选择棉花根结线虫抗性棉花植物的方法和组合物
阅读：571发布：2020-05-29
专利汇可以提供选择棉花根结线虫抗性棉花植物的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 植物 育种和抗病性领域。更具体地说，本发明提供一种培育含有一个或多个与根结 线虫 (RKN)抗性相关的数量性状基因座的 棉 花植物的方法，RKN是与南方根结线虫相关的病害。本发明还提供含有用于渗入优良种质中的赋予抗病性的数量性状基因座(QTL)的种质和该种质在育种计划中的应用，从而产生包含一个或多个RKN抗性QTL的新型优良种质。，下面是选择棉花根结线虫抗性棉花植物的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.一种在其基因组中包含根结线虫抗性基因座RKN-1和RKN-2的棉花植物，该植物是
通过包括以下步骤的方法产生的：
a.将至少一个根结线虫抗性棉花植物与至少一个其它棉花植物杂交，以形成根结线虫
抗性分离的群体；
b.使用至少一个选自表3的SNP标记和至少一个选自表3A的SNP标记，对所述群体中
的至少一个棉花植物进行基因型分型；和
c.鉴定在RKN-1基因座和RKN-2基因座处各包含所需基因型的棉花植物，其中所述所
需基因型能够赋予所述鉴定的棉花植物根结线虫抗性。
2.如权利要求1所述的棉花植物，其中所述至少一个选自表3的SNP标记是
NG0204877。
3.如权利要求1所述的棉花植物，其中所述至少一个选自表3A的SNP标记是
NG0206957、NG0207837和NG0207518。
4.如权利要求1所述的棉花植物，其中所述棉花植物显示转基因性状。
5.如权利要求4所述的棉花植物，其中所述转基因性状选自除草剂耐受性、产量增加、昆虫控制、真菌病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌病抗性、支原体病抗性、油产生改变、高产油量、高蛋白质产量、发芽和/或幼苗生长的控制、动物和人类营养增强、低棉子糖、环境应激抗性、可消化性提高、加工性状改善、风味改善、固氮、杂种种子的产生和变应原性降低。
6.一种培育能够抵抗根结线虫的棉花植物的方法，包括以下步骤：
a.提供棉花植物群体；
b.使用至少一个选自表3的SNP标记，对所述群体中的至少一种棉花植物针对RKN-1
基因座进行基因型分型；和
c.鉴定至少一个在RKN-1基因座处包含所需基因型的棉花植物，其中所述所需基因型
能够赋予所述鉴定的棉花植物根结线虫抗性。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述棉花植物群体是通过将至少一个根结线虫抗
性棉花植物与至少一个其它棉花植物杂交形成群体而产生的。
8.如权利要求6所述的方法，进一步包括使所鉴定的至少一个棉花植物暴露于诱发根
结线虫病的病原体。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述鉴定的至少一个棉花植物显示不差于大约2.0
的根结线虫抗性反应等级。
10.如权利要求6所述的方法，其中所述至少一个选自表3的SNP标记是NG0204877。
11.一种选择在其基因组中包含根结线虫抗性基因座RKN-1和RKN-2的棉花植物的方
法，包括以下步骤：
a.提供棉花植物群体；
b.使用至少一个选自表3的SNP标记和至少一个选自表3A的SNP标记，对所述群体中
的至少一个棉花植物进行基因型分型；和
c.选择在RKN-1基因座和RKN-2基因座处各包含所需基因型的棉花植物，其中所述所
需基因型能够赋予所述鉴定的棉花植物根结线虫抗性。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述群体是通过将至少一个根结线虫抗性棉花
植物与至少一个其它棉花植物杂交形成群体而产生的。
13.如权利要求11所述的方法，进一步包括使所选择的棉花植物暴露于诱发根结线虫
病的病原体。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述选择的棉花植物显示不差于大约2.0的根结
线虫抗性反应等级。
15.如权利要求11所述的方法，其中所述至少一个选自表3的SNP标记是NG0204877。
16.如权利要求11所述的方法，其中所述至少一个选自表3A的SNP标记是NG0206957、
NG0207837和NG0207518。
17.一种基本纯化的用于检测与根结线虫抗性相关的基因座的核酸分子，包括选自SEQ ID NO：6、8、9、12、13、15-17、22、25、28-32、34-36、64-66、69、71、72、76-78、80-83、85、89 的核酸分子。
选择棉花根结线虫抗性棉花植物的方法和组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2008年8月28日提交的美国临时申请61/092649的权益。该申请的全部在此引入作为参考。
[0004] 包含于2009年8月25日创建的、70.5千字节(在MS- 中确定)的名为“pa_53664.txt”的文件的序列表包括103个核苷酸序列，并且通过引用全部并入本文。
技术领域
[0005] 本发明属于植物育种和抗病性的领域。更具体地说，本发明包括一种培育含有与棉花根结线虫(RKN)抗性相关的数量性状基因座的棉花植物的方法，RKN是与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)(Kofoid和White)Chitwood相关的病害。本发明还包括含有用于渗入优良种质中的赋予抗病性的数量性状基因座(QTL)的种质和该种质在育种计划中的应用，从而产生包含一个或多个棉花RKN抗性QTL的新型优良种质。
背景技术
[0006] 棉花根结线虫(RKN)是一种破坏性的线虫，它在棉花植物的根上形成瘿瘤(gall)。其病原体是南方根结线虫(Meloidogyneincognita)(Kofoid和White)Chitwood，一种能够感染多种植物种的线虫。在受到感染的植物中，营养物质和水的吸收减少，植物可能变得对其它病原体敏感，特别是对镰刀菌萎蔫病(Fusarium wilt)敏感(Minton，N.A.和Minton E.B.，Phytopathology 56：319-322(1966))。因此，感染了RKN的植物的产量降低。仅在美国，估计2004年10.93％的棉花产量损失是由RKN引起的(Blasingame和Patel，
2005)。RKN在整个美国产棉地带广泛传播。减轻RKN损害的方法包括将棉花作物与不敏感的作物轮种，以及施用昂贵的杀线虫剂。但是，对于棉花种植者而言，减少由RKN引起的产量损失和作物损害的最有效的方法是种植RKN抗性棉花品种。因此，需要开发这样的RKN抗性棉花品种，并且需要加快这些品种开发的方法。植物育种者可以使用遗传标记作为间接手段来选择具有有利的等位基因的植物。已经报道了染色体A11上的主要RKN抗性基因座(Kai，W.等人.Theor.Appl.Genet.113：73-80(2006))。利用RKN抗性等位基因的标记辅助的选择可以大大促进RKN抗性棉花品种的培育。棉花中的RKN抗性已经在不同种质系诸如Aubum 623RNR和Acala NemX中报道。但是，具有RKN抗性的商业栽培品种是有限的。与RKN抗性相关的遗传标记的鉴定在棉花育种计划中具有很大的价值。用于鉴定RKN抗性植物的RAPD、AFLP和RGA标记已经在使用近等基因系(NIL)的研究中鉴定(Niu，C.等人，CropScience 47：951-960(2007))。植物中与RKN抗性相关的遗传标记也包括SSR标记(Wang，C.等人.Theor.Appl.Genet.112：770-777(2006))。
2005)。RKN在整个美国产棉地带广泛传播。减轻RKN损害的方法包括将棉花作物与不敏感的作物轮种，以及施用昂贵的杀线虫剂。但是，对于棉花种植者而言，减少由RKN引起的产量损失和作物损害的最有效的方法是种植RKN抗性棉花品种。因此，需要开发这样的RKN抗性棉花品种，并且需要加快这些品种开发的方法。植物育种者可以使用遗传标记作为间接手段来选择具有有利的等位基因的植物。已经报道了染色体A11上的主要RKN抗性基因座(Kai，W.等人.Theor.Appl.Genet.113：73-80(2006))。利用RKN抗性等位基因的标记辅助的选择可以大大促进RKN抗性棉花品种的培育。棉花中的RKN抗性已经在不同种质系诸如Aubum 623RNR和Acala NemX中报道。但是，具有RKN抗性的商业栽培品种是有限的。与RKN抗性相关的遗传标记的鉴定在棉花育种计划中具有很大的价值。用于鉴定RKN抗性植物的RAPD、AFLP和RGA标记已经在使用近等基因系(NIL)的研究中鉴定(Niu，C.等人，CropScience 47：951-960(2007))。植物中与RKN抗性相关的遗传标记也包括SSR标记(Wang，C.等人.Theor.Appl.Genet.112：770-777(2006))。
[0007] 在标记类型中，SNP具有使它们在检测、选择和在棉花植物中渗入RKN抗性方面优于其它遗传标记的特性。SNP是优选的，因为可以获得自动化、高通量筛选SNP标记的技术，这些技术可以缩短选择和向大豆植物中渗入RKN抗性的时间。此外，SNP标记是理想的，因为特定SNP等位基因来自于特定物种的现存群体中的独立来源的可能性非常低。因此，遗传连锁的SNP标记可用于跟踪和辅助RKN抗性等位基因的渗入，特别是在证实存在于抗性供体亲本中的RKN抗性单元型的情况下。存在对用于鉴定RKN抗性棉花植物的基于SNP的标记组的需要。本发明提供用于鉴定RKN抗性植物的基于SNP的标记。
发明内容
[0008] 本发明提供一种将与根结线虫(RKN)抗性相关的等位基因渗入棉花植物中的方法，包括以下步骤：(a)提供棉花植物群体；(b)针对选自SEQ ID NO：1-38的棉花基因组核酸标记，对该群体中的至少一个棉花植物进行基因型分型；和(c)从该群体中选择至少一个包含至少一种与RKN抗性相关的等位基因的棉花植物。提供的群体可以通过将至少一个RKN抗性棉花植物与至少一个RKN敏感性植物杂交形成群体而产生。
[0009] 一方面，使用0-5的指标化量表，其中0为无线虫的植物，5＝100％的根具有瘿瘤，通过本发明的方法选择的棉花植物显示不差于大约2.0的RKN抗性反应等级。
[0010] 一方面，本发明的方法进一步包括步骤(d)测定选择的棉花植物对诱发RKN病的病原体的抗性。在进一步的方面，通过一种分析确定基因型，该分析选自单碱基延伸(SBE)、等位基因特异性引物延伸测序(ASPE)、DNA测序、RNA测序、基于微阵列的分析、通用PCR、等位基因特异性延伸、杂交、质谱法、连接、延伸-连接和瓣核酸内切酶介导的分析(Flap Endonuclease-mediated assay)。在进一步的方面，棉花基因组核酸标记是SEQ ID NO：33。
[0011] 本发明还提供通过以下步骤产生的优良棉花植物：(a)提供棉花植物群体；(b)针对选自SEQ ID NO：1-38的棉花基因组核酸标记，对该群体中的至少一个棉花植物进行基因型分型；和(c)从该群体中选择至少一个包含至少一个与RKN抗性相关的等位基因的棉花植物。本发明的优良棉花植物可以显示转基因性状。该转基因性状选自除草剂耐受性、产量增加、昆虫控制、真菌病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌病抗性、支原体病抗性、油产生改变、高产油量、高蛋白质产量、发芽和/或幼苗生长的控制、动物和人类营养增强、低棉子糖、环境应激抗性、可消化性提高、加工性状改善、风味改善、固氮、杂种种子的产生和变应原性降低。除草剂耐受性可以选自对草甘膦、麦草畏、草丁膦、磺脲、溴苯腈、2，4-二氯苯氧基乙酸和达草灭除草剂的耐受性。
[0012] 本发明还提供一种将至少一个RKN抗性等位基因渗入棉花植物中的方法，包括：(a)提供棉花植物群体；(b)用至少一种核酸标记筛选该群体；(c)从该群体中选择一个或多个包含一个或多个RKN抗性相关的等位基因的棉花植物。一方面，选择的棉花植物显示不差于大约2.0的RKN抗性反应等级。本发明还提供通过以下步骤产生的棉花植物：(a)提供棉花植物群体；(b)用至少一种核酸标记筛选该群体；(c)从该群体中选择一个或多个包含一个或多个RKN抗性相关的等位基因的棉花植物。
[0013] 本发明还提供一种基本纯化的用于检测与RKN抗性相关的基因座的核酸分子，包括选自SEQ ID NO：1-62及其互补序列的核酸分子。本发明还提供一种用于检测棉花DNA中代表多态性的分子标记的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含至少15个包含或邻近该多态性的核苷酸，其中该核酸分子与包含或邻近该多态性的任一DNA链中相同数目连续核苷酸的序列至少90％相同，并且其中该分子标记选自SEQ IDNO：1-38。一方面，分离的核酸进一步包含可检测的标记物或提供可检测的标记物的掺入。在进一步的方面，可检测的标记物选自同位素、荧光团、氧化剂、还原剂、核苷酸和半抗原。
[0014] 本发明还提供一组寡核苷酸，包括a)一对寡核苷酸引物，其中每条引物包含至少12个连续核苷酸，并且其中这对引物允许PCR扩增包含选自SEQ ID NO：1-38的分子标记的DNA片段，和b)允许检测扩增片段中的多态性的至少一种检测寡核苷酸，其中该检测寡核苷酸的序列与步骤(a)的包含或邻近多态性的棉花DNA片段任一链中相同数目连续核苷酸的序列至少95％相同。
[0015] 核酸的简要说明
[0016] SEQ ID NO：1是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉(Gossypium hirsutum)的基因组序列。
[0017] SEQ ID NO：2是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0018] SEQ ID NO：3是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0019] SEQ ID NO：4是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0020] SEQ ID NO：5是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0021] SEQ ID NO：6是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0022] SEQ ID NO：7是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0023] SEQ ID NO：8是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0024] SEQ ID NO：9是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0025] SEQ ID NO：10是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0026] SEQ ID NO：11是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0027] SEQ ID NO：12是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0028] SEQ ID NO：13是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0029] SEQ ID NO：14是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0030] SEQ ID NO：15是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0031] SEQ ID NO：16是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0032] SEQ ID NO：17是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0033] SEQ ID NO：18是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0034] SEQ ID NO：19是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0035] SEQ ID NO：20是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0036] SEQ ID NO：21是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0037] SEQ ID NO：22是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0038] SEQ ID NO：23是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0039] SEQ ID NO：24是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0040] SEQ ID NO：25是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0041] SEQ ID NO：26是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0042] SEQ ID NO：27是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0043] SEQ ID NO：28是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0044] SEQ ID NO：29是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0045] SEQ ID NO：30是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0046] SEQ ID NO：31是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0047] SEQ ID NO：32是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0048] SEQ ID NO：33是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0049] SEQ ID NO：34是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0050] SEQ ID NO：35是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0051] SEQ ID NO：36是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0052] SEQ ID NO：37是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0053] SEQ ID NO：38是与染色体11上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0054] SEQ ID NO：39是用于扩增SEQ ID NO：33的正向PCR引物。
[0055] SEQ ID NO：40是用于扩增SEQ ID NO：33的反向PCR引物。
[0056] SEQ ID NO：41是用于扩增SEQ ID NO：36的正向PCR引物。
[0057] SEQ ID NO：42是用于扩增SEQ ID NO：36的反向PCR引物。
[0058] SEQ ID NO：43是用于扩增SEQ ID NO：9的正向PCR引物。
[0059] SEQ ID NO：44是用于扩增SEQ ID NO：9的反向PCR引物。
[0060] SEQ ID NO：45是用于检测SEQ ID NO：33的RKN抗性基因座的探针。
[0061] SEQ ID NO：46是用于检测SEQ ID NO：34的RKN抗性基因座的第二探针。
[0062] SEQ ID NO：47是用于检测SEQ ID NO：36的RKN抗性基因座的探针。
[0063] SEQ ID NO：48是用于检测SEQ ID NO：36的RKN抗性基因座的第二探针。
[0064] SEQ ID NO：49是用于检测SEQ ID NO：9的RKN抗性基因座的探针。
[0065] SEQ ID NO：50是用于检测SEQ ID NO：9的RKN抗性基因座的第二探针。
[0066] SEQ ID NO：51是用于检测SEQ ID NO：33的RKN抗性基因座的正向单碱基延伸探针。
[0067] SEQ ID NO：52是用于检测SEQ ID NO：33的RKN抗性基因座的反向单碱基延伸探针。
[0068] SEQ ID NO：53是用于检测SEQ ID NO：36的RKN抗性基因座的正向单碱基延伸探针。
[0069] SEQ ID NO：54是用于检测SEQ ID NO：36的RKN抗性基因座的反向单碱基延伸探针。
[0070] SEQ ID NO：55是用于检测SEQ ID NO：9的RKN抗性基因座的正向单碱基延伸探针。
[0071] SEQ ID NO：56是用于检测SEQ ID NO：9的RKN抗性基因座的反向单碱基延伸探针。
[0072] SEQ ID NO：57是用于检测SEQ ID NO：33的RKN抗性基因座的杂交探针。
[0073] SEQ ID NO：58是用于检测SEQ ID NO：33的RKN抗性基因座的第二杂交探针。
[0074] SEQ ID NO：59是用于检测SEQ ID NO：36的RKN抗性基因座的杂交探针。
[0075] SEQ ID NO：60是用于检测SEQ ID NO：36的RKN抗性基因座的第二杂交探针。
[0076] SEQ ID NO：61是用于检测SEQ ID NO：9的RKN抗性基因座的杂交探针。
[0077] SEQ ID NO：62是用于检测SEQ ID NO：9的RKN抗性基因座的第二杂交探针。
[0078] SEQ ID NO：63是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0079] SEQ ID NO：64是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0080] SEQ ID NO：65是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0081] SEQ ID NO：66是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0082] SEQ ID NO：67是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0083] SEQ ID NO：68是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0084] SEQ ID NO：69是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0085] SEQ ID NO：70是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0086] SEQ ID NO：71是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0087] SEQ ID NO：72是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0088] SEQ ID NO：73是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0089] SEQ ID NO：74是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0090] SEQ ID NO：75是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0091] SEQ ID NO：76是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0092] SEQ ID NO：77是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0093] SEQ ID NO：78是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0094] SEQ ID NO：79是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0095] SEQ ID NO：80是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0096] SEQ ID NO：81是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0097] SEQ ID NO：82是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0098] SEQ ID NO：83是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0099] SEQ ID NO：84是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0100] SEQ ID NO：85是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0101] SEQ ID NO：86是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0102] SEQ ID NO：87是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0103] SEQ ID NO：88是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0104] SEQ ID NO：89是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0105] SEQ ID NO：90是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0106] SEQ ID NO：91是与染色体7上的RKN抗性基因座相关的来源于陆地棉的基因组序列。
[0107] SEQ ID NO：92是用于扩增SEQ ID NO：73的正向PCR引物。
[0108] SEQ ID NO：93是用于扩增SEQ ID NO：73的反向PCR引物。
[0109] SEQ ID NO：94是用于扩增SEQ ID NO：74的正向PCR引物。
[0110] SEQ ID NO：95是用于扩增SEQ ID NO：74的反向PCR引物。
[0111] SEQ ID NO：96是用于扩增SEQ ID NO：75的正向PCR引物。
[0112] SEQ ID NO：97是用于扩增SEQ ID NO：75的反向PCR引物。
[0113] SEQ ID NO：98是用于检测SEQ ID NO：73的RKN抗性基因座的杂交探针。
[0114] SEQ ID NO：99是用于检测SEQ ID NO：73的RKN抗性基因座的第二杂交探针。
[0115] SEQ ID NO：100是用于检测SEQ ID NO：74的RKN抗性基因座的杂交探针。
[0116] SEQ ID NO：101是用于检测SEQ ID NO：74的RKN抗性基因座的第二杂交探针。
[0117] SEQ ID NO：102是用于检测SEQ ID NO：75的RKN抗性基因座的杂交探针。
[0118] SEQ ID NO：103是用于检测SEQ ID NO：75的RKN抗性基因座的第二杂交探针。
[0119] 发明详述
[0120] 本文提供的定义和方法限定本发明，并指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有说明，应当根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解术语。分子生物学常用术语的定义也可以在以下文献中找到：Alberts等人，Molecular Biology of The Cell，第5版，GarlandPublishing，Inc.：New York，2007；Rieger等人，Glossary of Genetics：Classical and Molecular，第 5 版，Springer-Verlag：New York，1991；King 等 人，A Dictionary of Genetics，第6版，Oxford University Press：New York，2002；和Lewin，Genes IX，Oxford University Press：New York，2007。使用如37CFR§1.822所述的DNA碱基命名法。
[0121] “等位基因”指特定的基因座处的替代序列；等位基因的长度可以小到1个核苷酸碱基，但通常较大。
[0122] “基因座”是通常由参照点发现的基因组序列上的位置；例如，作为基因或基因部分或基因间区域的DNA序列。本发明的基因座在群体中包含一种或多种多态性，即，替代的等位基因存在于一些个体中。
[0123] 如本文所用，“多态性”是指在一个或多个个体的群体中，在一个或多个基因座处存在核酸序列或核酸特征的两种或多种变异。该变异可以包括但不限于一个或多个碱基的变化、一个或多个核苷酸的插入或一个或多个核苷酸的缺失。多态性的产生可能是由于核酸复制中的随机过程，通过诱变，由于移动的基因组元件，拷贝数变异，和在减数分裂过程中，诸如不等交换、基因组复制和染色体断裂和融合。在群体中，变异可能常被发现或可能以低频率存在，前者在普通植物育种中具有更大的应用，而后者则可能与罕见但重要的表型变异有关。有用的多态性可以包括单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)、DNA序列的简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性以及标签SNP。遗传标记、基因、DNA衍生序列、单元型、RNA衍生序列、启动子、基因的5′非翻译区、基因的3′非翻译区、microRNA、siRNA、QTL、卫星标记、转基因、mRNA、ds mRNA、转录概况以及甲基化模式也可能包括多态性。另外，上述这些的存在、不存在或拷贝数的变化可能包括多态性。
[0124] 如本文所用，“标记”是指可用于区别生物体的可检测的特征。这样的特征的例子可以包括遗传标记、蛋白质组成、蛋白质水平、油组成、油水平、碳水化合物组成、碳水化合物水平、脂肪酸组成、脂肪酸水平、氨基酸组成、氨基酸水平、生物聚合物、药品、淀粉组成、淀粉水平、可发酵的淀粉、发酵产量、发酵效率、能量产量、次生化合物、代谢物、形态特征和农艺学特征。如本文所用，“遗传标记”是指多态性核酸序列或核酸特征。遗传标记可以由一个或多个特定的变异序列或共有序列代表。在另一种意义上，“遗传标记”是分离的变异体或这种序列的共有序列。
[0125] 如本文所用，“标记分析”是指使用特定方法检测特定基因座处的多态性的方法，例如，至少一种表型的测定(诸如种子颜色、花的颜色或其它视觉可检测的性状)、限制性片段长度多态性(RFLP)、单碱基延伸、电泳、序列比对、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、随机扩增的多态性DNA(RAPD)、基于微阵列的技术和核酸测序技术等。
[0126] 如本文所用，“分型”(“typing”)是指确定给定的棉花基因组多态性的特定等位基因形式的任何方法。例如，通过确定存在哪种核苷酸(即，A、G、T或C)，对单核苷酸多态性(SNP)进行分型。通过确定是否存在Indel来确定插入/缺失(Indel)。通过包括但不仅限于标记分析的多种分析方法可以对Indel进行分型。
[0127] 如本文所用，术语“邻近”，当用来描述与包含多态性的DNA杂交的核酸分子时，指的是与直接邻接该多态性核苷酸碱基位置的DNA序列杂交的核酸。例如，可在单碱基延伸分析中使用的核酸分子“邻近”该多态性。
[0128] 如本文所用，“探询位置”是指固体载体上的物理位置，可以对其进行查询以获得一个或多个预定的基因组多态性的基因型分型数据。
[0129] 如本文所用，“共有序列”是指构建的DNA序列，其鉴定基因座处等位基因的SNP和Indel多态性。共有序列可以基于基因座处DNA的任一链，并且表示该基因座中各SNP的任一个的核苷酸碱基及该基因座中的所有Indel的核苷酸碱基。因此，虽然共有序列可能不是一个实际的DNA序列的拷贝，但共有序列可用于精确设计用于基因座中的实际多态性的引物和探针。
[0130] 如本文所用，术语“单核苷酸多态性”，也缩写为“SNP”，是指单个位点上的多态性，其中，所述多态性构成单碱基对改变、一个或多个碱基对的插入或一个或多个碱基对的缺失。
[0131] 如本文所用，术语“单元型”是指由至少一种多态性分子标记限定的单元型窗口内的染色体区域。每个单元型窗口中的独特的标记指纹组合限定了该窗口的各个单元型。此外，例如重组导致的单元型的变化可能导致单元型的修饰，使其只包含与性状可操作地连锁的初始(亲本)单元型的一部分，例如，通过与基因、QTL或转基因物理连锁。单元型中的任何这样的变化都包括在我们对于构成单元型的内容的定义中，只要该基因组区域的功能完整性不变或改善。
[0132] 如本文所用，术语“单元型窗口”是指通过本领域技术人员已知的统计分析建立的，且处于连锁不平衡的染色体区域。因此，将位于该区域内的一个或多个分子标记基因座处的两个近交个体(或两个配子)之间的状态同一性(identity by state)作为整个区域的谱系同一性(identity-by-descent)的证据。每个单元型窗口包含至少一个多态性分子标记。单元型窗口可以沿基因组中的每个染色体作图。单元型窗口本身不是固定不变的，且考虑到逐渐增加的分子标记密度，本发明预计单元型窗口的数目和大小将会发展，窗口数目逐渐增加，其各自的大小逐渐减小，从而导致在根据标记基因座的状态同一性确定谱系同一性方面的置信度逐渐增加。
[0133] 如本文所用，“基因型”是指表型的遗传部分，且可以使用标记间接表征，或通过核酸测序直接表征。适当的标记包括表型特性、代谢型、遗传标记或一些其它类型的标记。基因型可以构成至少一个遗传标记基因座的等位基因或至少一个单元型窗口的单元型。在某些实施方案中，基因型可以代表单个基因座，而在其它实施方案中，它可以代表整个基因组宽的一组基因座。在另一实施方案中，基因型可以反映染色体的一部分、整个染色体、基因组的一部分和整个基因组的序列。
[0134] 如本文所用，“基因型分型”是指为了试图测定物种成员之间的遗传变异，分析一个或多个具体基因座处存在的等位基因的过程。目前的基因型分型方法包括PCR、DNA测序和探针杂交。SNP是最常见的遗传变异类型。SNP是特定基因座处的单碱基对突变，通常由两个等位基因组成。
[0135] 如本文所用，“表型”是指可能受基因型影响的细胞或生物体的可检测的特征。
[0136] 如本文所用，“连锁”是指杂交产生配子类型的相对频率。例如，如果基因座A具有基因“A”或“a”，基因座B具有基因“B”或“b”，具有AABB的亲本I与具有aabb的亲本B之间的杂交将产生4种可能的配子，其中基因分离为AB、Ab、aB和ab。空预期为独立相等地分离成4个可能的基因型中的每一个，即，如果没有连锁，每个基因型将会有1/4的配子。不等于1/4的配子向基因型的分离是由于连锁。
[0137] 如本文所用，“连锁不平衡”，在上下文中定义为一代的许多个体的群体中配子类型的相对频率。如果等位基因A的频率是p，a是p′，B是q，b是q′，那么基因型AB的预期频率(没有连锁不平衡)是pq，Ab是pq’，aB是p’q，ab是p’q’。相对于预期频率的任何偏差称为连锁不平衡。当两个基因座处于连锁不平衡时，它们被称为是“遗传连锁的”。
[0139] 如本文所用，“数量性状基因座(QTL)”是指在一定程度上控制通
[0140] 常连续分布的、可用数字表示的性状的基因座。
[0141] 如本文所用，“抗性等位基因”是指包括与根结线虫抗性相关的多态性等位基因的分离的核酸序列。
[0142] 如本文所用，“棉花”是指陆地棉，并且包括可以用棉花繁育的所有植物品种，包括野生棉花种。更具体地，来自陆地棉种和陆地棉(Gossypium hirsutum L.)亚种的棉花植物可以利用这些组合物和方法进行基因型分型。另一方面，棉花植物来自亚洲棉(Gossypiumarboreum L.)群，它另外也被称为树棉。另一方面，棉花植物来自海岛棉(Gossypium barbadense L.)群，它另外也被称为美洲皮马棉(American pima)或埃及棉。另一方面，棉花植物来自阿拉伯早棉(Gossypium herbaceum L.)群，它另外也被称为levant棉。棉属或棉花植物可以包括杂种、近交种、部分近交种或明确或不明确的群体的成员。
[0143] 如本文所用，术语“包括”是指“包括但不限于”。
[0144] 如本文所用，术语“优良品系”是指通过针对优异的农艺学表现进行育种和选择而产生的任何品系。可以商业获得的优良品系的非限制性的例子包括DP 555BG/RR、DP 445BG/RR、DP 444BG/RR、DP 454BG/RR、DP 161 B2RF、DP 141 B2RF、DP 0924 B2RF、DP 0935B2RF、DP 121 RF、DP 174 RF(Deltapine)；ST5599BR、ST5242BR、ST4554B2RF、ST4498B2RF、ST5458B2RF(Stoneville)；FM9058F、FM9180B2F、FM1880B2F、FM1740B2F(FiberMax)；PHY485WRF、PHY375WRF、PHY745WRF(Acala)(PhytoGen)； 和MCS0423B2RF、MCS0508B2RF(Cotton States)。
[0145] 在本发明中，RKN抗性基因座位于染色体A11上(RKN-1)。用来监测RKN-1的渗入的SNP标记包括选自SEQ ID N0：1-38的标记。说明性的RKN-1 SNP标记DNA序列SEQ ID NO：33可以使用如SEQID NO：39至40所示的引物扩增，并且利用如SEQ ID NO：45至46所示的探针检测。说明性的RKN-1SNP标记DNA序列SEQ ID NO：36可以使用如SEQ ID NO：41至42所示的引物扩增，并且利用如SEQ IDNO：47至48所示的探针检测。说明性的RKN-1SNP标记DNA序列SEQ ID NO：9可以使用如SEQ ID NO：43至44所示的引物扩增，并且利用如SEQ ID NO：49至50所示的探针检测。
[0146] 在本发明中，RKN抗性基因座位于染色体A07上(RKN-2)。用来监测RKN-2的渗入的SNP标记包括选自SEQ ID NO：63-91的标记。说明性的RKN-2SNP标记DNA序列SEQ ID NO：73可以使用如SEQID NO：92至93所示的引物扩增，并且利用如SEQ ID NO：98至99所示的探针检测。说明性的RKN-2SNP标记DNA序列SEQ ID NO：74可以使用如SEQ ID NO：94至95所示的引物扩增，并且利用如SEQ IDNO：100至101所示的探针检测。说明性的RKN-2SNP标记DNA序列SEQ ID NO：75可以使用如SEQ ID NO：96至97所示的引物扩增，并且利用如SEQ ID NO：102至103所示的探针检测。
[0147] 本发明也提供了包含选自SEQ ID NO：1-38、其片段及它们的互补序列的核酸分子的棉花植物。本发明还提供了包含选自SEQ ID NO：39-50、其片段和它们的互补序列的核酸分子的棉花植物。
[0148] 本发明还提供了包含至少一个RKN抗性基因座的棉花植物。一方面，提供了包含染色体A11的RKN抗性基因座(RKN-1)的棉花植物。另一方面，提供了包含染色体A07的RKN抗性基因座(RKN-2)的棉花植物。在进一步的方面，提供了分别包含RKN-1和RKN-2两个抗性基因座的棉花植物。在所有方面，这些等位基因可以是纯合的或杂合的。
[0149] 如本文使用的RKN是指任何RKN变种或分离种。本发明的棉花植物可以对一种或多种能够引起或诱发类似于RKN的瘿瘤的线虫具有抗性。一方面，本发明提供了RKN抗性植物以及用于针对对根结线虫属引起的RKN的抗性或敏感性筛选棉花植物的方法和组合物。在一个优选方面，本发明提供了用于针对对南方根结线虫的抗性或敏感性筛选棉花植物的方法和组合物。
[0150] 一方面，所述植物选自棉属。另一方面，所述植物选自陆地棉种。另一方面，所述植物选自陆地棉亚种。另一方面，所述植物来自亚洲棉群，它另外也被称为树棉。另一方面，所述植物来自海岛棉群，它另外也被称为美洲皮马棉或埃及棉。另一方面，所述棉花植物来自阿拉伯早棉群，它另外也被称为levant棉。棉属或棉花植物可以包括杂种、近交种、部分近交种或明确或不明确的群体的成员。
[0151] 本发明的植物可以是具有非常高的抗性、抗性、基本抗性、中度抗性、相当的抗性、部分抗性、中度敏感性或敏感性的棉花植物。
[0152] 在一个优选方面，本发明提供了将要通过任何方法测定其对RKN的抗性或敏感性的棉花植物，以确定棉花植物是否具有非常高的抗性、抗性、基本抗性、中度抗性、相当的抗性、部分抗性、中度敏感性或敏感性。
[0153] 利用瘿瘤化指数量表(galling index scale)将植物分级为RKN抗性或敏感性的。检查植物根的瘿瘤数目和大小，并按照0(无瘿瘤)到5(100％的根具有瘿瘤)的量表进行分级。指数化的详细说明如下：0(无可见瘿瘤，根系健康)；1(1-2个瘿瘤，根系健康)；2(3-12个瘿瘤，小尺寸瘿瘤更可见)；3(13-30个瘿瘤，大尺寸瘿瘤在直根上更可见)；4(31-60个瘿瘤，具有大瘿瘤尺寸的严重瘿瘤化)；5(超过60个瘿瘤，＞75％的根具有大瘿瘤，根系无功能)。在此方面，分级低于2的植物被认为是抗性植物。
[0154] 另一方面，棉花植物可以显示与非抗性对照棉花植物相比相当的抗性。在此方面，除了一个或多个所述RKN抗性等位基因以外，对照棉花植物优选地在遗传学上相似。这些植物可以在等同或接近等同地暴露于病原体的相似的条件下生长。在此方面，一种或多种抗性植物有少于25％、15％、10％、5％、2％或1％的叶面积受到感染。
[0155] 本发明的抗病性QTL可以被引入优良棉花近交系中。“优良品系”是通过针对优异的农艺学表现进行育种和选择而产生的任何品系。
[0156] 本发明的RKN抗性QTL也可以被引入包含一个或多个赋予以下性状的转基因的优良棉花植物中：除草剂耐受性、产量增加、昆虫控制、真菌病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌病抗性、支原体病抗性、油产生改变、高产油量、高蛋白质产量、发芽和幼苗生长的控制、动物和人类营养增强、低棉子糖、环境应激抗性、可消化性提高、工业酶、药用蛋白质、肽和小分子、加工性状改善、风味改善、固氮、杂种种子的产生、变应原性降低、生物聚合物和生物燃料等。一方面，除草剂耐受性选自对草甘膦、麦草畏、草丁膦、磺脲、溴苯腈和达草灭除草剂的耐受性。这些性状可通过植物生物技术作为棉花中的转基因提供。
[0157] 一个或多个抗病性QTL等位基因可以从任何包含该等位基因的植物(供体)引入到任何接受体棉花植物中。一方面，接受体棉花植物可以包含另外的RKN抗性基因座。另一方面，接受体棉花植物可以包含转基因。另一方面，在保持引入的QTL的同时，可以通过回交或其它合适的方法来减少提供抗病性QTL的植物的遗传贡献。一方面，来自棉花植物中的供体材料的核遗传物质可能少于或是大约50％、少于或是大约25％、少于或是大约
13％、少于或是大约5％、3％、2％或1％，但该遗传物质包含一个或多个感兴趣的棉花抗性基因座。
13％、少于或是大约5％、3％、2％或1％，但该遗传物质包含一个或多个感兴趣的棉花抗性基因座。
[0158] 进一步可以理解，本发明的棉花植物可以显示任何相对成熟群的特征。一方面，成熟群选自早熟品种、中熟品种和全季节品种。
[0159] QTL的等位基因当然可以包含多个基因或其它遗传因素，甚至在连续基因组区域或连锁群如单元型内。如本文所用，抗病性基因座的等位基因因此可以包含一个以上的基因或其它遗传因素，其中，每个单独的基因或遗传组分也能够显示等位基因变异，并且其中，每个基因或遗传因素也能够引发对所述数量性状的表型效应。在本发明的一方面，QTL的等位基因包含一个或多个也能够显示等位基因变异的基因或其它遗传因素。因此，术语“QTL的等位基因”的使用并不打算排除包含一个以上的基因或其它遗传因素的QTL。特别是，本发明中的“QTL的等位基因”可以表示单元型窗口中的单元型，其中表型可以是抗病性。单元型窗口是可以用一组一个或多个多态性标记定义和示踪的连续的基因组区域，其中，多态性表示谱系同一性。该窗口中的单元型可以通过每个标记处的等位基因的独特指纹定义。如本文所用，等位基因是占据染色体上给定基因座的基因的几种替代形式之一。当染色体上的给定基因座处存在的所有等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果染色体上的给定基因座处存在的等位基因不同，该植物在该基因座处是杂合的。本发明的植物在任何特定的RKN基因座处或对于特定的多态性标记，可能是纯合或杂合的。
[0160] 本发明也提供了本发明的植物的部分。植物部分包括但不限于，种子、胚乳、胚珠和花粉。在本发明的特别优选的方面，植物部分是种子。
[0161] 本发明也提供了棉花的容器，该容器中超过50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的种子包含RKN抗性基因座。
[0162] 棉花种子的容器可以含有任何数量、重量或体积的种子。例如，容器可以含有至少或超过大约10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、80、90、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000个或更多的种子。另一方面，容器可以含有大约或超过大约1克、5克、10克、15克、20克、25克、50克、100克、250克、500克或1000克种子。或者，容器可以含有至少或超过大约0盎司、1盎司、5盎司、10盎司、1磅、2磅、3磅、4磅、5磅、10磅、15磅、20磅、
25磅或50磅或更多的种子。
25磅或50磅或更多的种子。
[0163] 棉花种子的容器可以是本领域中可以获得的任何容器。例如，容器可以是盒子、袋子、罐、包、囊、卷带、桶或管。
[0164] 另一方面，棉花种子的容器中含有的种子可以是处理过的或未处理的棉花种子。一方面，种子可以经过处理以改善发芽，例如通过引发种子或者通过消毒以抵御种子携带的病原体。另一方面，种子可以用任何可以使用的涂层涂覆，以改善例如可种植性、种子发芽和抵御种子携带的病原体。种子涂层可以是任何形式的种子涂层，包括但不限于粒化、薄膜涂层和硬外层(encrustment)。
[0166] 由于可以在不背离本发明的范围的情况下对本文描述和说明的结构和方法进行多种改变，前面的描述中包含的或附图中显示的所有内容都应被解释为说明性的而不是限制性的。本发明的宽度和范围不应受上述任何示例性的实施方案限制，而应只根据以下所附的权利要求及其等同方案进行限定。实施例
[0167] 包括以下实施例用来证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例公开的技术代表本发明人发现的在实施本发明中表现良好的技术，因此可以认为构成用于实施本发明的优选方式。但是，本领域技术人员根据本公开内容应当理解，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，而仍获得相同的或相似的结果，而不偏离本发明的概念、精神和范围。更具体地，应当理解，在化学上和生理学上相关的某些试剂可以代替本文描述的试剂，而获得相同或相似的结果。本领域技术人员清楚的所有这些类似的替代和改变都被认为包含在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念之内。
[0168] 实施例1：表型分级量表
[0169] 为了评估植物对RKN的反应，棉花植物在生长室中生长，并在发芽后大约7天人工接种2500个线虫卵。接种后45-50天检查植物根的瘿瘤化。利用0(无瘿瘤)到5(100％根具有瘿瘤)的瘿瘤化指数对植物进行分级。表1提供了用于鉴定棉花植物的RKN反应的表型分级量表。
[0170] 表1：用于RKN反应的表型分级量表
[0171]
[0172] 实施例2：与RKN抗性相关的SNP标记的鉴定
[0173] 从RKN抗性亲本M240与RKN敏感性亲本33B的杂交开发作图群体。为作图群体开发了总共250个近等基因系(NIL)。如实施例1所述，对每个品系的10个重复评价其对RKN的反应。
[0174] 利用11个位于染色体A11上的SNP标记筛查NIL作图群体。其中，发现SNP标记NG0204877与RKN抗性高度相关。在筛选的248个品系中，具有TT基因型的品系的平均瘿瘤化指数显著低于具有AA基因型的品系。表2提供了具有基因型AA、AT和TT的品系的平均瘿瘤化指数。进行t检验分析，AA和TT基因型之间瘿瘤化指数无平均差异的p值为-823.84x10 。标记NG0204877位于染色体A11上的位置181.1处。
[0175] 表2：标记NG0204877(SEQ ID N0.31)与棉花中的RKN抗性相关
[0176]基因型 平均瘿瘤化指数 品系数
AA 4.5 78
AT 3.0 37
TT 1.1 133
AA 4.5 78
AT 3.0 37
TT 1.1 133
[0177] 实施例3：SNP标记在监测RKN抗性中的应用
[0178] 另外的SNP标记位于染色体A11上。表3提供了标记名称、染色体位置、标记中的多态性的位置和等位基因。
[0179] 在育种计划中，可以利用表3提供的一个或多个标记选择RKN抗性并将其渗入棉花植物中。棉花育种者可以选择一个或多个在育种杂交的亲本之间具有多态性的标记，以选择具有RKN抗性亲本的基因型的后代。
[0180] 表3：用于检测RKN抗性的染色体A11上的SNP标记
[0181]
[0182]
[0183] “*”表示单核苷酸缺失
[0184] 1SNP位置：是指所示SEQ ID NO中的SNP多态性的位置。
[0185] 表3A：用于检测RKN抗性的染色体A07上的SNP标记
[0186]标记 SEQ ID NO： 染色体位置 SNP位置1 等位基因1 等位基因2
NG0203799 63 32.2 268 T A
NG0210921 64 33.1 190 G A
NG0210441 65 34.7 356 G A
NG0210456 66 35.2 139 T G
NG0204031 67 40.3 50 G A
NG0207405 68 41.1 143 T C
NG0210569 69 45.3 443 T G
NG0206553 70 45.7 194 G C
NG0210273 71 46.0 359 T C
NG0208436 72 46.6 85 G C
NG0206957 73 47.5 384 T G
NG0207837 74 47.5 142 G A
NG0207518 75 47.8 506 T C
NG0211237 76 47.8 439 T C
NG0210755 77 48.1 173 T A
NG0208863 78 48.5 348 T A
NG0203306 79 49.0 376 G A
NG0210314 80 49.5 489 G A
NG0208128 81 50.3 180 G A
NG0209149 82 50.8 108 T A
NG0209751 83 52.7 64 G A
NG0204353 84 53.2 338 T C
NG0209136 85 58.8 563 C A
NG0207947 86 62.2 554 T C
NG0204860 87 64.6 540 C A
NG0207151 88 64.6 148 G A
NG0208606 89 64.6 150 G A
NG0206706 90 68.6 487 G A
NG0207731 91 71.6 169 T C
NG0203799 63 32.2 268 T A
NG0210921 64 33.1 190 G A
NG0210441 65 34.7 356 G A
NG0210456 66 35.2 139 T G
NG0204031 67 40.3 50 G A
NG0207405 68 41.1 143 T C
NG0210569 69 45.3 443 T G
NG0206553 70 45.7 194 G C
NG0210273 71 46.0 359 T C
NG0208436 72 46.6 85 G C
NG0206957 73 47.5 384 T G
NG0207837 74 47.5 142 G A
NG0207518 75 47.8 506 T C
NG0211237 76 47.8 439 T C
NG0210755 77 48.1 173 T A
NG0208863 78 48.5 348 T A
NG0203306 79 49.0 376 G A
NG0210314 80 49.5 489 G A
NG0208128 81 50.3 180 G A
NG0209149 82 50.8 108 T A
NG0209751 83 52.7 64 G A
NG0204353 84 53.2 338 T C
NG0209136 85 58.8 563 C A
NG0207947 86 62.2 554 T C
NG0204860 87 64.6 540 C A
NG0207151 88 64.6 148 G A
NG0208606 89 64.6 150 G A
NG0206706 90 68.6 487 G A
NG0207731 91 71.6 169 T C
[0187] 1SNP位置：是指所示SEQ ID NO中的SNP多态性的位置。
[0188] 实施例4：用于检测RKN抗性的示例性的标记分析
[0189] 在一个实施方案中，通过利用核酸扩增方法可以促进DNA、RNA或cDNA样品中多态性位点的检测。这些方法特异性地提高跨越多态性位点或包括该位点和位于其近端或远端的序列的多核苷酸的浓度。这样扩增的分子可以通过凝胶电泳、荧光检测方法或其它手段容易地检测。用于扩增和检测与棉花RKN抗性相关的基因组区域的示例性的引物和探针在表4中给出。
[0190] 表4：用于检测RKN抗性的示例性分析
[0191]
[0192] 实施例5：可用于通过单碱基延伸方法检测具有RKN抗性基因座的棉花植物的寡核苷酸探针
[0193] 也可以利用寡核苷酸，通过基于单碱基延伸(SBE)的SNP检测方法，来检测本文所公开的与RKN抗性相关的多态性或对其进行分型。表5提供了示例性的用于基于SBE的SNP检测的寡核苷酸。SBE方法基于与邻近多态性的序列杂交的核苷酸引物的延伸，以在引物延伸时掺入可检测的核苷酸残基。也预期SBE方法可以使用3种合成的寡核苷酸。其中两种寡核苷酸用作PCR引物，并与位于包含待测多态性的区域侧翼的基因座的序列互补。表4在标注为“SEQ ID正向引物”和“SEQ ID反向引物”的栏中提供了可用于对本发明公开的多态性进行分型的示例性的PCR引物。在包含多态性的区域扩增之后，将PCR产物与延伸引物杂交，该延伸引物与邻近该多态性的扩增的DNA退火。然后提供DNA聚合酶和两种差别标记的双脱氧核苷三磷酸。如果模板上存在该多态性，可以在单碱基链延伸中向引物添加标记的一种双脱氧核苷三磷酸。然后通过确定两种差别标记物中的哪一种添加到延伸引物上来推断存在的等位基因。纯合的样品将导致两种标记的碱基中只有一种被掺入，因此两种标记物中只有一种被检测到。杂合的样品存在两个等位基因，因此将直接掺入两种标记物(进入延伸引物的不同的分子)，因此这两种标记物都被检测到。示例性的正向和反向SBE探针在表5中提供。
[0194] 表5.用于单碱基延伸(SBE)分析的探针(延伸引物)
[0195]
[0196] 实施例6：可用于检测具有RKN抗性基因座的棉花植物的寡核苷酸杂交探针[0197] 也可以利用寡核苷酸，通过基于杂交的SNP检测方法，检测本文所公开的与RKN抗性相关的多态性或对其进行分型。提供了能够与包含多态性的分离的核酸序列杂交的寡核苷酸。本领域技术人员能够设计具有经实验确定的严格性的分析，用来区别本文提出的多态性的等位基因状态。示例性的分析包括Southern印迹法、Northern印迹法、微阵列、原位杂交和其它基于杂交的多态性检测方法。表6提供了示例性的用于基于杂交的SNP检测的寡核苷酸。这些寡核苷酸可以用放射性标记物、荧光团或其它化学发光手段可检测地标记，以有助于使用本领域已知的方法检测与源自一种或多种棉花植物的基因组或扩增核酸的样品的杂交。
[0198] 表6.寡核苷酸杂交探针
[0199]
[0200] 实施例7：利用SNP标记渗入RKN抗性的预言性实施例
[0201] 植物育种者可以利用SNP标记促进染色体A11上的RKN抗性基因座的渗入以及选择携带对于一种或多种所述SNP标记有利的等位基因的品系。在该实施例中，棉花品系M240用作RKN抗性的供体。SNP标记NG0204877(SEQ ID NO：31)用来监测RKN抗性基因座的渗入。植物育种者可以选择表2提供的有利的基因型来针对由供体引起的RKN抗性选择植物，同时选择相邻染色体区域中的接受体基因组。实际上，这减少了也许与不希望的农艺学或纤维质量性质相关的供体基因组的连锁累赘(1inkage drag)的量。
[0202] 一个或多个抗性基因座的渗入是通过与轮回亲本反复回交并伴随着用来保留一个或多个来自供体亲本的RKN抗性基因座的选择而获得的。这一回交过程在品系发育的任何阶段进行，并且与针对优异农艺学特征或一种或多种感兴趣的性状(包括转基因和非转基因性状)的育种共同发生。
[0203] 或者，采用正向选育方法，其中可以监测一个或多个RKN抗性基因座在与敏感亲本杂交后的成功渗入，针对一个或多个RKN抗性基因座以及针对一个或多个其它感兴趣的性状(包括转基因和非转基因性状)对后续几代进行基因分型。
[0204] 实施例8：利用SNP标记渗入RKN-1和RKN-2以产生根结线虫抗性的棉花植物[0205] 植物育种者可以利用SNP标记促进染色体A07上的RKN-1抗性基因座和染色体A11上的RKN-2抗性基因座的渗入，以选择携带对于一种或多种所述SNP标记有利的等位基因的品系。在该实施例中，棉花品系M-315用作RKN抗性的供体。SNP标记NG0204877(SEQ ID NO：31)用来监测RKN-1抗性基因座的渗入，SNP标记NG0206957(SEQ IDNO：73)、NG0207837(SEQ ID NO：74)和NG0207518(SEQ ID NO：75)用来监测RKN-2抗性基因座的渗入。植物育种者可以选择提供的有利的多态性基因型来针对由供体引起的RKN抗性选择植物，同时选择相邻染色体区域中的接受体基因组。实际上，这减少了也许与不希望的农艺学或纤维质量性质相关的供体基因组的连锁累赘的量。
[0206] 一个或多个抗性基因座的渗入是通过与轮回亲本反复回交并伴随着用来保留一个或多个来自供体亲本的RKN抗性基因座的选择而获得的。这一回交过程在品系发育的任何阶段进行，并且与针对优异农艺学特征或一种或多种感兴趣的性状(包括转基因和非转基因性状)的育种共同发生。
[0207] 或者，采用正向选育方法，其中可以监测一个或多个RKN抗性基因座在与敏感亲本杂交后的成功渗入，针对一个或多个RKN抗性基因座以及针对一个或多个其它感兴趣的性状(包括转基因和非转基因性状)对后续几代进行基因分型。
[0208] 从以上的记载将会看出，本发明的几个优点已经实现并达到。实施方案的选择和描述是为了最好地解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域其它技术人员能够在各种实施方案中最佳地利用本发明，以及进行适合预期的具体应用的各种修改。
[0209] 本文引用了多篇专利和非专利出版物，其公开内容均在必要程度上全文引入作为参考。由于可以在不背离本发明的范围的情况下对本文描述和说明的结构和方法进行多种改变，前面的描述中包含的或附图中显示的所有内容都应被解释为说明性的而不是限制性的。本发明的宽度和范围不应受上述示例性的实施方案限制，而应只根据以下所附的权利要求及其等同方案进行限定。
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