活性或毒性的。本文提供了所测试的合适肽的实例和所得数据。除上文提及的生物以
外，还明确已知下列物种携带适于通过本发明的处置方法特别制备的毒素。下列物种具
体名为：Agelenopsis aperta、Androctonus australis Hector、Antrax formidabillis、Antrax infensus、Atrax robustus、苏云金芽孢杆菌、Bothus martensii Karsch、Bothus occitanus tunetanus、Buthacus arenicola、Buthotus judaicus、Buthus occitanus mardochei、Centruroides noxius、Centruroides suffusus suffusus、Hadronyche
infensa、Hadronyche versuta、Hadronyche versutus、Hololena curta、Hottentotta judaica、Leiurus quinquestriatus、Leiurus quinquestriatus hebraeus、Leiurus
quinquestriatus quinquestriatus、Oldenlandia affinis、Scorpio maurus palmatus、Tityus serrulatus、Tityus zulianu。任何上述属和/或属种的任何肽类毒素适于按照本发明的处置方法特别制备。
外，还明确已知下列物种携带适于通过本发明的处置方法特别制备的毒素。下列物种具
体名为：Agelenopsis aperta、Androctonus australis Hector、Antrax formidabillis、Antrax infensus、Atrax robustus、苏云金芽孢杆菌、Bothus martensii Karsch、Bothus occitanus tunetanus、Buthacus arenicola、Buthotus judaicus、Buthus occitanus mardochei、Centruroides noxius、Centruroides suffusus suffusus、Hadronyche
infensa、Hadronyche versuta、Hadronyche versutus、Hololena curta、Hottentotta judaica、Leiurus quinquestriatus、Leiurus quinquestriatus hebraeus、Leiurus
quinquestriatus quinquestriatus、Oldenlandia affinis、Scorpio maurus palmatus、Tityus serrulatus、Tityus zulianu。任何上述属和/或属种的任何肽类毒素适于按照本发明的处置方法特别制备。
[0432] 本说明书中的实例无意且不应用来限制本发明，它们仅供说明本发明。
[0433] 如上所述，许多肽是作为特别制备的处置方法主题的合适候选物。上文、下文和序列表中所述序列是可特别制备的尤其合适的肽，并且这些中的许多已按照本发明特别制备，其结果见下列实例。
[0434] 本说明书中的实例无意且不应用来限制本发明，它们仅供说明本发明。
[0435] 如上所述，许多肽是作为用于植物表达成为PIP的处置方法主题的合适候选物。上文、下文和序列表中所述序列是可在植物中作为PEP表达的尤其合适的肽，且这些中的一些已按照本发明在植物中作为PEP表达，其结果见下列实例。
[0436] SEQ ID NO: 1042 (一字母代码)。
[0437] GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A名为“U+2-ACTX-Hv1a”，在以下位置具有二硫桥：5-20、12-25、19-39。分子量为
4564.85道尔顿。
4564.85道尔顿。
[0438] ICK基序杀虫蛋白的另一个实例为SEQ ID NO: 1010。
[0439] SEQ ID NO: 661 (一字母代码)QYCVP VDQPC SLNTQ PCCDD ATCTQ ERNEN GHTVY YCRA
SEQ ID NO: 661，名为“杂合-ACTX-Hv1a”，在以下位置具有二硫桥：3-18、10-23、
17-37。分子量为4426.84道尔顿。
SEQ ID NO: 661，名为“杂合-ACTX-Hv1a”，在以下位置具有二硫桥：3-18、10-23、
17-37。分子量为4426.84道尔顿。
[0440] SEQ ID NO: 593 (一字母代码)SPTCI PSGQP CPYNE NCCSQ SCTFK ENENG NTVKR CD
SEQ ID NO: 593 (三字母代码)
Ser Pro Thr Cys Ile Pro Ser Gly Gln Pro Cys Pro Tyr Asn Glu Asn
Cys Cys Ser Gln Ser Cys Thr Phe Lys Glu Asn Glu Asn Gly Asn Thr
Val Lys Arg Cys Asp
名为“ω-ACTX-Hv1a”，在以下位置具有二硫桥：4-18、11-22和17-36。分子量为4096。
SEQ ID NO: 593 (三字母代码)
Ser Pro Thr Cys Ile Pro Ser Gly Gln Pro Cys Pro Tyr Asn Glu Asn
Cys Cys Ser Gln Ser Cys Thr Phe Lys Glu Asn Glu Asn Gly Asn Thr
Val Lys Arg Cys Asp
名为“ω-ACTX-Hv1a”，在以下位置具有二硫桥：4-18、11-22和17-36。分子量为4096。
[0441] SEQ ID NO: 650 (一字母代码)GSSPT CIPSG QPCPY NENCC SQSCT FKENE NGNTV KRCD
SEQ ID NO: 650 (三字母代码)
Gly Ser Ser Pro Thr Cys Ile Pro Ser Gly Gln Pro Cys Pro Tyr Asn
Glu Asn Cys Cys Ser Gln Ser Cys Thr Phe Lys Glu Asn Glu Asn Gly
Asn Thr Val Lys Arg Cys Asp
名为“ω-ACTX-Hv1a+2”，在以下位置具有二硫桥：6-20、13-24和19-38。分子量为
4199。
SEQ ID NO: 650 (三字母代码)
Gly Ser Ser Pro Thr Cys Ile Pro Ser Gly Gln Pro Cys Pro Tyr Asn
Glu Asn Cys Cys Ser Gln Ser Cys Thr Phe Lys Glu Asn Glu Asn Gly
Asn Thr Val Lys Arg Cys Asp
名为“ω-ACTX-Hv1a+2”，在以下位置具有二硫桥：6-20、13-24和19-38。分子量为
4199。
[0442] SEQ ID NO: 651 (一字母代码)GSAIC TGADR PCAAC CPCCP GTSCK AESNG VSYCR KDEP
SEQ ID NO: 651 (三字母代码)
Gly Ser Ala Ile Cys Thr Gly Ala Asp Arg Pro Cys Ala Ala Cys Cys
Pro Cys Cys Pro Gly Thr Ser Cys Lys Ala Glu Ser Asn Gly Val Ser
Tyr Cys Arg Lys Asp Glu Pro
名为“rκ-ACTX-Hv1c”，在以下位置具有二硫桥：5-19、12-24、15-16、18-34。分子量为
3912.15。
SEQ ID NO: 651 (三字母代码)
Gly Ser Ala Ile Cys Thr Gly Ala Asp Arg Pro Cys Ala Ala Cys Cys
Pro Cys Cys Pro Gly Thr Ser Cys Lys Ala Glu Ser Asn Gly Val Ser
Tyr Cys Arg Lys Asp Glu Pro
名为“rκ-ACTX-Hv1c”，在以下位置具有二硫桥：5-19、12-24、15-16、18-34。分子量为
3912.15。
[0443] SEQ ID NO: 652 (三字母代码)Gly Ser Gln Tyr Cys Val Pro Val Asp Gln Pro Cys Ser Leu Asn Thr
Gln Pro Cys Cys Asp Asp Ala Thr Cys Thr Gln Glu Arg Asn Glu Asn
Gly His Thr Val Tyr Tyr Cys Arg Ala
名为“rU-ACTX-Hv1a (“杂合”)+2”，在以下位置具有二硫桥：5-20、12-25、19-39。分子量为4570.51。
Gln Pro Cys Cys Asp Asp Ala Thr Cys Thr Gln Glu Arg Asn Glu Asn
Gly His Thr Val Tyr Tyr Cys Arg Ala
名为“rU-ACTX-Hv1a (“杂合”)+2”，在以下位置具有二硫桥：5-20、12-25、19-39。分子量为4570.51。
[0444] 序列表中提供了其它ICK肽。SEQ ID NO: 534-707是ICK肽序列，包括“κ”/“ω”毒素和“杂合”毒素。SEQ ID NO: 593是ω-ACTX-Hv1a。SEQ ID NO: 661是杂合-ACTX-Hv1a或U-ACTX-Hv1a。
[0445] 第II节. TMOF基序肽或TMOF肽。
[0446] “TMOF基序”或“TMOF蛋白”意指胰蛋白酶调节抑卵因子肽。提供了许多实例和变体。SEQ ID NO: 708是野生型TMOF序列。SEQ. ID. NO: 709-721中提供了其它非限制性变体。其它实例是已知的或可通过本领域技术人员产生。
[0447] 第III节. Bt蛋白Bt是称为苏云金芽孢杆菌的细菌的字首。Bt细菌产生对许多昆虫有毒的肽的家族。Bt
毒肽因其产生伴胞晶体蛋白质内含物(通常称为晶体)的能力而著称，所述内含物归于毒
素的两个主要类别；细胞溶素(Cyt)和晶体Bt蛋白(Cry)。自1980年代早期对第一个晶体
蛋白基因进行克隆和测序以来，其它晶体蛋白已被表征，目前按照Crickmore等人(1998)的命名法分类。一般来说，Cyt蛋白对昆虫目鞘翅目(甲虫)和双翅目(蝇)有毒，Cry蛋
白以鳞翅目(蛾和蝴蝶)为目标。Cry蛋白与中肠(上皮)细胞膜上的特异性受体结合，导
致这些细胞破裂。如果Cry蛋白无法找到上皮细胞上它与之结合的特异性受体，则它是无毒的。Bt菌株可具有Cyt和Cry蛋白的不同互补序列，因此限定了其宿主范围。已鉴定出
编码许多Cry蛋白的基因。
毒肽因其产生伴胞晶体蛋白质内含物(通常称为晶体)的能力而著称，所述内含物归于毒
素的两个主要类别；细胞溶素(Cyt)和晶体Bt蛋白(Cry)。自1980年代早期对第一个晶体
蛋白基因进行克隆和测序以来，其它晶体蛋白已被表征，目前按照Crickmore等人(1998)的命名法分类。一般来说，Cyt蛋白对昆虫目鞘翅目(甲虫)和双翅目(蝇)有毒，Cry蛋
白以鳞翅目(蛾和蝴蝶)为目标。Cry蛋白与中肠(上皮)细胞膜上的特异性受体结合，导
致这些细胞破裂。如果Cry蛋白无法找到上皮细胞上它与之结合的特异性受体，则它是无毒的。Bt菌株可具有Cyt和Cry蛋白的不同互补序列，因此限定了其宿主范围。已鉴定出
编码许多Cry蛋白的基因。
[0448] 目前，基于目特异性，杀虫Bt伴胞肽有4个主要致病型：鳞翅目特异性(CryI，现为Cry1)、鞘翅目特异性(CryIII，现为Cry3)、双翅目特异性(CryIV，现为Cry4、Cry 10、Cry11；和CytA，现为Cyt1A)和CryII (现为Cry2)，当时已知的具有双重(鳞翅目和双翅目)特异性的唯一家族。目前跨目活性在许多情况下是明显的。
[0449] 该命名法指定正模序列，一种结合基于趋异程度排序的独特名称，其边界介于一级(阿拉伯数字)、二级(大写字母)和三级(小写字母)排序间，表示大约95%、78%和45%同一性。使用第4个排序(另一个阿拉伯数字)表明具有相同或仅略有不同的序列的正模
毒素基因的独立分离。目前，该命名法区别归类于55 cry和2 cyt家族的174个正模序列
(Crickmore, N., Zeigler, D.R., Schnepf, E., Van Rie, J., Lereclus, D., Daum, J, Bravo, A., Dean, D.H., B. thuringiensis toxin nomenclature (苏云金素毒命名法))。这些晶体蛋白和产生所述晶体蛋白的基因的任一种都可用来产生用于本发明的合适的Bt相关毒素。
毒素基因的独立分离。目前，该命名法区别归类于55 cry和2 cyt家族的174个正模序列
(Crickmore, N., Zeigler, D.R., Schnepf, E., Van Rie, J., Lereclus, D., Daum, J, Bravo, A., Dean, D.H., B. thuringiensis toxin nomenclature (苏云金素毒命名法))。这些晶体蛋白和产生所述晶体蛋白的基因的任一种都可用来产生用于本发明的合适的Bt相关毒素。
[0450] 还包括在本发明的描述中的是由其它细菌产生的高度相关的晶体蛋白的家族：来自双酶梭状芽胞杆菌(Clostridium bifermentans)的Cry16和Cry17 (Barloy等，1996，1998)、来自日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popilliae)的Cry 18 (Zhang等，1997)、来自Paenibacillus lentimorbis 的Cry43 (Yokoyama等，2004)和由球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)产生的二元Cry48/Cry49 (Jones等，2008)。其它晶体或分泌的杀虫蛋白，例如在此包括的S-layer蛋白(Peña等，2006)，为遗传改变的晶体蛋白，通过单一氨基酸取代来修饰的那些除外(例如Lambert等，1996)。这些基因的任一种可用来产生用于本发明的合适的Bt相关毒素。
[0451] Bt的实例具体地讲，提供对应于Bt蛋白核酸序列的分离核酸分子。另外，包括对应于所述多核
苷酸的氨基酸序列。具体地讲，本发明提供分离的核酸分子，其包含编码2009年4月18日公开的US 2009/0099081中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，其全部通过引用以其整体结合到本文中，且根据数字识别的所有序列通过引用明确予以结合。SEQ ID NO: 9、11、13、15或18，或SEQ ID NO:1、2、4、6、7、8、10、12、14、16或17中给出的核苷酸序列及其变体和片段。还包括与本发明的核苷酸序列互补或与本发明的序列杂交的核苷酸序列。
苷酸的氨基酸序列。具体地讲，本发明提供分离的核酸分子，其包含编码2009年4月18日公开的US 2009/0099081中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，其全部通过引用以其整体结合到本文中，且根据数字识别的所有序列通过引用明确予以结合。SEQ ID NO: 9、11、13、15或18，或SEQ ID NO:1、2、4、6、7、8、10、12、14、16或17中给出的核苷酸序列及其变体和片段。还包括与本发明的核苷酸序列互补或与本发明的序列杂交的核苷酸序列。
[0452] 编码本发明的蛋白质的核苷酸序列包括2009年4月18日公开的US2009/0099081给出的序列SEQ ID NO: 1、2、4、6、7、8、10、12、14、16或17及其变体、片段和互补序列。所谓“互补序列”意指与规定核苷酸序列充分互补使得它可与规定核苷酸序列杂交从而形成稳定双链体的核苷酸序列。SEQ ID NO: 33-533给出了由该核苷酸序列编码的Bt蛋白的相应氨基酸序列。
[0453] 本发明还包括是这些Bt蛋白编码核苷酸序列的片段的核酸分子(例如2009年4月18日公开的US 2009/0099081，其全部通过引用以其整体结合到本文中，且根据数字识别的所有序列通过引用明确予以结合)。SEQ ID NO: 8是SEQ ID NO: 4和12的片段；SEQ ID NO: 4是SEQ ID NO: 2的片段。所谓“片段”意指编码Bt蛋白的核苷酸序列的一部分。
核苷酸序列的片段可编码Bt蛋白的生物活性部分，或它可以是可采用下文公开的方法，用作杂交探针或PCR引物的片段。是Bt蛋白核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约50、
100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、
1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1860、1870、1880、1885个邻接核苷酸，或至多存在于本文公开的全长Bt蛋白编码核苷酸序列的核苷酸数(例如2009年4
月18日公开的US 2009/0099081的1890个核苷酸，在此这些在序列表中作为SEQ ID NO:
1和2提供，SEQ ID NO: 4的1806个核苷酸、SEQ ID NO: 6、7、8和16的1743个核苷酸、
SEQ ID NO: 10的1809个核苷酸和SEQ ID NO: 12和14的1752个核苷酸)，这取决于预
期的用途。所谓“邻接”核苷酸意指彼此直接相邻的核苷酸残基。本发明核苷酸序列的片段编码保持Bt蛋白的生物活性并因此保持杀虫活性的蛋白质片段。所谓“保持活性”意指所述片段具有Bt蛋白的杀虫活性的至少约30%、至少约50%、至少约70%、80%、90%、95%或更多。用于测量杀虫活性的方法是本领域众所周知的。参见例如Czapla和Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485；Andrews等. (1988) Biochem. J. 252:199-206；Marrone等(1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；以及美国专利号5,743,477，其所有文献均通过引用以其整体结合到本文中，且根据数字识别的所有序列通过引用明确予以结合。
核苷酸序列的片段可编码Bt蛋白的生物活性部分，或它可以是可采用下文公开的方法，用作杂交探针或PCR引物的片段。是Bt蛋白核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约50、
100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、
1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1860、1870、1880、1885个邻接核苷酸，或至多存在于本文公开的全长Bt蛋白编码核苷酸序列的核苷酸数(例如2009年4
月18日公开的US 2009/0099081的1890个核苷酸，在此这些在序列表中作为SEQ ID NO:
1和2提供，SEQ ID NO: 4的1806个核苷酸、SEQ ID NO: 6、7、8和16的1743个核苷酸、
SEQ ID NO: 10的1809个核苷酸和SEQ ID NO: 12和14的1752个核苷酸)，这取决于预
期的用途。所谓“邻接”核苷酸意指彼此直接相邻的核苷酸残基。本发明核苷酸序列的片段编码保持Bt蛋白的生物活性并因此保持杀虫活性的蛋白质片段。所谓“保持活性”意指所述片段具有Bt蛋白的杀虫活性的至少约30%、至少约50%、至少约70%、80%、90%、95%或更多。用于测量杀虫活性的方法是本领域众所周知的。参见例如Czapla和Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485；Andrews等. (1988) Biochem. J. 252:199-206；Marrone等(1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；以及美国专利号5,743,477，其所有文献均通过引用以其整体结合到本文中，且根据数字识别的所有序列通过引用明确予以结合。
[0454] 编码本发明蛋白质的生物活性部分的Bt蛋白编码核苷酸序列的片段编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、560、570、575、
580、585、590、595、600个邻接氨基酸，或至多存在于本发明的全长Bt蛋白的氨基酸总数(例如SEQ ID NO: 41的580个氨基酸、SEQ ID NO: 43的602个氨基酸和SEQ ID NO: 45
和47的583个氨基酸)。
580、585、590、595、600个邻接氨基酸，或至多存在于本发明的全长Bt蛋白的氨基酸总数(例如SEQ ID NO: 41的580个氨基酸、SEQ ID NO: 43的602个氨基酸和SEQ ID NO: 45
和47的583个氨基酸)。
[0455] 本发明优选的Bt蛋白由与2009年4月18日公开的US 2009/0099081的核苷酸序列充分相同的核苷酸序列编码，其全部通过引用以其整体结合到本文中，且根据数字识别的所有序列通过引用序列1、2、4、6、7、8、10、12、14、16或17明确予以结合。所谓“充分相同”意指使用标准参数，应用本文所述比对程序之一，与参比序列相比，具有至少约60%或
65%序列同一性、约70%或75%序列同一性、约80%或85%序列同一性、约90%、91%、92%、93%、
94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员应认识到，鉴于密码子简并、氨基酸相似性、读框定位等，可适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。
65%序列同一性、约70%或75%序列同一性、约80%或85%序列同一性、约90%、91%、92%、93%、
94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员应认识到，鉴于密码子简并、氨基酸相似性、读框定位等，可适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。
[0456] 本发明还包括变体核酸分子(例如2009年4月18日公开的US 2009/0099081，其全部通过引用以其整体结合到本文中，且根据数字识别的所有序列通过引用明确予以结合，序列2是序列1的变体；序列7和8是序列6的变体；序列10是序列4和12的变体；
序列14是序列12的变体)。Bt蛋白编码核苷酸序列的“变体”包括编码本文公开的Bt蛋
白但由于遗传密码的简并而保守地不同的那些序列以及如上所述充分相同的那些序列。
序列14是序列12的变体)。Bt蛋白编码核苷酸序列的“变体”包括编码本文公开的Bt蛋
白但由于遗传密码的简并而保守地不同的那些序列以及如上所述充分相同的那些序列。
[0457] 天然存在的等位基因变体可使用众所周知的分子生物学技术鉴定，例如下文概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体核苷酸序列还包括例如如下所述，使用位点定向诱变产生的但它仍编码本发明公开的Bt蛋白的合成来源的核苷酸序列。本发明包括的变体蛋白质是有生物活性的，也就是说它们继续具有天然蛋白质的所需要的生物活性，即保留杀虫活性。所谓“保留活性”意指变体具有天然蛋白质杀虫活性的至少约30%、至少约
50%、至少约70%或至少约80%。用于测量杀虫活性的方法是本领域众所周知的。参见例如Czapla和Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485；Andrews等(1988) Biochem. J. 252:199-206；Marrone等(1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；以及美国专利号5,743,477，所有文献均通过引用以其整体结合到本文中，且根据数字识别的所有序列通过引用明确予以结合。
50%、至少约70%或至少约80%。用于测量杀虫活性的方法是本领域众所周知的。参见例如Czapla和Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485；Andrews等(1988) Biochem. J. 252:199-206；Marrone等(1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；以及美国专利号5,743,477，所有文献均通过引用以其整体结合到本文中，且根据数字识别的所有序列通过引用明确予以结合。
[0458] 合成和变体Bt基因产生的实例在本发明的一个方面，产生合成的axmi-004序列，例如synaxmi-004 (序列1) (2009
年4月18日公开的US 2009/0099081，其全部通过引用以其整体结合到本文中，且根据
数字识别的所有序列通过引用明确予以结合)和synaxmi-004B (序列2)。相对于U.S.
7,355,099列举的axmi-004序列(序列3) (其全部通过引用以其整体结合到本文中，且根
据数字识别的所有序列通过引用明确予以结合)，这些合成序列具有改变的DNA序列，并编码原始AXMI-004蛋白质。同样，命名了synaxmi-004B-2M (序列4)，编码最初在美国专利申请顺序号10/782,020中鉴定的axmi-004替代起始位点(本文称为axmi-004B-2M，并在
序列5中给出)。
年4月18日公开的US 2009/0099081，其全部通过引用以其整体结合到本文中，且根据
数字识别的所有序列通过引用明确予以结合)和synaxmi-004B (序列2)。相对于U.S.
7,355,099列举的axmi-004序列(序列3) (其全部通过引用以其整体结合到本文中，且根
据数字识别的所有序列通过引用明确予以结合)，这些合成序列具有改变的DNA序列，并编码原始AXMI-004蛋白质。同样，命名了synaxmi-004B-2M (序列4)，编码最初在美国专利申请顺序号10/782,020中鉴定的axmi-004替代起始位点(本文称为axmi-004B-2M，并在
序列5中给出)。
[0459] 在本发明的另一个方面，在axmi-004编码序列中鉴定出第三起始位点。该编码区名为axmi-004B-3M (2009年4月18日公开的US 2009/0099081，其全部通过引用
以其整体结合到本文中，且根据数字识别的所有序列通过引用明确予以结合，序列16)，并编码序列9所示的AXMI-004B-3M氨基酸序列。还命名了编码AXMI-004B-3M蛋白
的合成序列。这些合成核苷酸序列分别命名为synaxmi-004B-3M，synaxmi-004C-3M
和synaxmi-004D-3M，并在序列6、7和8中给出。在本发明的另一个方面，设计了编码
AXMI-004B-3M蛋白的核苷酸序列的修饰形式，使得将另外的N端残基加到该编码的蛋白质上。这些序列命名为synaxmi-004B-3M-alt1 (2009年4月18日公开的US 2009/0099081，
序 列10)、synaxmi-004B-3M-alt2 (序 列 12)、synaxmi-004B-3M-alt3 (序 列14) 和
synaxmi-004B-3M-alt4 (序列17)。编码的蛋白质命名为AXMI-004B-3M-ALT1 (序列11)、AXMI-004B-3M-ALT2 (序列13)、AXMI-004B-3M-ALT3 (序列15)和AXMI-004B-3M-ALT4 (序列18)。
以其整体结合到本文中，且根据数字识别的所有序列通过引用明确予以结合，序列16)，并编码序列9所示的AXMI-004B-3M氨基酸序列。还命名了编码AXMI-004B-3M蛋白
的合成序列。这些合成核苷酸序列分别命名为synaxmi-004B-3M，synaxmi-004C-3M
和synaxmi-004D-3M，并在序列6、7和8中给出。在本发明的另一个方面，设计了编码
AXMI-004B-3M蛋白的核苷酸序列的修饰形式，使得将另外的N端残基加到该编码的蛋白质上。这些序列命名为synaxmi-004B-3M-alt1 (2009年4月18日公开的US 2009/0099081，
序 列10)、synaxmi-004B-3M-alt2 (序 列 12)、synaxmi-004B-3M-alt3 (序 列14) 和
synaxmi-004B-3M-alt4 (序列17)。编码的蛋白质命名为AXMI-004B-3M-ALT1 (序列11)、AXMI-004B-3M-ALT2 (序列13)、AXMI-004B-3M-ALT3 (序列15)和AXMI-004B-3M-ALT4 (序列18)。
[0460] 其它Bt蛋白和基因描述可见于下文。下文提及的具有所述出版物提及的注释为Bt毒素的每个专利出版物，通过引用以其整体结合到本文中。这些文件也已发表，且所述文件及其序列已处于公开领域。
[0461] Bt基因、蛋白质的更多实例和描述它们的专利文件见下表4、5和6。表4、5、6中的专利文件，特别是美国专利和美国申请，通过引用以其整体结合到本文中。
[0462] 表4. Bt毒素表5. 杂合杀虫晶体蛋白和专利。
[0463] 表6.有关其它杂合杀虫晶体蛋白的专利序列表包括Bt序列SEQ. ID. NO: 33-533。这些序列包括Bt蛋白Cry和Cyt蛋白序
列的实例。实例有很多，本领域的技术人员知道是本公开内容中的序列的合适替代物的各种Bt序列的许多其它实例。
列的实例。实例有很多，本领域的技术人员知道是本公开内容中的序列的合适替代物的各种Bt序列的许多其它实例。
[0464] 第IV节. 杀虫组合物和提高植物产量本发明的活性成分通常以组合物的形式施用，并可与其它化合物一起同时或依次施用
于待处理的作物区或植物。这些化合物可以是化肥、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、去污剂、杀虫皂、休眠油、聚合物和/或在单次施用制剂后允许长期给予目标面积的延时释放或生物可降解载体制剂。它们还可以是选择性除草剂、化学杀虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀阿米巴剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或数种这些制剂的混合物，以及若需要，通常应用于制剂领域的其它农业上可接受的载体、表面活性剂或施用促进辅料。合适的载体和辅料可为固体或液体，相当于通常用于制剂技术的物质，例如天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或化肥。同样，制剂可制成可食用的“诱饵”或制作成害虫“陷阱”以允许杀虫制剂的目标害虫摄食或采食。
于待处理的作物区或植物。这些化合物可以是化肥、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、去污剂、杀虫皂、休眠油、聚合物和/或在单次施用制剂后允许长期给予目标面积的延时释放或生物可降解载体制剂。它们还可以是选择性除草剂、化学杀虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀阿米巴剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或数种这些制剂的混合物，以及若需要，通常应用于制剂领域的其它农业上可接受的载体、表面活性剂或施用促进辅料。合适的载体和辅料可为固体或液体，相当于通常用于制剂技术的物质，例如天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或化肥。同样，制剂可制成可食用的“诱饵”或制作成害虫“陷阱”以允许杀虫制剂的目标害虫摄食或采食。
[0465] 施用本发明的活性成分或含有由本发明的细菌菌株产生的至少一种杀虫蛋白的本发明的农业化学组合物的方法包括叶施用、种子涂覆和土壤施用。施用次数和施用率取决于受相应害虫侵染的强度。
[0466] 组合物可配制成粉末、粉尘、小丸、颗粒、喷雾、乳液、胶体、溶液等，并可通过如下常规方法制备，如包含所述多肽的细胞培养物的干燥、冻干、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩。在所有的含有至少一种所述杀虫多肽的这类组合物中，多肽可以按重量计约1%至约99%的浓度存在。
[0467] 通过本发明的方法，鳞翅类或鞘翅类害虫可被杀死，或在规定区域中的数目可下降，或可预防性施用于环境区域以防止被易受影响的害虫侵染。优选害虫摄食杀虫有效量的多肽或与之接触。所谓“杀虫有效量”意指能够引起至少一种害虫死亡，或明显减缓害虫生长、摄食或正常生理发育的杀虫剂的量。该量将随例如以下因素而改变：待控制的具体目标害虫、待处理的特定环境、场所、植物、作物或农业场所、环境条件及施用杀虫有效的多肽组合物的方法、速率、浓度、稳定性和量。制剂还可根据气候条件、环境考虑和/或施用频率和/或害虫侵染的严重程度而变化。
[0468] 所述杀虫组合物可通过配制细菌细胞、晶体和/或孢子悬液，或分离的蛋白质组分与所需的农业上可接受的载体来制备。可在给予之前以合适的方法(例如冻干、冷冻干燥、干燥)或在水性载体、介质或合适的稀释剂(例如盐水或其它缓冲液)中配制组合物。所配制的组合物可呈粉尘或颗粒材料、或油(植物或矿物)中的混悬液、或水或油/水乳
液、或作为湿粉的形式，或与适于农业应用的任何其它载体材料组合。合适的农业载体可以是固体或液体，并且是本领域众所周知的。术语“农业上可接受的载体”涵盖通常用于杀虫制剂技术的所有辅料、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些为杀虫制剂技术人员所熟知。制剂可与一种或多种固体或液体辅料混合，并通过以下各种方法制备：例如采用常规制剂技术，通过均匀混合、共混和/或研磨杀虫组合物与合适的辅料。合适的制剂和应用方法描述于美国专利号6,468,523，通过引用结合到本文中。
液、或作为湿粉的形式，或与适于农业应用的任何其它载体材料组合。合适的农业载体可以是固体或液体，并且是本领域众所周知的。术语“农业上可接受的载体”涵盖通常用于杀虫制剂技术的所有辅料、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些为杀虫制剂技术人员所熟知。制剂可与一种或多种固体或液体辅料混合，并通过以下各种方法制备：例如采用常规制剂技术，通过均匀混合、共混和/或研磨杀虫组合物与合适的辅料。合适的制剂和应用方法描述于美国专利号6,468,523，通过引用结合到本文中。
[0469] 用于提高植物产量的方法提供了提高植物产量的方法。该方法包括将包含本文公开的杀虫序列的多核苷酸导入
植物或植物细胞中。如本文定义，植物的“产量”是指由植物产生的生物质的质量和/或数量。所谓“生物质”意指任何所测量的植物产物。生物质生产提高是所测量的植物产物产量的任何改进。提高植物产量有若干商业应用。例如，增加植物叶生物质可提高叶菜产量用于人或动物消耗。另外，增加叶生物质可用来增加植物来源的药物或工业产品的产量。产量增加可包括任何统计显著性增加，包括但不限于与不表达杀虫序列的植物相比，产量至少1%增加、至少3%增加、至少5%增加、至少10%增加、至少20%增加、至少30%、至少50%、至少70%、至少100%或更大增加。
植物或植物细胞中。如本文定义，植物的“产量”是指由植物产生的生物质的质量和/或数量。所谓“生物质”意指任何所测量的植物产物。生物质生产提高是所测量的植物产物产量的任何改进。提高植物产量有若干商业应用。例如，增加植物叶生物质可提高叶菜产量用于人或动物消耗。另外，增加叶生物质可用来增加植物来源的药物或工业产品的产量。产量增加可包括任何统计显著性增加，包括但不限于与不表达杀虫序列的植物相比，产量至少1%增加、至少3%增加、至少5%增加、至少10%增加、至少20%增加、至少30%、至少50%、至少70%、至少100%或更大增加。
[0470] 在具体的方法中，由于表达本文公开的杀虫蛋白的植物的害虫抵抗性改进的结果，植物产量增加。杀虫蛋白的表达导致害虫侵染或摄食植物的能力降低，因此提高了植物产量。
[0471] 第V节. 植物转化主要组分ICK基序蛋白和/或TMOF基序蛋白和Bt蛋白的任何组合，都可在PIP中组
合。我们还公开了加入ERSP (内质网信号肽)和翻译稳定性蛋白和间插接头以产生优秀
的PIP (植物结合杀虫剂)，并作生为PEP (植物表达的肽)表达，只要使用最小量的Bt和
ICK基序蛋白两者，优选使用这两种肽与ERSP组合。TMOF基序还可与ICK基序一起使用或
替换ICK基序。这些组合物可产生、用作PEP并作为PIP表达。
合。我们还公开了加入ERSP (内质网信号肽)和翻译稳定性蛋白和间插接头以产生优秀
的PIP (植物结合杀虫剂)，并作生为PEP (植物表达的肽)表达，只要使用最小量的Bt和
ICK基序蛋白两者，优选使用这两种肽与ERSP组合。TMOF基序还可与ICK基序一起使用或
替换ICK基序。这些组合物可产生、用作PEP并作为PIP表达。
[0472] 我们描述了提高植物表达的效能、增加植物表达的蛋白质的蓄积和显著提高植物表达的蛋白质的杀虫活性的方法。我们描述了通过植物中的内质网信号转导蛋白(ERSP)将ICK基序蛋白引导入内质网(ER)中，从而提供肽二硫桥正确的共价交联，这产生了杀虫活性所必需的基本三级ICK基序结构。我们还描述了通过植物中的ERSP将ICK基序蛋白
引导入ER中，其添加有翻译稳定性蛋白结构域，从而增加所得ICK融合蛋白的大小，促进肽在植物中蓄积。我们还描述了通过植物中的ERSP将ICK基序蛋白引导入ER中，其添加有
上述翻译稳定性蛋白和添加有间插肽序列，所述间插肽序列允许具有杀虫活性的活性形式的ICK基序蛋白的可能切割和回收。
引导入ER中，其添加有翻译稳定性蛋白结构域，从而增加所得ICK融合蛋白的大小，促进肽在植物中蓄积。我们还描述了通过植物中的ERSP将ICK基序蛋白引导入ER中，其添加有
上述翻译稳定性蛋白和添加有间插肽序列，所述间插肽序列允许具有杀虫活性的活性形式的ICK基序蛋白的可能切割和回收。
[0473] 本发明描述了植物表达的并可成功保护植物或作物免遭虫害的具有杀虫活性的ICK基序蛋白。本文教导的方法将使肽不仅能够在植物中表达，并且还能够正确表达并折叠，使得它们甚至在植物中表达后仍保持其杀虫活性。
[0474] 我们描述了如何必须修饰目标肽(例如ICK基序肽)的可读框(ORF)以在植物表达ICK基序肽后保持所需的生物活性。在一个实施方案中，我们描述了表达活性杀虫蛋白的植物结合杀虫剂或PIP。PIP杀虫蛋白包含与富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)或抑制物胱
氨酸结(ICK)基序蛋白有效连接的内质网信号肽(ERSP)，其中ERSP是所连接的ERSP+ICK
基序蛋白的N端。然后将PIP杀虫蛋白掺入所选植物中以赋予植物昆虫抗性。植物细胞
表达并蓄积正确折叠的ICK基序杀虫蛋白。当昆虫采食植物细胞时，正确折叠的ICK基序
杀虫蛋白将递送到昆虫中，在其中它具有杀虫活性，引起昆虫减慢或停止其摄食，减慢其运动，并减慢或停止繁殖，所有这些都对植物提供免遭虫害的保护。
氨酸结(ICK)基序蛋白有效连接的内质网信号肽(ERSP)，其中ERSP是所连接的ERSP+ICK
基序蛋白的N端。然后将PIP杀虫蛋白掺入所选植物中以赋予植物昆虫抗性。植物细胞
表达并蓄积正确折叠的ICK基序杀虫蛋白。当昆虫采食植物细胞时，正确折叠的ICK基序
杀虫蛋白将递送到昆虫中，在其中它具有杀虫活性，引起昆虫减慢或停止其摄食，减慢其运动，并减慢或停止繁殖，所有这些都对植物提供免遭虫害的保护。
[0475] 我们描述了表达各种植物表达盒的瞬时表达系统。我们使用的一种表达的转基因是绿色荧光蛋白或GFP，当被紫外线激发时，它是目测可检测的。我们用于评价植物转基因蛋白的GFP瞬时表达系统是用于所有实用目的——相当于将稳定的转基因植物系统用于这些类型的评价。
[0476] 、ICK、TMOF、海葵基序可与ERSP连接。
[0477] 对于当在转基因植物中表达时是正确折叠的ICK基序杀虫蛋白，它必须具有与ICK基序杀虫蛋白融合在框中的ERSP。这也可用TMOF基序进行。这可以数种方式完成。
参见图1、2和3。蛋白质应经由ER途径，在其中形成正确的共价键连接以形成适当的二硫键。虽不希望受理论的约束，但我们认为ER路径导致正确的ICK基序蛋白三级结构。通常假设该路径通过称为信号识别颗粒的细胞组分实现：信号识别颗粒与翻译蛋白质的核糖体结合，它暂停翻译，并将核糖体/mRNA复合物转运到ER上的易位子孔，在此处核糖体然后继续翻译并使所得蛋白质穿过进入ER。在ER内，ERSP被切割，蛋白质在ER中通过翻译后修
饰过程而起作用。这个过程牵涉蛋白质二硫键异构酶(催化二硫键形成的一类蛋白质)。
在没有任何其它保留蛋白质信号的情况下，蛋白质通过ER转运到高尔基体，最后在高尔基体中分泌到质膜外，进入质外体空间。虽不希望受理论的约束，但我们认为具有ICK基序的蛋白质(例如杀虫蛋白)，必须经由ER路径，以便如果蛋白质在植物中表达，蛋白质就具有正确的二硫键形成。
参见图1、2和3。蛋白质应经由ER途径，在其中形成正确的共价键连接以形成适当的二硫键。虽不希望受理论的约束，但我们认为ER路径导致正确的ICK基序蛋白三级结构。通常假设该路径通过称为信号识别颗粒的细胞组分实现：信号识别颗粒与翻译蛋白质的核糖体结合，它暂停翻译，并将核糖体/mRNA复合物转运到ER上的易位子孔，在此处核糖体然后继续翻译并使所得蛋白质穿过进入ER。在ER内，ERSP被切割，蛋白质在ER中通过翻译后修
饰过程而起作用。这个过程牵涉蛋白质二硫键异构酶(催化二硫键形成的一类蛋白质)。
在没有任何其它保留蛋白质信号的情况下，蛋白质通过ER转运到高尔基体，最后在高尔基体中分泌到质膜外，进入质外体空间。虽不希望受理论的约束，但我们认为具有ICK基序的蛋白质(例如杀虫蛋白)，必须经由ER路径，以便如果蛋白质在植物中表达，蛋白质就具有正确的二硫键形成。
[0478] 内质网信号转导蛋白)。
[0479] 除下文以外，参见第I-1部分(PEPs的EERSP或ersp的组分)。
[0480] ERSP是ERSP+ICK基序蛋白复合物的N端区，ERSP部分由大约3-60个氨基酸组成。在一些实施方案，为5-50个氨基酸。在一些实施方案，为10-40个氨基酸，但最通常由
15-20、20-25或25-30个氨基酸组成。ERSP是所谓的信号肽，因为它指导蛋白质转运。信号肽也可称为引导信号、信号序列、转运肽或定位信号。用于ER引导的信号肽长度常常为
15-30个氨基酸残基，具有由两侧接带正电荷的氨基端和极性但不带电荷的羧基端区的疏水残基核心组成的三联组构。参见：Zimmermann, Richard; Eyrisch, Susanne; Ahmad, Mazen和Helms, Volkhard: “Protein translocation across the ER membrane Elsevier (蛋白质跨ER膜的易位)” Biochimica et Biohysica Acta 1808 (2011) 912-924,
Elsevier。
15-20、20-25或25-30个氨基酸组成。ERSP是所谓的信号肽，因为它指导蛋白质转运。信号肽也可称为引导信号、信号序列、转运肽或定位信号。用于ER引导的信号肽长度常常为
15-30个氨基酸残基，具有由两侧接带正电荷的氨基端和极性但不带电荷的羧基端区的疏水残基核心组成的三联组构。参见：Zimmermann, Richard; Eyrisch, Susanne; Ahmad, Mazen和Helms, Volkhard: “Protein translocation across the ER membrane Elsevier (蛋白质跨ER膜的易位)” Biochimica et Biohysica Acta 1808 (2011) 912-924,
Elsevier。
[0481] ERSP的大约一半并且常常更多通常由疏水氨基酸组成，但是ERSP中疏水氨基酸的百分比可以改变。不希望受本发明如何运作的任何理论束缚，我们认为疏水氨基酸在翻译后粘附在ER膜上，这使得信号肽肽酶将ERSP从翻译蛋白质上切下，释放ICK基序蛋白进入ER。许多ERSP是已知的。许多植物ERSP是已知的。ERSP来源于植物ERSP不是必须的，
非植物ERSP可按本文所述方法运作。然而许多植物ERSP是众所周知的，我们在此描述了
一些植物来源的ERSP。例如，BAAS来源于植物大麦(Hordeum vulgare)。
非植物ERSP可按本文所述方法运作。然而许多植物ERSP是众所周知的，我们在此描述了
一些植物来源的ERSP。例如，BAAS来源于植物大麦(Hordeum vulgare)。
[0482] 在此使用的ERSP的一个实例是BAAS，BAAS的序列为MANKH LSLSL FLVLL GLSASLASG (SEQ ID NO: 1035——一字母代码)。
[0483] 该肽，名为“BAAS”在蛋白质翻译进入ER时从ICK基序上切割。分子量为2442.94道尔顿。图1-3表示与ERSP连接的ICK基序蛋白的示图。这些图同样可表示与ERSP连接的TMOF基序蛋白。
[0484] 植物ERSP (其选自已知表达并释放进入植物质外体空间的蛋白质的基因组序列)和几个实例为BAAS、胡萝卜伸展蛋白、烟草PR1。下列参考文献提供更多描述，并通过引用以其整体结合到本文中。De Loose, M.等, “The extensin signal peptide allows secretion of a heterologous protein from protoplasts (伸展蛋白信号肽允许异源
蛋白质从原生质体中分泌)” Gene, 99 (1991) 95-100。De Loose，M.等描述了来自皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)的伸展蛋白编码基因的结构分析，其序列含有用于蛋白质易位到内质网的典型信号肽。Chen, M.H.等“Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids and extracellular
compartments of plant cells (稻α淀粉酶和货物蛋白质的信号肽依赖性引导至植物细胞的质体和胞外区室)” Plant Physiology, 2004年7月; 135(3): 1367-77. 电子出版
物2004年7月2日。Chen，M.H.等人通过分析转基因烟草中在有或没有其信号肽的情况
下α-淀粉酶的表达，研究植物细胞中α-淀粉酶的亚细胞定位。这些参考文献和其它文
献教导和公开了可用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的翻译稳定性蛋白。
蛋白质从原生质体中分泌)” Gene, 99 (1991) 95-100。De Loose，M.等描述了来自皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)的伸展蛋白编码基因的结构分析，其序列含有用于蛋白质易位到内质网的典型信号肽。Chen, M.H.等“Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids and extracellular
compartments of plant cells (稻α淀粉酶和货物蛋白质的信号肽依赖性引导至植物细胞的质体和胞外区室)” Plant Physiology, 2004年7月; 135(3): 1367-77. 电子出版
物2004年7月2日。Chen，M.H.等人通过分析转基因烟草中在有或没有其信号肽的情况
下α-淀粉酶的表达，研究植物细胞中α-淀粉酶的亚细胞定位。这些参考文献和其它文
献教导和公开了可用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的翻译稳定性蛋白。
[0485] 翻译稳定性蛋白。
[0486] 除下文以外，参见第I-III部分(翻译稳定性蛋白组分，STA或sta)。
[0487] 上述程序涉及提供ERSP + CRIP (其中ERSP + CRIP可以是ERSP + ICK、ERSP +非ICK、ERSP + Av (SEA ANOMONE))，或程序可涉及ERSP + TMOF，或可涉及ERSP + CRIP和TMOF，它们足以使植物产生正确折叠的肽。我们还表明为了更全面地保护植物免遭某些昆虫，有时不仅仅需要正确折叠。用正确构建的表达盒，植物可经诱导以产生并蓄积甚至更大量的毒肽。当植物蓄积更大量的正确折叠的毒性CRIP或TMOF肽时，可更容易地对抗或杀
死攻击和摄食植物的昆虫。提高PIP的杀虫活性的一种方式是具有翻译稳定性蛋白。翻译稳定性蛋白可用来显著提高毒肽在植物中的蓄积，因此提高PIP的效能(尤其当PIP具有
其自身的翻译稳定性蛋白时)。本文所述程序可提供大量的当时正确折叠的转基因植物蛋白质在植物中蓄积。相对于没有翻译稳定性蛋白的系统，表达ICK基序杀虫蛋白和翻译稳定性蛋白两者的转基因植物显示毒性ICK肽的蓄积显著改进。本文描述了具有翻译稳定性蛋白的代表性PIP。
死攻击和摄食植物的昆虫。提高PIP的杀虫活性的一种方式是具有翻译稳定性蛋白。翻译稳定性蛋白可用来显著提高毒肽在植物中的蓄积，因此提高PIP的效能(尤其当PIP具有
其自身的翻译稳定性蛋白时)。本文所述程序可提供大量的当时正确折叠的转基因植物蛋白质在植物中蓄积。相对于没有翻译稳定性蛋白的系统，表达ICK基序杀虫蛋白和翻译稳定性蛋白两者的转基因植物显示毒性ICK肽的蓄积显著改进。本文描述了具有翻译稳定性蛋白的代表性PIP。
[0488] 比较植物表达的含和不含翻译稳定性蛋白两种的肽的实验显示显著差异。不含翻译稳定性蛋白的ICK基序蛋白的蛋白质表达可极低。当翻译稳定性蛋白与ICK基序蛋白融合时，具有较高水平的可检测蓄积。翻译稳定性蛋白可为另一种蛋白质的结构域或可包含完整的蛋白质序列。翻译稳定性蛋白是一种具有充足三级结构的蛋白质，它可在细胞中蓄积而又不会成为蛋白质降解的细胞过程的目标。蛋白质可介于5和50aa之间(例如另一
种ICK基序蛋白)、50-250aa (GNA)、250-750aa (例如几丁质酶)和750-1500aa (例如增
强蛋白)。
种ICK基序蛋白)、50-250aa (GNA)、250-750aa (例如几丁质酶)和750-1500aa (例如增
强蛋白)。
[0489] 翻译稳定性蛋白(或蛋白质结构域)可含有除翻译稳定以外没有有用特性的蛋白质，或它们可具有除翻译稳定以外的其它有用特性。翻译稳定性蛋白的一个实施方案可以是串联的多个ICK基序蛋白。有用特性可包括：另外的杀虫活性，例如对围食膜是破坏性的活性，对肠壁是破坏性的活性，和/或主动将ICK基序蛋白跨过肠壁转运的活性。翻译稳定性蛋白的一个实施方案可以是包括ICK基序蛋白的融合蛋白的聚合物。翻译稳定性蛋白的一个实施方案可以是包括TMOF基序蛋白的融合蛋白的聚合物。本文提供翻译稳定性蛋
白的一个具体实例以说明翻译稳定性蛋白的用途。该实例无意以任何方式限制本公开内容或权利要求书。有用的翻译稳定性蛋白是本领域众所周知的，可以使用这种类型的任何蛋白质，如本文所公开。评价和测试肽的产生的程序均是本领域已知的，并且在本文中予以描述。一种翻译稳定性蛋白的一个实例是SEQ ID NO:1036，一字母代码，如下：
SEQ ID NO: 1036 (一字母代码)。
白的一个具体实例以说明翻译稳定性蛋白的用途。该实例无意以任何方式限制本公开内容或权利要求书。有用的翻译稳定性蛋白是本领域众所周知的，可以使用这种类型的任何蛋白质，如本文所公开。评价和测试肽的产生的程序均是本领域已知的，并且在本文中予以描述。一种翻译稳定性蛋白的一个实例是SEQ ID NO:1036，一字母代码，如下：
SEQ ID NO: 1036 (一字母代码)。
[0490] ASKGE ELFTG VVPIL VELDG DVNGH KFSVS GEG例如DATYG KLTLK FICTTGKLPV PWPTL VTTFS YGVQC FSRYP DHMKR HDFFK SAMPE GYVQE RTISF
KDDGN YKTRA EVKFE GDTLV NRIEL KGIDF KEDGN ILGHK LEYNY NSHNV
YITAD KQKNG IKANF KIRHN IEDGS VQLAD HYQQN TPIGD GPVLL PDNHY
LSTQS ALSKD PNEKR DHMVL LEFVT AAGIT HGMDE LYK
SEQ. ID No. 1036名为“GFP”。分子量为26736.02道尔顿。
KDDGN YKTRA EVKFE GDTLV NRIEL KGIDF KEDGN ILGHK LEYNY NSHNV
YITAD KQKNG IKANF KIRHN IEDGS VQLAD HYQQN TPIGD GPVLL PDNHY
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SEQ. ID No. 1036名为“GFP”。分子量为26736.02道尔顿。
[0491] 翻译稳定性蛋白的其它实例蛋白质可见于下列参考文献，通过引用以其整体予以结合：Kramer, K.J.等. “Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta (编码Manduca sexta 表皮和肠几丁质酶的基因的cDNA序列和表达)” Insect Biochemistry and Molecular Biology,
第23卷, 第6期, 1993年9月, 第691-701页。Kramer，K.J.等人从烟草天蛾幼虫
(Manduca sexta)中分离出几丁质酶编码cDNA并测序。Hashimoto, Y.等. “Location
and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the Trichoplusia ni granulosis virus (编码粉纹夜蛾颗粒体病病毒的病毒增强因子的基
因的定位和核苷酸序列)” Journal of General Virology, (1991), 72, 2645-2651。
Hashimoto，Y.等人克隆了编码粉纹夜蛾颗粒体病病毒的病毒增强因子的基因并测定
了完整的核苷酸序列。Van Damme, E.J.M.等. “Biosynthesis, primary structure
and molecular cloning of snowdrop (Galanthus nivalis L.) lectin ( 雪 花 莲
(Galanthus nivalis L.)凝集素的生物合成、一级结构和分子克隆)” European Journal of Biochemistry, 202, 23-30 (1991)。Van Damme，E.J.M.等人从成熟子房中分离出雪花莲凝集素的富含Poly(A)的RNA，当在无麦胚细胞系统中翻译时产生单一的17-kDa凝集
素多肽。这些参考文献和其它文献教导和公开了可用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的翻译稳定性蛋白。
第23卷, 第6期, 1993年9月, 第691-701页。Kramer，K.J.等人从烟草天蛾幼虫
(Manduca sexta)中分离出几丁质酶编码cDNA并测序。Hashimoto, Y.等. “Location
and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the Trichoplusia ni granulosis virus (编码粉纹夜蛾颗粒体病病毒的病毒增强因子的基
因的定位和核苷酸序列)” Journal of General Virology, (1991), 72, 2645-2651。
Hashimoto，Y.等人克隆了编码粉纹夜蛾颗粒体病病毒的病毒增强因子的基因并测定
了完整的核苷酸序列。Van Damme, E.J.M.等. “Biosynthesis, primary structure
and molecular cloning of snowdrop (Galanthus nivalis L.) lectin ( 雪 花 莲
(Galanthus nivalis L.)凝集素的生物合成、一级结构和分子克隆)” European Journal of Biochemistry, 202, 23-30 (1991)。Van Damme，E.J.M.等人从成熟子房中分离出雪花莲凝集素的富含Poly(A)的RNA，当在无麦胚细胞系统中翻译时产生单一的17-kDa凝集
素多肽。这些参考文献和其它文献教导和公开了可用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的翻译稳定性蛋白。
[0492] 间插接头除下文以外，参见第I-1V部分(间插接头肽组分、LINKER、接头、L；或如果是多核苷酸，PEPs的接头或l)。
[0493] 本发明还在ICK基序蛋白和翻译稳定性蛋白之间掺入了间插接头。间插接头为1-30个氨基酸。它可以没有切割位点或可具有对丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶有特异性的蛋白酶切割位点。可切割接头可以是被存在于鳞翅类肠环境和/或鳞翅类血淋巴环境中的蛋白酶消化的位点。下面列举了说明本发明的其它组分的实例，但是不限于该实例。
[0494] 间插接头的实例为IGER (SEQ ID NO: 1037)名为“IGER”，该间插接头的分子量为473.53道尔顿。
[0495] 间插接头的其它实例可见于下列参考文献，其通过引用以其整体予以结合：在Chang, H.C.等. “De novo folding of GFP fusion proteins: high efficiency in
eukaryotes but not in bacteria (GFP融合蛋白的从头折叠：在真核生物但非在细菌中的高效率)” Journal of Molecular Biology, 2005年10月21日; 353(2): 397-409
中，探索了绿色荧光蛋白通过6种不同接头的折叠行为的比较。Daskalova, S.M.等人
“Engineering of N. benthamiana L. plants for production of N-acetylgalactosamine-glycosylated proteins (用于产生N-乙酰半乳糖胺糖基化蛋白质的N. benthamiana L.植物的工程改造)” BMC Biotechnology, 2010年8月24日; 10: 62表明人GalNAc-Ts
家族的同种型GalNAc-T2在N. benthamiana植物中表达时保持其定位和功能性。在Kwok, E.Y.等.“GFP-labelled Rubisco and aspartate aminotransferase are present in
plastid stromules and traffic between plastids (GFP标记的核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶和天冬氨酸氨基转移酶存在于质体基质填充小管中并在质体间运输)” Journal of Experimental Botany, 2004年3月; 55(397): 595-604. 电子出版物2004年1月30日
中，表明了内源质体蛋白质通过基质填充小管移动的能力。Borovsky, D.等人“Expression of Aedes trypsin-modulating oostatic factor on the virion of TMV: A potential larvicide (TMV病毒体中伊蚊胰蛋白酶-调节抑卵因子的表达：潜在的杀幼虫剂)” Proc Natl Acad Sci, 2006年12月12日; 103(50): 18963–18968提交了有关用蚊十肽激素
胰蛋白酶-调节抑卵因子(TMOF)对烟草花叶病毒(TMV)病毒体表面的工程改造的报告。这
些参考文献和其它文献教导和公开了可用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的翻译稳定性蛋白。
eukaryotes but not in bacteria (GFP融合蛋白的从头折叠：在真核生物但非在细菌中的高效率)” Journal of Molecular Biology, 2005年10月21日; 353(2): 397-409
中，探索了绿色荧光蛋白通过6种不同接头的折叠行为的比较。Daskalova, S.M.等人
“Engineering of N. benthamiana L. plants for production of N-acetylgalactosamine-glycosylated proteins (用于产生N-乙酰半乳糖胺糖基化蛋白质的N. benthamiana L.植物的工程改造)” BMC Biotechnology, 2010年8月24日; 10: 62表明人GalNAc-Ts
家族的同种型GalNAc-T2在N. benthamiana植物中表达时保持其定位和功能性。在Kwok, E.Y.等.“GFP-labelled Rubisco and aspartate aminotransferase are present in
plastid stromules and traffic between plastids (GFP标记的核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶和天冬氨酸氨基转移酶存在于质体基质填充小管中并在质体间运输)” Journal of Experimental Botany, 2004年3月; 55(397): 595-604. 电子出版物2004年1月30日
中，表明了内源质体蛋白质通过基质填充小管移动的能力。Borovsky, D.等人“Expression of Aedes trypsin-modulating oostatic factor on the virion of TMV: A potential larvicide (TMV病毒体中伊蚊胰蛋白酶-调节抑卵因子的表达：潜在的杀幼虫剂)” Proc Natl Acad Sci, 2006年12月12日; 103(50): 18963–18968提交了有关用蚊十肽激素
胰蛋白酶-调节抑卵因子(TMOF)对烟草花叶病毒(TMV)病毒体表面的工程改造的报告。这
些参考文献和其它文献教导和公开了可用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的翻译稳定性蛋白。
[0496] 其它植物转化更为众所周知。
[0497] 本发明的方法包括将核苷酸构建体导入植物中。所谓“导入”意指向植物提供核苷酸构建体，其方式为使得该构建体进入植物细胞内部。本发明的方法不需要使用将核苷酸构建体导入植物的特定方法，只需要核苷酸构建体进入植物的至少一个细胞内部。用于将核苷酸构建体导入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
[0498] 所谓“植物”意指完整植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其子代。植物细胞可以是分化或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。
[0499] “转基因植物”或“转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指外源核酸序列或DNA片段已被掺入或整合至植物细胞中的植物。这些核酸序列包括是外源的，或不存在于非转化的植物细胞中的核酸序列，以及可以是内源的，或存在于非转化的植物细胞中的核酸序列。“异源”一般是指对它们存在于其中的天然基因组的细胞或部分而言不是内源的，且已通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微轰击(microprojection)等加入细胞的核酸序列。
[0500] 植物细胞的转化可通过本领域已知的几种技术之一实现。可对本发明的Bt蛋白基因进行修饰以获得或提高在植物细胞中的表达。通常表达所述蛋白质的构建体含有驱动基因转录的启动子，以及使转录终止和多腺苷酸化的3'非翻译区。所述构建体的组构是本领域众所周知的。在某些情况下，它可用来改造基因，使得所得肽分泌，或以其它方式引导入植物细胞内。例如，可对基因进行改造以含有促进肽转运至内质网的信号肽。还可优选对植物表达盒进行改造以含有内含子，使得内含子的mRNA加工是表达所必须的。
[0501] 通常可将该“植物表达盒”插入“植物转化载体”中。该植物转化载体可由实现植物转化所需的一个或多个DNA载体组成。例如，本领域的习惯作法是利用由超过一个的邻接DNA区段组成的植物转化载体。这些载体在本领域常被称为“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现有效转化所需的DNA区段的大小和复杂性相当大，并且有利的是将功能分隔在单独的DNA分子中。二元载体通常含有质粒载体，所述载体含有T-DNA转运所必需的顺式作用序列(例如左边界和右边界)、经工程改造能够在植物细胞中表达的选择标记和“目标基因”(经改造能够在需要产生转基因植物的植物细胞中表达的基因)。还存在于该质粒载体中的为细菌复制所必需的序列。顺式作用序列以允许有效转运至植物细胞中并在其中表达的方式排列。例如，选择标记基因和Bt蛋白位于左边界与右边界之间。第二质粒载体常常含有介导T-DNA从农杆菌转运至植物细胞的反式作用因子。该质粒常常含有毒力功能(Vir基因)，其允许植物细胞被农杆菌感染，及DNA通过在边界序列处切割而转运和vir介导的DNA转运，如本领域所了解的一样(Hellens和Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451)。几种类型的
农杆菌属菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物转化。对于通过其它方法(例如显微轰击、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等)转化植物，第二质粒载体不是必需的。
农杆菌属菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物转化。对于通过其它方法(例如显微轰击、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等)转化植物，第二质粒载体不是必需的。
[0502] 总的来说，植物转化方法包括将异源DNA转移至目标植物细胞(例如未成熟或成熟胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)中，接着应用合适选择的最大阈值水平(取决于选择标记基因)以从一群未转化的细胞团块中回收转化的植物细胞。通常将
外植块转移到新配的相同培养基中，并按常规培养。随后，在放入补充最大阈值水平的选择剂的再生培养基中后，转化的细胞分化成苗。然后将苗转移到选择生根培养基中以回收带根苗或小植物。然后使转基因小植物生长成为成熟植物，并产生能育种子(例如Hiei
等 (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida等(1996) Nature Biotechnology
14:745-750)。通常将外植块转移到新配制的相同培养基中，并按常规培养。用于产生转基因植物的技术和方法的一般说明见Ayres和Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239及Bommineni和Jauhar (1997) Maydica 42:107-120。由于转化的
材料含有许多细胞，因此转化和非转化的细胞两者存在于任一块所述目标愈伤组织或组织或细胞群中。杀死非转化的细胞并允许转化的细胞增殖的能力产生转化的植物培养物。除去非转化细胞的能力常常限制转化植物细胞的快速回收和转基因植物的成功产生。
外植块转移到新配的相同培养基中，并按常规培养。随后，在放入补充最大阈值水平的选择剂的再生培养基中后，转化的细胞分化成苗。然后将苗转移到选择生根培养基中以回收带根苗或小植物。然后使转基因小植物生长成为成熟植物，并产生能育种子(例如Hiei
等 (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida等(1996) Nature Biotechnology
14:745-750)。通常将外植块转移到新配制的相同培养基中，并按常规培养。用于产生转基因植物的技术和方法的一般说明见Ayres和Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239及Bommineni和Jauhar (1997) Maydica 42:107-120。由于转化的
材料含有许多细胞，因此转化和非转化的细胞两者存在于任一块所述目标愈伤组织或组织或细胞群中。杀死非转化的细胞并允许转化的细胞增殖的能力产生转化的植物培养物。除去非转化细胞的能力常常限制转化植物细胞的快速回收和转基因植物的成功产生。
[0503] 转化方案以及将核苷酸序列导入植物中的方案可随植物或植物细胞的类型(即，转化目标的单子叶植物或双子叶植物)而变化。转基因植物的产生可通过几种方法之一进行，包括但不限于显微注射、电穿孔、直接基因转运、通过农杆菌将异源DNA导入植物细胞(农杆菌介导的转化)、植物细胞用粘附在粒子上的异源外源DNA轰击、射弹粒子加速
(ballistic particle acceleration)、气溶胶束转化(美国公开申请号20010026941、美国专利号4,945,050、国际公开申请号WO 91/00915、美国公开申请号2002015066)、Lec1转化和转运DNA的各种其它非粒子直接介导方法。
(ballistic particle acceleration)、气溶胶束转化(美国公开申请号20010026941、美国专利号4,945,050、国际公开申请号WO 91/00915、美国公开申请号2002015066)、Lec1转化和转运DNA的各种其它非粒子直接介导方法。
[0504] 用于叶绿体转化的方法是本领域已知的。参见例如Svab等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530；Svab和Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:913-917；Svab和Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606。该方法依赖于基因枪递送含有选择标记的DNA，并使DNA通过同源重组引导入质体基因组中。另外，质体转化可通过核编码的和质体指导的RNA聚合酶的组织优选表达，经由沉默的携带质体的转基因的反式激活来实现。McBride等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305报告了所述系统。
[0505] 在异源外源DNA整合入植物细胞后，然后在培养基中应用最大阈值水平的合适选择以杀死未转化的细胞，通过定期转移至新的培养基，分离出经过这种选择处理仍存活的推定的转化细胞，并使之增殖。通过连续传代并用合适的选择攻击，鉴定出用质粒载体转化的细胞并使之增殖。然后可利用分子和生物化学方法以证实整合到转基因植物基因组中的异源目标基因的存在。
[0506] 按照常规方法，已转化的细胞可生长成植物。参见例如McCormick等(1986) Plant Cell Reports 5:81-84。这些植物然后可生长，并用相同的转化品系或不同的品系授粉，鉴定具有所需表型特征的组成型表达的所得杂种。可生长两代或更多代以确保稳定地保持并遗传所需表型特征的表达，然后收获种子以确保已实现所需表型特征的表达。以这种方式，本发明提供具有稳定掺入其基因组的本发明的核苷酸构建体(例如本发明的表达盒)的转化种子(亦称为“转基因种子”)。
[0507] 植物中的ICK和TMOF表达。
[0508] 如上所述，有许多可用于ERSP、ICK基序蛋白、TMOF基序、翻译稳定性蛋白和间插接头的组分的备选方案。
[0509] 植物转化的评价在将异源外源DNA导入植物细胞中后，通过各种方法，例如与整合基因有关的核酸、蛋
白质和代谢物的分析，证实异源基因转化或整合到植物基因组中。
白质和代谢物的分析，证实异源基因转化或整合到植物基因组中。
[0510] PCR分析是在移栽到土壤中之前的较早阶段针对整合基因的存在筛选转化的细胞、组织或苗的快速方法(Sambrook和Russell (2001) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y.)。PCR使用对目标基因或农杆菌载体背景等有特异性的寡核苷酸引物进行。
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y.)。PCR使用对目标基因或农杆菌载体背景等有特异性的寡核苷酸引物进行。
[0511] 植物转化可通过基因组DNA的DNA印迹法分析证实(Sambrook和Russell，2001，同上)。总的来说，从转化体中提取总DNA，用合适的限制性内切酶消化，在琼脂糖凝胶中分级分离，并转移至硝化纤维或尼龙膜上。然后按照标准技术(Sambrook和Russell，2001，同
32
上)，将膜或“印迹”用例如放射性标记的 P目标DNA片段探测以证实导入的基因整合到植物基因组。
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上)，将膜或“印迹”用例如放射性标记的 P目标DNA片段探测以证实导入的基因整合到植物基因组。
[0512] 在RNA印迹法分析中，按照本领域常规使用的标准程序(Sambrook和Russell，2001，同上)，将RNA自转化体的特定组织中分离，在甲醛琼脂糖凝胶中分级分离，转印到尼龙滤膜上。通过本领域已知方法(Sambrook和Russell，2001，同上)，然后通过使滤膜与来源于Bt蛋白的放射性探针杂交，来测定由Bt蛋白编码的RNA的表达。
[0513] 可通过标准程序(Sambrook和Russell，2001，同上)，使用与存在于Bt蛋白上的一个或多个表位结合的抗体，对转基因植物进行蛋白质印迹、生物化学测定法等以证实由Bt蛋白基因编码的蛋白质的存在。
[0514] 植物中的杀虫活性在本发明的另一个方面，可产生表达具有杀虫活性的Bt蛋白的转基因植物。上文通
过实例描述的方法可用来产生转基因植物，但是其中转基因植物细胞产生的方式对本发明不是关键的。可采用本领域已知或描述的方法，例如农杆菌介导的转化、生物射弹转化和非粒子介导的方法。表达Bt蛋白的植物可通过本领域描述的普通方法分离，例如通过转化愈伤组织、选择转化的愈伤组织和从所述转基因愈伤组织再生能育植物。在该处置方法中，可使用任何基因作为选择标志物，只要其植物细胞中的表达赋予鉴定或选择转化的细胞的能力。
过实例描述的方法可用来产生转基因植物，但是其中转基因植物细胞产生的方式对本发明不是关键的。可采用本领域已知或描述的方法，例如农杆菌介导的转化、生物射弹转化和非粒子介导的方法。表达Bt蛋白的植物可通过本领域描述的普通方法分离，例如通过转化愈伤组织、选择转化的愈伤组织和从所述转基因愈伤组织再生能育植物。在该处置方法中，可使用任何基因作为选择标志物，只要其植物细胞中的表达赋予鉴定或选择转化的细胞的能力。
[0515] 已开发了与植物细胞一起使用的许多标志物，例如氯霉素、氨基糖苷G418、潮霉素抗性等。编码参与叶绿体代谢的产物的其它基因也可用作选择标记。例如，提供植物除草剂(例如草甘膦、溴草腈或咪唑啉酮)抗性的基因可能特别有用。已报告了所述基因(Stalker等(1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (溴草腈抗性腈水解酶基因)；以及Sathasivan等(1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (AHAS咪唑啉酮抗性基因)。另外，本文公开的基因可用作标志物以评价细菌或植物细胞的转化。检测植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚或其子代中转基因的存在的方法是本领域众所周知的。在一个实施方案中，通过测试杀虫活性检测转基因的存在。
[0516] 可测试表达Bt蛋白的能育植物的杀虫活性，选出显示最佳活性的植物用于进一步培育。本领域可获得测定害虫活性的方法。总的来讲，将蛋白质混合，并用于摄食测定法中。参见例如Marrone等(1985) J. of Economic Entomology 78:290-293。
[0517] 第VI节. CRIP和Bt蛋白组合的描述和实例当Bt和ICK肽适当递送到昆虫栖息场所时，该毒素的组合可抑制生长、损害运动或甚
至杀死昆虫。SDP 1234604、1234605和609是杂合+2-ACTX-Hv1a肽(此为“Hv1a肽”)的
喷雾干燥粉末制品。喷雾干燥的Hv1a肽粉由肽、各种赋形剂和发酵副产物制成。‘604和‘605制剂使用相同的肽，只是赋形剂不同。在‘604和‘605粉末中定量测定活性杂合肽的浓度均为约26% (重量/重量)。609粉末中，定量测定活性杂合肽的浓度为约35% (重量
/重量)。采用本领域技术人员已知的C18 rpHPLC方法，定量测定各种粉末中的Hv1a肽。
至杀死昆虫。SDP 1234604、1234605和609是杂合+2-ACTX-Hv1a肽(此为“Hv1a肽”)的
喷雾干燥粉末制品。喷雾干燥的Hv1a肽粉由肽、各种赋形剂和发酵副产物制成。‘604和‘605制剂使用相同的肽，只是赋形剂不同。在‘604和‘605粉末中定量测定活性杂合肽的浓度均为约26% (重量/重量)。609粉末中，定量测定活性杂合肽的浓度为约35% (重量
/重量)。采用本领域技术人员已知的C18 rpHPLC方法，定量测定各种粉末中的Hv1a肽。
[0518] 抑制性半胱氨酸结或ICK肽当暴露于环境中时可具有显著的稳定性。许多ICK肽分离自分泌毒液的动物，例如蜘蛛、蝎和蛇。Bt蛋白因为其特殊的杀虫活性而广为人知。出乎意料的是，我们发现，当Bt蛋白与ICK肽选择性地混合时，Bt和ICK肽的组合产生高效
杀虫剂，其效力远大于预期。
杀虫剂，其效力远大于预期。
[0519] 我们描述了包含Bt (苏云金芽孢杆菌)蛋白和杀虫ICK (抑制物胱氨酸结)肽两者的杀虫组合肽组合物。以干重基础计，组合物Bt与ICK的比率可为大约下列比率的
任一个或全部：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、
45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99或这些值的任两个的任何组合。我们还描述了其中以干重基础计，Bt与ICK的比率选自大致下列比率：0:50、
45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和
0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合的组合物。
任一个或全部：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、
45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99或这些值的任两个的任何组合。我们还描述了其中以干重基础计，Bt与ICK的比率选自大致下列比率：0:50、
45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和
0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合的组合物。
[0520] 本文所述程序可应用于任何PFIP或CRIP肽。PFIP和CRIP肽的组合包括PFIP和CRIP肽的任一种或两种，它们来源于PFIP和CRIP肽的任一种或两种的一种以上的不同类
型或细菌菌株来源。所谓细菌菌株来源，我们是指肽可描述为由表达所述肽的细菌菌株表达，应理解就它们不再全部由细菌菌株生产的意义而言，包括许多Bt蛋白的许多PFIP肽也是人工的。
型或细菌菌株来源。所谓细菌菌株来源，我们是指肽可描述为由表达所述肽的细菌菌株表达，应理解就它们不再全部由细菌菌株生产的意义而言，包括许多Bt蛋白的许多PFIP肽也是人工的。
[0521] 在另一个实施方案中，PFIP和CRIP肽的组合包括与ICK、非ICK和TMOF肽组合PFIP (例如Bt)的任一种或两种，其来源于Bt和ICK肽的任一种或两种的一种以上的不同
类型或细菌菌株来源。所谓细菌菌株来源，我们是指肽可描述为通过表达所述肽的细菌菌株表达，应理解就它们不再全都由细菌菌株生产意义而言，许多Bt蛋白也是人工的。
类型或细菌菌株来源。所谓细菌菌株来源，我们是指肽可描述为通过表达所述肽的细菌菌株表达，应理解就它们不再全都由细菌菌株生产意义而言，许多Bt蛋白也是人工的。
[0522] 我们还公开了其中与ICK、非ICK和TMOF肽组合的PFIP (例如Bt)的任一种或两种来源于Bt或ICK肽的任一种或两种的2-5、2-15、2-30、5-10、5-15、5-30、5-50种和各种其它不同的类型或细菌菌株来源的组合物。我们公开了这样的组合物，其中Bt和ICK肽的任一种或两种由来自Bt和ICK肽的任一种或两种的2-15种不同类型或细菌菌株来源编
码。2-5、2-15、2-30、5-10、5-15、5-30、5-50种和各种其它不同类型的Bt和ICK肽的组合的任一种和它们的混合物可为组合物提供多于至少1%的各菌株类型。
码。2-5、2-15、2-30、5-10、5-15、5-30、5-50种和各种其它不同类型的Bt和ICK肽的组合的任一种和它们的混合物可为组合物提供多于至少1%的各菌株类型。
[0523] 我们公开了权利要求33-38的Bt和ICK肽的组合物，其中组合物中与ICK、非ICK和TMOF肽组合的PFIP (例如Bt)的总浓度选自下列百分比浓度：1、5、10、15、20、25、30、
35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。我们公开了其中杀虫组合肽使用还包含与ICK、非ICK和/或TMOF肽杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的组合物，其中所
述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接。我们公开了其中杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽
有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的组合物，其中所述ERSP在杀虫ICK肽
的N端连接，其中ERSP为BAAS。
35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。我们公开了其中杀虫组合肽使用还包含与ICK、非ICK和/或TMOF肽杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的组合物，其中所
述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接。我们公开了其中杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽
有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的组合物，其中所述ERSP在杀虫ICK肽
的N端连接，其中ERSP为BAAS。
[0524] 我们公开了其中所述组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的二肽的遗传盒产生的组合物，其中所述二肽在杀虫ICK肽的N端连接；且其中二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成，包括其中二肽为甘氨酸-丝氨酸的实施方案，包括其中杀虫ICK肽是抑制昆虫的电压门控钙通道和钙激活的钾通道两者的任何杀虫肽
的实施方案，包括其中杀虫ICK肽来源于澳大利亚漏斗网蜘蛛的任何种的实施方案，包括其中蜘蛛选自澳毒蜘蛛属或Hadronyche 属的澳大利亚漏斗网蜘蛛的实施方案，包括其中蜘蛛选自Hadronyche 属的澳大利亚漏斗网蜘蛛的实施方案，包括其中蜘蛛选自澳大利亚布鲁山脉漏斗网Hadronyche versuta的实施方案，包括其中杀虫ICK肽是杂合-ACTX-Hv1a的实施方案，包括其中杀虫ICK肽含有20-100个氨基酸和2-4个二硫键的实施方案，包
括其中所述杀虫ICK肽是与本文公开的任何ICK序列有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、
80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性的任何杀虫肽的实施方案，包括其中杀虫ICK肽选自通过引用予以结合的出版物的实施方案，包括其中Bt蛋白是任何杀虫Bt蛋白的实施方案，包括其中Bt蛋白是Cry或Cyt蛋白的实施方案，包括其中Bt蛋白
选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫蛋白
TIC810或TIC812的组合和二元杀虫蛋白PS149B1的实施方案，包括其中Bt蛋白选自Cry
蛋白、Cry1A蛋白或Cry1F蛋白的实施方案，包括其中Bt蛋白是Cry1F-Cry1A蛋白的组合
的实施方案，包括其中Bt蛋白包含与美国专利号7,304,206的SEQ ID NO: 10、12、14、26、
28或34有至少90%同一性的氨基酸序列的实施方案，包括其中Bt蛋白是Dipel的实施方
案，包括其中Bt蛋白是Thuricide的实施方案。
的实施方案，包括其中杀虫ICK肽来源于澳大利亚漏斗网蜘蛛的任何种的实施方案，包括其中蜘蛛选自澳毒蜘蛛属或Hadronyche 属的澳大利亚漏斗网蜘蛛的实施方案，包括其中蜘蛛选自Hadronyche 属的澳大利亚漏斗网蜘蛛的实施方案，包括其中蜘蛛选自澳大利亚布鲁山脉漏斗网Hadronyche versuta的实施方案，包括其中杀虫ICK肽是杂合-ACTX-Hv1a的实施方案，包括其中杀虫ICK肽含有20-100个氨基酸和2-4个二硫键的实施方案，包
括其中所述杀虫ICK肽是与本文公开的任何ICK序列有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、
80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性的任何杀虫肽的实施方案，包括其中杀虫ICK肽选自通过引用予以结合的出版物的实施方案，包括其中Bt蛋白是任何杀虫Bt蛋白的实施方案，包括其中Bt蛋白是Cry或Cyt蛋白的实施方案，包括其中Bt蛋白
选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫蛋白
TIC810或TIC812的组合和二元杀虫蛋白PS149B1的实施方案，包括其中Bt蛋白选自Cry
蛋白、Cry1A蛋白或Cry1F蛋白的实施方案，包括其中Bt蛋白是Cry1F-Cry1A蛋白的组合
的实施方案，包括其中Bt蛋白包含与美国专利号7,304,206的SEQ ID NO: 10、12、14、26、
28或34有至少90%同一性的氨基酸序列的实施方案，包括其中Bt蛋白是Dipel的实施方
案，包括其中Bt蛋白是Thuricide的实施方案。
[0525] 我们公开了在转化的植物或植物基因组中包含Bt (苏云金芽孢杆菌)蛋白和杀虫ICK (抑制物胱氨酸结)蛋白的核苷酸的组合物；其中以干重基础计，Bt与ICK的比率
选自大致下列比率：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、
50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合。
选自大致下列比率：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、
50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合。
[0526] 我们公开了转化的植物或植物基因组，其中以干重基础计，PFIP (例如Bt)与ICK、非ICK和TMOF肽、优选Bt与ICK或Bt与Anomone毒素的比率选自大致下列比率：
50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、
0.1:99.9和0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。转化的植物或植物基因组可具有
Bt和ICK的任一种或两种，或Bt和Anomone蛋白来源于Bt或ICK蛋白的一种以上的不同
类型或细菌菌株来源，或Bt和ICK蛋白的任一种或两种来源于Bt或ICK蛋白的任一种的
2-5种不同类型或细菌菌株来源，或Bt和ICK蛋白两种来源于2-5种不同类型或菌株来源，或Bt和ICK蛋白的任一种或两种来源于Bt和ICK蛋白的任一种或两种的2-15种不同类
型或细菌菌株来源且Bt或ICK任一种或Bt和ICK蛋白两种的至少一个菌株由1拷贝以上
的Bt或ICK基因编码，或Bt和ICK蛋白的任一种或两种来源于Bt和/或ICK蛋白的一种
以上的不同类型或细菌菌株来源，其中Bt和/或ICK蛋白的所有菌株向所述组合物提供超
过至少1%的各菌株类型，或Bt和ICK蛋白的任一种或两种来源于Bt和ICK蛋白的任一种
或两种的2-5种不同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK任一种或Bt和ICK蛋白两种的至
少一个菌株由1拷贝以上的Bt或ICK基因编码，或组合物中Bt和ICK蛋白的总浓度可选
自下列百分比浓度：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或
99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。
50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、
0.1:99.9和0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。转化的植物或植物基因组可具有
Bt和ICK的任一种或两种，或Bt和Anomone蛋白来源于Bt或ICK蛋白的一种以上的不同
类型或细菌菌株来源，或Bt和ICK蛋白的任一种或两种来源于Bt或ICK蛋白的任一种的
2-5种不同类型或细菌菌株来源，或Bt和ICK蛋白两种来源于2-5种不同类型或菌株来源，或Bt和ICK蛋白的任一种或两种来源于Bt和ICK蛋白的任一种或两种的2-15种不同类
型或细菌菌株来源且Bt或ICK任一种或Bt和ICK蛋白两种的至少一个菌株由1拷贝以上
的Bt或ICK基因编码，或Bt和ICK蛋白的任一种或两种来源于Bt和/或ICK蛋白的一种
以上的不同类型或细菌菌株来源，其中Bt和/或ICK蛋白的所有菌株向所述组合物提供超
过至少1%的各菌株类型，或Bt和ICK蛋白的任一种或两种来源于Bt和ICK蛋白的任一种
或两种的2-5种不同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK任一种或Bt和ICK蛋白两种的至
少一个菌株由1拷贝以上的Bt或ICK基因编码，或组合物中Bt和ICK蛋白的总浓度可选
自下列百分比浓度：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或
99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。
[0527] 本文所述组合物和植物包括使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的杀虫组合蛋白，其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接。在另一
个实施方案中，杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的
遗传盒产生，其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。在另一个实施方
案中，掺入和表达来自本文所述核苷酸的组合肽的转基因植物，其中所述组合肽使用还包含表达与杀虫ICK肽有效连接的二肽的核苷酸的遗传盒产生，其中所述二肽在杀虫ICK肽
的N端连接；且其中二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组
成。在另一个实施方案中，转基因植物具有是甘氨酸-丝氨酸的二肽。在另一个实施方案中，转基因植物具有所表达的由ICK和Bt蛋白的杀虫肽组合组成的杀虫ICK肽。转基因植
物可具有来源于澳大利亚漏斗网蜘蛛的任何种，或澳毒蜘蛛属或Hadronyche属的澳大利
亚漏斗网蜘蛛和澳大利亚布鲁山脉漏斗网Hadronyche versuta 的杀虫ICK肽。
个实施方案中，杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的
遗传盒产生，其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。在另一个实施方
案中，掺入和表达来自本文所述核苷酸的组合肽的转基因植物，其中所述组合肽使用还包含表达与杀虫ICK肽有效连接的二肽的核苷酸的遗传盒产生，其中所述二肽在杀虫ICK肽
的N端连接；且其中二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组
成。在另一个实施方案中，转基因植物具有是甘氨酸-丝氨酸的二肽。在另一个实施方案中，转基因植物具有所表达的由ICK和Bt蛋白的杀虫肽组合组成的杀虫ICK肽。转基因植
物可具有来源于澳大利亚漏斗网蜘蛛的任何种，或澳毒蜘蛛属或Hadronyche属的澳大利
亚漏斗网蜘蛛和澳大利亚布鲁山脉漏斗网Hadronyche versuta 的杀虫ICK肽。
[0528] 我们描述并要求保护这样的转基因植物，其中所表达的杀虫ICK肽是杂合-ACTX-Hv1a，和/或所表达的杀虫ICK肽可含有20-100个氨基酸和2-4个二硫键和/或
杀虫ICK肽是与本文所述的任何ICK肽有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、
95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性的任何杀虫肽。所公开的转基因植物可含有任何已知的Bt蛋白，包括其中Bt蛋白为Cry或Cyt蛋白的肽，和/或Bt蛋白选自Cry1、
Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫蛋白TIC810或
TIC812的组合和二元杀虫蛋白PS149B1。Bt蛋白可选自Cry蛋白、Cry1A蛋白或Cry1F蛋
白、或Cry1F-Cry1A蛋白的组合，或它包含与美国专利号7,304,206的SEQ ID NO: 10、12、
14、26、28或34有至少90%同一性的氨基酸序列。我们描述了其中Bt蛋白是Dipel的转基
因植物，我们描述了其中Bt蛋白是Thuricide的转基因植物。
杀虫ICK肽是与本文所述的任何ICK肽有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、
95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性的任何杀虫肽。所公开的转基因植物可含有任何已知的Bt蛋白，包括其中Bt蛋白为Cry或Cyt蛋白的肽，和/或Bt蛋白选自Cry1、
Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫蛋白TIC810或
TIC812的组合和二元杀虫蛋白PS149B1。Bt蛋白可选自Cry蛋白、Cry1A蛋白或Cry1F蛋
白、或Cry1F-Cry1A蛋白的组合，或它包含与美国专利号7,304,206的SEQ ID NO: 10、12、
14、26、28或34有至少90%同一性的氨基酸序列。我们描述了其中Bt蛋白是Dipel的转基
因植物，我们描述了其中Bt蛋白是Thuricide的转基因植物。
[0529] 我们具体描述并要求保护表达本文所述肽的转化植物，其中转化植物的普通叶片中Bt和ICK肽的平均浓度约为：1，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围。我们具体描述并要求保护在转化植物中表达正确折叠的毒肽的转化植物。我们具体描述并要求保护这样的转化植物，其在转化植物中表达正确折叠的组合毒肽，使已表达的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积，引起植物的产量或对虫害的抗性增加，并且它们控制作物和林业的虫害。我们描述了通过本文所述任何产品和处置方法生产的植物。
[0530] 我们描述了包含表达本文所述任何肽的任何核苷酸的表达盒，包括具有掺入转化植物的功能表达盒的实施方案，其包含编码本文公开的任何肽或鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人员制备的核苷酸。我们描述并要求保护用于产生具有或表达本文所述任何肽的转化植物的程序。
[0531] 我们描述了本文所述任何肽或核苷酸制备植物或将这些肽或核苷酸转化至植物中的用途；用于在植物中产生这些蛋白质的方法和技术；和/或包含任何肽的表达盒和将所述表达盒转化至植物基因组中的方法；使用、制备任何所述肽或核苷酸或将其转化至植物中的任何方法；用于在包含任何所公开的肽及其相应核苷酸的植物中产生具有或表达任何肽和功能表达盒的转化植物的方法和技术；和通过本文所述产品和处置方法制备的任何植物。
[0532] 在一些实施方案中，我们公开了包含与本文所述核酸或表达盒有效连接的在植物中有活性的启动子的嵌合基因。我们公开了制备、生产或使用本文所述基因的组合的方法。我们公开了包含本文所述基因的组合的重组载体。我们公开了制备、生产或使用重组载体的方法。我们公开了包含本文所述基因的组合的转基因宿主细胞和制备、生产或使用转基因宿主细胞的方法，所述转基因宿主细胞可以是转基因植物细胞，并且我们公开了制备、生产或使用所述转基因植物细胞以及包含转基因植物细胞的转基因植物和如何制备和使用
转基因植物的方法。我们公开了具有本文所述性质的来源于以下的转基因植物和种子：玉米、大豆、棉、稻、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、马铃薯或番茄。转基因种子可具有我们在本文描述的嵌合基因。我们描述了制备、生产或使用本公开内容的转基因植物和/或种子的方法。
转基因植物的方法。我们公开了具有本文所述性质的来源于以下的转基因植物和种子：玉米、大豆、棉、稻、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、马铃薯或番茄。转基因种子可具有我们在本文描述的嵌合基因。我们描述了制备、生产或使用本公开内容的转基因植物和/或种子的方法。
[0533] 我们还描述了使用本发明的方法并提供新的制剂。本发明对控制昆虫最为有用。我们描述了防治昆虫的方法，所述方法包括：向所述昆虫施用Bt (苏云金芽孢杆菌)蛋白；
并向所述昆虫施用杀虫ICK (抑制物胱氨酸结)肽。可采用其中Bt蛋白和杀虫ICK肽在同
一组合物中在同一时间一起施用或在不同的组合物中在不同时间单独施用的方法。Bt蛋白和杀虫ICK肽可序贯施用，并且可施用于(Bt蛋白)抗性昆虫。以干重基础计，Bt与ICK的比率可选自至少大致下列比率：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、
55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合。以干重基础计，Bt与ICK的比率可选自大致下列比率：50:50、
45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和
0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK
肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源。Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt或ICK
肽的任一种或Bt和ICK肽两种的2-5种不同类型或细菌菌株来源。Bt和ICK肽的任一种
或两种来源于Bt和ICK肽任一种或两种的2-15种不同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK
的任一种或Bt和ICK肽两种的至少一个菌株由1拷贝以上的Bt或ICK基因编码。Bt和
ICK肽的任一种或两种来源于Bt和/或ICK肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源，其
Bt和/或ICK肽的所有菌株为所述组合物提供超过至少1%的来自各菌株类型的肽。Bt和
ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK肽的任一种或两种的2-5种不同类型或细菌菌株来
源且Bt或ICK的任一种或Bt和ICK肽两种的至少一个菌株由1拷贝以上的Bt或ICK基因
编码。组合物中Bt和ICK肽的总浓度选自下列百分比浓度：1、5、10、15、20、25、30、35、40、
45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。
并向所述昆虫施用杀虫ICK (抑制物胱氨酸结)肽。可采用其中Bt蛋白和杀虫ICK肽在同
一组合物中在同一时间一起施用或在不同的组合物中在不同时间单独施用的方法。Bt蛋白和杀虫ICK肽可序贯施用，并且可施用于(Bt蛋白)抗性昆虫。以干重基础计，Bt与ICK的比率可选自至少大致下列比率：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、
55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合。以干重基础计，Bt与ICK的比率可选自大致下列比率：50:50、
45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和
0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK
肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源。Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt或ICK
肽的任一种或Bt和ICK肽两种的2-5种不同类型或细菌菌株来源。Bt和ICK肽的任一种
或两种来源于Bt和ICK肽任一种或两种的2-15种不同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK
的任一种或Bt和ICK肽两种的至少一个菌株由1拷贝以上的Bt或ICK基因编码。Bt和
ICK肽的任一种或两种来源于Bt和/或ICK肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源，其
Bt和/或ICK肽的所有菌株为所述组合物提供超过至少1%的来自各菌株类型的肽。Bt和
ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK肽的任一种或两种的2-5种不同类型或细菌菌株来
源且Bt或ICK的任一种或Bt和ICK肽两种的至少一个菌株由1拷贝以上的Bt或ICK基因
编码。组合物中Bt和ICK肽的总浓度选自下列百分比浓度：1、5、10、15、20、25、30、35、40、
45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。
[0534] 可采用其中杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的方法，其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接。在一些实施方案中，
所用的杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒
产生，其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。
所用的杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒
产生，其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。
[0535] 本文所述的任何肽和植物可用来控制昆虫、其生长和损害，尤其其对植物的损害。通过喷洒在植物或昆虫所在地或需要保护的植物的所在地来施用Bt蛋白和杀虫ICK肽的
组合。
组合。
[0536] 我们还描述了包含Bt蛋白和杀虫ICK肽的制剂，其可包括本文描述的或鉴于本公开内容本领域的技术人员能够制备的任何组合物。所述制剂的一些包括使用极性非质子溶剂和/或水，和/或其中极性非质子溶剂以1-99 wt%的量存在，极性质子溶剂以1-99 wt%的量存在，水以0-98 wt%的量存在。制剂包括其中Bt蛋白是Dipel且其中杀虫ICK肽是
杂合-ACTX-Hv1a肽的制剂。极性非质子溶剂制剂当含有MSO时尤其有效。下文的实例旨
在说明本发明，并不以任何方式限制本发明。
杂合-ACTX-Hv1a肽的制剂。极性非质子溶剂制剂当含有MSO时尤其有效。下文的实例旨
在说明本发明，并不以任何方式限制本发明。
[0537] 第VII节. TMOF和Bt组合的描述和实例当Bt和TMOF肽的组合适当递送到昆虫栖息场所时，所述毒素的组合可抑制生长，损害
运动，或甚至杀死昆虫。喷雾干燥粉末由肽、各种赋形剂和发酵副产物制成。
运动，或甚至杀死昆虫。喷雾干燥粉末由肽、各种赋形剂和发酵副产物制成。
[0538] 我们描述了包含Bt (苏云金芽孢杆菌)蛋白和杀虫TMOF肽两者的杀虫组合肽组合物。以干重基础计，组合物的Bt与TMOF的比率可为大致下列比率的任一个或全部：
99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、
35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合。
我们还描述了其中以干重基础计，Bt与TMOF的比率选自大致下列比率的组合物：0:50、
45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和
0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。
99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、
35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合。
我们还描述了其中以干重基础计，Bt与TMOF的比率选自大致下列比率的组合物：0:50、
45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和
0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。
[0539] 在另一个实施方案中，Bt和TMOF肽的组合包括来源于Bt和TMOF肽的任一种或两种的一种以上的不同类型或细菌菌株来源的Bt和TMOF肽的任一种或两种。所谓细菌菌
株来源，我们是指肽可描述为由表达所述肽的细菌菌株表达，应理解许多Bt蛋白就它们不再全由细菌菌株产生的意义而言也是人工的。
株来源，我们是指肽可描述为由表达所述肽的细菌菌株表达，应理解许多Bt蛋白就它们不再全由细菌菌株产生的意义而言也是人工的。
[0540] 我们还公开了其中Bt和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt或TMOF肽的任一种或两种的2-5、2-15、2-30、5-10、5-15、5-30、5-50种和各种其它不同的类型或细菌菌株来源的组合物。我们公开其中Bt和TMOF肽的任一种或两种由来自Bt和TMOF肽的任一种或
两种的2-15种不同类型或细菌菌株来源编码的组合物。Bt和TMOF肽的2-5、2-15、2-30、
5-10、5-15、5-30、5-50种和各种其它不同的类型的这些组合的任一种和混合物可为组合物提供超过至少1%的各菌株类型。
两种的2-15种不同类型或细菌菌株来源编码的组合物。Bt和TMOF肽的2-5、2-15、2-30、
5-10、5-15、5-30、5-50种和各种其它不同的类型的这些组合的任一种和混合物可为组合物提供超过至少1%的各菌株类型。
[0541] 我们公开了Bt和TMOF的组合物，其中组合物中Bt和TMOF肽的总浓度选自下列百分比浓度：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。我们公开了组合物，其中杀虫组合肽使用还包含与杀虫TMOF肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产
生，其中所述ERSP在杀虫TMOF肽的N端连接。我们公开了其中杀虫组合肽使用还包含与
杀虫TMOF肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的组合物，其中所述ERSP在
杀虫TMOF肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。
生，其中所述ERSP在杀虫TMOF肽的N端连接。我们公开了其中杀虫组合肽使用还包含与
杀虫TMOF肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的组合物，其中所述ERSP在
杀虫TMOF肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。
[0542] 我们公开了其中所述组合肽使用还包含与杀虫TMOF肽有效连接的二肽的遗传盒产生的组合物，其中所述二肽在杀虫TMOF肽的N端连接；且其中二肽由二肽N端的一个非
极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成，包括其中二肽为甘氨酸-丝氨酸的实施方
案，包括这样的实施方案，其中杀虫TMOF肽是包括其中杀虫TMOF肽与本文公开的任何TMOF序列有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性的实施方案的任何肽，包括其中Bt蛋白是任何杀虫Bt蛋白的实施方案，包括其中Bt蛋白是Cry或Cyt蛋白的实施方案，包括其中Bt蛋白选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫蛋白TIC810或TIC812的组合和二元杀虫
蛋白PS149B1的实施方案，包括其中Bt蛋白选自Cry蛋白、Cry1A蛋白或Cry1F蛋白的实
施方案，包括其中Bt蛋白是Cry1F-Cry1A蛋白的组合的实施方案，包括其中Bt蛋白包含与美国专利号7,304,206的SEQ ID NO: 10、12、14、26、28或34有至少90%同一性的氨基酸序列的实施方案，包括其中Bt内毒素是Dipel的实施方案，包括其中Bt蛋白是Thuricide
的实施方案。
极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成，包括其中二肽为甘氨酸-丝氨酸的实施方
案，包括这样的实施方案，其中杀虫TMOF肽是包括其中杀虫TMOF肽与本文公开的任何TMOF序列有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性的实施方案的任何肽，包括其中Bt蛋白是任何杀虫Bt蛋白的实施方案，包括其中Bt蛋白是Cry或Cyt蛋白的实施方案，包括其中Bt蛋白选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫蛋白TIC810或TIC812的组合和二元杀虫
蛋白PS149B1的实施方案，包括其中Bt蛋白选自Cry蛋白、Cry1A蛋白或Cry1F蛋白的实
施方案，包括其中Bt蛋白是Cry1F-Cry1A蛋白的组合的实施方案，包括其中Bt蛋白包含与美国专利号7,304,206的SEQ ID NO: 10、12、14、26、28或34有至少90%同一性的氨基酸序列的实施方案，包括其中Bt内毒素是Dipel的实施方案，包括其中Bt蛋白是Thuricide
的实施方案。
[0543] 我们公开了在转化的植物或植物基因组中包含Bt (苏云金芽孢杆菌)蛋白和杀虫TMOF肽的核苷酸的组合物；其中以干重基础计，Bt与TMOF的比率选自大致下列比率：
99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、
35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合。
99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、
35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合。
[0544] 我们公开了转化的植物或植物基因组，其中以干重基础计，Bt与TMOF的比率选自大致下列比率：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。转化的植物或植物基因组可具有来源于Bt或TMOF肽的一种以上不同类型或细菌菌株来源的Bt和TMOF肽的任一
种或两种，或Bt和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt或TMOF肽任一种的2-5种不同类型
或细菌菌株来源，或Bt和TMOF肽两种来源于2-5种不同类型或菌株来源，或Bt和TMOF肽
的任一种或两种来源于Bt和TMOF肽的任一种或两种的2-15种不同类型或细菌菌株来源
且Bt或TMOF的任一种或Bt和TMOF肽两种的至少一个菌株由1拷贝以上的Bt或TMOF基
因编码，或Bt和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt和/或TMOF肽的一种以上的不同类型
或细菌菌株来源，其中Bt和/或TMOF肽的所有菌株向所述组合物提供超过至少1%的各菌
株类型，或Bt和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt和TMOF肽的任一种或两种的2-5种不
同类型或细菌菌株来源且Bt或TMOF的任一种或Bt和TMOF肽两种的至少一个菌株由1拷
贝以上的Bt或TMOF基因编码，或组合物中Bt和TMOF肽的总浓度可选自下列百分比浓度：
1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。
种或两种，或Bt和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt或TMOF肽任一种的2-5种不同类型
或细菌菌株来源，或Bt和TMOF肽两种来源于2-5种不同类型或菌株来源，或Bt和TMOF肽
的任一种或两种来源于Bt和TMOF肽的任一种或两种的2-15种不同类型或细菌菌株来源
且Bt或TMOF的任一种或Bt和TMOF肽两种的至少一个菌株由1拷贝以上的Bt或TMOF基
因编码，或Bt和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt和/或TMOF肽的一种以上的不同类型
或细菌菌株来源，其中Bt和/或TMOF肽的所有菌株向所述组合物提供超过至少1%的各菌
株类型，或Bt和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt和TMOF肽的任一种或两种的2-5种不
同类型或细菌菌株来源且Bt或TMOF的任一种或Bt和TMOF肽两种的至少一个菌株由1拷
贝以上的Bt或TMOF基因编码，或组合物中Bt和TMOF肽的总浓度可选自下列百分比浓度：
1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。
[0545] 本文所述组合物和植物包括使用还包含与杀虫TMOF肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的杀虫组合肽，其中所述ERSP在杀虫TMOF肽的N端连接。在另一
个实施方案中，杀虫组合肽使用还包含与杀虫TMOF肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)
的遗传盒产生，其中所述ERSP在杀虫TMOF肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。在另一个实
施方案中，掺入和表达来自本文所述核苷酸的组合肽的转基因植物，其中所述组合肽使用还包含表达与杀虫TMOF肽有效连接的二肽的核苷酸的遗传盒产生，其中所述二肽在杀虫
TMOF肽的N端连接；且其中二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨
基酸组成。在另一个实施方案中，转基因植物具有是甘氨酸-丝氨酸的二肽。在另一个实施方案中，转基因植物具有所表达的由TMOF和Bt蛋白的杀虫肽组合组成的杀虫TMOF肽。
转基因植物可具有来源于任何TMOF物类的杀虫TMOF肽。
个实施方案中，杀虫组合肽使用还包含与杀虫TMOF肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)
的遗传盒产生，其中所述ERSP在杀虫TMOF肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。在另一个实
施方案中，掺入和表达来自本文所述核苷酸的组合肽的转基因植物，其中所述组合肽使用还包含表达与杀虫TMOF肽有效连接的二肽的核苷酸的遗传盒产生，其中所述二肽在杀虫
TMOF肽的N端连接；且其中二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨
基酸组成。在另一个实施方案中，转基因植物具有是甘氨酸-丝氨酸的二肽。在另一个实施方案中，转基因植物具有所表达的由TMOF和Bt蛋白的杀虫肽组合组成的杀虫TMOF肽。
转基因植物可具有来源于任何TMOF物类的杀虫TMOF肽。
[0546] 我们描述并要求保护转基因植物，其中所表达的杀虫TMOF肽可含有20-100个氨基酸，和/或杀虫TMOF肽是与本文所述任何TMOF肽有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、
80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性的任何杀虫肽。所公开的转基因植物可含有任何已知的Bt蛋白，包括肽，其中Bt蛋白为Cry或Cyt蛋白，和/或Bt蛋白
选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫蛋白
TIC810或TIC812的组合和二元杀虫蛋白PS149B1。Bt蛋白可选自Cry蛋白、Cry1A蛋白或
Cry1F蛋白，或Cry1F-Cry1A蛋白的组合，或它包含与美国专利号7,304,206的SEQ ID NO:
10、12、14、26、28或34有至少90%同一性的氨基酸序列。我们描述了其中Bt蛋白是Dipel的转基因植物，我们描述了其中Bt蛋白是Thuricide的转基因植物。
80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性的任何杀虫肽。所公开的转基因植物可含有任何已知的Bt蛋白，包括肽，其中Bt蛋白为Cry或Cyt蛋白，和/或Bt蛋白
选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫蛋白
TIC810或TIC812的组合和二元杀虫蛋白PS149B1。Bt蛋白可选自Cry蛋白、Cry1A蛋白或
Cry1F蛋白，或Cry1F-Cry1A蛋白的组合，或它包含与美国专利号7,304,206的SEQ ID NO:
10、12、14、26、28或34有至少90%同一性的氨基酸序列。我们描述了其中Bt蛋白是Dipel的转基因植物，我们描述了其中Bt蛋白是Thuricide的转基因植物。
[0547] 我们具体描述并要求保护表达本文所述肽的转化植物，其中转化植物中普通叶片的Bt和TMOF肽的平均浓度约为：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围。我们具体描述并要求保护在转化植物中表达正确折叠的毒肽的转化植物。我们具体描述并要求保护这样的转化植物，其在转化植物中表达正确折叠的组合毒肽，使已表达的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积，引起植物的产量或对虫害的抗性增加，并且它们控制作物和林业的虫害。我们描述了通过本文所述任何产品和处置方法生产的植物。
[0548] 我们描述了包含表达本文所述任何肽的任何核苷酸的表达盒，包括具有掺入转化植物的功能表达盒的实施方案，其包含编码本文公开的任何肽或鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人员制备的核苷酸。我们描述并要求保护用于产生具有或表达本文所述任何肽的转化植物的程序。
[0549] 我们描述了本文所述任何肽或核苷酸产生植物或将这些肽或核苷酸转化至植物中的用途；用于在植物中产生这些蛋白质的方法和技术；和/或包含任何肽的表达盒和将所述表达盒转化至植物基因组中的方法；使用、制备任何所述肽或核苷酸或将其转化至植物中的任何方法；用于在包含任何所公开的肽及其相应核苷酸的植物中产生具有或表达任何肽和功能表达盒的转化植物的方法和技术；和通过本文所述产品和处置方法制备的任何植物。
[0550] 在一些实施方案中，我们公开了包含与本文所述核酸或表达盒有效连接的在植物中有活性的启动子的嵌合基因。我们公开了制备、生产或使用本文所述基因的组合的方法。我们公开了包含本文所述基因的组合的重组载体。我们公开了制备、生产或使用重组载体的方法。我们公开了包含本文所述基因的组合的转基因宿主细胞和制备、生产或使用转基因宿主细胞的方法，所述转基因宿主细胞可以是转基因植物细胞，并且我们公开了制备、生产或使用所述转基因植物细胞以及包含转基因植物细胞的转基因植物和如何制备和使用
转基因植物的方法。我们公开了具有本文所述性质的来源于以下的转基因植物和种子：玉米、大豆、棉、稻、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、马铃薯或番茄。转基因种子可具有我们在本文描述的嵌合基因。我们描述了制备、生产或使用本公开内容的转基因植物和/或种子的方法。
转基因植物的方法。我们公开了具有本文所述性质的来源于以下的转基因植物和种子：玉米、大豆、棉、稻、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、马铃薯或番茄。转基因种子可具有我们在本文描述的嵌合基因。我们描述了制备、生产或使用本公开内容的转基因植物和/或种子的方法。
[0551] 我们还描述了使用本发明的方法并提供新的制剂。本发明对控制昆虫最为有用。我们描述了控制昆虫的方法，所述方法包括：向所述昆虫施用Bt (苏云金芽孢杆菌)蛋白；
并向所述昆虫施用杀虫TMOF肽。可采用其中Bt蛋白和杀虫ICK肽在同一组合物中在同一
时间一起施用或在不同的组合物中在不同时间单独施用的方法。Bt蛋白和杀虫TMOF肽可
序贯施用，并且可施用于(Bt蛋白)抗性昆虫。以干重基础计，Bt与TMOF的比率可选自至少大致下列比率：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、
45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合。以干重基础计，Bt与TMOF的比率可选自大致下列比率：50:50、45:55、40:60、
35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9 和 0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。Bt和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt和TMOF肽的一种
以上的不同类型或细菌菌株来源。Bt和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt或TMOF肽任一
种或Bt和TMOF肽两种的2-5种不同类型或细菌菌株来源。Bt和TMOF肽的任一种或两种
来源于Bt和TMOF肽的任一种或两种的2-15种不同类型或细菌菌株来源，且Bt或TMOF的
任一种或Bt和TMOF肽两种的至少一个菌株由1拷贝以上的Bt或TMOF基因编码。Bt和
TMOF肽的任一种或两种来源于Bt和/或TMOF肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源，
其Bt和/或TMOF肽的所有菌株为所述组合物提供大于至少1%的各菌株类型的肽。Bt和
TMOF肽的任一种或两种来源于Bt和TMOF肽的任一种或两种的2-5种不同类型或细菌菌
株来源，且Bt或TMOF的任一种或Bt和TMOF肽两种的至少一个菌株由1拷贝以上的Bt或
TMOF基因编码。组合物中Bt和TMOF肽的总浓度选自下列百分比浓度：1、5、10、15、20、25、
30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。
并向所述昆虫施用杀虫TMOF肽。可采用其中Bt蛋白和杀虫ICK肽在同一组合物中在同一
时间一起施用或在不同的组合物中在不同时间单独施用的方法。Bt蛋白和杀虫TMOF肽可
序贯施用，并且可施用于(Bt蛋白)抗性昆虫。以干重基础计，Bt与TMOF的比率可选自至少大致下列比率：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、
45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合。以干重基础计，Bt与TMOF的比率可选自大致下列比率：50:50、45:55、40:60、
35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9 和 0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。Bt和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt和TMOF肽的一种
以上的不同类型或细菌菌株来源。Bt和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt或TMOF肽任一
种或Bt和TMOF肽两种的2-5种不同类型或细菌菌株来源。Bt和TMOF肽的任一种或两种
来源于Bt和TMOF肽的任一种或两种的2-15种不同类型或细菌菌株来源，且Bt或TMOF的
任一种或Bt和TMOF肽两种的至少一个菌株由1拷贝以上的Bt或TMOF基因编码。Bt和
TMOF肽的任一种或两种来源于Bt和/或TMOF肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源，
其Bt和/或TMOF肽的所有菌株为所述组合物提供大于至少1%的各菌株类型的肽。Bt和
TMOF肽的任一种或两种来源于Bt和TMOF肽的任一种或两种的2-5种不同类型或细菌菌
株来源，且Bt或TMOF的任一种或Bt和TMOF肽两种的至少一个菌株由1拷贝以上的Bt或
TMOF基因编码。组合物中Bt和TMOF肽的总浓度选自下列百分比浓度：1、5、10、15、20、25、
30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。
[0552] 可采用其中杀虫组合肽使用还包含与杀虫TMOF肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的方法，其中所述ERSP在杀虫TMOF肽的N端连接。在一些实施方案中，
所用的杀虫组合肽使用还包含与杀虫TMOF肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒
产生，其中所述ERSP在杀虫TMOF肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。
所用的杀虫组合肽使用还包含与杀虫TMOF肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒
产生，其中所述ERSP在杀虫TMOF肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。
[0553] 本文所述的任何肽和植物可用来控制昆虫、其生长和损害，尤其其对植物的损害。可通过喷洒在植物，或昆虫所在地，或需要保护的植物的所在地，来施用Bt蛋白和杀虫TMOF肽的组合。
[0554] 我们还描述了包含Bt蛋白和杀虫TMOF肽的制剂，其可包括本文描述的或鉴于本公开内容本领域的技术人员能够制备的任何组合物。所述制剂的一些包括使用极性非质
子溶剂和/或水，和/或其中极性非质子溶剂以1-99 wt%的量存在，极性质子溶剂以1-99 wt%的量存在，水以0-98 wt%的量存在。制剂包括其中Bt蛋白是Dipel且其中杀虫TMOF
肽是像序列表中提供的任何TMOF肽一样的肽的制剂。极性非质子溶剂制剂当含有MSO时
尤其有效。下文的实例旨在说明本发明，并不以任何方式限制本发明。
子溶剂和/或水，和/或其中极性非质子溶剂以1-99 wt%的量存在，极性质子溶剂以1-99 wt%的量存在，水以0-98 wt%的量存在。制剂包括其中Bt蛋白是Dipel且其中杀虫TMOF
肽是像序列表中提供的任何TMOF肽一样的肽的制剂。极性非质子溶剂制剂当含有MSO时
尤其有效。下文的实例旨在说明本发明，并不以任何方式限制本发明。
[0555] 总之，我们在第3部分中描述了：包含至少两种类型的杀虫蛋白或肽的组合物，其中一种类型是成孔杀虫蛋白(PFIP)，
另一种类型是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)。其中组合物可包含至少两种类型的杀虫肽，其中一种类型是成孔杀虫蛋白(PFIP)，其中所述PFIP是Bt蛋白，另一种类型是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，其中所述CRIP是ICK蛋白，其中所述ICK蛋白来源于漏斗网蜘蛛。我
们描述了以下处置方法：a)评价和任选测试昆虫或昆虫样品以确定昆虫是否显示对PFIP
的抗性，和b)当所述评价结果得到所述昆虫样品对PFIP有抗性的结论时，然后c)施用一
种或多种CRIPS，任选CRIPS可以是来自以下的ICK：Hadronyche versuta 或布鲁山脉漏斗网蜘蛛、Atrax robustus、Atrax formidabilis、Atrax infensus，包括称为U-ACTX多肽、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b的毒素或突变体或变体，或CRIP可以是来自海葵、来自名为Anemonia viridi的海葵的非ICK，名为Av2和Av3的肽，尤其类似于序列表的这些肽的肽。我们描述了控制昆虫(包括Bt抗性昆虫)的方法，所述方法包括产生至少两
种类型的肽的组合物，其中一种类型的肽是成孔杀虫肽(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自本文所述任何组合物和选自序列表提供
的任何蛋白质，然后将所述组合物施用于昆虫所在地。我们描述了控制昆虫(包括Bt抗性昆虫)，包括保护植物免遭Bt抗性昆虫的方法，所述方法包括产生表达至少两种正确折叠的肽的组合的植物，其中一种类型的肽是成孔杀虫肽(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自本文所述任何组合物和选自序列表提供的
任何蛋白质。我们描述了以下处置方法：a)评价和任选测试昆虫或昆虫样品以确定昆虫是否显示对PFIP的抗性，和b)当所述评价结果得到所述昆虫样品对PFIP有抗性的结论时，
然后c)施用一种或多种CRIPS，和任选d)以同时或序贯施用的方式施用PFIP和CRIP的组
合。
另一种类型是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)。其中组合物可包含至少两种类型的杀虫肽，其中一种类型是成孔杀虫蛋白(PFIP)，其中所述PFIP是Bt蛋白，另一种类型是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，其中所述CRIP是ICK蛋白，其中所述ICK蛋白来源于漏斗网蜘蛛。我
们描述了以下处置方法：a)评价和任选测试昆虫或昆虫样品以确定昆虫是否显示对PFIP
的抗性，和b)当所述评价结果得到所述昆虫样品对PFIP有抗性的结论时，然后c)施用一
种或多种CRIPS，任选CRIPS可以是来自以下的ICK：Hadronyche versuta 或布鲁山脉漏斗网蜘蛛、Atrax robustus、Atrax formidabilis、Atrax infensus，包括称为U-ACTX多肽、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b的毒素或突变体或变体，或CRIP可以是来自海葵、来自名为Anemonia viridi的海葵的非ICK，名为Av2和Av3的肽，尤其类似于序列表的这些肽的肽。我们描述了控制昆虫(包括Bt抗性昆虫)的方法，所述方法包括产生至少两
种类型的肽的组合物，其中一种类型的肽是成孔杀虫肽(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自本文所述任何组合物和选自序列表提供
的任何蛋白质，然后将所述组合物施用于昆虫所在地。我们描述了控制昆虫(包括Bt抗性昆虫)，包括保护植物免遭Bt抗性昆虫的方法，所述方法包括产生表达至少两种正确折叠的肽的组合的植物，其中一种类型的肽是成孔杀虫肽(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自本文所述任何组合物和选自序列表提供的
任何蛋白质。我们描述了以下处置方法：a)评价和任选测试昆虫或昆虫样品以确定昆虫是否显示对PFIP的抗性，和b)当所述评价结果得到所述昆虫样品对PFIP有抗性的结论时，
然后c)施用一种或多种CRIPS，和任选d)以同时或序贯施用的方式施用PFIP和CRIP的组
合。
[0556] 我们描述了包含至少两种类型的杀虫蛋白或肽的组合物，其中一种类型是成孔杀虫蛋白(PFIP)，另一种类型是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)。一种组合物，其中CRIP是ICK，任选所述ICK源自于或来源于Hadronyche versuta 或布鲁山脉漏斗网蜘蛛、Atrax robustus、Atrax formidabilis、Atrax infensus，包括称为U-ACTX多肽、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b的毒素或突变体或变体。一种组合物，其中CRIP是非ICK
CRIP，任选所述非ICK CRIP源自于或来源于具有非ICK CRIPS的动物例如海葵、海胆和海蛤蝓，任选包括名为Anemonia viridi 的海葵，任选包括名为Av2和Av3的肽，尤其类似于Av2和Av3的肽，包括序列表所列出的这类肽或突变体或变体。一种使用组合物控制昆虫
(包括Bt抗性昆虫)的方法，所述方法包括产生至少两种类型的肽的组合物，其中一种类型的肽是成孔杀虫蛋白(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自权利要求1和本文描述的任何组合物和序列表提供的任何蛋白质，然后将所述组合物施用于昆虫所在地。一种控制昆虫(包括Bt抗性昆虫)、包括保护植物免遭Bt抗
性昆虫的方法，所述方法包括产生表达至少两种正确折叠的肽的组合的植物，其中一种类型的肽是成孔杀虫蛋白(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自本文所述的任何组合物和选自序列表提供的任何蛋白质。一种控制昆虫
(包括Bt抗性昆虫)的方法，其中在PFIP影响昆虫肠内衬期间的任何时间给予CRIP。一
种控制昆虫(包括Bt抗性昆虫)的方法，其中在测试昆虫的Bt抗性后给予CRIP，且其中所
述昆虫Bt抗性测试为阳性。将呈固体或液体形式的本文所述任何化合物施用或递送至昆
虫、昆虫所在地或作为植物结合杀虫剂。
CRIP，任选所述非ICK CRIP源自于或来源于具有非ICK CRIPS的动物例如海葵、海胆和海蛤蝓，任选包括名为Anemonia viridi 的海葵，任选包括名为Av2和Av3的肽，尤其类似于Av2和Av3的肽，包括序列表所列出的这类肽或突变体或变体。一种使用组合物控制昆虫
(包括Bt抗性昆虫)的方法，所述方法包括产生至少两种类型的肽的组合物，其中一种类型的肽是成孔杀虫蛋白(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自权利要求1和本文描述的任何组合物和序列表提供的任何蛋白质，然后将所述组合物施用于昆虫所在地。一种控制昆虫(包括Bt抗性昆虫)、包括保护植物免遭Bt抗
性昆虫的方法，所述方法包括产生表达至少两种正确折叠的肽的组合的植物，其中一种类型的肽是成孔杀虫蛋白(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自本文所述的任何组合物和选自序列表提供的任何蛋白质。一种控制昆虫
(包括Bt抗性昆虫)的方法，其中在PFIP影响昆虫肠内衬期间的任何时间给予CRIP。一
种控制昆虫(包括Bt抗性昆虫)的方法，其中在测试昆虫的Bt抗性后给予CRIP，且其中所
述昆虫Bt抗性测试为阳性。将呈固体或液体形式的本文所述任何化合物施用或递送至昆
虫、昆虫所在地或作为植物结合杀虫剂。
[0557] 我们描述了包含至少两种类型的杀虫肽的组合物，其中一种类型是成孔杀虫蛋白(PFIP)，其中所述PFIP是cry蛋白，另一种类型是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，其中所述CRIP是ICK蛋白，其中所述ICK蛋白来源于漏斗网蜘蛛。我们描述了包含至少两种类型的杀虫肽的组合物，其中一种类型是成孔杀虫肽(PFIP)，其中所述PFIP具有Bt生物作为其
来源，另一种类型是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，其中所述CRIP为非ICK蛋白。我们描述了包含至少两种类型的杀虫肽的组合物，其中一种类型是成孔杀虫肽(PFIP)，另一种类型是TMOF。我们描述了保护植物免遭昆虫(包括Bt抗性昆虫)的方法，所述方法包括产
生掺入至少两种不同类型的肽的组合的植物，其中一种类型的肽是成孔杀虫肽(PFIP)，另一种类型是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)。我们描述了保护植物免遭昆虫(包括Bt抗性
昆虫)的方法，所述方法包括产生表达至少两种正确折叠的肽的组合的植物，其中一种类型的肽是成孔杀虫肽(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自本文所述的任何组合物和选自序列表提供的任何蛋白质。
来源，另一种类型是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，其中所述CRIP为非ICK蛋白。我们描述了包含至少两种类型的杀虫肽的组合物，其中一种类型是成孔杀虫肽(PFIP)，另一种类型是TMOF。我们描述了保护植物免遭昆虫(包括Bt抗性昆虫)的方法，所述方法包括产
生掺入至少两种不同类型的肽的组合的植物，其中一种类型的肽是成孔杀虫肽(PFIP)，另一种类型是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)。我们描述了保护植物免遭昆虫(包括Bt抗性
昆虫)的方法，所述方法包括产生表达至少两种正确折叠的肽的组合的植物，其中一种类型的肽是成孔杀虫肽(PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自本文所述的任何组合物和选自序列表提供的任何蛋白质。
[0558] 我们描述了杀虫组合肽组合物，其包含富含半胱氨酸的杀虫蛋白(CRIP)，例如杀虫ICK (抑制物胱氨酸结)肽像蜘蛛肽或非ICK像海葵毒素与成孔杀虫蛋白(PFIP)像Bt肽，例如cry、cyp或VIP组合；或富含半胱氨酸的杀虫蛋白(CRIP)，例如杀虫ICK (抑制物胱氨酸结)肽与TMOF (胰蛋白酶调节抑卵因子)肽组合。注意CRIP可以是非ICK蛋白，
像海葵肽，例如Av2和Av3和序列表中的其它类似序列。我们描述了这类组合物，其中以干重基础计，Bt与CRIP、Bt与ICK、Bt与非ICK CRIP、Bt与TMOF或Bt与ICK和TMOF的比
率选自大致下列比率：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、
50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合。或者其中以干重基础计，Bt与CRIP、Bt与ICK、Bt与非ICK CRIP、Bt与TMOF和TMOF和海葵的比率选自大致下列比率：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、
20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。或者其中Bt与CRIP、Bt与ICK、Bt与非ICK CRIP、Bt与TMOF、或Bt与ICK和
TMOF的比率，和海葵肽来源于Bt和ICK肽的任一种或两种的一种以上的不同类型或细菌
菌株来源。或者其中Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽来源于Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽的任一种或两种的2-5种不同类型或细菌菌株来源，且TMOF肽来源于2-5种不同的
菌株。或者其中Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的任一种或所有的2-5种不同类型或细菌菌株来源。或者其中Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的任一种或两种由Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的任一种或所有的2-15种不同类型或细菌菌株来源编码。或者其中Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的一种或所有来源于Bt、ICK和TMOF肽的任一种或所有的2-15种
不同类型或细菌菌株来源，且Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽任一种或Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的两种及Bt和ICK、Bt和TMOF或Bt和ICK + TMOF肽的至少
一个菌株由1拷贝以上的Bt或ICK基因编码。或者其中Bt、CRIP、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt和/或ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的2-15
菌株或细菌类型，其Bt和/或ICK肽的所有菌株为所述组合物提供超过至少1%各菌株类
型。
像海葵肽，例如Av2和Av3和序列表中的其它类似序列。我们描述了这类组合物，其中以干重基础计，Bt与CRIP、Bt与ICK、Bt与非ICK CRIP、Bt与TMOF或Bt与ICK和TMOF的比
率选自大致下列比率：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、
50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合。或者其中以干重基础计，Bt与CRIP、Bt与ICK、Bt与非ICK CRIP、Bt与TMOF和TMOF和海葵的比率选自大致下列比率：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、
20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。或者其中Bt与CRIP、Bt与ICK、Bt与非ICK CRIP、Bt与TMOF、或Bt与ICK和
TMOF的比率，和海葵肽来源于Bt和ICK肽的任一种或两种的一种以上的不同类型或细菌
菌株来源。或者其中Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽来源于Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽的任一种或两种的2-5种不同类型或细菌菌株来源，且TMOF肽来源于2-5种不同的
菌株。或者其中Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的任一种或所有的2-5种不同类型或细菌菌株来源。或者其中Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的任一种或两种由Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的任一种或所有的2-15种不同类型或细菌菌株来源编码。或者其中Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的一种或所有来源于Bt、ICK和TMOF肽的任一种或所有的2-15种
不同类型或细菌菌株来源，且Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽任一种或Bt、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的两种及Bt和ICK、Bt和TMOF或Bt和ICK + TMOF肽的至少
一个菌株由1拷贝以上的Bt或ICK基因编码。或者其中Bt、CRIP、ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的任一种或两种来源于Bt和/或ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的2-15
菌株或细菌类型，其Bt和/或ICK肽的所有菌株为所述组合物提供超过至少1%各菌株类
型。
[0559] 我们描述了编号1-9的Bt和ICK、非ICK CRIP、海葵肽和TMOF肽的组合物，其中组合物中Bt和CRIP肽的总浓度选自下列百分比浓度：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、
50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。我们描述了其中杀虫组合肽使用还包含与杀虫CRIP肽有效连接
的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的组合物，其中所述ERSP在杀虫CRIP肽的N端连
接。我们描述了其中杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号
肽)的遗传盒产生的组合物，其中所述ERSP在杀虫CRIP肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。
我们描述了其中所述组合肽使用还包含与杀虫CRIP肽有效连接的二肽的遗传盒产生的组
合物，其中所述二肽在杀虫CRIP肽的N端连接；且其中二肽由二肽N端的一个非极性氨基
酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成。我们描述了其中所述二肽为甘氨酸-丝氨酸的组合
物。
50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。我们描述了其中杀虫组合肽使用还包含与杀虫CRIP肽有效连接
的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生的组合物，其中所述ERSP在杀虫CRIP肽的N端连
接。我们描述了其中杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号
肽)的遗传盒产生的组合物，其中所述ERSP在杀虫CRIP肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。
我们描述了其中所述组合肽使用还包含与杀虫CRIP肽有效连接的二肽的遗传盒产生的组
合物，其中所述二肽在杀虫CRIP肽的N端连接；且其中二肽由二肽N端的一个非极性氨基
酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成。我们描述了其中所述二肽为甘氨酸-丝氨酸的组合
物。
[0560] 我们描述了其中杀虫CRIP肽是抑制昆虫的电压门控钙通道和钙激活的钾通道两者的任何杀虫肽的组合物，且其中杀虫CRIP肽起源于澳大利亚漏斗网蜘蛛的任何种，且其中所述蜘蛛选自澳毒蜘蛛属或Hadronyche属的澳大利亚漏斗网蜘蛛，且其中所述蜘蛛选
自Hadronyche 属的澳大利亚漏斗网蜘蛛，且其中所述蜘蛛选自澳大利亚布鲁山脉漏斗网即漏斗网蜘蛛hadronyche versuta，且其中杀虫CRIP肽是杂合-ACTX-Hv1a，且其中所述杀虫CRIP肽含有20-100个氨基酸和2-4个二硫键，其中所述杀虫CRIP肽是与序列表中的任
何肽有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性的任何杀虫肽。
自Hadronyche 属的澳大利亚漏斗网蜘蛛，且其中所述蜘蛛选自澳大利亚布鲁山脉漏斗网即漏斗网蜘蛛hadronyche versuta，且其中杀虫CRIP肽是杂合-ACTX-Hv1a，且其中所述杀虫CRIP肽含有20-100个氨基酸和2-4个二硫键，其中所述杀虫CRIP肽是与序列表中的任
何肽有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性的任何杀虫肽。
[0561] 我们描述了来自Bt蛋白的杀虫CRIP肽且其中Bt蛋白是Cry或Cyt蛋白，或选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫蛋白
TIC810或TIC812的组合和二元杀虫蛋白PS149B1。我们描述了选自Cry蛋白、Cry1A蛋白
或Cry1F蛋白的Bt蛋白。我们描述了其中所述Bt蛋白是Cry1F-Cry1A蛋白的组合、Dipel
或Thuricide，且其中Bt蛋白来源于Bacillus thuringiensis kurstaki。
TIC810或TIC812的组合和二元杀虫蛋白PS149B1。我们描述了选自Cry蛋白、Cry1A蛋白
或Cry1F蛋白的Bt蛋白。我们描述了其中所述Bt蛋白是Cry1F-Cry1A蛋白的组合、Dipel
或Thuricide，且其中Bt蛋白来源于Bacillus thuringiensis kurstaki。
[0562] 我们描述了在转化的植物或植物基因组中包含PFIP (例如Bt) (苏云金芽孢杆菌)蛋白和CRIP例如杀虫ICK (抑制物胱氨酸结)肽或非ICK肽的核苷酸的组合物；且
其中以干重基础计，Bt与ICK的比率选自大致下列比率：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、
75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、
15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合，或其中编号33的组合物，在转化的植物或植物基因组中，其中以干重基础计，Bt与ICK的比率选自大致下列比率：0:50、
45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和
0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。
其中以干重基础计，Bt与ICK的比率选自大致下列比率：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、
75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、
15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合，或其中编号33的组合物，在转化的植物或植物基因组中，其中以干重基础计，Bt与ICK的比率选自大致下列比率：0:50、
45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和
0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。
[0563] 我们描述了其中编码的Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt或ICK肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源的组合物，其中编码的Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt或ICK肽的任一种的2-5种不同类型或细菌菌株来源，或Bt和ICK肽两种来源于2-5种不
同类型或菌株来源，其中编码的Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK肽任一种或
两种的2-15种不同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK的任一种或Bt和ICK肽两种的至少
一个菌株由超过1拷贝的Bt或ICK基因编码，其中编码的Bt和ICK肽的任一种或两种来
源于Bt和/或ICK肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源，其中Bt和/或ICK肽的所
有菌株向所述组合物提供超过至少1%的各菌株类型，其中编码的Bt和ICK肽的任一种或
两种来源于Bt和ICK肽的任一种或两种的2-5种不同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK的
任一种或Bt和ICK肽两种的至少一个菌株由超过1拷贝的Bt或ICK基因编码。
同类型或菌株来源，其中编码的Bt和ICK肽的任一种或两种来源于Bt和ICK肽任一种或
两种的2-15种不同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK的任一种或Bt和ICK肽两种的至少
一个菌株由超过1拷贝的Bt或ICK基因编码，其中编码的Bt和ICK肽的任一种或两种来
源于Bt和/或ICK肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源，其中Bt和/或ICK肽的所
有菌株向所述组合物提供超过至少1%的各菌株类型，其中编码的Bt和ICK肽的任一种或
两种来源于Bt和ICK肽的任一种或两种的2-5种不同类型或细菌菌株来源且Bt或ICK的
任一种或Bt和ICK肽两种的至少一个菌株由超过1拷贝的Bt或ICK基因编码。
[0564] 我们描述了这样的组合物，其中产生自该组合物的转基因表达的Bt和ICK肽的总浓度选自下列百分比浓度：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、
90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。我们描述了其中杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗
传盒产生的组合物，其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接，且其中杀虫组合肽使用还包
含与杀虫CRIP肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生，其中所述ERSP在杀虫
CRIP肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。
90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。我们描述了其中杀虫组合肽使用还包含与杀虫ICK肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗
传盒产生的组合物，其中所述ERSP在杀虫ICK肽的N端连接，且其中杀虫组合肽使用还包
含与杀虫CRIP肽有效连接的ERSP (内质网信号肽)的遗传盒产生，其中所述ERSP在杀虫
CRIP肽的N端连接，其中ERSP为BAAS。
[0565] 我们描述了掺入和表达本文公开的组合肽的转基因植物，其中所述组合肽使用还包含表达与杀虫CRIP (肽)有效连接的二肽的核苷酸的遗传盒产生，其中编码所述二肽，使得它在杀虫CRIP的N端共价连接；且其中二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成。我们描述了转基因植物，其中转化肽包括具有N端甘氨酸-丝氨酸的二肽。我们描述了转基因植物，其中所表达的杀虫肽是CRIP和PFIP (或Bt肽)的任
何杀虫肽组合，其允许肽进入肠，然后抑制昆虫的电压门控钙通道和钙激活的钾通道两者。
何杀虫肽组合，其允许肽进入肠，然后抑制昆虫的电压门控钙通道和钙激活的钾通道两者。
[0566] 我们描述了转基因植物，其中重组产生的杀虫CRIP肽来源于澳大利亚漏斗网蜘蛛或海葵，并且我们描述和提供用来自选自澳毒蜘蛛属或Hadronyche 属的澳大利亚漏斗网蜘蛛的蜘蛛或选自Anemonia viridi 的海葵的CRIP转化的转化植物的实际或理论上的
实例。转基因植物可具有所表达的是杂合-ACTX-Hv1a的杀虫ICK肽。CRIP可以是当表达
时含有20-100个氨基酸和2-4个二硫键的ICK或非ICK。PIP肽可与SEQ ID NO: 33和/
或选自SEQ ID NO: 33-1032的肽具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、
96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性。
实例。转基因植物可具有所表达的是杂合-ACTX-Hv1a的杀虫ICK肽。CRIP可以是当表达
时含有20-100个氨基酸和2-4个二硫键的ICK或非ICK。PIP肽可与SEQ ID NO: 33和/
或选自SEQ ID NO: 33-1032的肽具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、
96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性。
[0567] 我们描述了转基因植物，其中Bt蛋白是任何杀虫Bt蛋白，且其中Bt蛋白是Cry或Cyt蛋白，且其中Bt蛋白选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫蛋白TIC810或TIC812的组合和二元杀虫蛋白PS149B1，且其中Bt蛋白选自Cry蛋白、Cry1A蛋白或Cry1F蛋白，且其中Bt蛋白是Cry1F-Cry1A蛋白的组合和/或
Dipel和/或Thuricide。
Dipel和/或Thuricide。
[0568] 我们描述了转基因植物，其中转化植物的普通叶片中Bt和ICK/非ICK肽的平均浓度为约：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%的总的可回收的可溶性蛋白，或这些值的任两个之间的任何范围，且其中转化植物表达在转化植物中肽正确折叠的毒肽，且其中它引起表达的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积，且引起植物的产量或对虫害的抗性增加。我们描述了控制昆虫的这些组合物和程序。
[0569] 我们描述了包含表达本文提及的任何肽的任何核苷酸的表达盒。我们描述了掺入转化植物中的功能表达盒，其包含编码本文公开的任何肽或鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人员制备的核苷酸。我们描述了用于产生具有或表达本文所述任何组合肽的转化植物的程序。我们描述了一种由本文所述任何产品和处置方法产生的植物。
[0570] 我们描述了本文所述任何肽或核苷酸产生植物或将这些肽或核苷酸转化至植物中的用途；用于在植物中产生这些蛋白质的方法和技术；和/或包含任何肽的表达盒和将所述表达盒转化至植物基因组中的方法；使用、制备任何所述肽或核苷酸或将其转化至植物中的任何方法；用于在包含任何所公开的肽及其相应核苷酸的植物中产生具有或表达任何肽和功能表达盒的转化植物的方法和技术；和通过本文所述产品和处置方法制备的任何植物。
[0571] 我们描述了包含与本文所述核酸或表达盒有效连接的在植物中有活性的启动子的嵌合基因和制备、生产或使用本文所述基因的组合的方法。我们描述了包含本文所述基因的组合的重组载体。我们描述了制备、生产或使用以下的方法：重组载体、包含基因的组合的转基因宿主细胞、是转基因植物细胞的转基因宿主细胞、转基因植物和是以下植物的转基因植物：玉米、大豆、棉、稻、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、马铃薯或番茄和这些和其它植物的种子，且其中种子包含嵌合基因。
[0572] 我们描述了控制昆虫或控制昆虫所在地的方法，所述方法包括：向所述昆虫施用PFIP，像Bt (苏云金芽孢杆菌)蛋白；接着施用下列的任一种或任何组合：向所述昆虫施用富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIP)，组合或备选地，向所述昆虫施用杀虫ICK (抑制物胱氨酸结)肽，组合或备选地，向所述昆虫施用非ICK CRIP肽，组合或备选地，向所述昆虫施用TMOF肽，向所述昆虫施用海葵肽。
[0573] 我们解释了施用Bt蛋白和杀虫CRIP、ICK和/或TMOF肽，使得共同产生效果，但它们不必同时施用。PFIP像Bt蛋白和杀虫CRIP、ICK和/或TMOF肽可同时或序贯施用。
[0574] 我们如下解释了量：以干重基础计，Bt与CRIP、Bt与ICK、Bt与非ICK CRIP、Bt与TMOF或Bt与ICK和TMOF的比率选自大致下列比率：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、
15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合；或者，以干重基础计，Bt与CRIP、Bt与ICK、Bt与非ICK CRIP、Bt与TMOF、或Bt与ICK和TMOF的比率选自大致下列比
率：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、
0.1:99.9和0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。
15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值的任两个的任何组合；或者，以干重基础计，Bt与CRIP、Bt与ICK、Bt与非ICK CRIP、Bt与TMOF、或Bt与ICK和TMOF的比率选自大致下列比
率：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、
0.1:99.9和0.01:99.99或这些值的任两个的任何组合。
[0575] 我们解释了Bt + CRIP、Bt + ICK、Bt+非ICK CRIP、Bt + TMOF或Bt + ICK + TMOF的两种或全部来源于Bt、ICK和TMOF肽和/或Bt和CRIP、ICK、非ICK CRIP、Bt和TMOF或Bt和ICK + TMOF的两种的一种以上的不同类型或细菌菌株来源；Bt +海葵肽来源于Bt、
CRIP、ICK、非ICK CRIP、海葵肽或TMOF肽的任一种、2种或更多种的2-5种不同类型或细菌菌株来源，和/或Bt、ICK和TMOF肽的任一种、2种或全部来源于Bt和ICK肽任一种或两
种的2-15种不同类型或细菌菌株来源且Bt、CRIP、ICK、非ICK CRIP、海葵肽或TMOF肽的任一种、2种或全部的至少一个菌株由1拷贝以上的Bt、CRIP、ICK、非ICK CRIP、海葵肽或TMOF基因的1、2种或全部编码。
CRIP、ICK、非ICK CRIP、海葵肽或TMOF肽的任一种、2种或更多种的2-5种不同类型或细菌菌株来源，和/或Bt、ICK和TMOF肽的任一种、2种或全部来源于Bt和ICK肽任一种或两
种的2-15种不同类型或细菌菌株来源且Bt、CRIP、ICK、非ICK CRIP、海葵肽或TMOF肽的任一种、2种或全部的至少一个菌株由1拷贝以上的Bt、CRIP、ICK、非ICK CRIP、海葵肽或TMOF基因的1、2种或全部编码。
[0576] 我们解释了1、2或全部Bt、ICK和TMOF肽来源于1、2或全部Bt、ICK和TMOF肽的一种以上的不同类型或细菌菌株来源，1、2或全部Bt、ICK和TMOF肽的全部菌株在所述组合物提供超过至少1%的来自各菌株类型的肽。组合物中Bt和CRIP肽的总浓度选自下列
百分比浓度：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。
百分比浓度：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%或这些值的任两个之间的任何范围，组合物的剩余百分比由赋形剂组成。
[0577] 我们还提供本领域的技术人员可制备包含PFIP例如Bt蛋白；和CRIP例如杀虫ICK或非ICK肽；和/或TMOF肽的制剂的足够信息。我们解释了所述制剂可使用极性非
质子溶剂和极性质子溶剂制备并且还包含水。在一些制剂中，极性非质子溶剂以1-99 wt%的量存在，极性质子溶剂以1-99 wt%的量存在，水以0-98 wt%的量存在，并且它还可包含MSO。
质子溶剂和极性质子溶剂制备并且还包含水。在一些制剂中，极性非质子溶剂以1-99 wt%的量存在，极性质子溶剂以1-99 wt%的量存在，水以0-98 wt%的量存在，并且它还可包含MSO。
[0578] 实施例1使用SDP 1234604和1234605针对Mud Lakes Farms Romaine Lettuce上的甜菜夜蛾
(Spodoptera exigua)的叶生物测定
目的：设计该实验的目的是测定在叶片叶盘生物测定中当将SDP 1234604 (wp制剂)
和605 (pre-gran制剂)针对第1、第2、第3和第4龄期幼虫喷洒时，针对甜菜夜蛾发生的
百分比死亡率。
(Spodoptera exigua)的叶生物测定
目的：设计该实验的目的是测定在叶片叶盘生物测定中当将SDP 1234604 (wp制剂)
和605 (pre-gran制剂)针对第1、第2、第3和第4龄期幼虫喷洒时，针对甜菜夜蛾发生的
百分比死亡率。
[0579] 测定准备和处理制剂：甜菜夜蛾卵接收自Benzon Research。将卵置于10℃的冷酒器中2天，然后移到设置为28℃和2-30%相对湿度的VWR低温培养箱在LED光下的架子上，直到新孵化的新生虫约24小时龄，用于第一个实验。在07/09/12收到Mud Lake Farms莴苣，并保存在4℃冰箱中备用。对于各龄期，在培养箱中24小时后，将幼虫置于mud lakes farms莴苣上。切下莴苣叶，置于中方格聚乙烯容器中，将幼虫轻拍到容器中。24小时后，从旧莴苣上取出幼虫，置换新鲜莴苣，使得幼虫用优良组织饲养。这进行一天一次达3天，直到幼虫96小时龄。使用2 ¼英寸弓形模(arch)将莴苣叶切成圆盘，弓形模用70%乙醇消
毒和清洗以除去之前测定的任何叶组织。将叶盘在true bamboo砧板上钻孔。在不损伤叶盘的情况下，使用非常稀的12ppm漂白溶液(6ppt次氯酸盐{Clorox Bleach}原液，1/500
稀释度)消毒叶组织后4次漂洗。在大的长方形聚乙烯容器(盖上盖子)中，将切下的叶
盘放入12ppm漂白溶液中，在轨道式振荡器上以3500rpm振荡1.5分钟，对叶盘进行12ppm
漂白处理。然后将漂白溶液从箱中沥出，在箱中将叶用dH2O漂洗4次，在轨道式振荡器上在diH2O中轻轻振荡除去剩余的漂白液。将叶盘放在纸巾上，用另外的纸巾覆盖，使得它们不变干。然后仅最平的圆形和均匀的圆盘用Kimwipes手动干燥，除去任何剩余的水，放入标记过的Tupperware容器，远轴侧向上以便喷洒。在此期间，在50mL Falcon管(确保管
中充满去离子H2O)中制备用于叶盘上的喷雾干燥的粉末的喷雾溶液的制剂(如下表所述)
后，加入精确计量的喷雾干燥的粉末。在Labconco通风橱E207中从叶盘腹侧开始进行喷
洒。对于喷洒，带有压风管路(airline)的复动内部混合喷枪(Paasch Airbrush Company，Chicago IL)设置为200µL/秒钟(20psi)的速度。叶盘用垂直于叶表面的喷枪以循环方
式喷洒，使得细雾均匀地覆盖整个叶表面(约3-4秒钟)。在每次处理喷洒之间，用dH2O
冲洗装有喷雾溶液的杯，除去之前处理的任何残余物。在喷洒后，允许干燥1小时然后，晃动圆盘，使得其近轴侧在Tupperware容器中面朝上取向，以相同方式喷洒。在喷洒近轴侧后，允许干燥1小时，并将叶盘放入在底部具有2 90mm Whatman 3 Qualitative滤纸(GE Healthcare UK Limited，Amersham Place Little Chalfont，Buckinghamshire，HP7 9NA，UK)的经标记的培养皿中，所述滤纸已使用Eppendorf Repeater Plus和25mL触头(tip)，用4mL的diH2O浸湿。在使用#0细毛刷，取白纸板，并将24、48、72或96小时新生蛾的容
器清空到上面，以将约7-9个新孵化的新生甜菜夜蛾加到各叶盘上后，盖上培养皿并随机使用。将板用石蜡膜密封，并随机放在27℃下的支架上用于统计目的。次日在18、24、40和
48小时期间，通过观察死亡和记录未处理和处理叶间的任何差异，对实验进行评分。
毒和清洗以除去之前测定的任何叶组织。将叶盘在true bamboo砧板上钻孔。在不损伤叶盘的情况下，使用非常稀的12ppm漂白溶液(6ppt次氯酸盐{Clorox Bleach}原液，1/500
稀释度)消毒叶组织后4次漂洗。在大的长方形聚乙烯容器(盖上盖子)中，将切下的叶
盘放入12ppm漂白溶液中，在轨道式振荡器上以3500rpm振荡1.5分钟，对叶盘进行12ppm
漂白处理。然后将漂白溶液从箱中沥出，在箱中将叶用dH2O漂洗4次，在轨道式振荡器上在diH2O中轻轻振荡除去剩余的漂白液。将叶盘放在纸巾上，用另外的纸巾覆盖，使得它们不变干。然后仅最平的圆形和均匀的圆盘用Kimwipes手动干燥，除去任何剩余的水，放入标记过的Tupperware容器，远轴侧向上以便喷洒。在此期间，在50mL Falcon管(确保管
中充满去离子H2O)中制备用于叶盘上的喷雾干燥的粉末的喷雾溶液的制剂(如下表所述)
后，加入精确计量的喷雾干燥的粉末。在Labconco通风橱E207中从叶盘腹侧开始进行喷
洒。对于喷洒，带有压风管路(airline)的复动内部混合喷枪(Paasch Airbrush Company，Chicago IL)设置为200µL/秒钟(20psi)的速度。叶盘用垂直于叶表面的喷枪以循环方
式喷洒，使得细雾均匀地覆盖整个叶表面(约3-4秒钟)。在每次处理喷洒之间，用dH2O
冲洗装有喷雾溶液的杯，除去之前处理的任何残余物。在喷洒后，允许干燥1小时然后，晃动圆盘，使得其近轴侧在Tupperware容器中面朝上取向，以相同方式喷洒。在喷洒近轴侧后，允许干燥1小时，并将叶盘放入在底部具有2 90mm Whatman 3 Qualitative滤纸(GE Healthcare UK Limited，Amersham Place Little Chalfont，Buckinghamshire，HP7 9NA，UK)的经标记的培养皿中，所述滤纸已使用Eppendorf Repeater Plus和25mL触头(tip)，用4mL的diH2O浸湿。在使用#0细毛刷，取白纸板，并将24、48、72或96小时新生蛾的容
器清空到上面，以将约7-9个新孵化的新生甜菜夜蛾加到各叶盘上后，盖上培养皿并随机使用。将板用石蜡膜密封，并随机放在27℃下的支架上用于统计目的。次日在18、24、40和
48小时期间，通过观察死亡和记录未处理和处理叶间的任何差异，对实验进行评分。
[0580] 图19表示在18、24、40和48小时每个实验记录的4个实验的百分比死亡率结果。非喷雾干燥对照处理显示任何处理的最低平均死亡率。在18小时评分时观察到大多数昆
虫死亡，通过40和48小时评分显示，在40和48小时观察到其它死亡。健康昆虫具有明显
的绿色(叶绿素样颜色)，当用漆刷戳弄时有快速回避反应，且平均生长48小时。与24和
48小时龄幼虫相比，72和96小时幼虫的百分比死亡率结果显著下降。显然，仅Bt蛋白和
杂合肽两者的处理在控制老龄昆虫时失效。
虫死亡，通过40和48小时评分显示，在40和48小时观察到其它死亡。健康昆虫具有明显
的绿色(叶绿素样颜色)，当用漆刷戳弄时有快速回避反应，且平均生长48小时。与24和
48小时龄幼虫相比，72和96小时幼虫的百分比死亡率结果显著下降。显然，仅Bt蛋白和
杂合肽两者的处理在控制老龄昆虫时失效。
[0581] 实施例2使用SDP 1234605针对Mud Lakes Farms Romaine Lettuce上的甜菜夜蛾的叶生物测
定法。
定法。
[0582] 目的：设计该实验的目的是测定在叶片叶盘生物测定中当SDP 1234605针对72小时龄幼虫喷洒时和将Dipel DF与SDP 1234605共同喷洒时，针对甜菜夜蛾发生的百分比死亡率。
[0583] 测定准备和处理制剂：参见实施例1的准备。甜菜夜蛾卵接收自BenzonResearch。在使用#0细毛刷，取白纸板，并将72小时龄幼虫的容器清空在上面，将约7-9个新孵化的新生甜菜夜蛾加到各叶盘上后，盖上培养皿并随机使用。将板用石蜡膜密封并随机放在27℃下的支架上用于统计目的。次日在18、24和48小时期间，通过观察死亡和记录未处理和处理叶间的任何差异，对实验进行评分。
[0584] 图20表示在18、24和48小时的柱状图实施例2数据。10千分率(ppt)的含杂合肽的制剂‘605和300百万分率(ppm)的Dipel分别显示相对于未处理对照或表面活性剂
死亡率几乎无改进。然而，当组合时，48小时84.4%的所得死亡率出人意料地超过自分别处理的相加效应(29.1%)所预期的死亡率。各个组分的协同作用为至少2.9倍(84.4/29.1)。
未预料到的是，通过脓毒病消杀的杀虫蛋白与调节CNS中的离子通道的杀虫肽是协同作用的。
死亡率几乎无改进。然而，当组合时，48小时84.4%的所得死亡率出人意料地超过自分别处理的相加效应(29.1%)所预期的死亡率。各个组分的协同作用为至少2.9倍(84.4/29.1)。
未预料到的是，通过脓毒病消杀的杀虫蛋白与调节CNS中的离子通道的杀虫肽是协同作用的。
[0585] 实施例3我们研究了苏云金芽孢杆菌(Bt)蛋白和来自海葵的Av2肽的组合的潜在的相加效应
和/或协同效应。我们使用是市售的Bt产品Dipel DF和市售的Av2毒海葵肽。
和/或协同效应。我们使用是市售的Bt产品Dipel DF和市售的Av2毒海葵肽。
[0586] 方法：从购自本地杂货店的甘蓝内部叶片上切下小叶盘(约2cm)。将圆盘浸入400 μL处理液中，放入约4.5 cm调味杯底部的4.25 cm #4滤纸圆盘(Whatman)上。每个处理准备4个圆盘。将75 μL水加入较大滤纸圆盘顶上的第二个较小的3.2 cm #1滤纸圆盘
(Whatman)中。允许叶盘干燥约10分钟后，每个叶盘加入4个120小时龄Cry1a抗性小菜
蛾(Plutella xylostella)。调味杯用无穿孔盖密封。将处理物放入培养箱中，在24和48小时针对死亡和摄食损害进行评分。由于在许多处理中叶盘大量消耗，在24小时加入额外的3.2 cm未处理叶盘以确保不发生幼虫饥饿。
(Whatman)中。允许叶盘干燥约10分钟后，每个叶盘加入4个120小时龄Cry1a抗性小菜
蛾(Plutella xylostella)。调味杯用无穿孔盖密封。将处理物放入培养箱中，在24和48小时针对死亡和摄食损害进行评分。由于在许多处理中叶盘大量消耗，在24小时加入额外的3.2 cm未处理叶盘以确保不发生幼虫饥饿。
[0587] 在24和48小时，使用Iphone 4S (Apple Inc.)拍摄叶盘照片，并保存。从群处理照片裁剪各个叶盘照片，并随机编号。使用程序ImageJ，计算被摄食的叶面积。在imageJ中打开图像，并在照片中设置比例尺。为了设置比例尺，使用段线工具，画出照片中单位为厘米(cm)的已知距离并测量，单位为像素单位。对于该实验，滤纸圆盘的已知直径对于#1滤纸圆盘为1.5 cm，对于#4 Whatman滤纸圆盘为4.5 cm。使用单位为cm的已知长度，在图像中转化为像素单位为厘米。一旦测定比例尺，使用徒手画选择工具在叶组织保留的区域周围勾画。对于所有照片重复该过程，确保实验室笔记本中通过image J计算对数面积。
2
对于该实验，未摄食叶盘的对照面积为2.54cm，进行计算以测定%摄食面积。
2
对于该实验，未摄食叶盘的对照面积为2.54cm，进行计算以测定%摄食面积。
[0588] 处理：150 PPM Dipel DF：200 μL 300 PPM Dipel DF + 200 μL水
1 PPT Av2：含0.1 mg Av2的100 μL水(合并的4个小瓶1 PPT Av2 用于必需的400
μL处理)
150 PPM Dipel DF + 1PPT Av2：100 μL 150 PPM Dipel DF加入0.1mg Av2 (合并4
个小瓶用于必需的400 μL处理)
图21表示产生自甘蓝叶盘上的Bt蛋白抗性菱形斑纹蛾幼虫(120小时龄)的百分比
摄食损害。24小时和48小时两者下的评分显示相对于只用Dipel处理显著改进。虽然这
些昆虫对Bt有抗性，但它们仍饲喂至未死亡的有限程度。组合处理导致对叶片材料的保护显著改善。此外，仅用Av2处理对摄食损害无作用，它只有与Bt蛋白组合，其效果才显得明显。这与通过Bt蛋白可提高Av2的生物利用度一致。
1 PPT Av2：含0.1 mg Av2的100 μL水(合并的4个小瓶1 PPT Av2 用于必需的400
μL处理)
150 PPM Dipel DF + 1PPT Av2：100 μL 150 PPM Dipel DF加入0.1mg Av2 (合并4
个小瓶用于必需的400 μL处理)
图21表示产生自甘蓝叶盘上的Bt蛋白抗性菱形斑纹蛾幼虫(120小时龄)的百分比
摄食损害。24小时和48小时两者下的评分显示相对于只用Dipel处理显著改进。虽然这
些昆虫对Bt有抗性，但它们仍饲喂至未死亡的有限程度。组合处理导致对叶片材料的保护显著改善。此外，仅用Av2处理对摄食损害无作用，它只有与Bt蛋白组合，其效果才显得明显。这与通过Bt蛋白可提高Av2的生物利用度一致。
[0589] 实施例4使用SDP 1234609和DiPel DF针对Earthbound Farms Romaine Lettuce上的叶生物
测定
目的：该实验的目的是测定在叶片叶盘生物测定中当针对120小时龄幼虫喷洒SDP
1234609时和在Dipel DF与SDP 1234609共喷洒时，针对Bt抗性(HD-1)小菜蛾发生的百
分比死亡率。
测定
目的：该实验的目的是测定在叶片叶盘生物测定中当针对120小时龄幼虫喷洒SDP
1234609时和在Dipel DF与SDP 1234609共喷洒时，针对Bt抗性(HD-1)小菜蛾发生的百
分比死亡率。
[0590] 测定准备和处理制剂：参见实施例1的准备。
[0591] 图22表示在24和48小时的柱状图实施例4数据。1千分率(ppt)的含杂合肽的制剂‘609和150百万分率(ppm)的Dipel分别相对于未处理对照或表面活性剂显示死亡率
几乎无改进。然而，当组合时，在48小时62.5%的所得死亡率出人意料地超过自分别处理的相加效应所预期的死亡率(21.8%)。各个组分的协同作用为至少2.86倍(62.5/21.8)。
此外，未预料到的是，通过脓毒病消杀的杀虫蛋白与调节CNS中的离子通道的杀虫肽是协同作用的。
几乎无改进。然而，当组合时，在48小时62.5%的所得死亡率出人意料地超过自分别处理的相加效应所预期的死亡率(21.8%)。各个组分的协同作用为至少2.86倍(62.5/21.8)。
此外，未预料到的是，通过脓毒病消杀的杀虫蛋白与调节CNS中的离子通道的杀虫肽是协同作用的。
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