技术领域：

本发明涉及医药生物工程技术领域，具体涉及一种携带α-黑素细 胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体(α-MSH-rAAV)，以及该重 组表达载体的制备方法、该重组表达载体用于制备治疗自身免疫性疾 病和移植排斥反应药物的用途。

背景技术：

α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH) 是近几年来发现的具有抗多种急、慢性炎症作用的内源性神经免疫调 节肽，是由13个氨基酸组成的多肽，其氨基酸序列如下： Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val。α-MSH也 可以促进受损的外周神经或脊髓修复(参见Joosten等人，神经创伤 杂志，16：543；(1999))。α-MSH可以用于治疗风湿性关节炎(参见 Catania A等人，神经免疫调节，1：321-328，(1994))、自身免疫性 卵巢炎(参见Casalino-Matsuda SM等人，生理、生物化学杂志， 58：25-31，(2002))、风湿性关节炎(参见Catania A等人，神经免疫 调节，1：321-328，(1994))等自身免疫性疾病，还可以抑制移植排斥 反应(参见Gatti S等人，移植，74：1678-1684，(2002))。α-MSH是 人体内存在的小分子调节肽，无抗原性，目前尚未发现有蓄积毒性。 但是α-MSH半衰期较短、体内代谢较快，在治疗疾病时需要反复多次 注射是其缺点。

以腺病毒为载体，携带α-黑素细胞刺激素基因的腺病毒重组表达 载体(参见Robinson WH，临床免疫学杂志，103：7，(2002))，具有 转染效率高的优点，但是腺病毒本身具有免疫原性，从靶组织中很快 地被清除，因此目的基因表达时间较短。

重组腺相关病毒对人类无致病性，能感染分裂和非分裂细胞，并 能使表达产物进行维持功能所必需的折叠和翻译后修饰，目的基因整 合宿主细胞基因组，在体内能长期稳定表达。由于不产生野生型病毒， 从而减少了宿主的免疫应答，允许基因转移至免疫活性细胞(参见Xiao X，病毒学杂志，72：2224，(1998))。腺相关病毒载体理化性质稳定， 是目前基因治疗所使用的各种载体中最具优势和前途的载体之一。

发明内容：

本发明克服上述的α-MSH半衰期较短、体内代谢较快，在治疗疾 病时需要反复多次注射的缺点及携带α-黑素细胞刺激素基因的腺病毒 重组表达载体由于腺病毒本身具有免疫原性，从靶组织中很快地被清 除，目的基因表达时间较短的缺点，提供了一种基因表达时间长的携 带α-黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体α-MSH-rAAV。

本发明的目的在于提供一种基因表达时间长的携带α-黑素细胞刺 激素基因的重组腺相关病毒表达载体α-MSH-rAAV，它是由α-黑素细 胞刺激素(α-MSH)基因和腺相关病毒(rAAV)载体构建而成的重组表 达载体，其中α-MSH基因的核苷酸序列如下：

5′agttatagta tggagcactt caggtgggga aagccagta 3′                  39

本发明的另一目的在于提供一种携带α-黑素细胞刺激素基因的重 组腺相关病毒表达载体α-MSH-rAAV的制备方法。

由于α-MSH本身不含有信号肽序列，为了使其能够分泌至细胞外， 故在α-MSH基因序列前加入了细胞因子IL-6的信号肽编码序列。

为了构建能够分泌目的基因α-MSH的腺相关病毒重组表达载体， 首先运用RT-PCR技术和特异性引物，以T淋巴细胞系分离的总RNA为 模板，扩增出IL-6信号肽cDNA，将IL-6信号肽基因编码序列克隆入 载体质粒pGEM-3z(Stratagene公司，美国)，构建成pGEM-IL6sp。 然后合成全长α-MSH双链DNA，再将其克隆入载体质粒pGEM-IL6sp， 构建成pGEM-IL6sp-α-MSH重组质粒。将IL6sp-α-MSH片段克隆入含 人源化重组绿色荧光蛋白(hrGFP)基因的表达载体pAAV-IRES-hrGFP (Stratagene公司，美国)，构建成pAAV-IL6sp-α-MSH-hrGFP重组质 粒。将pAAV-IL6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒与pHelper质粒(Stratagene 公司，美国)和pRC质粒(Stratagene公司，美国)共转染人胚肾细 胞株(HEK293细胞，ATCC，美国)，得到含有α-MSH基因的重组腺相关 病毒表达载体α-MSH-rAAV。

具体步骤如下：

1、构建pGEM-IL-6sp重组质粒

①以T淋巴细胞系总RNA为模板，用M-MLV RTase cDNA合成试 剂盒行逆转录；

②合成IL-6信号肽引物

正向引物：5’-G GAATTCATGAAGTTCCTCTCTGC-3’

反向引物：5’-C GGTACCGCCGGCGGCCGTGGTTGTCACCA-3’

其中正向引物引入EcoR I酶切位点，反向引物引入Nae I Kpn I酶切位 点；

③以逆转录产物为模板，用合成的正反向引物进行PCR扩增，扩 增出IL-6信号肽cDNA，其碱基序列5’至3’为序列3：

5′atgaagttcc tctctgcaag agacttccat ccagttgcct tcttgggact gatgctggtg     60

acaaccacgg cc 3′                                                        72

④将PCR产物经EcoR I和Kpn I酶切纯化后定向克隆入载体质粒 pGEM-3z，测序鉴定，构建成pGEM-IL6sp重组质粒。

2、合成α-MSH双链DNA片段

α-MSH基因的碱基序列5’至3’为序列1：

5′agttatagta tggagcactt caggtgggga aagccagta 3′                        39

合成α-MSH双链DNA片段，使其5’端和3’端分别携带Nae I和Kpn I 酶切位点；

3、构建pGEM-IL-6sp-α-MSH重组质粒

将合成的α-MSH双链DNA片段经Nae I和Kpn I酶切纯化后定向克 隆入上述构建的pGEM-IL-6sp重组质粒，测序鉴定，构建成 pGEM-IL-6sp-α-MSH重组质粒；

4、构建pAAV-IL-6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒

将pGEM-IL-6sp-α-MSH重组质粒中的IL-6sp-α-MSH片段经EcoR I和Xho I酶切纯化后克隆入载体质粒pAAV-IRES-hrGFP，测序鉴定， 通过末端连接可得到融合多肽IL-6sp-α-MSH，其碱基序列5’至3’为 序列2：

5′atgaagttcc tctctgcaag agacttccat ccagttgcct tcttgggact gatgctggtg     60

acaaccacgg ccagttatag tatggagcac ttcaggtggg gaaagccagt atag 3′         114

构建成pAAV-IL6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒；

5、构建α-MSH-rAAV

将pAAV-IL-6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒和对照pAAV-IRES-hrGFP 质粒分别与腺相关病毒重组系统(AAV Helper Free System)中含有 重组rAAV所需腺病毒成分的pHelper质粒以及含包装和复制rAAV所 需成分的pRC质粒，共转染人胚肾细胞株(HEK293细胞)，分别得到 携带α-黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体α-MSH-rAAV 和对照初级病毒颗粒hrGFP-rAAV；

6、rAAV的纯化与鉴定

初级病毒颗粒α-MSH-rAAV或hrGFP-rAAV经氯仿-PEG8000/NaCl纯化后，再用Milipore超滤管Centroplus YM 100进一步浓缩，采用 SDS-PAGE蛋白电泳方法进行初步鉴定；

7、rAAV病毒滴度检测

用辣根过氧化物酶(HRP)标记的hrGFP基因为探针，点杂交病毒 颗粒α-MSH-rAAV或hrGFP-rAAV中的rAAV病毒基因组(vector genomes， v.g.)，同pAAV-IRES-hrGFP标准质粒比较，计算纯化后rAAV的物理 滴度为2×1013v.g./ml。给人纤维肉瘤细胞株(HT1080细胞)加入 10倍梯度系列稀释的病毒液，培养48h，在荧光显微镜下计数某孔荧 光细胞的数量n(10＜n＜100)，rAAV的感染滴度(tfu)＝n×稀释倍数， 测得rAAV的感染滴度为4×1011tfu/ml，物理滴度/感染滴度的比值 为50。

本发明的另一目的在于利用上述制备方法得到的重组腺相关病毒 表达载体α-MSH-rAAV转染相关免疫细胞，用于治疗自身免疫性疾病 和移植排斥反应。

1、α-MSH-rAAV在治疗自身免疫性疾病上的用途

自身抗原特异性T淋巴细胞具有向炎性病灶归巢的特性(参见 Flugel A，免疫学，14：547，(2001))，且仅在受到相同的自身抗原刺 激后才会活化，因此能将治疗性目的基因运送至靶器官，并能够可控 性表达。基因修饰的自身抗原特异性T细胞已被应用于自身免疫性疾 病基因治疗的实验研究(参见Mathisen PM，实验医学杂志， 186：159(1997))。

为研究α-MSH基因修饰的自身抗原特异性T细胞在治疗自身免疫 性疾病上的用途，首先制备出自身抗原PLP139-151特异性T淋巴细胞 (PLP139-151-T细胞)，分别应用纯化并浓缩后的α-MSH-rAAV或 hrGFP-rAAV转染PLP139-151活化的PLP139-151-T细胞，制备出α-MSH基因 修饰的PLP139-151特异性T细胞(α-MSH-T细胞)和对照性hrGFP-T细 胞。α-MSH-T细胞在体外受到PLP139-151刺激后，应用酶联免疫检测试剂 盒(EIA)检测细胞培养上清中α-MSH的水平，发现α-MSH的分泌呈时 间依赖性；[3H]掺入法检测到α-MSH-T细胞的增殖能力降低；细胞因子 IL-2和IFN-γ的分泌减少，TGF-β的产生却明显增加。说明α-MSH-T细 胞的生物学特性发生了改变，其产生致炎性细胞因子的能力下降而产 生抑炎性细胞因子的能力增加。

将α-MSH-T细胞被动回输SJL小鼠，观察其诱导被动转移性实验 性自身免疫性脑脊髓炎(tEAE)的能力。给正常SJL/J小鼠被动转移 PLP139-151-T细胞或hrGFP-T细胞(5×106细胞/只)，tEAE的发病率为 100％；而被动回输相同数量的α-MSH-T细胞，tEAE的发病率显著降低， 起始发病时间明显延长，临床症状仅出现尾无力现象。说明α-MSH-T 细胞被动转移EAE的能力即致脑炎性明显降低。

在PLP139-151主动免疫SJL/J小鼠后的第11天，即主动性复发-缓解 型EAE(REAE)的起始发病期，经尾静脉分别注射α-MSH-T细胞、hrGFP-T 细胞和PBS。结果发现，与hrGFP-T细胞组和PBS组相比，α-MSH-T 细胞组REAE的复发率明显降低，起始复发时间延长，而且复发期的病 情严重程度也明显减轻。表明α-MSH-T细胞对主动性REAE小鼠具有治 疗作用。

在REAE的起始发病期回输α-MSH-T细胞，24h后血清和中枢神经 系统(CNS)中都可以检测到高水平的α-MSH。血清中高水平的α-MSH 维持时间相对较短；而CNS内α-MSH的含量于回输细胞后96h达到高 峰，并且高水平的α-MSH可以持续1周左右。PBS处理组或回输hrGFP-T 细胞组小鼠未见此现象。

在REAE的起始发病期回输α-MSH-T细胞或hrGFP-T细胞，用ELISA 方法检测REAE小鼠血清及CNS中Th1/Th2型细胞因子的含量表明，与 PBS处理组和回输hrGFP-T细胞组相比较，给予α-MSH-T细胞组小鼠血 清及CNS中IL-2的含量显著降低，IL-10和TGF-β的含量则明显增 加。说明回输α-MSH-T细胞可以降低EAE小鼠体内致炎性细胞因子的 含量，而增加抑炎性细胞因子的水平。

应用α-MSH-rAAV除了可以转染自身抗原特异性T淋巴细胞外，还 可以按常规方法转染其它种类的细胞，例如B淋巴细胞、树突状细胞 或成纤维细胞。

除了直接应用α-MSH-rAAV或α-MSH基因修饰的细胞治疗EAE外， 还可用于治疗其它种类的自身免疫性疾病，如多发性硬化、风湿性关 节炎或自身免疫性卵巢炎。

2、α-MSH-rAAV在防治移植排斥反应上的用途

首先在体外培养和扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)，应用纯 化并浓缩后的α-MSH-rAAV和hrGFP-rAAV分别转染DC，制备出α-MSH 基因修饰的DC细胞α-MSH-DC和对照性hrGFP-DC，收获不同时间的 α-MSH-DC培养上清，应用EIA试剂盒检测细胞培养上清中α-MSH的水 平，转染后第3天可以检测到α-MSH(20pg/ml)，其水平逐渐升高至 第6天(380pg/ml)，之后两天持续在这一水平。而hrGFP-DC和正常 DC组上清中则检测不到α-MSH存在。应用流式细胞仪(FACS)检测 α-MSH-DC的细胞表型变化，发现α-MSH-DC在LPS刺激下，细胞表面 CD80、CD86、CD11c和MHC-II的表达低于正常组和hrGFP-DC。ELISA 检测(R&D公司，美国)IL-12水平的结果表明，与Day8-DC相比， Day5-DC、hrGFP-DC、α-MSH-DC皆分泌低水平的IL-12。当各组DC经 100ng/ml LPS刺激20h后，分泌IL-12的水平都较LPS刺激前明显增 高，但Day8-DC分泌IL-12的水平最高(P＜0.01)，Day6-DC与hrGFP-DC 分泌IL-12的水平较Day8-DC降低，α-MSH-DC分泌IL-12的水平又低 于Day6-DC和hrGFP-DC(P＜0.01)。说明α-MSH-DC的成熟受到抑制， 且能部分抵抗LPS的促成熟作用。

应用BALB/c小鼠来源的α-MSH-DC免疫C57BL/6受体小鼠后，采 用同种小鼠异位心脏移植模型，研究了α-MSH-DC对心脏移植物存活时 间的影响。结果发现，与hrGFP-DC免疫组小鼠相比较，α-MSH-DC组 移植心脏存活时间明显延长，α-MSH-DC免疫受者后，明显抑制受者脾 脏淋巴细胞对供者同种异基因抗原的免疫应答。

另外，可以直接应用α-MSH-rAAV来防治心脏移植时排斥反应，也 可以应用α-MSH-rAAV或α-MSH-DC来防治其它器官移植时的排斥反 应。

附图说明

图1：重组表达载体pAAV-IL-6sp-α-MSH-hrGFP的结构示意图

图2：重组表达载体α-MSH-rAAV的构建流程图

图3：α-MSH-T细胞受到特异性抗原(PLP139-151)刺激后α-MSH的分泌 水平图

图4：α-MSH-T细胞受PLP139-151刺激后的增殖和细胞因子分泌水平图

图5：α-MSH-T细胞诱导tEAE发病能力的变化图

图6：α-MSH-T细胞对主动型REAE的治疗作用图

图7：α-MSH-T细胞被动回输后小鼠体内α-MSH的含量图

图8：α-MSH-T细胞被动回输后小鼠体内Th1/Th2型细胞因子的含量图

图9：α-MSH-DC培养上清中α-MSH的水平图

图10：α-MSH-DC分泌IL-12的水平图

图11：α-MSH-DC影响同种异体小鼠心脏移植物存活时间图

图12：α-MSH-DC受者小鼠脾脏T细胞与正常供者脾脏细胞的混和淋 巴细胞反应图

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明作详细的描述：

实施例1：α-MSH-rAAV重组表达载体的构建

首先构建pGEM-IL-6sp重组质粒。以T细胞的总RNA为模板，用 M-MLV RTase cDNA合成试剂盒(TaKaRa公司，日本)行逆转录合成 cDNA。合成IL-6信号肽基因的特异性引物，即5’-G GA ATT CAT GAA GTT CCT CTC TGC-3’的正向引物和5’-C GG TAC CGC CGG CGG CCG TGG TTG TCA CCA-3’的反向引物，其中正向引物引入EcoR I酶切位点，反向 引物引入Nae I Kpn I酶切位点。以上述逆转录产物为模板进行PCR， 扩增出IL-6信号肽cDNA，其碱基序列5’至3’为序列3：

5′atgaagttcc tctctgcaag agacttccat ccagttgcct tcttgggact gatgctggtg     60

acaaccacgg cc 3′                                                        72

将IL-6信号肽基因定向克隆入载体质粒pGEM-3z，测序鉴定，构建成 pGEM-IL-6sp。

然后构建pGEM-IL6sp-α-MSH重组质粒。合成α-MSH基因双链DNA 片段，其碱基序列5’至3’为序列1：

5′agttatagta tggagcactt caggtgggga aagccagta 3′                        39

将其定向克隆入上述构建的pGEM-IL-6sp重组质粒，测序鉴定， 构建成pGEM-IL-6sp-α-MSH重组质粒。

接着构建pAAV-IL-6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒。将 pGEM-IL-6sp-α-MSH重组质粒中的IL-6sp-α-MSH片段定向克隆入含人 源化重组绿色荧光蛋白(hrGFP)基因的载体质粒pAAV-IRES-hrGFP (Stratagene公司，美国)中，测序鉴定，IL-6sp-α-MSH基因的碱基 序列5’至3’为序列2：

加框显示的为翻译起始密码atg和翻译终止密码tag，构建成 pAAV-IL6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒(图1)。上述质粒均用Qiagen去 内毒素试剂盒提取和纯化。

最后，为了构建携带α-MSH基因的rAAV载体，按照图2显示的重 组表达载体α-MSH-rAAV的构建流程图，运用磷酸钙方法(参见金冬 雁、黎孟枫等译，分子克隆实验指南(第二版)，科学出版社(1998)) 将AAV Helper-Free System(Stratagene，美国)中的含有重组rAAV 所需腺病毒成分的pHelper质粒以及含包装和复制rAAV所需成分的 pRC质粒，与上述构建的pAAV-IL-6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒和对照 pAAV-IRES-hrGFP质粒，各10μg，分别共转染HEK293细胞(ATCC，美 国)，72小时后可得到含有α-MSH基因的rAAV(α-MSH-rAAV)和对照 rAAV(hrGFP-rAAV)。将α-MSH-rAAV或对照rAAV初级病毒颗粒经氯仿 -PEG8000/NaCl纯化后，再用Milipore超滤管Centroplus YM 100 (Milipore公司，德国)进一步地浓缩(参见李桂林等人，中华医学 杂志，14：1255(2003))。采用SDS-PAGE蛋白电泳对rAAV病毒进行初 步鉴定。

利用点杂交检测试剂盒(North2South Direct HRP Labeling and Detection Kit，PIERCE公司，美国)检测rAAV病毒的物理滴度。以 辣根过氧化物酶(HRP)标记的hrGFP基因为探针，点杂交病毒颗粒中 的rAAV病毒基因组(vector genomes，v.g.)，同pAAV-IRES-hrGFP 标准质粒比较，计算纯化后α-MSH-rAAV或hrGFP-rAAV的物理滴度为2 ×1013v.g./ml。将10倍梯度系列稀释的病毒液加到体外培养的人纤 维肉瘤细胞株(HT1080细胞)(ATCC，美国)中，培养48h，在荧光显 微镜下计数某孔荧光细胞的数量n(10＜n＜100)，根据公式：rAAV感染 滴度(tfu)＝n×稀释倍数，测得α-MSH-rAAV的感染滴度为4×1011tfu /ml，其物理滴度/感染滴度的比值为50。

实施例2：α-MSH基因修饰的PLP139-151特异性T细胞的制备及其生物学 活性的检测

取PLP139-151/CFA(Sigma公司，美国)免疫10天后SJL/J小鼠的 引流淋巴结细胞，在体外经PLP139-151(25μg/ml)刺激，再以IL-2(R&D 公司，美国)扩增，反复培养3个循环后即可获得PLP139-151特异性T 细胞(PLP139-151-T细胞)。

应用纯化并浓缩后的α-MSH-rAAV和hrGFP-rAAV分别转染PLP139-151 (25μg/ml)活化的PLP139-151-T细胞，制备出α-MSH基因修饰的PLP139-151 特异性T细胞(α-MSH-T细胞)和对照hrGFP-T细胞。α-MSH-rAAV对 活化性PLP139-151-T细胞的最适感染复数(MOI)为4×105v.g./ml，转染 效率为22～25％。

α-MSH-T细胞在体外受到PLP139-151刺激后，应用酶联免疫检测试剂 盒(EIA)(Phoenix公司，美国)检测细胞培养上清中α-MSH的水平， 结果表明α-MSH的分泌呈时间依赖性(图3)；如图4所示，应用[3H]掺 入法检测到α-MSH-T细胞增殖能力下降，应用ELISA试剂盒(R&D公司， 美国)检测到细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌减少，TGF-β的产生却明 显增加。上述现象未见于活化性PLP139-151-T细胞或hrGFP-T细胞。

实施例3：α-MSH-T细胞对主动性复发-缓解型EAE(REAE)的治疗作 用实验

如图5所示，给正常SJL/J小鼠(Jackson实验室，美国)被动转 移PLP139-151-T细胞或hrGFP-T细胞(5×106细胞/只)，tEAE的发病率 为100％；而被动回输相同数量的α-MSH-T细胞，tEAE的发病率为 28.57％(2/7)，下降了71.43％(P＜0.01)，起始发病时间由原来的转输 后7天延长至11天，临床症状仅出现尾无力现象。说明α-MSH-T细 胞被动转移EAE的能力即致脑炎性明显降低。

在用PLP139-151主动免疫SJL/J小鼠后的第11天，即REAE起始发病 期，经尾静脉分别注射5×106α-MSH-T细胞、5×106hrGFP-T细胞和PBS。 结果如图6所示，与hrGFP-T细胞组和PBS相比，α-MSH-T细胞组REAE 的复发率明显降低，起始复发时间延长，而且复发期的病情严重程度 也明显减轻。以上结果表明α-MSH-T细胞对主动性REAE具有治疗作用。

应用EIA试剂盒(Phoenix公司，美国)检测小鼠血清和CNS中 α-MSH的含量显示(图7)，在REAE的起始发病期回输α-MSH-T细胞， 24h后血清和CNS中都可以检测到高水平的α-MSH，血清中高水平的 α-MSH维持时间相对较短；而CNS内α-MSH的含量于回输细胞后96h 达到高峰，并且高水平的α-MSH可以持续1周左右。PBS处理组或回输 hrGFP-T细胞组小鼠未见此现象。

在REAE的起始发病期回输α-MSH-T细胞或hrGFP-T细胞，用ELISA 试剂盒(R&D公司，美国)检测REAE小鼠血清及CNS中Th1/Th2型细 胞因子的含量表明(图8)，与PBS处理组和回输hrGFP-T细胞组相比 较，给予α-MSH-T细胞组小鼠血清及CNS中IL-2和IFN-γ的含量显著 降低，IL-4、IL-10和TGF-β的含量则明显增加。以上结果说明，转输 α-MSH-T细胞能抑制Th1型细胞因子分泌，并促进Th2型细胞因子产 生。

实施例4：α-MSH基因修饰的小鼠骨髓来源的树突状细胞(α-MSH-DC) 的制备及其生物学特性检测实验

为了制备出α-MSH-DC，首先体外培养和扩增了骨髓来源的DC，参 考Inaba等方法(参见Inaba等人，实验医学杂志，176：1693(1992)) 并稍作改进，简述之：颈椎脱位法处死BALB/c小鼠，无菌取股骨骨髓 细胞，Tris-NH4Cl溶解去除红细胞后，加入抗Ia、B220、CD4、CD8单 抗(PharMingen公司，美国)，使终浓度均为10μg/ml，再加入补体(10： 1稀释)，37℃水浴45min溶解去除T、B及Ia+细胞，洗两次后，以1 ×106细胞/孔，加入24孔板培养，用含重组小鼠GM-CSF 10ng/ml(R&D 公司，美国)、重组小鼠IL-41ng/ml(R&D公司，美国)的RPMI1640 完全培养基(Gibco公司，美国)培养。培养第3天后，吸弃培养基 及悬浮细胞，重新加入新鲜RPMI1640完全培养基及rmGM-CSF和 rmIL-4，以后隔天半量换液，细胞培养至第6天，收集疏松贴壁的增 殖性细胞聚集体，置新培养板培养过夜，第2天收集悬浮细胞即为富 集的第8天骨髓来源的树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cell，BMDC)。收获培养4天的具有典型DC特征的细胞，按104tfu/ 细胞的MOI值进行α-MSH-rAAV病毒和对照hrGFP-rAAV病毒的转染， 设未经病毒转染的正常BMDC为对照。α-MSH-rAAV对BMDC的转染效率 约为20％。

用α-MSH的EIA检测试剂盒测定α-MSH-DC、hrGFP-DC和培养至第 5天的正常对照DC(Day5-DC)培养上清中的α-MSH水平，结果如图9 所示，在α-MSH-DC上清中，转染后第3天可以检测到α-MSH(20pg/ml)， 其水平逐渐升高至第6天(380pg/ml)，之后两天持续在这一水平。 而hrGFP-DC和正常DC组上清中则检测不到α-MSH存在。本结果说明 α-MSH-rAAV转染DC后，可以使DC有效地表达α-MSH。

为了研究α-MSH-DC的体外生物学特性，应用FACS技术检测细胞 表面分子的表达，结果发现，培养至第5天和第8天的DC(Day8-DC) 和hrGFP-DC经100ng/ml LPS刺激后，细胞表面皆表达高水平CD80、 CD86、CD11c和MHC-II，显示出成熟型DC的表型特征，而α-MSH-DC 经LPS刺激后表面CD80、CD86、CD11c和MHC-II的表达显著降低。 ELISA检测(R&D公司，美国)IL-12水平的结果如图10所示，与Day8-DC 相比，Day5-DC、hrGFP-DC、α-MSH-DC皆分泌低水平的IL-12(P＜0.01)， 而且三组间无显著差异。当各组DC经100ng/ml LPS刺激20h后，分 泌IL-12的水平都较LPS刺激前明显增高(P＜0.01)，但Day8-DC分 泌IL-12的水平最高(P＜0.01)，Day6-DC与hrGFP-DC分泌IL-12的 水平较Day8-DC降低，α-MSH-DC分泌IL-12的水平又低于Day6-DC 和hrGFP-DC(P＜0.01)。说明α-MSH-DC的成熟受到抑制，且能部分抵 抗LPS的促成熟作用。

实施例5：α-MSH-DC影响同种异体心脏移植排斥反应的实验

分别将供者BALB/c小鼠来源的Day5-DC、GFP-DC、α-MSH-DC和 PBS经尾静脉注入受者C57BL/6小鼠，观察移植心脏存活期，结果如 图11所示，Day5-DC和hrGFP-DC免疫组的移植心脏存活时间分别为 14.6±2.21和14.3±1.57天，较未经DC免疫的PBS对照组的7.0± 0.33天明显延长，而Day5-DC和hrGFP-DC免疫组之间没有明显差异； 输入α-MSH-DC组移植心脏平均存活天数延长至19.3±2.35天，与 Day5-DC和hrGFP-DC免疫组相比有显著的差异(P＜0.01)。表明经α-MSH 基因修饰的未成熟DC在体内能明显延长移植物的存活时间。

在注射各组DC后第7天处死C57BL/6受者，收获其脾脏T淋巴 细胞，与不同数量经γ射线(30Gy)灭活的BALB/c同种脾脏淋巴细胞作 混合淋巴细胞反应。结果发现，与PBS组相比，Day5-DC、GFP-DC与 α-MSH-DC免疫组的脾脏T淋巴细胞对供者同种抗原的刺激反应都减弱 (P＜0.01)；α-MSH-DC组比Day5-DC和GFP-DC组进一步减弱(P＜0.01)， 而Day5-DC与GFP-DC组之间无明显差别(P＞0.05)，见图12。结果表 明，与Day5-DC和GFP-DC相比，α-MSH-DC免疫受者后，进一步抑制 了受者脾脏淋巴细胞对供者同种异基因抗原的免疫应答。

SEQUENCE LISTING

<110>第二军医大学

<120>携带a-黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体与用 途

<130>说明书，权利要求书

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

agttatagta tggagcactt caggtgggga aagccagta                               39

<210>2

<211>114

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgaagttcc tctctgcaag agacttccat ccagttgcct tcttgggact gatgctggtg        60

acaaccacgg ccagttatag tatggagcac ttcaggtggg gaaagccagt atag             114

<210>3

<211>72

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

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acaaccacgg cc                                                            72