高纯度尿卵泡刺激素的纯化及生产工艺
专利汇可以提供高纯度尿卵泡刺激素的纯化及生产工艺专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种高纯度尿卵泡刺 激素 的纯化及生产工艺，它是将偶氮红色染料偶联到Sepharose 4B上用作亲和分离纯化尿卵泡刺激素的介质，在分离纯化尿卵泡刺激素时，采用包括染料亲和层析和QAE离子交换层析等工艺步骤从绝经后尿促性腺素中纯化得到高纯度尿卵泡刺激素产品。采用本 发明 工艺生产的产品 生物 效价不低于200IU/mg，FSH/LH＞100，色白易溶，各项指标都符合或超过《英国药典》98版相应指标，可直接用于注射针剂的生产之用。，下面是高纯度尿卵泡刺激素的纯化及生产工艺专利的具体信息内容。
1.一种高纯度尿卵泡刺激素的纯化及生产工艺，其特征是工艺步骤如下：A、首先将红色偶氮类染料配成一定浓度的溶液，然后加入10～50％凝胶，升温后先后加入助染剂、固定剂以及催化剂，进行偶联反应，偶联后的凝胶反复用纯水洗净，装于亲和层析的层析柱；B、将尿促进素粗品经过磺基水杨酸和聚乙二醇处理后，上硼砂缓冲平衡过的红色染料亲和层析柱，然后进行洗涤操作和洗脱操作；C、获得的具有FSH生物活性的组份上用磷酸盐缓冲液平衡的离子交换层析柱，离子交换层析柱依次经过洗涤和洗脱操作后，获得纯度比较高的FSH组分；D、从离子交换层析柱上洗脱下来的FSH组分经过通常的超滤、膜过滤以及冷冻、干燥得FSH产品，将该产品在无菌条件下分装，同时进行热原、内毒素、HIV、HV、 HBV病毒的检测。
2.根据权利要求1所述的高纯度尿卵泡刺激素的纯化及生产工艺，其特征是染料亲和层析介质的合成过程中所用的助染剂为NaCl，固定剂为Na2CO3，催化剂为DABCO。
3.根据权利要求1所述的高纯度尿卵泡刺激素的纯化及生产工艺，其特征是洗涤操作中，洗涤的溶液是苷氨酸-NaOH缓冲液，洗脱操作中，洗脱溶液是含钾盐的苷氨酸-NaOH缓冲液。
高纯度尿卵泡刺激素的纯化及生产工艺
技术领域
背景技术
发明内容
本发明包括以下步骤的纯化FSH的工艺。首先将红色染料(偶氮类染料，例如Reactive Red 120)配成初如浓度为0.5～3.5％(W/V)溶液(初始的配基溶液)，然后加入10～50％(W/V)Sepharose 4B凝胶，升温后加入助染剂，固定剂以及催化剂，在一定的条件下反应。在本发明中，染料亲和层介质的合成过程中所用的最佳的助染剂可以为NaCl，固定剂为Na2CO3，催化剂可以为DABCO。偶联后的凝胶反复用纯水洗净备用，装于通常用于亲和层析的层析柱，其中小试试验中亲和层析柱为2.5cm×10cm，中试试验中为20cm×80cm。
HMG粗品经过磺基水杨酸和聚乙二醇处理后，上硼砂(pH8.0)缓冲液平衡过的红色染料亲和层析柱，然后进行洗涤操作。其中洗涤的溶液最好是苷氨酸-NaOH缓冲液。然后进行洗脱操作，其中最好的洗脱溶液是含一种钾盐的苷氨酸-NaOH缓冲液，获得FSH组分。FSH和LH的生物活性可以用放射免疫的方法使用Serono FSH Maiclone检测试剂盒(目录号为13101)进行监测。蛋白浓度的检测采用Lowry试剂法进行，蛋白质标准为牛血清白蛋白(Pierce公司产品，目录号为2323)。
获得的具有FSH生物活性的组分上用磷酸盐缓冲液平衡的QAE离子交换层析柱尺村寸(径×高)为2cm×18cm，中试用的QAE离子交换层析柱为5cm×30cm。依次经过洗涤和洗脱操作后，获得纯度比较高的FSH组分。
从QAE离子交换层析柱上洗脱下来的FSH组分经过通常的超滤、膜过滤以及冷冻等步骤，获得FSH产品。该产品在无菌条件下分装。同时进行热原、内毒素、HIV、HCV、 HBV病毒的检测。
用本发明的方法能够得到纯度较高的FSH产品，平均生物学效价达到200IU/mg以上，FSH/LH＞100，色白易溶，各项指标都符合或超过《英国药典》98版相应指标，可直接用于注射针剂的生产之用。而且工艺中FSH的活性回收率均高于目前以报道的方法，为60％以上。为工业化大规模生产时降低成本打下了基础。
附图说明
图1为红色染料亲和层纯化FSH的层析谱图。
图2为离子交换层析纯化FSH的层析谱图具体实施方式红色染料与Sepharose 4B的偶联：称取一定量红色染料(偶氮类染料，例如Reactive Red 120)配基加入到蒸馏水中，使初始的配基浓度为为0.5～3.5％(W/V)之间，搅拌溶解，然后加入10～50％(W/V)洗涤滤干的Sepharose 4B凝胶，置于恒温水浴摇床在1-10min内升到所需的反应温度(40-80℃)，然后加入助染剂染色(例如NaCl)，30分钟后再加入Na2CO3(终浓度为10-25g/L)固定15min，然后加入催化剂(例如DABCO)，反应2-10小时。反应的pH控制在9～10之间。偶联后的凝胶反复用纯水洗净备用。
FSH的纯化步骤1-粗品的处理：HMG粗品中的FSH活性约为1IU/mg，LU的活性约为1IU/mg。由于HMG粗品中含有很多杂蛋白，以及高岭土等杂质，确定以下粗品处理的工艺；先用去离子水将粗品溶解为2％(W/V)的溶液，然后在缓慢搅拌的条件下用0.2mol/L碘基水杨酸溶液将粗品溶液的pH值调成3.5，操作条件4℃，过夜静置。离心收集上清液，上清液先用1mmol/L、pH8.0硼砂缓冲夜透析24小时后准备上亲和层析柱。
FSH的纯化步骤2-染料亲和层析：干燥后的染料亲和层析介质先用纯水于20℃左右过液溶胀，然后装柱。含有染料亲和层介质的染料亲和柱先用20mM的硼砂(pH8.0)缓冲液平衡，然后上样，其中，样品为经过预处理的HMG溶液，上样溶液的蛋白浓度为10mg/mL胶。用20mM的硼砂(pH8.0)缓冲液循环2-4柱床体积。先用50mM苷氨酸-NaOH缓冲液(pH 10)洗涤5柱床体积，然后50mM苷氨酸-NaOH，0.2M KCl(pH9)缓冲液洗涤4柱床体积。
采用50mM苷氨酸-NaOH，0.2～3M KCl(pH9)进行梯度洗脱。用紫外检测仪监测蛋白质的洗脱峰，对FSH组分进行超滤除盐，并用pH 7.3的缓冲液调整其pH什，同时取样检测FSH的活性。
红色染料亲和层析纯化FSH的层析谱图如图1所示。
FSH的纯化步骤3-QAE交换层析：用pH7.3的10-50mM PB缓冲液平衡QAE离子交换柱。然后上样，上样溶液的蛋白浓度约为10-100mg/mL胶。用pH7.3的10-50mM PB缓冲液洗涤5柱床体积。
用pH7.3的10-50mM PB，20-100mM NaCl缓冲液进行洗脱。用紫外检测仪监测蛋白质的洗脱峰，同时取样检测FSH的活性。
QAE离子交换层析纯化FSH的层析谱图如图2所示。
FSH组分经过通常的超滤、膜过滤和冷冻干燥等步骤，获得符合《英国药典》98版规格的FSH产品。
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