성선 자극 호르몬의 생체 활성을 강화시키는 리간드{LIGANDS THAT POTENTIATE THE BIOACTIVITY OF GONADOTROPINS}

본 발명은 여포 자극 호르몬(FSH)에 대항하고 성선 자극 호르몬의 생체 활성을 강화시킬 수 있는 항체에 관한 것이다.

본 발명은 주로 인간 의학 및 수의학에서 암컷 포유동물의 배란을 유도하기 위해 응용된다.

하기 기술내용에서, ([]) 사이의 참고문헌은 본문의 말단에 제공된 참고문헌의 목록을 나타낸다.

성선 자극 호르몬(gonadotropin 또는 gonadotrophin)은 성선(난소 및 고환)의 기능에 작용하여 척추동물의 생식 조절에 중요한 역할을 하는 복합 당단백질 호르몬이다. 이 호르몬들 중 다음의 두 가지는 모든 척추동물에서 분비된다: 황체 형성 호르몬(LH) 및 여포 자극 호르몬(FSH). 포유동물의 두 가지 군, 즉 말과(horse family) 및 영장류의 구성원에서는, 또한 태반에 의해 분비되는 융모성 성선 자극 호르몬(CG), 즉 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG) 및 말 융모성 성선 자극 호르몬(eCG)이 있으며, 이것들 둘 다는 LH 수용체를 통해 작용한다.

황체 형성 호르몬(LH)은 그 자체가 시상하부에 의해 생산되는 GnRH로부터의 자극 하에 뇌하수체 전엽의 성선 자극 세포에 의해 생산된다. LH는 수컷에서 테스토스테론 생산을 자극하는 반면, 암컷에서는 말기 여포 성장과 배란 그리고 이어서 파열된 배란 여포의 황체로의 전환의 원인이 되는 난소 주기의 변형에 관여한다. 월경 주기의 황체기 동안에, LH는 초기 배 발달 및 착상에 필수적인, 황체에 의한 프로게스테론 분비를 자극한다. LH는 동일한 종의 모든 당단백질 호르몬(FSH, CG 및 갑상선-자극 호르몬, TSH와 같은)에 공통된 α-서브유닛, 및 호르몬 활성의 특이성의 원인이 되는 β-서브유닛으로 구성되며; 상기 활성은 상기 두 서브유닛이 비공유결합적으로 다이머 형태로 연결되는 경우에만 존재한다.

여포 자극 호르몬(또는 FSH)은 시상하부에 의해 생산된 GnRH로부터의 자극 하에 뇌하수체 전엽에 의해 생산된다. 수컷에서, FSH는 정자 형성(spermatogenesis)에 필수적인 세르톨리 세포(Sertoli cell)를 자극한다. 암컷에서, FSH는 과립막 세포의 FSH 수용체를 자극함으로써 미성숙 원시 여포의 모집, 그것들의 성장 및 배란 전 여포로의 분화의 원인이 된다. FSH는 두 개의 서브유닛, α 및 β로 구성되고, LH와 유사한 구조를 가진다. 다이머만이 FSH 수용체를 자극할 수 있다.

암컷에서, LH 및 FSH 수준은 주기적이다: 생식 휴지 주기 동안 또는 배란 주기 외에는 매우 낮으며, 배란 전 주기에 분비 피크를 가진다.

성선 자극 호르몬은 암컷 포유동물의 배란을 유도하기 위해서 수의학 및 의학에 사용된다. 이 처리는, 효과적이긴 하지만, 특히 수의학 분야에서, 생물학적 유체(혈액, 소변), 또는 조직(뇌하수체)으로부터 추출된 호르몬의 사용으로 인해 건강에 악영향을 나타낸다. 이것은 임신한 암말 혈액으로부터 추출된 말 융모성 성선 자극 호르몬(eCG), 및 돼지 뇌하수체로부터 추출된 돼지 LH 및 FSH의 경우에 해당한다. 수의학 분야에서, 임신한 여성의 소변으로부터 추출된 hCG, Chorulon®(MSD laboratory)이 또한 사용된다.

인간 임상 분야, 및 특히 보조 생식 기술(ART) 분야에서, 폐경기 여성의 소변으로부터 추출된 호르몬, 예를 들어, 정제된 FSH인 Fostimon®(Laboratoire Genevrier), 및 hMG(인간 폐경기 성선 자극 호르몬)인 Menopur®(Ferring Pharmaceuticals laboratory), FSH와 LH의 혼합물, 및 정제된 hCG인 융모성 성선 자극 호르몬 Endo5000(Schering-Plough laboratory)이 사용된다. 재조합 인간 FSH, 예를 들어, Gonal-F®(Merck Serono laboratory) 및 Puregon®(Merck Schering-Plough laboratory); 및 Ovidrel® 및 Luveris®(Merck Serono laboratory)와 같은 재조합 hCG 및 LH 또한 사용된다.

또한, 이 호르몬들의 반복적인 사용은 일반적으로 호르몬의 효과를 중화시키는 면역 반응을 유발하고, 따라서 치료 효능의 감소를 초래한다. 하지만, 어떤 경우에는 동시 투여될 때 면역 반응이 호르몬의 활성을 강화시킬 수 있는 항체를 생산할 수 있다는 것이 또한 입증되었다(특허 EP 1 518 863) [1]. 세가지의 항-LH 단클론 항체가 호르몬의 작용을 강화시킬 수 있고, 그것들 중 두 가지에 대해서는 FSH의 작용을 강화시킬 수 있다는 것이 또한 입증되었다(국제 출원 WO 2012/066519) [2].

본 발명자들은 FSH의 β-서브유닛에 대항하여 생산된 단클론 항체를 얻었으며, 이것은 그것의 작용 및 LH와 hCG의 작용을 강화시킬 수 있다.

이 단클론 항체는 CF12라 지칭한다.

CF12 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)는 부다페스트 조약(Treaty of Budapest)에 따라 2013년 10월 3일에 CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes[French National Collection of Microorganism Cultures], Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)에 기탁번호 CNCM I-4803 로 기탁되었다.

CF12 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열이 결정되었고, 상응하는 펩티드 서열이 도출되었다. 그것들은 하기 표 1에 제시된다.

CDR(상보성 결정 영역, complementarity determining regions)을 암호화하는 서열은 상기 CF12 항체의 중쇄(VH-CDR) 및 경쇄(VL-CDR)의 가변 영역의 서열로부터 결정되었다. 해당 펩티드 서열이 도출되었고 각각 하기 표 2에 제시된다.

본 발명의 목적은 항-FSH β-서브유닛 항체의 파라토프를 포함하는 것을 특징으로 하는, FSH, 황체 형성 호르몬(LH) 및 융모성 성선 자극 호르몬(CG)의 생체 활성을 강화시키는 여포 자극 호르몬(FSH) 리간드이다.

본 명세서에서, 용어 "항-FSH β-서브유닛 항체"는 FSH의 1차 주사 후 이어서 FSH β-서브유닛의 주사를 동반한 여러 촉진제를 기반으로 하는 동물의 면역화에 의해 얻어지는 임의의 항체를 의미한다. 상기 주사는 예를 들어 양, 인간, 소, 염소 또는 돼지, 말, 개, 쥐, 등의 다양한 포유동물로부터의 FSH, 동종 또는 이종 기원의 FSH 및 FSH의 β-서브유닛을 사용하여 제공될 수 있다. 따라서, CF12 단클론 항체는 인간 FSH 및 인간 FSH β-서브유닛을 사용한 면역화 이후에 얻어졌다.

특히, 본 발명의 목적은 다음을 특징으로 하는, 본 발명에 따르는 리간드이다:

중쇄 가변 도메인은 다음 CDR을 포함한다:

- 서열 GFTFSSSY (서열 번호: 5)로 정의된 VH-CDR1;

- 서열 IYAGTGGT (서열 번호: 6)로 정의된 VH-CDR2;

- 서열 ARHGSYFDY (서열 번호: 7)로 정의된 VH-CDR3; 및

경쇄 가변 도메인은 다음 CDR을 포함한다:

- 서열 QSVDYDGDSY (서열 번호: 8)로 정의된 VL-CDR1;

- 서열 AAS로 한정된 VL-CDR2;

- 서열 QQSNEDPYT (서열 번호: 9)로 정의된 VL-CDR3.

본 명세서에서, 용어 "CDR"은 파라토프의 요소들을 구성하고 항원의 에피토프와 항체의 상보성을 결정하는 것이 가능하게 하는 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 세 개의 초가변 영역을 의미한다. 이들 세 개의 초가변 영역은 "프레임워크" 영역(FRs)을 구성하고 가변 도메인에게 안정한 입체배치를 제공하는 네 개의 불변 영역에 의해 프레이밍된다.

본 발명에 따르는 리간드는 예를 들어 다음과 같다:

- CNCM I-4803 하이브리도마에 의해 생산된 CF12 단클론 항체;

- 단독으로 또는 혼합물로서 사용되는 상기 항체의 VH 또는 VL 단편;

- 상기 항체의 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv 또는 scFv 단편 또는 나노바디(nanobody), 바람직하게는 Fab 단편 또는 scFv 단편;

- 각각 2개, 3개 또는 4개의 scFv 단편의 2가, 3가 또는 4가 형태(디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody));

- 상기 항체의 파라토프 및 의도된 동물 또는 인간에 관하여 면역원성을 최소화하기 위해 변형된 불변 영역을 포함하는 재조합 항체, 예를 들어, 키메라(인간화, 양화, 염소화, 소화, 돼지화 등) 또는 완전히 인간화된, 양화된, 염소화된, 소화된, 돼지화된 항체.

비제한적 예로서, CF12 항체로부터 유래한 scFv의 뉴클레오티드 서열이 결정되었고, 해당 펩티드 서열이 도출되었으며 각각 하기 표 3에 제시한다.

본 발명의 목적은 또한 본 발명에 따르는 리간드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.

본 발명의 목적은 또한 본 발명에 따르는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 특히 발현 벡터이다.

본 발명의 목적은 또한 본 발명에 따르는 뉴클레오티드 서열 또는 본 발명에 따르는 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 예를 들어, 숙주 세포는 CNCM I-4803 하이브리도마 또는 본 발명에 따르는 뉴클레오티드 서열 또는 재조합 벡터로 형질전환된 세포이다.

본 발명의 목적은 또한 적절한 배지에서 본 발명에 따르는 숙주 세포를 배양하고, 그리고 상기 배양물로부터 상기 리간드를 회수하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따르는 리간드의 생산 방법이다.

본 발명자들은 CF12 항체가 인간 FSH를 강력하게 강화시키는 것과 대조적으로, 돼지, 양 및 소 FSH를, 상당하지만, 더 적게 강화시킨다는 것을 입증하였다. 또한, 본 발명자들은 CF12 항체로부터 유래한 scFv가 그것이 유래된 항체와 같은 결합 및 강화 성질을 가진다는 것을 입증하였다.

본 발명의 목적은 또한 약제로서 사용되고, 특히 FSH, LH 및 융모성 성선 자극 호르몬(CG)의 생체 활성을 강화시켜 암컷 포유동물에서 배란을 유도하고 수컷 또는 암컷 포유동물에서 호르몬-의존성 불임 또는 저수태능 문제를 감소시키는 본 발명에 따르는 리간드이다.

본 발명의 목적은 또한 리간드 및 상기 리간드에 결합할 수 있는 성선 자극 호르몬, 또는 이들의 활성 펩티드로부터 형성되는 복합체이며, 상기 활성은 상기 리간드에 의해 강화된다. 예를 들어, 본 발명의 목적은 리간드와, 생물학적 조직 또는 유체로부터 추출되었거나 상기 리간드에 결합할 수 있는 재조합형, 또는 이들의 활성 펩티드인, LH, 융모성 성선 자극 호르몬(CG) 또는 FSH의 복합체이며, 그 활성은 상기 리간드에 의해 강화된다.

본 발명의 목적은 또한 약제로서 사용되고, 특히 FSH, LH 및 융모성 성선 자극 호르몬(CG)의 생체 활성을 강화시켜 암컷 포유동물에서 배란 또는 다중배란을 유도하거나 또는 수컷 또는 암컷 포유동물에서 호르몬-의존성 불임 또는 저수태능 문제를 감소시키는 본 발명에 따르는 리간드 또는 복합체이다. 상기 약제는 또한 암컷 포유동물에서 하나 이상의 황체에 의해 분비되는 내인성 프로게스테론의 순환 레벨을 증가시키고, 따라서 초기 배 발달을 촉진하고 유산의 위험을 감소시키는 것을 가능하게 한다.

본 발명의 목적은 또한 비-인간 암컷 포유동물에 본 발명의 리간드 및/또는 복합체의 투여를 포함하는, 육생산(meat production) 방법이다.

본 발명의 목적은 또한 포유동물에서 호르몬-의존성 불임 또는 저수태능의 치료에 사용되는 본 발명의 리간드 및/또는 복합체이다. 불임 또는 저수태능을 앓고 있는 암컷 포유동물의 경우, 본 발명의 리간드 또는 복합체의 투여가 자연적, 의학적으로 보조된 또는 인공적 생식을 자극하는 것을 가능하게 할 것이다. 건강한 암컷 포유동물에 본 발명의 리간드 또는 복합체의 투여는 또한 자연적 또는 인공적 생식의 맥락에서 배란을 촉발하는 것을 가능하게 한다는 것을 주목해야 한다.

본 명세서에서, 용어 "호르몬-의존성 불임/저수태능"은, 예를 들어, 외적 원인(예를 들어 살충제) 또는 내적 원인(예를 들어, LH, FSH 또는 CG 수용체 또는 성선 자극 호르몬의 이상, 예를 들어 수용체 돌연변이 또는 다형성증으로 인한 뇌하수체 또는 시상하부 불충분 또는 LH 및/또는 FSH에 대한 생식선 수용성의 문제)으로부터 발생한 호르몬 불충분, 예를 들어 FSH 및 LH의 낮은 순환 농도 또는 이 호르몬들의 결핍으로 인한 불임/저수태능을 의미한다.

본 발명의 리간드 및 복합체는 인간 또는 동물, 특히 양과, 소과, 염소과, 말과, 돼지과, 쥐과, 개과, 낙타과 등의 구성원에서 사용될 수 있다.

본 발명에 따르는 리간드, 호르몬 또는 복합체는 그것들의 강화 효과를 변형시키지 않으면서 주사, 예를 들어 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 피하, 경피, 피부 내(intradermal), 안와 내(intraorbital), 안구 내(intraocular) 또는 안 내(ophthalmic) 주사에 의해, 또는 경안(transocular) 경로를 통해 별도로, 또는 순차적으로, 또는 공동으로 투여될 수 있다.

본 발명의 목적은 또한 본 발명의 리간드 또는 복합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이다. 상기 약학적 조성물은 또한 FSH 및/또는 LH 및/또는 융모성 성선 자극 호르몬(CG)을 포함할 수 있다.

당업자는 하기 첨부된 도면에 의해 예시된 실시예를 통해 다른 이점을 추가로 이해할 수 있다.

도 1은 소 과립막 세포에서 인간 FSH(hFSH)의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체의 시험관 내 강화 효과를 도시한다.
도 2는 인간 FSH 수용체로 안정하게 트랜스펙션된 HEK 293 세포주에서 인간 FSH(hFSH)의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체의 시험관 내 강화 효과를 나타낸다.
도 3은 인간 FSH 수용체 및 Glosensor ^® 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 HEK 293 세포주에서 인간 FSH(hFSH)의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체의 시험관 내 강화 효과를 나타낸다.
도 4는 인간 FSH 수용체 및 Glosensor ^® 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 HEK 293 세포주에서 인간 FSH(hFSH)의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체 및 CF12 scFv의 시험관 내 강화 효과를 나타낸다.
도 5는 인간 FSH 수용체 및 Glosensor ^® 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 HEK 293 세포주에서 양 FSH(oFSH)의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체의 시험관 내 강화 효과를 나타낸다.
도 6는 인간 FSH 수용체 및 Glosensor ^® 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 HEK 293 세포주에서 돼지 FSH(pFSH)의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체의 시험관 내 강화 효과를 나타낸다.
도 7은 인간 과립막 세포에서 인간 FSH(hFSH) Gonal-F ^® (B) 및 Fostimon ^® (C)의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체의 시험관 내 강화 효과를 나타낸다.
도 8은 인간 과립막 세포에서 인간 FSH(hFSH) Gonal-F ^® 의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체의 시험관 내 강화 효과를 나타낸다.
도 9는 암컷 래트에서 인간 FSH(hFSH) Gonal-F ^® , Puregon ^® 및 Fostimon ^® (A) 및 양 FSH(oFSH)(B)의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체의 생체 내 강화 효과를 나타낸다.
도 10은 인간 FSH(hFSH) Gonal-F ^® (A 및 B), Puregon ^® 및 Fostimon ^® (A)의 생체 활성에 대한 CF12 scFv의 생체 내 강화 효과 및 다양한 투여 방법에 따른 인간 FSH(hFSH) Gonal-F(C)의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체의 생체 내 강화 효과를 나타낸다.
도 11은 수컷 래트에서 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG) Chorulon ^® 및 Endo 5000®의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체의 생체 내 강화 효과를 나타낸다.
도 12는 생식 기간 중의 암양에서 내인성 성선 자극 호르몬의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체의 생체 내 강화 효과를 나타낸다.
도 13은 암컷 원숭이에서 여포 자극에 대하여, 25 IU의 hFSH 이후 단독으로 주사된 CF12 단클론 항체의 생체 내 강화 효과를 나타낸다.
도 14는 암컷 원숭이에서 여포 자극에 대하여, 37.5 IU의 hFSH 이후 단독으로 주사된 CF12 단클론 항체의 생체 내 강화 효과를 나타낸다.
도 15는 암컷 원숭이에서 에스트라디올 및 프로게스테론의 분비에 대하여, 37.5 IU의 hFSH 이후 단독으로 주사된 CF12 단클론 항체의 생체 내 강화 효과를 나타낸다.
도 16은 hFSH, hCG, hLH, oLH, pLH, oFSH 및 pFSH 호르몬 및 인간 FSH 수용체에서 CF12 리간드의 에피토프의 입체구조적 에피토프를 나타낸다.
도 17은 hFSH의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체의 다양한 단편의 시험관 내 강화 효과를 나타낸다.
도 18은 암컷 래트에서 hFSH의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체의 다양한 단편의 생체 내 강화 효과를 나타낸다.

실시예

실시예 1: 본 발명의 리간드의 획득, 및 그것들의 특성화

1. 마우스 면역화 계획

모든 주사를 마우스(Balb/C)의 복강 내로 수행하였다. 다섯 마리의 마우스를 사용하였다.

CF12 항체에 대한 마우스 면역화 계획

재조합 인간 FSH(rhFSH)을 여러 번 주사하여 면역화를 수행하였다. 완전 프로인트 보조제(complete Freund's adjuvant)와 함께 rhFSH 50 μg 로 제1 주사 (D0)를 수행하였다. 그 다음에 여러 번의 촉진 주사를 다음 순서에 따라 수행하였다.

- D21 및 D35: 불완전 프로인트 보조제(incomplete Freund's adjuvant)와 함께 rhFSH 50 μg 의 촉진 주사;

- D55, D56 및 D57: 보조제 없이 30 μg의 rhFSH 베타-서브유닛의 주사;

- D58: 융합.

2. 아이소타이핑(Isotyping)

RD Biotech에서 판매된 FastElysa 아이소타이핑 키트(reference RDB 3255)로 제조사의 권장사항에 따라 CF12 항체의 아이소타이핑을 수행하였다.

CF12 항체는 IgM Class 및 카파 아이소타입의 면역글로불린이다. 얻어진 광학 밀도(OD) 값은 각각 0.639 및 0.6이었다.

3. 시퀀싱(Sequencing)

하기 프로토콜에 따라 그것들의 메신저 RNA (mRNA)로부터 CNCM I-4803 하이브리도마에 의해 분비된 CF12 항체의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변부의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다.

Nucleospin® RNA 키트(Macherey Nagel, Germany)를 사용하여 제조사의 권장사항에 따라 세포에서 RNA를 추출하였다. 260 nm에서의 흡광도(A)를 측정함하여 정제된 RNA 농도를 평가하였고, 그것들의 양을 A260 nm/280 nm 비율로 및 아가로스 겔 상의 전기영동 이동 후 시각적으로 평가하였다.

그 다음에 프라이머로서 oligo-dT ₁₈ 을 사용하여 M-MLV 효소(Ref. M1701, Promega, USA)와의 역전사 반응에 의해 제조사의 권장사항에 따라 mRNA의 상보적 DNA를 합성하였다.

다음 프로토콜에 따라 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 제2 DNA 가닥의 합성을 수행하였다: 50 μl의 최종 부피로 역전사 반응물 4 μl에 하기 성분을 첨가하였다; 반응 버퍼(1X 최종 농도), dNTP 각각 200 μM, 정방향 및 역방향 프라이머 300 nM, GoTaq 폴리머라제(Ref M3175, Promega, USA) 1.25 U.

경쇄의 가변부의 증폭을 위해서, 5개의 다른 프라이머 쌍(MKRev2 내지 8 + MKC5For)을 사용하였고 중쇄의 가변부의 증폭을 위해서 2개의 쌍(VHRev1 또는 VHRev2 + MμCFor)을 사용하였다.

사용된 PCR 프로그램은 95℃에서 2분 동안 최초 변성 후 이어서 95℃에서 30초 동안 30주기의 변성, 47℃에서 30초 동안 혼성체화(hybridization) 및 72℃에서 1분 동안 증폭, 및 마지막으로, 72℃에서 5분 동안 최종 증폭으로 이루어진다. 얻어진 PCR 생성물을 QIAquick®Gel extraction kit(Ref 28704, Qiagen GmbH, Germany)로 탈염한 다음에, 박테리아에서 형질전환되도록 pGEMT easy vector 플라스미드(Ref A1360, Promega, USA)로 결찰시켰다. 다양한 박테리아 클론에서 추출된 플라스미드 DNA에 대해 시퀀싱 분석 의뢰하였다(Macrogen Europe, the Netherlands).

cDNA의 선도 서열에 고정된 특이적 프라이머(Fw 프라이머)의 설계를 통해 CF12 항체의 VH 및 VL의 5'-말단 뉴클레오티드 서열을 순차적으로 결정하였다. 앞서 얻어진 VL 및 VH 서열 사이의 정렬 및 IMGT/V-QUEST 소프트웨어의 데이터베이스에 의한 상동성의 확인(Brochet et al., Nucl. Acids Res., 36: W503-508, 2008; Giudicelli et al., Cold Spring Harb Protoc., 2011(6): 695-715, 2011) [3, 4] 및 IMGT/GENE-DB로부터 원하는 선도 서열의 추출(Giudicelli et al., Nucl. Acids Res., 33: D256-261, 2005) [5] 후 이 프라이머들을 설계하였다. 각각의 항체의 앞서 결정된 각각의 VH 및 VL 서열 내에서 역방향(Rev) 프라이머를 설계하였다. 5' 부분을 얻는데 사용된 프로토콜은 전술된 단락에서 기술된 바와 같다.

MultAlin 소프트웨어를 사용하여 서열의 정렬로부터 공통 뉴클레오티드 서열을 도출하였다(Corpet, Nucl. Acids Res., 16(22): 10881-10890, 1988) [6]. IMGT/V-QUEST 소프트웨어를 사용하여 폴리펩티드 서열로의 전사 및 CDR의 주석(annotation)을 수행하였다. 그 결과는 표 6 및 7에 제시한다.

4. scFv의 구성, 생산 및 특징

a. scFv 항체 단편의 구성

ATG:Biosynthetics GmbH(Germany)에 의해 CF12 항체로부터 유도된 단일 사슬 가변 단편(scFv)의 합성 유전자를 합성하였다.

단백질의 기능을 보장하는 펩티드(Gly ₄ Ser) ₃ 를 암호화하는 서열로 연결되고, scFv의 정제를 허용하는 His ₆ 펩티드(HIS-태그 펩티드)를 암호화하는 서열로 끝나는 중쇄 및 경쇄 가변부(서열 번호: 1/ 서열 번호: 3)의 융합으로부터 각각의 서열을 설계하였다. 발현 플라스미드 내로 삽입이 가능하게 하기 위해서, PstI 및 SalI 제한 효소 부위로 서열을 플랭킹하였다(flank). VL의 3' 단부 및 SalI 부위 사이에 추가적인 서열을 첨가하여 원하는 경우 His ₆ 펩티드를 제거할 수 있게 하였다. 코돈을 대장균( E. coli )에서의 발현에 최적화하였다. scFv 합성 유전자의 구조의 도식적 표현은 하기 상세히 제공된다:

ES Ward et al.(Ward et al., Nature, 341: 544-546, 1989) [7]에 따라, LacZ 유도성 프로모터의 제어 하에, 리딩 프레임(reading frame)에서 재조합 항체 단편의 유전자와 융합되어, 합성된 단백질의 박테리아 주변세포질로의 이동을 허용하는 PelB 신호 서열을 함유하는 pSW1 발현 플라스미드(ATG:Biosynthetics GmbH, Germany)의 PstI 및 XhoI 효소 부위 사이에 항체 단편을 삽입하였다. 주변세포질에서, 이 신호 서열은 펩티다제에 의해 제거된다.

시퀀싱에 의해 구성의 품질 검증 후, 컴피턴트(competent)하게 만든 HB2151 박테리아(T53040, Interchim, France)를 pSW1-CA5, pSW1-CH10 및 pSW1-CF12 플라스미드를 사용하여 열 충격으로 형질전환하였다(Li et al., Afr. J. Biotechnol., 9(50): 8549-8554, 2010) [8].

b. 재조합 항체 단편의 생산

- 박테리아 배양

사전배양물을 50 μg/ml 앰피실린을 함유하는 2xYT 배지 5 ml에서 37℃에서 밤새 제조하였다. 다음 날, 이 사전배양물 500 μl를 동일한 배지 500 ml에 접종하였고, OD _600nm 1.4가 얻어질 때까지 37℃, 150 RPM에서 성장시켰다. 16℃, 150 RPM에서 16 시간 동안 0.1 mM의 IPTG를 첨가하여 scFv의 합성을 유도하였다.

- 추출

4℃에서 30분 동안 4500 g로 배양 배지를 원심분리하였다. 이후의 제조는 4℃에서 수행하였다. 박테리아 주변세포질을 추출하기 위해서, 펠릿을 재현탁하여 TES (0.2 M Tris, pH 8, 0.5 M EDTA, 0.5 M 수크로스) 10 ml에서 30분 동안 배양한 다음, 여기에 1/4로 희석된 TES 15 ml를 추가한 후, 이어서 30분 동안 추가 배양하였다. 10 000 g에서 30분 동안 박테리아 추출물을 원심분리하였다. 상층액을 PBS에 대하여 밤새투석하였다. 투석된 상층액을 scFv를 정제하기 위해서 즉시 처리하거나, 사용할 때까지 -20℃에 저장하였다.

제조사의 권장사항에 따라 항-His-태그 HRP 항체(Ref R93125 Life Technologies, France)를 사용한 웨스턴 블롯팅으로 주변세포질에서의 scFv의 생산을 분석하였다.

- 정제

4℃에서 20분 동안 5 000 g으로 주변세포질을 원심분리하였다. 4℃에서 1 시간 동안 상층액을 HIS-Select® Nickel Affinity Gel(Sigma-Aldrich, MO, USA)과 함께 교반하면서 배양하였다. 겔을 0.3 M NaCl, pH 8을 함유하는 0.05 M 나트륨 포스페이트로 세척한 다음, 0에 가까운 OD _280nm 가 얻어질 때까지, 20 mM 이미다졸을 함유한 동일한 버퍼를 첨가하였다. 그 다음에 0.3 M NaCl 및 250 mM 이미다졸, pH 8을 함유하는 0.05 M 소듐포스페이트 버퍼로 scFv를 용출시켰다. 용출액을 PBS로 밤새 투석하였다. 그것을 -20℃에 저장하였다.

- 품질 관리

정제된 scFv를 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색한 후, 15% 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 전기영동 및 Sephadex™ 75 10 /300 GL 컬럼(Ref 17-5174-01 GE Healthcare, Germany) 상에서의 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다.

5. 특이성

CF12 항체 및 이것의 scFv의 특이성을 ELISA 기술로 연구하였다. 평가된 각각의 호르몬은 0.1 M 소듐카보네이트 버퍼, pH 9.6 내에서 10 μg/ml 농도로 준비하고, ELISA 플레이트 상에 웰 당 100 μl의 양으로 분배하였다. 흡착 시간은 +4℃에서 18시간이었다. 5번 세척한 후, 37℃에서 웰에 0.1% Tween 및 1% BSA가 보충된 PBS 100 μl를 45분 동안 처리한 다음, 각각의 항체 또는 scFv를 100 μl/웰의 양으로 분배하였고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 평가된 각각의 호르몬에 있어서, 항체 및 scFv는 항체에 대해서 10 내지 250 μg/ml 및 scFv에 대해서 10 내지 150 또는 200 μg/ml의 범위의 다양한 농도로 분배하였다.

5번 세척한 후, 퍼옥시다제(HRP)에 커플링된 제2 항체를 100 μl/웰의 양으로 분배하였고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 연구된 단클론 항체의 아이소타입에 따라, 제2 항체는 항-IgG1 HRP(Ref. 115-035-205, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc), 항-IgG2a HRP(Ref. 115-035-206, Jackson Laboratories) 또는 항-IgM HRP(Ref. 115-035-075, Jackson Laboratories)였다. scFv에 대하여, 항-His Tag HRP(Ref. R93125 Life Technologies, France)를 사용하였다. 5번 세척한 후, 100 μl/웰의 양으로 분배한 TMB를 이용하여 효소 활성을 확인하였다. 현상 시간은 상온(ambient temperature)에서 반응 속도에 따라 5 내지 30분이었다. 1 MH ₂ SO ₄ (50 μl/웰)를 이용하여 반응이 중단된 후, 착색 반응의 강도(광학 밀도)를 ELISA 플레이트에 대한 분광 광도계를 사용하여 측정하였다.

- CF12 scFv의 특이성

CF12 scFv는 증가하는 농도로 제조된 항체의 흡착된 다양한 호르몬에 대한 결합(포화될 때까지의 결합, Bmax) 현상을 기초로 하여 ELISA 방법에 의해 정량화 가능한 정도의 결합을 얻는 것이 가능하다. 그 결과는 현상 후 얻어진 광학 밀도 단위로 표현된다.

표 9는 돼지 FSH(pFSH) 및 양 FSH(oFSH) 및 다양한 인간 FSH에서 200 μg/ml의 농도로 배양된 CF12 scFv로 얻어진 광학 밀도 값을 나타낸다.

CF12 scFv는 흡착된 pFSH 및 oFSH로는 강력한 결합을 나타내고, hFSH 및 hMG(Menopur)에는 더 약한 결합을 나타낸다.

표 10은 돼지 LH(pLH), 양 LH(oLH), 소 LH(bLH), eCG 및 hCG Chorulon 및 Endo 5000에서 200 μg/ml의 농도로 배양된 CF12 scFv로 얻어진 광학 밀도 값을 나타낸다.

동물 LH에 대한 CF12 scFv의 결합은, 결합이 약한 흡착된 hCG 및 eCG와는 달리 상당하다.

따라서, CF12의 결합 및 CF12 scFv의 결합은, 특히 인간 호르몬에 대하여, 에피토프의 입체구조(conformation)에 의해 극도로 제한되는 것으로 보인다. CF12 및 그것의 scFV를 이용하여 얻어진 주목할 만한 생물학적 효과, 시험관 내 및 생체 내에서 인간 FSH 및 hCGs Chorulon 및 Endo 5000의 활성(실시예 2 및 3의 결과 참조)에 따르면, CF12 scFv의 결합은 전체 항체의 결합처럼, 호르몬의 입체구조에 전적으로 의존적일 것으로 보인다. ELISA 플레이트의 플라스틱 위에 흡착된 호르몬의 입체구조의 변형으로 인한 CF12 및 CF12 scFv의 결합의 손상에 대한 가설은 이 결과들을 설명할 수 있으며, CF12 및 그것의 scFv가 극단적인 입체구조의 에피토프에 특이적이라는 가설을 보강한다.

연구된 다양한 FSH, LH 및 CG에 대하여, scFv의 해리 상수 Kd의 평가값을 포화 결합 모델("포화 결합 실험 모델", GraphPad PRISM 소프트웨어)의 "1 부위 - 특이적 결합(One site - Specific binding)" 기능을 사용하여 GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA, version 5)으로 계산하였다. 얻어진 다양한 값들은 표 11 및 12에서 나타난다.

이와 같이 평가된 해리 상수 Kd의 비교는 양, 돼지 및 인간 FSH(Gonal-F 및 Fostimon)에 대하여 scFv의 더 강력한 친화도를 나타내며, Kd 값은 pFSH 및 hFSH Fostimon에 대한 2.6 μM에서 oFSH에 대한 3.77 μM 및 hFSH Gonal-F에 대한 4.87 μM까지의 범위이다.

동물 LH, eCG 및 hCG Chorulon 및 Endo 5000에 대한 Kd 값은 비교적 균일하며 4.72 내지 6.23 μM로 다른데, 이는 상기 FSH와 비교하여 이 호르몬들에 대한 CF12 scFv의 친화도가 조금 더 약하다는 것을 증명한다.

hFSH Puregon 및 hMG Menopur에 대하여, CF12 scFv는 Kd 약 10 μM 정도 훨씬 더 약한 친화도를 나타낸다: 각각 14 및 25.22 μM.

실시예 2: FSH의 생체 활성에 대한 본 발명의 리간드의 강화 효과의 시험관 내 측정

본 발명의 리간드의 FSH 생체 활성에 대한 강화 효과의 입증을 FSH 단독 또는 FSH / 단클론 항체(MAb) 복합체로 자극된 다양한 세포 유형 또는 세포주를 이용하여 얻어진 생물학적 반응을 비교함으로써 수행하였다.

각각의 경우에, 얻어진 용량-반응 곡선의 비교는 복합체를 형성한 FSH의 생물학적 활성에 대한 MAb의 시험관 내 강화 효과를 정량하는 것을 가능하게 하였다. 얻어진 결과의 통계 분석을 Prism 소프트웨어(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA, version 5)를 사용하여 수행하였다.

1. 소 과립막 세포의 1차 배양물에서

우선 인간 FSH(hFSH)에서의 CF12 MAb의 강화 효과를 소 FSH 수용체를 내인성으로 발현하는 소 과립막 세포에서 특성화하였다.

0.1 μg/ml의 CF12 항체의 최종 농도로 하이브리도마 상층액을 37℃에서 30분 동안 3 ng/ml 내지 25 ng/ml의 범위의 인간 FSH의 범위를 이용하여 배양하였다.

소 과립막 세포를 Chopineau et al.(Mol. Cell Endocrinol., 92(2): 229-39, 1993) [8] 및 Wehbi et al.(Endocrinology, 151(6): 2788-2799, 2010) [9]에 의해 기술된 프로토콜에 따라 2 내지 6 mm의 범위의 직경을 가진 여포로부터 소 난소의 난소 천자에 의해 채취하였다. McCoy's 5A 배지(Lonza, Belgium, reference BE12-688F)의 현탁액 내에 0.5 ml 당 80 000개 세포로 준비된 소 과립막 세포를 상기 프로토콜에 따라, 48 μg/ml의 IBMX(Sigma Aldrich, France, reference I5879)의 존재 하에, 3 ng/ml 내지 25 ng/ml 범위의 FSH 단독 또는 단클론 항체와의 사전 복합체로, 37℃에서 3시간 동안 교반하면서 자극하였다. 측정된 생물학적 반응은 cAMP 분비량이었다.

원심분리 후, 생산된 cAMP를 배양 상층액에서 ELISA 키트(Biomedical Technologies Inc., MA, USA, BT-730)를 사용하여 분석하였다.

그 결과는 도 1에서 제공된다.

이 결과는 인간 FSH의 활성에 있어서 CF12에 대하여 2.5배 증폭을 보여준다. 이원 분산 분석에 의한 통계 분석( two-way ANOVA, GraphPad PRISM 소프트웨어)은 CF12에 대하여 p<0.01(**) 내지 p<0.001(***)의 범위의 유의한 효과를 보여준다. CF12 항체는 테스트된 모든 hFSH 농도에 대하여 유의한 효과를 가진다.

2. 인간 FSH 수용체로 안정하게 트랜스펙션된 HEK293 세포주에서

다양한 종의 FSH에 대한 MAb의 강화 효과를 인간 FSH 수용체를 안정하게 발현하는 HEK 293 세포에서 측정하였다. 이 시스템은 37℃에서 1시간 동안 FSH 단독 또는 FSH / MAb 복합체로 자극 이후 FSH 수용체의 활성화에 따른 cAMP 생산량을 측정하는 것을 가능하게 한다.

이를 위해, 60 000개의 세포를 96-웰 플레이트(Becton Dickinson, NJ, USA, reference 353072)의 웰에 분배하고 10% SVF(Lonza, Belgium, reference DE14-801F), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Sigma Aldrich, France, reference P-4333) 및 400 μg/ml의 G418(Sigma Aldrich, France, reference A1720)을 함유하는 MEM 배지(Ozyme, France, reference BE12-611F) 100 μl에서 습윤 대기에서 37℃, 5% CO ₂ 로 24 시간 동안 배양하였다. MEM 배지에서 위닝(weaning) 2 시간 후, 세포를 37℃에서 1 시간 동안 자극하였다. 배양 상층액을 회수하여 ELISA 키트(Biomedical Technologies Inc., MA, USA, BT-730)를 사용하여 분석하였다. 그 결과는 종점에서 분비된 cAMP의 양을 나타낸다. 그것들을 Prism 소프트웨어(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA, version 5)를 사용하여 분석하였다.

도 2는 인간 FSH 수용체로 안정하게 트랜스펙션된 HEK 293 세포에서 시험관 내 인간 FSH의 생체 활성에 대한 CF12 단클론 항체의 강화 효과를 나타낸다. 이를 위해, 세포들을 인간 FSH(Gonal-F, Serono Laboratory) 0.3 ng/ml 내지 3 ng/ml의 범위, 또는 세포 자극 전 단클론 항체(최종 농도 0.1 μg/ml)로 37℃에서 30분 동안 사전 배양된 FSH 동일 범위로 자극하였다. 이원 분산 분석( two-way ANOVA, GraphPad PRISM 소프트웨어)는 FSH 단독 또는 FSH/단클론 항체 복합체를 이용하여 얻어진 용량-반응 곡선을 비교하는 것을 가능하게 한다. 재조합 인간 FSH(Gonal-F, Serono Laboratory)로 얻어진 결과는 CF12 항체가 0.5 ng/ml에서 140% 및 각각 1 및 3 ng/ml의 농도에 대하여 160%의 호르몬 활성-강화 효과를 가진다는 것을 보여준다. 이 효과는 대응표본 t-테스트(윌콕슨 테스트(Wilcoxon test))를 이용하여 인간 FSH의 3 ng/ml 지점에 대하여 유의하다(p<0.01)

3. 인간 FSH 수용체 및 Glosensor ® 시스템으로 안정하게 트랜스펙션된 HEK293 세포주에서

다양한 종의 FSH에 대한 MAb의 강화 효과를 인간 FSH 수용체 및 GloSensor™ 벡터(Promega, France)를 안정하게 발현하는 HEK 293 세포에서 실시간으로 측정하였다. 이 세포 시스템은 아고니스트(FSH 단독 또는 FSH / 단클론 항체 복합체)로 FSH 수용체의 자극 이후 cAMP 생산을 실시간으로 모니터링하는 것을 가능하게 하였다. GloSensor™ 단백질 상에 cAMP의 결합 후, GloSensor™ 기질(Promega, France, reference E1291)은 가수분해되어 PolarStar Optima 리더(BMG Labtech, Germany)로써 측정되는 발광의 방출을 초래하였으며 RLU(Relative Luminescence Units)으로 표현된다. 이 안정한 세포주는 INRA[French National Institute for Agronomic Research] center, Val de Loire, 37380 Nouzilly, France)의 Biology and BioInformatics of Signaling Systems 팀에 의해 개발되었고, 이 검정에 이용 가능하게 하였다.

이를 위해, HEK 293 세포를 투명한 바닥의 흰색 96-웰 마이크로플레이트(Dominique Dutscher, France, reference 655903)의 웰 당 80 000개 세포의 비율로 배양하였고, 10% SVF(Lonza, Belgium, reference DE14-801F), 1% 페니실린 / 스트렙토마이신(Sigma Aldrich, France, reference P-4333), 200 μg/ml의 하이그로마이신 B(Life Technologies™, France, reference 10687010) 및 400 μg/ml의 G418(Sigma Aldrich, France, reference A1720)이 보충된 MEM 배지(Ozyme, France, reference BE12-611F) 100 μl에서 밤새 배양하였다. 암(dark)조건 상온에서 2시간 동안 1% BSA(PAA, France, reference K45012)가 보충되고 4%의 GloSensor™ 기질을 함유하는 MEM 배지 100 μl에서 2시간 위닝(weaning) 후, 세포의 플레이트를 PolarStar Optima 리더에 배치하였고, 발광의 기저 수준을 측정하기 위해서 5분 동안 1차 판독을 수행하였다. 그 다음에 플레이트를 판독기에서 제거하고, 표시된 농도를 얻기 위해서 11 μl의 리간드(FSH 단독 또는 FSH / 단클론 항체 복합체)를 첨가하였다. 그 다음에 방출된 발광을 대략 1 시간 30분 동안 측정하였다.

얻어진 결과를 Prism 소프트웨어(GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA, USA, version 5)를 사용하여 분석하였다. 비-선형 함수 "로그(아고니스트) 대 반응"을 사용하여 FSH 농도의 함수로서 반응을 플롯팅하였다. 이것은 FSH 단독 및 단클론 항체와 복합체를 형성한 FSH에 대한 EC50을 특성화하고 비교하는 것을 가능하게 하였다. 각각의 실시예에 대하여, FSH / 강화 항체 복합체의 유의한 효과를 두 곡선을 전체적으로 비교하여 이원 분산 분석(two-way ANOVA, GraphPad PRISM 소프트웨어)에 의해 측정하였다.

- CF12 단클론 항체

CF12 단클론 항체의 강화 효과를 인간, 양 및 돼지 FSH의 생체 활성에 대하여 특성화하였다.

도 3은 인간 FSH(Gonal-F, Serono Laboratory)의 생체 활성에 대한 CF12의 주목할 만한 강화 효과를 도시한다. 이 주목할 만한 효과는 세포 시스템이 포화 상태가 아닌, hFSH의 낮은 농도인 0.01 nM 및 0.03 nM에서도 완전히 정량화 가능하다(곡선 A 및 B). 각각 280% 및 341%의 매우 유의한(p<0.001) 발광 신호의 증가가 관찰된다. 더 높은 농도(0.1, 0.3 및 1 nM)에서, 세포 반응의 증가는 각각 181%, 147% 및 120%이며(곡선 C, D 및 E), 이는 아마도 46 000 RLU까지의 발광 신호의 점진적 포화로 인한 것일 것이다. 곡선 C, D 및 E에 대하여, 증가는 여전히 매우 유의하다(p<0.001). GraphPad Prism으로 측정된 EC50 값은 hFSH에 대해 4.25x10 ^-10 M이고 hFSH/CF12 복합체에 대해서는 9.38x10 ^-11 M이며, 이는 강화 항체 CF12와 복합체를 형성할 때 0.7 LogEC50 유닛의 호르몬의 생체 활성의 증가(각각 10 ^-9.37 내지 10 ^-10.03 )를 반영한다(곡선 F).

CF12 scFv(40 nM)의 강화 효과를 또한 0.01 nM의 농도로 제조된 인간 FSH(Gonal-F, Serono Laboratory)의 활성에 대하여 측정하였다(도 4). 전체 CF12 항체(6 nM)의 효과를 비교와 동시에 측정하였다. hFSH / CF12 scFv 또는 hFSH / CF12 항체 복합체로 얻어진 곡선은 서로 완전히 겹쳐지며, 이는 1가 항체 단편의 동일한 효과를 나타낸다.

또한 도 5에서 도시된 바와 같이 CF12에 의해 가해진 강화 효과는 양 FSH에 대하여 매우 유의하며, CF12 / oFSH 복합체로 자극하는 동안에 호르몬 농도 0.01 nM, 0.03 nM 및 0.1 nM에 대하여 240%, 300% 및 350%의 세포 반응의 증가가 관찰된다(곡선 A, B, C). CF12는 10 nM로 제조하였다. hFSH와 같은 방식으로, 더 높은 농도인 0.3 nM 및 1 nM(곡선 D 및 E)에 대하여, 세포 반응의 증가는 40 000 RLU까지의 발광 신호의 점진적 포화로 인해 각각 200% 및 130%이다. GraphPad Prism에 의해 측정된 EC50 값은 oFSH에 대해 2.29x10 ^-9 M이고 oFSH/CF12 복합체에 대해서는 1.98x10 ^-10 M이며, 이는 강화 항체 CF12와 복합체를 형성할 때 1.06 LogEC50의 호르몬 생체 활성의 증가(각각 8.64 내지 9.7)를 반영한다(곡선 F). 세포 반응에서 관찰된 강화 효과는 모든 경우에 매우 유의하다(p<0.001).

도 6의 곡선은 0.01, 0.03, 0.1, 0.3 및 1 nM의 농도로 제조된 돼지 FSH에 대한 CF12(10 nM)의 강화 효과를 도시한다. 이 효과는 세포 시스템이 포화 상태가 아닌, 가장 낮은 pFSH 농도인 0.01 nM, 0.03 nM 및 0.1 nM에서도 완벽하게 정량 가능하다(곡선 A, B, C). 따라서 각각 220%, 350% 및 330%의 매우 유의하고 큰 발광 신호의 증가가 관찰된다. 더 높은 농도(0.3 및 1 nM)에 대하여, 세포 반응의 증가는 각각 40 000 RLU 한계까지의 발광 신호의 점진적 포화로 인해 175% 및 114%보다 낮다(곡선 D 및 E). GraphPad Prism에 의해 측정된 EC50 값은 pFSH에 대해 1.92x10 ^-9 M이고 pFSH/CF12 복합체에 대해서는 3.69x10 ^-10 M이며, 이는 강화 항체 CF12와 복합체를 형성할 때 0.717 LogEC50의 호르몬 생체 활성의 증가(각각 10 ^-8.715 내지 10 ^-9.432 )를 반영한다(곡선 F).

4. 인간 과립막 세포의 1차 배양물에서

인간 과립막 세포를 회수하여 Reverchon et al(Reverchon et al., Human Reprod., 27(6): 1790-1800, 2012) [11]에서 기술된 바와 같이 배양하였다.

이 세포들을 보조 생식 기술(assisted reproductive technology, ART)의 맥락에서 체외 수정(IVF) 치료를 받은 여성의 난모세포 천자 후 수확된 여포액에서 회수하였다. 이 세포들을 40% 퍼콜 구배(Percoll gradient)로 원심분리하여 분리하고, 완전 McCoy's 5A 배지(Lonza, Belgium, reference BE12-688F)에 재현탁한 다음 24-웰 플레이트(Becton Dickinson, NJ, USA, reference 353047)에 500 μl의 최종 부피로 웰 당 30,000개 세포의 비율로 분주하였고, 48시간 동안 배양하였다. 그 다음에 인간 FSH 단독 또는 인간 FSH / MAb 복합체로 48시간 동안 자극하였다. 사용된 인간 FSH는 주로 제약 연구소 Serono(Serono, Europe, Limited)에 의해 판매되는 재조합 호르몬인 Gonal-F 및 제약 연구소 Genevrier(France)에 판매되는 폐경기 여성의 소변으로부터 추출한 FSH인 Fostimon이다. 자극 후, 상층액을 회수하여 원심분리하였다. 생산된 cAMP를 ELISA 키트(Biomedical Technologies Inc., MA, USA, BT-730)를 사용하여 각각의 배양 상층액에서 분석하였다.

23명의 환자의 세포를 별도로 준비하고 상기 기술된 방법에 따라 별도로 배양하였다. 환자의 각각의 세포 배양물을 다음과 같이 두 종류의 배치로 나누었다: 한 종류를 10 ^-11 M 내지 10 ^-8 M의 범위의 FSH로 자극하였고, 다른 종류를 다양한 농도 범위의 CF12 단클론 항체 / hFSH 복합체로 자극하였다. 항체를 최종 농도 0.1 nM 또는 4 nM로 제조하였다. 각각의 환자에 대하여, 사용된 인간 호르몬의 생체 활성에 대한 항체의 강화 효과를 평가하기 위해서 두 가지 조건 하에 얻어진 용량-반응 곡선을 비교하였다.

23명의 환자의 세포 배양물은 hFSH 및/또는 hFSH / 항체 복합체로의 자극에 대하여 매우 다른 반응을 보였다. 총 23명 중 12명의 환자의 세포만이 사용된 hFSH에 관계없이 FSH 단독으로의 자극, 및 FSH / 항체 복합체로의 자극에 반응하였다(도 7, 곡선 A, B, C). 이 결과들은 도 7에 나타난다. 곡선 A는 Gonal-F 및 Fostimon에 의한 자극에 대한 환자의 세포 반응을 나타낸다; 측정된 EC50 값은 각각 7x10 ^-11 및 1x10 ^-9 였다. 곡선 B 및 C는 과립막 세포가 hFSH 단독(Gonal-F는 곡선 B 및 Fostimon은 곡선 C)으로의 자극 및 CF12 / hFSH 복합체로의 자극 둘 다에 반응하는 환자를 대표하는 두 가지 경우를 도시한다. 곡선 B의 경우에, 복합체로 얻어진 용량-반응 곡선의 EC50 값은 호르몬 단독으로 얻어진 값보다 더 크다(2.42x10 ^-9 M 과 비교하여 7.52x10 ^-10 M). 곡선 C의 경우에, EC50 값은 다르지 않다(3.61x10 ^-9 M 와 비교하여 2.28x10 ^-9 M과 3.61x10 ^-9 M).

나머지 11명의 환자 중에서, 그들 중 네 명의 세포는 FSH로의 자극 및 FSH / CF12 복합체로의 자극에 모두 반응하지 않았다. 정반대로, 그리고 놀랍게도, 다른 7명의 환자의 세포는 FSH / 강화 항체 복합체로의 자극에만 반응하는 반면 같은 농도 범위의 hFSH 단독으로 자극 후에 cAMP 분비의 증가는 관찰되지 않았다. 이 주목할 만한 결과는 도 8, 곡선 A 내지 F에서 도시되며, 각각의 곡선은 다른 환자의 과립막 세포의 반응을 나타낸다. 각각의 경우에서, CF12 항체를 0.1 nM로 사용하였다. 두 명의 환자는 곡선 D에서 도시된 같은 용량-반응 곡선을 제공하였다. 이 결과들은, 이 환자들에서, hFSHR 수용체의 활성화 없음을 초래하는 FSH 단독과는 달리 hFSH / CF12 항체 복합체만이 hFSHR 수용체의 기능적 자극을 유도할 수 있다는 것을 매우 명백하게 입증한다. hFSH / CF12 항체 복합체로의 자극 하에 얻어진 최대 cAMP 분비 수준은 6 내지 15 pmol/ml에 있으며, 이는 hFSH에 정상적으로 반응하는 세포 배양물로 얻어진 최대 분비 수준과 동등하다(도 12). 각각의 용량-반응 곡선에 대하여 GraphPad Prism에 의해 측정된 EC50 값은 표 13에 나타난다:

*: 환자 G에 대하여 얻어진 EC50 값은 환자 D의 값과 동일하였다.

따라서 hFSH / CF12 항체 복합체는 새로운 리간드로서, 재조합 또는 추출된 hFSH로의 통상적인 자극에 자연적으로 난치성인 환자에서 hFSHR을 활성화할 수 있는 새로운 아고니스트로서 작용한다. 따라서 hFSH / 강화 항체 혼합물의 사용은 인간 생식 생물학에 사용된 통상적인 호르몬 치료에 반응하지 않는 환자에서 배란(단일 배란 또는 다중 배란)을 유도하기 위한 호르몬 치료의 새로운 대안을 제공할 수 있다.

실시예 3: 래트 모델에서 FSH 및 LH /CG의 생체 활성에 대한 본 발명의 리간드의 강화 효과의 생체 내 측정

시험관 내에서 특성화 한 후, 암컷 및 수컷 래트가 또한 인식하는 단클론 항체의 강화 효과, 암컷 래트에서 FSH의 생체 활성에 대한 효과 및 수컷 래트에서 LH/CH의 생체 활성에 대한 효과를 생체 내에서 특성화하였다.

FSH 생체 활성을 측정하기 위해서, 사용된 프로토콜은 Steelman and Pohley(Steelman SL, Pohley FM. Endocrinology, 53:604-616. 1953) [12]에 의해 기술된 생물학적 검정법이다. LH 생체 활성을 측정하기 위해서, 사용된 프로토콜은 Scobey et al.(Scobey et al., Reprod. Biol. Endocr. 3:61, 2005) [13]에 의해 기술된 검정법이다.

FSH 활성에 대한 항체의 효과를 인간 FSH를 사용하여 평가하였다. LH 활성에 대한 항체의 효과를 두 가지 hCG(인간 융모성 성선 자극 호르몬) 조제물에서 평가하였다.

통계 분석을 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA, version 5)를 이용하여 수행하였다. 이 결과는 다섯 마리의 동물의 배치(batch)에서 수행된 실험과 관련되어 있기 때문에, 비모수(non-parametric) 일원 분산 분석(크러스칼 월리스 테스트(Kruskal Wallis test))에 이어서, 던스 교정(Dunns correction) 또는 비모수 t-테스트(만-휘트니 테스트(Mann-Whitney test))를 적용하였다. 여러 생체 검정의 집계에서 발생하는 더 많은 수(n>30)와 관련된 결과에 대해서는, 지표 검정(비쌍체 스튜던트 t 테스트(unpaired Student's t test))에 이어서 본페로니 교정(Bonferroni correction)을 적용하였다.

1. 암컷 래트에서 FSH의 생체 활성에 대한 항체의 강화 효과

CF12 항체 및 이것의 scFv의 강화 효과를 보조 생식 기술 치료의 맥락에서 인간 생식에 사용된 인간 FSH의 다음과 같은 다양한 조제물로 연구하였다: Gonal-F와 Puregon(각각 Merck Serono 및 Merck Schering-Plough 연구실의 재조합 FSH), 및 Fostimon과 Menopur(각각 Genevrier 및 Merck Schering-Plough 연구실에 의해 판매되는 추출된 FSH).

Steelman 및 Pohley의 프로토콜에서 기술된 바와 같이, 21일령 미성숙 암컷 래트에, 연속 3일 동안, 아침 및 저녁에, 인간 FSH(Gonal F, Puregon, Fostimon, Menopur)에 대하여 0.5 내지 1.5 IU의 범위의 FSH의 가변적인 양이 보충되된 일정한 양의 hCG(3.5 IU)를 포함하는 hCG 및 FSH의 혼합물 100 μl로 두 번의 주사를 하였다. 주사는 후경부(nape of neck)에 피하로 수행하였다. 각각의 실험은 다음과 같이 최소 네 개의 배치를 포함하였다: 한 배치는 생리 식염수(혈청 Φ)가 처리되었고, 다른 배치는 항체 또는 scFv가 단독으로 처리되었고, 또 다른 배치는 hCG+FSH 혼합물이 처리되었고, 또 다른 배치는 정제된 scFv 또는 항체 2 μg이 보충된 hCG/FSH 혼합물이 처리되었다.

호르몬/항체 또는 scFv 복합체 처리의 경우에는, 주사 전에, FSH + 항체 혼합물을, 구별 없이, 37℃에서 또는 상온에서 20분 동안 사전 배양한 다음, hCG에 첨가하였다. hCG를 복합체의 배양 중에 구별 없이 FSH와 혼합할 수 있다.

제4 일에, 암컷 래트를 칭량하고, 그것들의 난소를 채취하여, 절개한 다음 칭량하였다. 그 결과는 난소 밀리그램/체중 100 그램으로 표현된다. 난소 중량의 증가는 주사된 생체 활성 FSH의 양과 비례한다. 이는 단독 또는 항체와의 복합체로서 주사된 같은 양의 호르몬의 생체 활성을 정량하고 비교하는 것을 가능하게 한다.

단독으로 또는 항체 또는 scFv와 복합체를 형성하여 주사된 FSH의 생체 활성 비교는 반응의 차이를 측정하고, 이로 인해 항체 또는 이것의 scFv의 강화 효과를 정량하는 것을 가능하게 한다.

CF12 항체 및 이것의 scFv의 강화 효과

인간 FSH에 대항하여 생산된 CF12 항체의 생체 내 효과를 인간 FSH의 다양한 조제물의 생체 활성 및 양 FSH의 생체 활성에 대하여 평가하였다.

도 9A는 인간 FSH의 세 가지 다른 조제물에 대하여 CF12 항체에 의해 가해진 주목할 만한 강화 효과를 보여준다. 이 결과는 5마리의 암컷의 배치를 포함하는 대표적인 생체 검정의 결과이다. 배치들 간의 통계 분석을 비모수 t-테스트(만-휘트니 테스트)를 사용하여 수행하였다. 평균 난소 중량이 210% 증가하는, hFSH Gonal-F의 활성에 대한 상당하고 유의한 강화 효과가 기록되었다(74 mg과 155 mg/100 g의 체중의 비교, p<0.001). 유사하게, Puregon에 대해서는, 190%의 증가를 얻었고(141 mg과 224 mg의 비교, p<0.05) 또한, Fostimon은 평균 난소 중량의 160% 증가를 기록하였다(85 mg와 161 mg의 비교, p<0.05).

이 실험들을 5 내지 7번 반복하여 결과를 집계하였다(hCG+hFSH Gonal-F 배치 및 hCG+hFSH Gonal-F+CF12 배치의 암컷 래트에 대하여 n=40 및 47). 지표 검정(비쌍체 스튜던트 t 테스트)에 이어서 본페로니 교정을 적용하였다. 표 14에서 도시된 바와 같이, 통상적으로 hCG+hFSH(Gonal-F) 혼합물이 처리된 암컷의 평균 난소 중량과 hFSH Gonal-F/CF12 복합체가 처리된 암컷에서 측정된 평균 난소 중량 사이에서 170%의 매우 큰 증가를 나타냈다: 평균 중량은 암컷에서 난소 79.51 ± 2.178 mg/체중100g 에서 난소 134.8 ± 4.985 mg/체중100g 으로 증가하였다(***, p<0.001).

양 기원의 FSH에 대한 CF12 항체의 강화 효과를 평가 및 정량하기 위해 같은 접근법을 수행하였다.

도 9B는 암컷 래트에 양 FSH 0.5 μg + hCG 또는 hCG + CF12와 사전 복합체를 형성한 양 FSH 0.5 μg을 처리하여 얻어진 생체 검정의 대표적인 예(5 마리의 암컷의 배치)를 도시한다. CF12 없이 치료를 받은 것과 비교하여 oFSH/CF12 복합체 + hCG가 처리된 암컷에서 평균 난소 중량의 170% 증가를 얻었다: 평균 난소 중량은 107 mg/체중 100 g에서 183 mg/체중 100 g로 증가하였다(**, p<0.01).

더 많은 수(n=10)에 대한 이 연구의 반복은 oFSH의 생체 활성에 대한 CF12의 강화 효과를 매우 유의하게 확인하였으며(표 15), 평균 중량은 통상적인 치료의 경우에 115.5 ± 7.45 mg에서 oFSH/CF12 복합체 + hCG가 처리된 것에서는 166.4 ± 9.54 mg으로 증가하였다(***, p<0.001).

항체의 가변 영역 V _H 및 V _L 의 서열에서 발현된 CF12 scFv를 인간 FSH의 생체 활성과 같은 방식으로 평가하였다. 사전에, 주사 당 0.06 μg(2.5x10 ^{- 9} mol의 전체 항체와 등몰인 양에 해당함)에서 전체 항체의 같은 주사량에 해당하는 주사 당 2 μg까지의 여러 scFv 용량을 평가하였다. 생체 검정에서 다양한 용량의 scFv의 비교는 최적의 강화 효과가 주사 당 2 μg의 scFv, 다시 말해서 8x10 ^{- 8} mol을 주사함으로써 얻어진다는 것을 입증하였다.

인간 FSH의 다양한 조제물에서 얻어진 결과는 도 10A에서 나타난다. 이 결과는 scFv를 이용하여 기록된 효과가 세 개의 인간 FSH 조제물에 대한 전체 항체로 측정된 효과에 매우 가깝다는 것을 보여준다. 평균 난소 중량은 통상적으로 hFSH+hCG가 처리된 암컷 래트와 비교하여 hFSH/scFv/CF12 복합체 + hCG가 처리된 암컷 래트에서 전체적으로 더 높았다. 따라서, hFSH Gonal-F에서 190%의 증가(scFv가 없는 배치에서의 평균 중량 89 mg과 + CF12 scFv 배치에서 170 mg의 비교, p<0.01), hFSH Puregon에서 151%의 증가(scFv가 없는 배치에서의 평균 중량 86 mg과 + CF12 scFv 배치에서의 130 mg의 비교, p<0.05) 및 hFSH Fostimon에서 148%의 증가(scFv가 없는 배치에서의 평균 중량 77 mg과 + CF12 scFv 배치에서의 114 mg의 비교, P <0.05)를 기록하였다. 비모수 t-테스트(만-휘트니 테스트)를 사용하여 분석을 기록하였다. 난소 반응 증가의 크기는 전체 CF12 항체로 얻어진 것과 동등하다는 점을 주의해야 한다(같은 배율). 이 유의하고 주요한 결과는 성선 자극 호르몬 순환의 동일한 강화 효과가 생체 내에서 scFv 또는 전체 항체에 의해 얻어질 수 있으며, 장기에서 생리적 반응의 명확한 증폭을 초래한다는 것을 나타낸다.

호르몬 / 항체 또는 scFv 혼합물의 다양한 주사 방법을 평가하였고, CF12의 경우에도 통상적인 프로토콜(피하 주사)과 비교하였다. 따라서, 호르몬 혼합물의 복강 내 주사와 호르몬 혼합물의 복강 내 주사 후 이어서 15분 후 CF12 scFv의 두 번째 지연된 주사에 대해 비교할 목적으로 생체 검정을 수행하였다. 그 결과는 도 10B에서 제공되며, 두 단계로 복강 내로 주사된 암컷에서 122%의 난소 중량의 증가를 나타낸다: 1) hCG+hFSH 혼합물, 그 다음에 2) 15분 후 지연된 주사에 의해 scFv: hCG+hFSH Gonal-F 배치에서 체중 100 g 당 난소 58.8 mg과 배치 hCG+hFSH Gonal-F에 이은 scFv 배치에서 체중 100 g 당 난소 72 mg의 비교. 두 배치 간의 차이가 비교적 적어서 유의한 것은 아니지만, 이 결과는 두 단계로 및 두 개의 다른 주사 지점에 호르몬 및 scFv의 주사에 의한 FSH의 강화 경향을 나타낸다. 따라서 추후 적용을 위해서, 강화되는 호르몬 및 그 다음에 항체 또는 scFv를 시간의 관점에서 독립적으로 및 다른 주사 지점에서 주사를 구상하는 것이 가능하다.

또 다른 주사 방식을 다음과 같이 호르몬/항체 복합체가 처리된 동물에서 평가하였다: 한 마리는 hCG+FSH+CF12로 단일 피하 주사를 받았고, 다른 한 마리는 FSH+CF12의 처음 피하 주사 15분 후에 역시 피하로 hCG의 주사를 받았다. 도 19C에서 나타난 결과는 두 경우에서 관찰된 강화 효과가 다르지 않다는 것을 보여준다: 83 mg의 평균 난소 중량에 대하여 항체 없이 처리된 배치에 대한 160 mg/체중100g 과 CF12 항체 처리된 암컷에서 난소 159 mg/체중100g 의 비교.

래트에서 LH /CG의 생체 활성에 대한 항체의 강화 효과

양 LH의 매우 높은 비용으로 인해, 이 생물학적 검정을, 쉽게 이용 가능하고 매우 순수하고 저렴한 형태의 hCG를 이용하여 수행하였다. 두 개의 추출된 hCG(인간 융모성 성선 자극 호르몬) 조제물에 대한 항체의 효과를 연구하였으며, 그 중 하나는 보조 생식 기술 치료의 맥락에서 인간 생식에 사용되는 ENDO 5000(Schering-Plough laboratory)이고, 다른 하나는 수의학에 사용되는 Chorulon(MSD laboratory)이다.

Scobey et al. [13]의 프로토콜에 따라, LH 또는 hCG의 생체 활성을 안드로겐-의존적으로 발달하는 정낭의 중량의 증가에 관하여 정량하였다. 상기 중량은 hCG의 활성에 비례하여 달라지고 따라서 단독으로 또는 연구된 항체와 복합체를 형성하여 주사되는 호르몬의 생물학적 활성을 정량 및 비교하는 것을 가능하게 한다. 1.5 IU hCG 100 μl 또는 1.5 IU hCG + 37℃에서 20분 동안 사전 배양된 항체 2 μl의 혼합물 100 μl을 4일 동안 하루에 한 번 피하로 주사한 25일령 어린 래트를 이용하여 프로토콜을 수행하였다. 5일째에, 래트를 칭량한 다음 희생시켰다. 정낭(SV)을 제거하고, 절개하여 칭량하였다. 정낭의 중량은 다양한 배치에서 얻어진 결과를 비교 및 조합할 수 있도록 mg/체중100g로 표현된다. 각 실험에서, 각각의 조건을 5마리 래트의 배치에서 테스트하였다. 같은 실험을 여러 번 반복하였다.

도 11A, B 및 C는 hCG Chorulon 및 hCG Endo 5000과의 복합체로 CF12 항체가 처리된 래트를 이용하여 얻어진 결과를 보여준다.

도 11A는 5마리의 래트의 6개의 배치에서 수행된 생체 검정의 결과를 보여준다. 를 hCG 단독 처리된 배치와 비교하여 hCG Chorulon / CF12 복합체에서 정낭의 중량이 220% 증가한 매우 유의한 강화 효과(p<0.0001, 크러스칼 및 월리스 테스트)를 얻었다. 189%의 중량이 증가한 hCG Endo 5000 / CA5 복합체가 처리된 배치에서 또한 유의한 효과를 얻었다(p<0.0001). CF12 항체 단독 처리된 배치에서는 생리 식염수가 처리된 대조군 동물과 비교하여 정낭의 중량의 변화가 없다는 것이 관찰된다. 따라서 호르몬과 복합체를 형성하지 않은 CF12는 표적 장기에 대하여 특이적인 효과를 갖지 않는다.

도 11의 히스토그램 B 및 C에서 CF12로 수행된 다양한 생체 검정으로부터 발생한 결과의 집계를 나타낸다. 호르몬/CF12 복합체의 매우 유의한 강화 효과(p<0.0001, 비상체 t-테스트)를 hCG Chorulon 및 hCG Endo 5000로 측정하였다:

- 각각 33 및 36마리의 동물에서, SV의 평균 중량은 복합체가 처리된 래트에서 51.40 mg/100 g과 비교하여 hCG Chorulon이 처리된 래트에서 29.36 mg/100 g이었다(175% 증가)(도 11B)

- 각각 18 및 20마리의 동물에서, SV의 평균 중량은 hCG Endo 5000가 처리된 래트에서 25.35 mg/100 g이었고 복합체가 처리된 래트에서는 50.54 mg/100 g이었다(208% 증가)(도 11C).

실시예 4: 암양에서 내인성 성선 자극 호르몬의 생체 활성에 대한 본 발명의 리간드의 강화 효과의 생체 내 측정

설치류(소동물(small animal))에서 CF12 단클론 항체의 생체 내 강화 효과를 입증하고 특성화한 후, 목적은 더 큰 생산적인 가축인 암양에서 FSH의 활성에 대한 각각의 항체의 효과를 연구하는 것이었다.

이를 위해, 처리된 암양 자체의 호르몬(내인성 호르몬)에 대한 항체의 강화 효과를 평가할 목적으로 같은 나이의 사춘기의 일 드 프랑스(Ile de France) 암양에서 연구를 수행하였다. 특이성의 연구는 양 FSH에 대한 CF12 항체의 강력한 결합 및 양 LH에 대해서는 더 가변적인 결합을 보여주었다. 이 목적을 위해서, 항체 단독의 주사만을 포함하는 치료가 그 효능을 평가하기 위해 개발되었다.

암양에서 수행된 프로토콜에서, 암컷 래트에서의 연구에서 실행한 바와 같이, 항체를 FSH와 함께 사전배양하지 않고 단독으로 주사하였다. 또한, 각각의 항체를 난소의 아무런 사전 자극이 없는 암양에 주사하였다: 동물들은 항체의 주사 전 성선 자극 호르몬으로 배란을 자극하기 위한 호르몬 처리를 받지 않았다.

항-FSH CF12 항체의 강화 효과를 생식기 중간에(1월) 또는 생식기의 끝에(3월 말) 수행된 프로토콜 중에 평가하였다. 모든 프로토콜을 배란 주기가 프로게스토겐(45 mg 플루오로게스톤 아세테이트(FGA) - MSD)이 함침된 질 스폰지를 삽입하여 사전 동조된 암양에서 14일 동안 수행하였다. 대조군 암양(생리 식염수 배치), 돼지 FSH 처리로 자극된 암양(FSH 배치) 및 항체 단독으로 자극된 암양(항체 배치)에서 배란 반응(배란 횟수) 및 양호한 품질의 하나 이상의 기능성 황체의 확립(프로게스테론 분비의 크기)과 비교함으로써 강화 효과를 분석하였다.

각각의 프로토콜에서, LH의 배란 전 피크를 검출하고 날짜를 기입하기 위해서 ELISA 방법으로 혈장 LH 검정을 수행하였다. 배란 반응을 평가하기 위해서, 질 스폰지 회수 8일 후 복강경검사법으로 마취 하에 난소의 내시경 관찰을 수행하여 황체의 수를 계수하고 그것들의 외형을 관찰하였다.

황체 또는 황체들의 기능성 및 품질을 평가하기 위해서, 정량적 프로게스테론 ELISA 검정을 스폰지의 회수 후 제1 일에서 제21 일까지의 일일 혈액 샘플을 사용하여 수행하였다.

모든 통계 분석을 GraphPad Prism Version 5.0 소프트웨어(GraphPad, San Diego, CA, USA)를 이용하여 수행하였다.

CF12 항체 및 이것의 scFv

배란 및 확립된 황체의 기능적 품질의 측정 파라미터를 사용하여 CF12(IgM) 및 이것의 scFv의 강화 효과를 연구하고 비교하였다. 주사된 용량은 2회 1 mg이었다.

생식기에 수행된 프로토콜은 다음과 같은 네 개의 배치를 포함하였다:

- 스폰지의 회수 24 h 전 항체 1 mg의 근육 내 주사 및 스폰지가 회수된 시점에 1 mg의 제2 주사를 받은 CF12 항체 배치(n=7);

- 스폰지의 회수 24 h 전 scFv 1 mg의 근육 내 주사 및 스폰지가 회수된 시점에 1 mg의 제2 주사를 받은 CF12 scFv 배치(n=5);

- 스폰지의 회수 24 h 전 및 회수 시점에 생리 식염수의 근육 내 주사를 받은 "대조군" 배치(n=9);

- 스폰지의 회수 24 h 전 돼지 FSH(pFSH) 100 μg 및 스폰지의 회수 12 h 전 90 μg의 근육 내 주사를 받은 "FSH" 배치(n=11).

난소의 내시경을 스폰지 회수 8일 후에 수행하였다.

스폰지의 회수 후 제1 일에서 제21 일까지의 일일 혈액 샘플을 ELISA 검정에 의해 혈장 프로게스테론을 검정하기 위해 채취하였다.

배란 반응의 분석은 하기 표 16에 나타난 결과를 제공하였다. 통계 분석을 피셔 정확 테스트(Fisher's exact test)에 의해 수행하였다.

*, p<0.05; ***, p<0.0001

대조군 및 FSH 배치와 비교하여, CF12 및 CF12 scFv 배치에서 얻어진 결과는 배란 반응에 대하여 단독으로 주사된 항체 또는 이것의 scFv의 매우 유의한 효과를 보여준다. 실제로, 혈청 Φ 배치 및 FSH 배치에 대하여 각각 44% 및 36%와 비교하여 항체 또는 scFv 1 mg의 2회 주사를 받은 암컷의 100%(CF12에 대하여 7/7 및 CF12 scFv에 대하여 5/5)가 배란하였다(p<0.0001, 피셔 정확 테스트). 배치의 총 수에서 암컷 당 얻어진 황체의 수는 FSH 및 혈청 Φ 배치와 비교하여 CF12 scFv 배치에서 훨씬 더 높다(p<0.05, 크러스칼 월리스 테스트): 2.2개 황체와 각각 0.9개(FSH) 및 0.67개(혈청 Φ) 비교. CF12 scFv 및 CF12 배치 사이에서 유의한 차이는 없다.

LH 피크의 평균 출현 빈도는 세 개의 배치에서 크게 다르지 않다. 그럼에도 불구하고, LH 피크의 도달(및 따라서 배란의 빈도)에 대한 가변성이 적어지는 성향이 FSH 배치 및 특히 혈청 Φ 배치와 비교하여 CF12 및 CF12 scFv 배치에서 관찰된다. 이는 항체 또는 이것의 scFv를 받은 암양에서의 더 나은 배란 동조화를 나타낸다.

다양한 배치에서, 배란 후 황체기 동안 프로게스테론 분비 프로파일은 도 12A에 나타낸다. 각각의 개체에 대하여, 프로게스테론 농도 값(ng/ml)을 황체의 수에 대하여 표준화하였다. 도면의 각각의 곡선은 각각의 배치의 암컷에서 각각의 샘플링 시점에 측정된 프로게스테론의 평균 값을 나타낸다. CF12 및 CF12 scFv 배치로 얻어진 분비 곡선은 FSH 및 혈청 Φ 배치보다 매우 명확하다. 얻어진 결과는 CF12 scFv, CF12, FSH 및 혈청 Φ 배치에 대하여 스폰지의 회수 후 D10에서의 각각 1.46, 1.4, 1.1 및 0.6 ng/ml, 및 D15에서의 각각 1.93, 1.78, 1.22 및 1 ng/ml의 평균 프로게스테론 값을 나타낸다.

네 개의 곡선의 비교를 쌍체 비모수 t 테스트(윌콕슨 테스트)로 수행하였다. CF12 및 CF12 scFv 배치의 곡선은 혈청 Φ 배치의 곡선과는 유의하게 다르다(p<0.01). 마찬가지로, FSH 배치의 곡선은 대조군 배치와는 유의하게 다르다(p< 0.001). CF12 및 CF12 scFv가 처리된 암양의 곡선과 FSH가 처리된 암양의 곡선 간의 차이는 유의하지 않으며, 따라서 경향성을 나타낸다.

프로게스테론 분비 곡선 간의 차이를 정량하기 위해서 GraphPad Prism 소프트웨어 버전 5.0으로 곡선하면적(AUC)의 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 12B에서 나타나며, CF12 scFv 곡선의 AUC(16.98 유닛)가 혈청 Φ 곡선의 AUC(8 유닛)보다 1.55배만큼 유의하게 더 높다는 것을 나타낸다(p<0.01, 비모수 만-휘트니 t-테스트). 마찬가지로, CF12(16.78 유닛) 및 혈청 Φ(8 유닛) 곡선의 AUC는 유의하게 다르다(p<0.05, 만-휘트니 비모수 t-테스트). 다른 한편으로는, FSH 곡선의 AUC(10.82 유닛) 및 혈청 Φ 곡선의 AUC 사이에는 유의한 차이가 없으며, CF12 또는 CF12 scFv의 처리는 FSH 처리보다 더 효과적이라는 것을 나타낸다.

결론적으로, 모든 결과는 CF12의 1가 단편이 2가 CF12 항체와 같은 강화 효과를 가진다는 것을 나타낸다. 상기 암양의 두 배치의 반응 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 각각 1 mg의 2회의 근육 내 주사의 형태로 두 개의 분자 중 하나의 처리는 다음과 같은 관점에서 매우 유의하게 FSH 처리보다 더 양호한 결과를 제공하였다:

- 배란 유도에 대한 효과의 관점에서(100%의 얌양이 배란하였고 총 수에 대하여 암양 당 1.3개 및 0.8개의 추가적인 황체가 얻어진다);

- 황체기 전반에 걸쳐 더 높은 프로게스테론 분비로 확립된 황체의 품질의 관점에서.

모든 결과는 암양에서 생체 내로 주사된 CH12 강화 항체가 동물의 내인성 성선 자극 호르몬과 복합체를 형성하여 동물 자체의 호르몬의 생물학적 활성을 강화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

암양에서 CF12 항체의 강화 효과는 다음과 같이 통상적인 FSH 호르몬 처리보다 더 강력한 난소 자극을 유도할 수 있다: 생식기에서 배란 유도는 100%이며 모든 경우에 프로게스테론 순환 농도의 큰 증가가 황체기 전반에 걸쳐 유지된다. 이 추가적인 효과는 프로게스토겐-의존성 배 발달 실패율 및 유산의 위험을 감소시키는데 주요하다.

암양에서 CF12의 1가 scFv 단편이 배란의 유도 및 황체의 품질 둘 다에 대하여 전체 항체와 같은 강화 효과 및 프로게스테론 분비의 증가를 유도하는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명자들의 프로토콜에서 CF12 scFv의 주사가 치료된 암양에서 항-CF12 scFv 항체 분비를 유도하지 않았다. 1가 단편의 사용은 이와 같이 특정 암양에서 유도될 수도 있는 호르몬 면역 반응의 위험을 감소시킨다.

실시예 5: 암컷 원숭이에서 FSH의 생체 활성에 대한 본 발명의 CF12 리간드의 강화 효과의 생체 내 측정

래트, 암컷 래트 및 암양에서 생체 내 CF12 단클론 항체의 강화 효과를 입증하고 특성화한 후, 이 강화 효과를 인간과 유사한 종인 시노몰구스 원숭이( Macaca fascicularis )에서 연구하였다. 이를 위해, 인간 FSH(hFSH)에 대한 항체의 강화 효과를 평가할 목적으로 적어도 36개월령의 사춘기 암컷 원숭이에서 연구를 수행하였다.

확립된 프로토콜에서, 항체를 hFSH와의 복합체로서 주사하거나(항체를 외인성 FSH와 함께 사전 배양함), 또는 hFSH의 주사 20분 후 단독으로 주사하였다.

월경 제1일에, 암컷 원숭이는 지효성 GnRH 조제물(Decapeptyl ^® LP 3 mg - IPSEN Pharma) 1.5 mg의 근육 내 주사를 받았다. GnRH의 주사 15일 후, 암컷 원숭이를 다양한 프로토콜에 따라 처리하였다. 1마리의 암컷 원숭이를 프로토콜에 따라 처리하였다.

hFSH의 최종 주사 36시간 후, hCG(융모성 성선 자극 호르몬 Endo 5000 - MSD) 1000 IU를 동물에 주사하였다. hCG의 주사 36시간 후 개복술에 의한 천자로 난모세포를 제거하였고, 성숙함의 정도를 평가하기 위해서 현미경 하에서 관찰하였다.

유도된 여포 성장(여포의 표면적 및 에스트라디올 분비의 크기)과 양호한 품질의 황체(프로게스테론 분비의 크기)의 확립을 비교함으로써 강화 효과를 분석하였다. 이를 위해, 48시간마다 경복부 난소 초음파를 수행하여 여포를 계수하고 표면적(mm ² 로 표현됨)을 측정하였다. 처리 제1 일부터 여포 천자 후 최대 30일까지 48시간 마다 추출된 혈액 샘플은 정량적 에스트라디올(pg/ml로 표현됨) 및 프로게스테론(ng/ml로 표현됨) ELISA 검정을 수행하는 것을 가능하게 한다.

모든 통계 분석을 GraphPad Prism Version 5.0 소프트웨어(GraphPad, San Diego, CA, USA)로 수행하였다.

1. hFSH 25 IU의 주사 후 단독으로 투여된 CF12 리간드의 효과

먼저, CF12의 강화 효과를 hFSH에 대하여 평가하였다. 이를 위해, 다음과 같이 1 내지 3으로 표현된 세 개의 프로토콜을 수행하였다:

1. hFSH 25 IU의 1회 주사가 처리된 동물: 처리 제1일에 인간 FSH(Gonal-f ^® pre-filled pen - Merck Serono)의 25 IU의 피하 주사("hFSH 25 IU X1");

2. CF12 + hFSH가 처리된 동물: 20분 동안 인간 FSH(Gonal-f ^® pre-filled pen - Merck Serono)의 25 IU의 주사 20분 후 CF12 항체(400 μg)의 주사를 처리 제1일 및 제5일에 피하로 수행("hFSH 25 IU+CF12 X2");

3. 8일 동안 hFSH의 25 IU가 처리된 동물: 8일 동안 인간 FSH(Gonal-f ^® pre-filled pen - Merck Serono)의 25 IU의 매일 피하 주사("hFSH 25 IU X8").

세 가지 처리의 효과를 초음파 검사에 의해 유도된 여포 성장(여포의 표면적)을 측정함으로써 모니터링하였다. 처리 시작 9일 후(D9) 얻어진 결과는 도 13A에서 나타난다. 이 결과는 FSH 처리 시작 후 제9 일에, hFSH의 25 IU의 1회 주사가 처리된 암컷 원숭이에 자극된 여포가 없음을 보여준다(곡선하면적 영(0)). 반면, 처리 제1일 및 제5일에 CF12 400 μg + hFSH 25 IU 혼합물이 2회 처리된 암컷 원숭이는 28 mm ² 의 자극된 여포의 총 표면적을 나타냈다. hFSH의 8회 주사를 받은 암컷 원숭이에서, 자극된 여포의 총 면적은 35 mm ² 였다.

처리 시작 11일 후(D11) 얻어진 결과는 도 13B에서 나타난다. 이 결과는 CF12 + hFSH가 2회 처리된 암컷 원숭이가 6개의 자극된 여포로 29 mm ² 의 여포 총 면적을 나타낸다는 것을 보여준다. 반면, hFSH의 8회 주사를 받은 암컷 원숭이에서 측정된 여포의 면적은 11개의 자극된 여포로 22.6 mm ² 였다. CF12 400 μg + hFSH 25 IU의 2회 주사는 이와 같이 hFSH의 25 IU의 8회 주사보다 더 나은 여포 성장을 유도하였다: 4.83 mm ² /여포와 2.05 mm ² /여포의 각각 비교.

여포 성장에 대한 복합체의 효과는 자극된 여포의 면적의 감소가 언급되는 FSH의 8회 주사를 포함하는 처리와는 달리 D11까지 일정하였다. 이 결과는 암컷 원숭이 생체 내에서 순환성 FSH에 대한 CF12의 강화 효과를, 내인성인지 또는 외인성인지 여부에 관계없이, 입증한다. 실제로, FSH의 반감기가 1시간 미만이기 때문에, CF12가 처리 제1일 및 제5일에 hFSH의 25 IU와 함께 주사될 때 관찰된 효과는 동시 주사된 FSH에 대한 효과에 전적으로 기인할 수 없지만, 또한 암컷 원숭이의 내인성 FSH에 대한 효과를 반영한다.

2. hFSH의 37. 5 IU의 주사 후 단독으로 투여된 CF12 리간드의 효과

이어서, hFSH의 37.5 IU의 주사 후 잠시 지연 후 단독으로 주사된 CF12의 강화 효과를 연구하였다. 이를 위해, 다음과 같이 1 내지 4로 표현된 네 개의 프로토콜을 GnRH의 주사 15일 후 설정하였다. 프로토콜 당 한 마리의 암컷 원숭이를 처리하였다:

1. 12일 동안 hFSH의 37.5 IU가 처리된 동물: 12일 동안 인간 FSH(Gonal-f ^® pre-filled pen- Merck Serono)의 37.5 IU의 매일 피하 주사("hFSH 37.5 IU X12");

2. 매일 hFSH의 37.5 IU, 및 2일마다 CF12의 400 μg이 처리된 동물: hFSH 주사 12일 후 인간 FSH(Gonal-f ^® pre-filled pen- Merck Serono)의 37.5 IU의 매일 피하 주사, 및 hFSH 주사 20분 후 2일 마다 400 μg의 용량으로 CF12 항체의 주사("hFSH 37.5 IU X12 + 400 μg CF12 X6");

3. 매일 FSH의 37.5 IU, 및 2일마다 CH12의 70 μg이 처리된 동물: hFSH의 주사 12일 후 인간 FSH(Gonal-f ^® pre-filled pen - Merck Serono)의 37.5 IU의 매일 피하 주사, 및 hFSH의 주사 20분 후 2일마다 70 μg의 용량으로 CF12 항체의 주사("hFSH 37,5 IU X12 + 70 μg CF12 X6");

4. 8일 동안 FSH의 75 IU가 처리된 동물: 8일 동안 인간 FSH(Gonal-f ^® pre-filled pen - Merck Serono)의 75 IU의 매일 피하 주사("hFSH 75 IU X8").

4가지 처리의 효과를 초음파 검사에 의해 유도된 여포 성장(mm ² 단위의 여포의 표면적)을 측정함으로써 모니터링하였다. 도 14는 여포 천자일(D15)에, 각각의 처리 후 얻어진 자극된 여포의 표면적을 나타낸다. 여포 자극의 강도는 처리에 따라 다르다. 그 강도는 "hFSH 37.5 IU X12 + 70 μg CF12 X6" 처리를 받은 암컷 원숭이에서 최대로 매우 컸으며, 이 경우 387.5 mm ² 의 표면적이 측정되었다. 이 표면적은 112.3 mm ² 인, 대조군 암컷 원숭이 "hFSH 37.5 IU X12"에서 측정된 표면적보다 3.5배 더 크고, "hFSH 37.5 IU X12 + 400 μg CF12 X6"이 처리된 암컷 원숭이에서 얻어진 124.2 mm ² 의 표면적보다 3.2배 더 크다. 여포의 가장 작은 표면적(87.2 mm ² )은 8일 동안 hFSH 75 IU가 처리된 암컷 원숭이에서 얻어졌다.

천자일에 얻어진 여포의 총 수는 "hFSH 37.5 IU X12 + 400 μg CF12 X6" 및 "hFSH 75 IU X8"을 이용하여 7개였고, "hFSH 37.5 IU X12" 및 "37.5 IU X12 + 70 μg CF12 X6"을 이용하여 10개였다(표 17).

가장 큰 여포의 크기는 처리에 따라 상당히 달라진다. "37.5 IU X12 + 70 μg CF12 X6" 처리는 직경이 7 mm보다 큰 여포 5개(이것들 중 가장 큰 것은 9.15 mm의 직경을 가진다)의 형성을 유도하는 반면에, 다른 모든 처리들은 7 mm 미만의 여포들만 유도하였다.

천자에 의해 취해진 난모세포의 개수는 "hFSH 37.5 IU X12 + 400 μg CF12 X6" 및 "hFSH 75 IU X8"을 이용하여 11개의 난모세포였고, hFSH 37.5 IU X12를 이용하여 8개의 난모세포였다. hFSH 37.5 IU X12 + 70 μg CF12 X6이 처리된 암컷 원숭이는 난소에서 어린 황체를 나타냈으며, 천자일 전에 자발적으로 배란하였다는 것을 나타낸다.

이 결과들은 70 μg의 용량으로 투여된 CF12의 매우 큰 강화 효과를 입증하였으며, FSH 단독에 의해 유도된 것보다 훨씬 더 큰 여포 성장 및 고도로 자극되고 진보된 배란 반응을 초래하였다. "hFSH 37.5 IU X12 + 400 μg CF12 X6" 및 "hFSH 37.5 IU X12 + 70 μg CF12 X6" 사이에서 관찰된 반응의 차이는 또한 CF12에 의해 가해진 강화 효과가 용량-의존적이고, 70 μg 용량이 가장 강력한 난소 자극을 유도한다는 것을 나타낸다.

네 가지 처리의 효과를 또한 처리 제1 일부터 여포 천자 후 최대 30일까지 48시간마다 에스트라디올 및 프로게스테론의 분비를 측정함으로써 분석 및 비교하였다.

그 결과는 도 15에서 나타나는데, 각각의 처리는 주기 전반에 걸쳐 각각의 암컷 원숭이에 대하여 얻어진 에스트라디올 및 프로게스테론 분비 프로파일을 나타내는 그래프(A, B, C, D)로 제공된다.

hFSH의 37.5 IU 단독으로(도 15A) 또는 400 μg(도 15B) 및 70 μg(도 15C)의 CF12의 처리와 조합으로 처리된 암컷 원숭이는 서로 유의하게 다른 에스트라디올 분비 프로파일을 제공한다( ^**** p <0.0001, Two-way ANOVA). D9에서, 농도는 각각 157 pg/ml, 323 pg/ml 및 220 pg/ml이며, CF12를 조합한 처리를 이용하여 더 나은 에스트로겐 반응을 나타낸다. D13에서, 여포 천자 전 2일에, 에스트라디올 농도는 각각 70 pg/ml(도 15A), 200 pg/ml(도 15B) 및 1950 pg/ml(도 15C)이다. 반면, 이 농도는 여포 천자 2일 전에, hFSH 75 IU X8 처리된 암컷 원숭이에서 395 ng/ml이다(도 15D). 이 결과들은 에스트로겐 반응에 대한 CF12의 매우 큰 강화 효과를 입증하며, FSH 단독을 이용한 대조군 처리에 비해 CF12의 400 μg 용량에서 3배 만큼 및 CF12의 70 μg 용량에서 28배 만큼 에스트라디올 피크의 증가를 초래한다. "hFSH 37.5 IU X12 + 70 μg CF12 X6"의 경우에 D13에서 관찰된 큰 에스트라디올 피크는 여포 천자 전 발생한 조기 배란의 유도를 설명할 수도 있다.

양호한 품질의 황체의 확립을 반영하는 프로게스테론 분비 프로파일을 측정하였다. 도 15A, 15B 및 15C의 비교는 FSH가 단독으로 처리된 암컷 원숭이와 비교하여 CF12 및 FSH가 처리된 암컷 원숭이에서 프로게스테론 수준의 용량-의존적 증가를 매우 명확하게 나타낸다. D19에서, 여포 천자 4일 후, 프로게스테론 수준은 FSH 단독에서 2.4 ng/ml(도 15A), CF12 400 μg에서 14.5 ng/ml(X6)(도 15B)이고 CF12 70 μg에서 37 ng/ml(X15)에 도달한다(도 15C). 그에 비해, 75 IU X8으로 FSH가 단독으로 처리된 암컷 원숭이에서 여포 천자 4일 후 측정된 프로게스테론 수준은 1.5 ng/ml이고(도 15D), 이는 37.5 IU X12 처리와 통계적으로 다르지 않다. 반면, CF12 400 μg 및 70 μg의 처리는 FSH의 단독 처리와 통계적으로 다른 포르게스테론 수준을 유도한다( ^**** p<0.0001, Two-way ANOVA).

이 결과는 프로게스테론 혈액 수준에 대한 CF12의 강화 효과를 매우 명확하게 입증하며, 이는 항체를 받은 암컷 원숭이에서 황체의 더 나은 품질을 반영한다. 자궁 내막의 제조, 착상 및 조기 배 발달에서의 프로게스테론의 중요한 역할은 동물 종 및 여성에 적용하기 위한 중요한 수단이 된다.

FSH의 매우 짧은 반감기(1시간 미만)를 고려하면, 모든 결과(hFSH의 25 또는 37.5 IU)는 CF12 항체가, 내인성인지 또는 외인성인지 여부에 관계없이, 생체 내에서 순환성 FSH에 대한 강화 효과를 발휘할 수 있다는 것을 확인한다. 항체 70 μg이 처리된 암컷 원숭이에서 관찰된 매우 큰 효과는 사실 암컷 원숭이의 내인성 호르몬에 대한 항체의 "장기간" 작용과 연관성이 있다.

이 결과에 의해, 본 발명자들은 또한 CF12 항체가, 적합한 투약량을 한정함으로써 인공 수정의 맥락에서 단일 배란을 유도하기 위한 것이든 체외 수정(IVF)의 맥락에서 다중 배란을 유도하기 위한 것이든, 인간에서, 특히 ART 치료법에서 임상적으로 배란을 유도하기 위한 새로운 치료법의 확립으로 가는 길을 열어줄 수 있다는 것을 입증한다.

실시예 6: 본 발명의 CF12 리간드에 의해 인식되는 에피토프의 예측 및 그것의 파라토프의 예측

고유 및 비-고유 입체구조를 구별하는 것을 가능하게 하는 다양한 스코어 함수 진화 학습 방법에 의한 최적화 및 보로노이 다이어그램(Voronoi diagram)을 사용하는 단백질 구조 모델을 기반으로 하는 단백질-도킹 알고리즘를 사용하여 다양한 종의 성선 자극 호르몬에서 CF12 항체의 에피토프를 결정하였다(Bernauer et al., Bioinformatics 2007, 5:555) [14], (Bernauer et al., Bioinformatics 2008, 24:652) [15], (Bourquard et al., PLoS One 2011, 6:e18541) [16] 및 (Bourquard et al., Sci. Reports 2015, 5:10760) [17].

각각의 항체를 인간 FSH(hFSH), 인간 LH(hLH), 인간 CG(hCG), 양 FSH(oFSH), 양 LH(oLH), 돼지 FSH(pFSH) 및 돼지 LH (pLH)와 도킹시켰다. hFSH 및 hCG의 결정학적 구조는 Protein Data Bank(PDB)에서 이용 가능하다: 각각 4MQW 및 1QFW. 인간 FSH 수용체의 세포 외 도메인과 복합체를 형성한 인간 FSH의 구조를 사용하였다(Fan and Hendrickson, Nature 2005, 433:269) [18]. 다른 호르몬(hLH, oFSH, oLH, pFSH 및 pLH)에 대해서는, 상동성 모델을 생성하여 도킹에 사용하였다.

CF12 항체의 3D 구조를 이용할 수 없기 때문에, CF12의 1가 VH 및 VL의 서열을 사용하여 연구를 수행하였다. 이를 위해, 가변부 상동성 모델을 생성하였다. VH 및 VL 모델을 다른 구조로부터 별도로 생성하였고, 그것들의 상대적인 배향(orientation)을 VH 모델링의 지원 역할을 하는 구조로부터 결정하였다. 상동성 모델에 사용된 구조는 Protein Data Bank(PDB)에서 이용 가능하다: CF12의 VH에 대하여 1PLV 및 CF12의 VL에 대하여 3TT1.

도킹 결과는 도 16에서 나타난다. CF12 리간드는 7개의 표적 호르몬에 유사하게 도킹하는 것으로 나타난다. 에피토프는 연구된 성선 자극 호르몬의 알파- 및 베타-서브유닛에 불연속적으로 위치하는 여러 영역에 의해 한정된다. 에피토프는 또한 인간 FSH 수용체의 엑토도메인의 서열 His7-Cys8-Ser9-Asn10을 수반한다. CF12 리간드의 에피토프는 매우 입체구조적이며, 호르몬의 알파- 및 베타-서브유닛의 여러 영역 및 수용체의 서열로 구성되어 있다. 이들 불연속적인 영역 모두는 호르몬 및 그것의 활성화된 수용체의 고유한 입체구조에서 공간적으로 가깝다.

CH12 리간드와의 계면에 수반되는 호르몬 및 수용체의 다양한 잔기들은 도 16에서 직사각형으로 표시되어 있다. hFSH의 알파-서브유닛에서 음영처리된 영역으로 표시된 두 개의 잔기는 주된 상호작용에 수반되며, 따라서 항체/항원 인식에서 주요 역할을 한다: 이 잔기는 hFSH의 알파-서브유닛의 위치 9에서 글루탐산(Glu9) 및 위치 33에서 페닐알라닌(Phe33)이다. 이 두 개의 잔기들은 동일하고, 다른 표적 호르몬의 서열에서 인식된다. 계면에 수반된 알파-서브유닛의 다른 잔기 중에서, Glu9를 포함하여 9개의 잔기를 포함하는 영역이 언급된다. 그것은 Gln5-Asp6-Cys7-Pro8-Glu9-Cys10-Thr11-Leu12-Gln13 모티프이다.

고유한 호르몬에서 공간적으로 가까운, 위치 35에서 아르기닌 잔기(Arg35) 및 위치 56에서 글루탐산 잔기(Glu56)의 존재는 에피토프에서도 언급된다. 이들 두 개의 잔기는 베타-서브유닛의 C-말단부를 고정하고, 따라서 알파-서브유닛 주위에 "안전띠"를 확보한다. 이들 두 개의 잔기는 일정하게 존재하며 모든 표적 호르몬에서 인식된다. 그것들은 호르몬의 안정성 및 생체 활성에 중요한 역할을 한다. 이 메커니즘에 의해서, 이들 잔기에 대한 항체의 결합은 이런 식으로 FSH 다이머의 안정성을 증가시키는 것을 가능하게 한다.

CF12 리간드는 또한 안전띠를 구성하는 베타-서브유닛의 C-말단부의 잔기 100 내지 102 및 108-109를 인식한다. 이 안전띠의 역할이 호르몬의 알파/베타 다이머의 회합을 안정화시키는 것이기 때문에, 이들 두 개의 잔기에 대한 CH12 리간드의 결합은 또한 안전띠의 폐쇄를 안전하게 만들며, 따라서 호르몬의 생체 활성에 필수적인, 더 양호한 다이머의 안정성을 허용하는데 기여하는 것으로 생각된다.

CF12 리간드의 에피토프의 또 다른 특성은 CF12에 의해 인식되는 계면에서 인간 FSH 수용체의 N-말단 영역의 잔기 7 내지 10(His7-Cys8-Ser9-Asn10)의 수반이다. CF12 리간드의 결합은 또한, 이 메커니즘을 통해서, 수용체에 대한 호르몬의 상호작용을 촉진하고 "강화" 효과의 확립을 가져오는데 기여하는 것으로 생각된다.

표 18은 CF12 리간드의 파라토프의 다양한 영역을 제공한다. 사용된 넘버링은 서열 번호:2 및 서열 번호:4의 서열의 넘버링이다.

두 개의 VH 및 VL 사슬은 그것들의 세 개의 CDR 및 그것들의 프레임워크의 몇몇 잔기를 통해 호르몬의 인식에 수반된다.

주된 상호작용에 대하여, hFSH의 알파-서브유닛의 Glu9 잔기는 각각 VH 사슬의 CDR3의 Tyr102 및 Asp104 잔기 및 VL 사슬의 Leu50 잔기에 의해 인식된다. 알파-서브유닛의 Phe33 잔기는 VH 사슬의 CDR1의 Ser31 및 Tyr33 잔기 및 VH 사슬의 CDR2의 Tyr52 잔기에 의해 인식된다.

표 18: CF12 리간드의 에피토프를 구성하는 다양한 영역 및 그것의 파라토프를 구성하는 영역. 주요 상호작용에 관련된 잔기는 음영으로 표시된다.

알파-서브유닛의 Arg35 및 Glu56 잔기에서의 상호작용은 VH 사슬의 여러 잔기를 수반한다. CDR1의 Ser30 잔기 및 CDR2의 Tyr52 및 Gly54-Thr55 잔기는 Arg35와 상호작용한다. CDR2의 Tyr52 잔기는 또한 알파-서브유닛의 Glu56과 상호작용한다.

베타-사슬의 C-말단부(안전띠)에서의 상호작용은 VH 사슬의 여러 잔기를 수반한다: CDR1의 Ser30 잔기, CDR2의 Gly54 잔기 및 프레임워크 3의 Asp73-Thr74-Ser75 잔기.

오직 VH 사슬만이 또한 FSH 수용체의 엑토도메인, 특히 위치 26에서 글리신(Gly26)을 가진 CDR1, 및 프레임워크 1(Gln1-Gly2-Gln3, Lys23-Thr24-Ser25) 및 프레임워크 3(Ser75)의 특정 잔기의 인식에 수반된다.

결론적으로, CF12 리간드는 hFSH의 알파-서브유닛, 베타-서브유닛 및 특히 안전띠를 형성하는 그것의 C-말단부, 및 FSH 수용체의 엑토도메인을 수반하는 고도로 입체구조적인 에피토프를 인식한다는 점을 특징으로 한다. VH 사슬은 수용체와의 상호작용에 필수적으로 수반되고, VL 사슬은 호르몬과의 상호작용에 필수적으로 수반된다. 이 에피토프는 CF12 리간드가 한편으로 호르몬 다이머 회합을 안정화시키고, 다른 한편으로는 수용체에 대한 호르몬의 결합을 안정화시킬 수 있게 한다. 이들 두 가지 메커니즘은 호르몬과 그것의 수용체의 더 나은 상호작용을 생성하기 위해 상호보완적이고 성선 자극 호르몬에 대한 CF12 리간드의 강화 효과의 기반으로 여겨질 수 있다.

실시예 7: 본 발명의 CF12 리간드의 다양한 단편의 구성, 생성 및 특성화

CF12 항체의 다양한 단편을 양 FSH 및 인간 FSH의 생물학적 활성을 강화시키는 능력을 평가하기 위해 구성하였다. "CF12 VL"로 불리는 가변 경쇄를 단독으로 포함하는 단편, "CF12 VH"로 불리는 가변 중쇄를 단독으로 포함하는 단편 및 본 발명의 실시예 1, 단락 4에서 기술된 참고문헌의 CF12 scFv의 VH-VL 서열과 비교하여 역방향 VL-VH 순서로 구성된 "역방향 CF12 scFv"(서열 번호: 10 및 서열 번호: 11)를 생산하였다.

1. 항체 단편 구성 및 생산

CF12 항체로부터 유도된 CF12 VL 및 역방향 CF12 scFv 단편을 암호화하는 합성 유전자를 ATG:Biosynthetics GmbH(Germany)로 합성하였다. 역방향 CF12 scFv는 CF12 scFv 융합체의 CF12 scFv-링커-CF12 VH의 CF12 VL로 구성된다. 각각의 합성 유전자를 pSW1 플라스미드[7]의 서열의 융합으로 설계하고, HindIII 부위와 PelB 단백질을 암호화하는 서열 및 합성되는 원하는 단백질의 서열(서열 번호: 27 및 서열 번호: 31)의 단부 사이에 포함시켰고, XhoI 제한 부위로 플랭킹하였다. 서열을 pSW1 플라스미드의 HindIII 및 XhoI 부위 사이에 삽입한다. 코돈을 대장균에서의 발현에 최적화하였다.

pSW1 플라스미드[7]의 PstI-XhoI 부위에 pSW1 역방향 CF12 scFv 플라스미드의 이 효소들에 의한 분해로부터 발생한 단편을 삽입하여 pSW1CF12 VH 발현 플라스미드를 얻었다.

구조체의 품질의 시퀀싱에 의한 검증 후, 컴피턴트(competent)하게 만든 HB2151 박테리아(T53040, Interchim, France)를 pSW1-CF12 VL, pSW1-CF12 VH 및 pSW1 역방향 CF12 scFv 플라스미드를 사용하여 열 충격에 의해 형질전환하였다[8].

본 발명의 실시예 1에서 앞서 기술된 방법에 따라 단편 생산을 수행하였다.

2. FSH의 생체 활성에 대한 CF12 VL , CF12 VH 및 역방향 CF12 scFv 단편의 효과의 시험관 내 측정

인간 FSH의 생체 활성에 대한 "CF12 VL", "CF12 VH" 및 "역방향 CF12 scFv" 단편의 시험관 내 효과를 인간 FSH 수용체로 안정하게 트랜스펙션된 HEK293 세포주 및 본 발명의 실시예 2에서 앞서 기술된 프로토콜에 따르는 Glosensor ^® 시스템으로 연구하였다. "CF12 VL" 및 "CF12 VH" 단편을 단독으로 또는 혼합물로서 각각 40 nM로 테스트하였다. 역방향 CF12 scFv를 참조 CF12 scFv와 같이 80 nM의 농도로 테스트하였다. 인간 FSH를 0.1 nM로 테스트하였다.

도 17은 인간 FSH(hFSH) 단독 또는 다양한 CF12 단편과 복합체를 형성한 인간 FSH 0.1 nM로 존재 하에 얻어진, 시간의 함수(분 단위)로서 상대적 발광 유닛으로 표현되는 cAMP 생산 동역학 곡선을 나타낸다. 다음과 같은 네 가지 조건을 hFSH 단독과 비교하였다: hFSH + CF12 VL 복합체(도 17A), hFSH + CF12 VH 복합체(도 17B), hFSH + 역방향 CF12 scFv 복합체(도 17C) 및 hFSH와 CF12 VL 40 nM 및 CF12 VH 40 nM의 등몰 혼합물의 복합체(도 17D). 발광 반응의 수준을 자극 40분에서 비교한다.

0.1 nM hFSH와 복합체를 형성한 40 nM 농도의 "CF12 VL" 단편이 hFSH 단독으로의 자극과 비교하여 CF12 scFv(180% 증가)와 비슷한 218% 만큼 세포 반응을 증가시키는 매우 유의한 강화 효과(p<0.001)를 발휘한다는 것이 관찰된다(도 17A). 0.1 nM hFSH와 복합체를 형성한 40 nM 농도의 "CF12 VH" 단편은 hFSH 단독으로의 자극과 비교하여 CF12 scFv(180% 증가)보다 더 큰 250% 만큼 세포 반응을 증가시키는 매우 유의한 강화 효과(p<0.001)를 발휘한다 (도 17B).

역방향 CF12 scFv(도17C)는 참조 CF12 scFv와 동일한 FSH의 작용을 강화시키며, FSH에 대한 반응과 비교하여 180%의 발광 신호 증가를 제공한다; 이 효과는 유의하다(p<0.001).

마지막으로, hFSH와 복합체를 형성한 두 개의 CF12 VH + CF12 VL 단편의 혼합물(도 17D)은 참조 CF12 scFv(180% 증가)보다 더 큰 278%의 세포 반응의 유의한 증가를 유도한다(p <0.001).

이들 모든 결과는 분리된 VL 또는 VH 단편이 FSH의 생체 활성에 대한 강화 효과를 발휘할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 이 결과는 본 발명의 실시예 6에서 기술된 상호작용 모델의 예측을 확인하며, 이는 FSH/수용체 복합체에서의 상호작용에서 두 개의 가변 사슬의 수반을 나타낸다. 두 개의 VL 및 VH 단편의 혼합물은 이 검정에서 가장 큰 강화 효과를 발휘한다.

3. 암컷 래트에서 FSH의 생체 활성에 대한 CF12 VL , CF12 VH 및 역방향 CF12 scFv 단편의 강화 효과의 생체 내 측정

시험관 내에서 특성화한 후, hFSH의 생체 활성에 대한 다양한 CF12 단편의 강화 효과를 암컷 래트의 생체 내에서 연구하였다.

FSH 생체 활성을 측정하기 위해서, 사용된 프로토콜은 본 발명의 실시예 3에서 기술된 바와 같이 Steelman and Pohley(Steelman SL, Pohley FM. Endocrinology, 53:604-616. 1953) [12]의 생물학적 검정의 프로토콜이었다. 각각의 배치는 5마리의 암컷 래트를 포함하였다.

그 결과는 도 18에서 나타난다. 역방향 CF12 scFv와 복합체를 형성한 hFSH가 처리된 배치는 195 ± 15 mg 평균 난소 중량/체중 100 g을 제공하였는데, 이는 (160 ± 5 mg)인 참조 hFSH/CF12 scFv 복합체가 처리된 배치보다 약간 더 크며, 단독으로 호르몬 처리를 받은 배치와 비교하여 175% 증가하였다(p<0.01). hFSH와 복합체를 형성한 CF12 VL 및 CF12 VH 단편이 처리된 배치는 각각 186 ± 24 mg 및 237 ± 15 mg의 평균 난소 중량을 가지며, 이는 단독으로 호르몬 처리를 받은 배치와 비교하여 167% 및 213% 증가하였다(p<0.05 및 p<0.001).

이 결과들은 hFSH와 복합체를 형성한 scFv의 구조의 순서(VL-VH 대 VH-VL)는 FSH의 생체 활성에 대한 scFv의 강화 성질에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다. 이 결과는 또한 CF12의 가변 사슬, 특히 VL 단편이 호르몬의 생체 내 및 시험관 내 생체 활성을 강화시킬 수 있다는 것을 매우 유의하게 입증한다. 이는 본 발명의 실시예 7에서 기술된 상호작용 모델에 의해 예측된 바와 같이 효과 측면에서 두 개의 사슬의 개별적인 수반을 반영한다.

참고문헌 목록

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국립미생물배양센터

CNCMI-4803

20131003

SEQUENCE LISTING <110> REPROPHARM KARA, Elodie DECOURTYE, J??ye CASTERET, Sophie MAUREL, Marie-Christine <120> LIGANDS POTENTIALISANTS DE LA BIOACTIVITE DES GONADOTROPHINES <130> BNT213486PC00 <150> FR 1458469 <151> 2014-09-10 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CF12 <400> 1 cagggtcaga tgcagcagtc tggagctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaaga cttctggctt caccttcagc agtagctata taagttggtt gaagcaaaag 120 cctggacaga gtcttgagtg gattgcatgg atttatgctg gaactggtgg tactagctat 180 aatcagaagt tcacaggcaa ggcccaactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240 atgcaattca gcagcctgac aactgaggac tctgccatct attactgtgc aagacacggg 300 tcctactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CF12 <400> 2 Gln Gly Gln Met Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Leu 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