发明背景

相对于给予药物本身来讲，用生物可降解的聚合物微球体和纳米 球体包封的药物可延长维持治疗药物的水平。依据剂型和包封的活性 分子而定，缓释可最高延至数月。可是许多生物活性分子，尤其是蛋 白质被用聚合载体包封它们所需的操作过程所破坏或使其不稳定。另 外，许多蛋白质的带电荷的、极性的性质可限制用聚合药物载体包封 的程度，并且可导致当第一次给药时所包封的生物活性分子部分的迅 速丢失(“爆发释放(burst)”)。

当患者服药时一直采用生物可降解的聚合物传递体系包封的生 物活性分子的方法刺激免疫反应(见Gombotz等，U.S.Pat.No. 5,942,253)。在某些情况下这是理想的，但当目的是为了传递治疗用途 的生物活性分子时，却不理想。因此降低免疫系统对用生物可降解的 聚合物传递的生物活性分子的识别应该有利于治疗的进行。

生物活性分子，尤其是治疗性的蛋白质(药物)，可用亲水性聚合 物如聚乙二醇修饰(通称为“聚乙二醇化(pegylation)”的方法)，以共价 键连接到一个或多个氨基酸侧链上(如见Davis等，U.S.Pat.No. 4,179,337；Harris，U.S.Pat.No.5,446,090；Delgado等，U.S.Pat.No. 5,880,255.)。虽然本领域众所周知此类连接可导致分子量明显增加并可 降低修饰后的治疗性蛋白质的血液清除率(如见Camble等，U.S.Pat. No.5,320,840)，但是先有技术没有说明使用聚乙二醇化的蛋白可降低 免疫原性或可延长从生物可降解的聚合药物传递系统中释放的持续时 间。先有技术没有说明相对于未聚乙二醇化的药物，聚乙二醇化的药 物可增加药物在生物可降解的药物传递系统中的可达到的装载量，也 没有说明相对于未聚乙二醇化的药物，聚乙二醇化的部分可减少药物 的爆发释放。

发明概述

本发明提供控制、延长生物活性分子如治疗性蛋白质、肽和低(聚) 核苷酸释放的新制剂。所述制剂以生物可降解的聚合物如聚(乳 酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)及其共聚物联合形成的微粒或纳米粒为基 础。将生物活性分子连接到亲水性的聚合物如聚乙二醇或聚丙二醇 中，然后与固体微粒或纳米粒制成能提供控释的制剂。该控释制剂可 通过注射给药、吸入给药、鼻内或口服给药。

因此，作为本发明的部分，其发现亲水性聚合物连接到生物活性 分子(如药物和治疗性蛋白质)上有几个有益的作用，包括在用药物载 体包封条件下提供保护使其免受降解或变性。另外，相对于未修饰的 蛋白质，增加了可以被包封的修饰蛋白质的量，因此提供较低的原料 总剂量，对患者和生产者均有益。

另外，本发明进一步以以下发现为基础，发现相对于在载体中的 非聚乙二醇化的生物活性分子，降低了被生物可降解的聚合物药物传 递载体包封的聚乙二醇化的生物活性分子的免疫原性，特别是通过皮 下或肌内注射或吸入或粘膜传递(如口或鼻传递)给药时。当口腔传递 使用生物可降解的聚合物时，被降低的免疫原性具有特别的优势，因 为这是粘膜接种疫苗的一种典型的方法。

在另一方面，本发明以下述发现为基础，发现通过以生物可降解 的聚合物系统，具体地说以纳米球给药时，能使通常不能被胃肠道吸 收的聚乙二醇化的蛋白质、肽、低聚糖和低聚核苷酸成为生物可利用 的。当在此使用时，术语“生物可利用的”指在对一个主体给药后进 入血流的生物活性分子部分。当口服给药时，本发明的控释制剂可增 加生物活性分子的生物利用度，特别是此处所述的纳米球制剂。例如， 在单剂量口服给予纳米球包封的聚乙二醇化的生物活性分子后，血液 水平可维持数天。另外，在形成纳米球过程中聚乙二醇链保护该生物 活性分子免受降解和变性，促使活性分子的截留增加并减少“爆发释 放”作用。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供一种控制、延缓释 放并增加生物活性分子的生物利用度的药用组合物，它包括一种连接 包封到纳米球中的治疗剂的聚合物(如PEG)。在一个特别优选的实施 方案中，口服给予所述组合物。

在一个优选的实施方案中，所述生物活性分子选自：α-干扰素、 β-干扰素、γ-干扰素、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素1、白细胞介素2、白细胞介素3、 白细胞介素12、天门冬酰胺酶、腺苷、脱氨酶、胰岛素、ACTH、胰 高血糖素、生长激素抑制素、胸腺素、副甲状腺激素、色素激素、生 长调节素、促黄体生成激素、绒毛膜促性腺激素、下丘脑释放因子、 抗利尿激素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽、biphalin、泌乳刺激 素、单克隆的抗体、多克隆的抗体、反义寡核苷酸、阿普塔默、治疗 基因、肝素、低分子量肝素和小的生物活性分子。

因此，本发明的组合物可用于在多个方面改善治疗性的生物活性 分子的体内传递。详细地说，本发明提供降低免疫原性、增加生物利 用度、增加持续时间、增加稳定性、减少爆发释放并控制、延缓生物 活性分子的体内释放的优势。

本发明详述

I. 生物活性分子

当在此使用时，术语“生物活性分子”指给予主体如人或其它的 哺乳动物的任意的治疗性蛋白质、肽、多糖、核酸或其它的生物活性 化合物。用于本发明的合适的治疗性蛋白质包括，但不限于，α-干扰 素、β-干扰素、γ-干扰素、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒 细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素1、白细胞介素2、 白细胞介素3、白细胞介素12、天门冬酰胺酶、腺苷脱氨酶和胰岛素。

适宜的治疗性肽也包括激素，如ACTH、胰高血糖素、生长激素 抑制素、生长激素、胸腺素、副甲状腺激素、色素激素、生长调节素、 促黄体生成激素、绒毛膜促性腺激素、下丘脑释放因子、抗利尿激素、 甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽、biphalin和泌乳刺激素。

另外适宜的治疗性蛋白质包括单克隆和多克隆的抗体、单链抗 体、其它抗体片段、类似物和衍生物。治疗性聚核苷酸，包括反义寡 核苷酸、阿普塔默和治疗基因，也可用本发明的方法和组合物传递。

抗凝血治疗剂，如肝素和低分子量肝素，也可用本发明的方法和 组合物传递。其它适宜用于本发明的治疗性蛋白质包括小的生物活性 分子，如抗癌药，如紫杉醇、泰索帝、阿霉素和道诺霉素、长春新碱、 顺铂、卡铂、喜树碱和喜树碱类似物、抗生素、安定药、抗抑郁药、 糖尿病和心血管疾病的小分子药物。

II. 生物活性分子与亲水性聚合物的连接

术语“亲水性聚合物”指任意的水溶性直链或支链聚合物，包括 但不限于聚乙二醇和聚丙二醇和类似的直链和支链聚合物。优选聚合 物的分子量在约500道尔顿到50,000道尔顿的范围内。用于本发明的 亲水性聚合物一般具有一个反应基团，其通过氨基、羧基、硫氢基、 磷酸酯或羟基官能团，将该聚合物引入连接到所述的生物活性分子 中。

可根据标准方案制备用于本发明的亲水性聚合物如聚乙二醇，将 一个末端加有甲氧基基团而激活另一端以易于连接到生物活性分子的 活性基团上。例如，美国专利序号6,113,906描述了聚乙二醇上的琥珀 酰胺琥珀酸酯或氨基甲酸酯活性基团与蛋白质上的氨基基团的反应的 用途。美国专利序号5,446,090描述了聚乙二醇的砜衍生物与蛋白质的 硫氢基形成稳定的键的用途。美国专利序号5,880,255描述了tresyl衍 生物与蛋白质的氨基基团反应形成一种简单的、稳定的仲胺键的用 途。这些专利的所有内容通过引用全部结合到本文中。N-羟基琥珀酰 胺也可作为反应基团引入。

III. 结合聚合物的生物活性分子的控释制剂

术语“控释”指控制本发明的药物传递制剂传递的生物活性分子 的速率和/或数量。控释可以是连续的或不连续的，和/或线性的或非线 性的。为了产生所需的效果，可用一种或多种类型的聚合物成分、药 物载体、赋形剂的内含物或降解增强剂、或其它修饰剂，进行单独给 药、联合或连续给药来实现。

零级释放或线性释放通常解释为：在所需的时间期限内，一定时 间释放的生物活性分子的量作为量/单位时间的函数保持相对恒定。 “多相(Multi-phasic)”通常解释为释放出现一个以上的“爆发释放”。

A.微粒

在一个实施方案中，为了控制结合聚合物的生物活性分子的释 放，本发明采用生物可降解的微粒。当在此使用时，“微粒”指优选 具有小于1.0mm，而更优选具有在1.0和100.0微米之间的直径的粒 子。微粒包括微球，其一般为固体球形微粒。微粒也包括微囊，其通 常是具有不同的聚合物、药物或组合物的核心的球形微粒。

用于本发明的微粒可用各种控释制剂所用的生物可降解的聚合 物制备，这在本领域是众所周知的。例如，适宜的聚合物包括，但不 限于，包括聚乳酸、聚乙醇酸和它们的共聚物的聚(羟基酸)、聚酐、 聚原酸酯和某些类型的蛋白质和多糖聚合物。当在此使用时，术语“生 物可侵蚀的”或“生物可降解的”指当暴露到pH在大约6-8之间的生 理溶液中并在大约25℃-38℃之间的温度下，在一段时期内溶解或降解 的聚合物，所述一段时间在所需要的应用(通常在体内治疗中)中是可 以接受的，一般大约不到五年，更优选不到一年。

优选的聚合物包括聚(羟基酸)，尤其是乳酸-乙醇酸共聚物(lactic acid-co-glycolic acid)(“PLGA”)，其在暴露到机体的水环境中后通过 水解降解。然后该聚合物水解产生乳酸和乙醇酸单体，它们是细胞代 谢的正常的副产物。所述聚合物分解的速率可在几周到一年的一段时 间内变化，这取决于几个因素，所述因素包括聚合物的分子量、聚合 物链中乳酸与乙醇酸单体的比率和单体亚单位的立构规整性(L和D立 体异构体混合物破坏聚合物的结晶性，从而增强聚合物降解)。微球可 含有两种或两种以上的分子量不同和/或单体比率不同的生物可降解 的聚合物混合物。

衍生化的生物可降解的聚合物也适宜用于本发明，包括连接到 PLGA等上的亲水性聚合物。详细地说，为了形成微球，可使用本领 域中已知的各种技术。例如，这些技术包括在移除溶剂后的单乳化或 双乳化步骤。移除溶剂可通过其它方法之中的萃取、蒸发或喷雾干燥 完成。

在溶剂萃取方法中，将所述聚合物溶解于至少部分溶于萃取溶剂 (如水)的有机溶剂中。然后，将以溶解形式或以细小粒子分散形式的 生物活性分子加入到聚合物溶液中，之后将该混合物分散进入含有表 面活性剂如聚(乙烯醇)的水相中。将产生的乳化液加入到更大体积的 水中，将有机溶剂从聚合物/生物活性剂中移除，形成硬化的微粒。

在溶剂蒸发方法中，将所述聚合物溶解于挥发性有机溶剂中。将 以溶解形式或以细小粒子分散形式的生物活性分子加入到聚合物溶液 中，之后将该混合物悬浮在一种含有表面活性剂如聚(乙烯醇)的水相 中。搅拌所产生的乳化液，直到大部分有机溶剂蒸发，留下固体微球。

在喷雾干燥方法中，将所述聚合物溶解于适宜的溶剂中，如二氯 甲烷(如0.04g/ml)中。然后将已知量的生物活性分子(药物)悬浮(如果 不溶)或共溶(如果可溶)在该聚合物溶液中。随后将该溶液或分散液喷 雾干燥。可以获得直径范围在1-10微米之间的微球，其形态取决于聚 合物的选择。

其它已知的方法，如相分离法和凝聚法以及以上方法的变化在本 领域是众所周知的，并且也可用于本发明。

B.纳米粒

在另一个实施方案中，本发明采用生物可降解的纳米粒控制连接 生物活性分子的聚合物的释放，特别是口服给药。当在此使用时，术 语“纳米粒”指具有优选在大约20纳米和大约2.0微米之间的直径的 粒子，典型地是在大约100纳米和1.0微米之间的直径的粒子。

除了使用高速混合或匀化以便将聚合物/生物活性剂乳化液的粒 径减少到2.0微米以下，优选在1.0微米以下之外，基本上可按照以上 微米粒所述，获得纳米粒制剂，例如，WO 97/04747中说明了制备纳 米粒的适宜技术，该申请全部内容结合到本发明中作为参考。

                            实施例

I.传递leu-脑啡肽的制剂的制备和特征

实施例1-聚乙二醇缀合的leu-脑啡肽(PEG-leu-脑啡肽)的制备

如下制备用聚乙二醇共价修饰的leu-脑啡肽：将25mg leu-脑啡肽 溶解于500μL含有50μL TEA的无水DMSO中。将250mg mPEG(5000)-SPA溶解于1.5mL无水DMSO中，并通过直接注射加入 到所述肽溶液中。让该反应在室温下进行2小时或直到＞90％的肽转化 为其被PEG-修饰的形式。通过在EtOH中重结晶(2x)，从反应物中分 离出产物，mPEG(5000)-leu-脑啡肽。该反应产物为＞95％聚乙二醇化 的白色固体(通过RP-HPLC分析)。

实施例2-含有leu-脑啡肽的常规(w1/o/w2)微粒的制备和特征

如下制备含有leu-脑啡肽的常规w1/o/w2微粒：将leu-脑啡肽溶解 于1∶9 DMSO∶PBS混合物中，使终浓度为35mg/mL(其在PBS中的最 大溶解度)。将PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；酸末端基团；固有粘度 0.16L/g)溶解于二氯甲烷中，使终浓度为200mg/mL。通过以10,000rpm 速度，将200μL的肽溶液与3mL的聚合物溶液匀化3分钟，制成初 乳化液(w/o)。将该初乳化液倾入到100mL 0.5％PVA溶液中，并以750 rpm搅拌3-6小时。在溶剂已经蒸发并且微粒已经变硬后，过滤收集， 并在分析前于真空中干燥。该粒子的核心装载量(CL)、包封效率(EE)、 粒径(PS)和它们的内容物的最初释放量(IR)的特征如下。结果见表1。

通过溶解10mg微球在50％乙腈中，随后离心以沉淀不溶的聚合 物，进行微球核心装载量的测量。通过RP-HPLC分析部分样品，并与 在50％乙腈中制备的有代表性的标准品比较。通过悬浮20mg样品在 2mL含有0.02％吐温20和25％EtOH的PBS(50mM，pH 7.2)中，测量 微球的最初释放量。将该悬浮液涡流振荡，并在37℃下孵育。1小时 后，移去等份样品，过滤并通过RP-HPLC分析释放量。表明1小时时 的加速释放与1天以后在没有EtOH的PBS中的活性释放量相关。

实施例3-含有PEG-leu-脑啡肽缀合物的常规(w1/o/w2)微粒的制备和 特征

如下制备含有PEG-leu-脑啡肽的常规w1/o/w2微粒：将PEG-leu- 脑啡肽溶解于1∶9 DMSO∶PBS混合物中，使终浓度为50mg/mL。将 PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；酸末端基团；固有粘度0.16L/g)溶解于 二氯甲烷中，使终浓度为200mg/ml。通过以10,000rpm速度将200μL 的肽溶液与3ml的聚合物溶液匀化3分钟，制成初乳化液(w/o)。将该 初步乳化液倾入到100ml0.5％PVA溶液中，并以750rpm搅拌3-6小 时。在溶剂已经蒸发并且微粒已经变硬后，过滤收集，并在分析前于 真空中干燥。如实施例2所述，该粒子具有核心装载量(CL)、包封效 率(EE)、粒径(PS)和它们的内容物的最初释放量(IR)的特征。这些数据 示于表1中。

实施例4-含有leu-脑啡肽的单相微粒的制备和特征

如下制备含有未修饰的leu-脑啡肽的单相微粒：将10mg leu-脑啡 肽溶解于1ml含有30μL TFA的二氯甲烷中。然后将90mg PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基团；固有粘度0.61 L/g) 溶解于该有机的肽溶液中。通过使该溶液与2.5ml 2.5％PVA涡流振荡 3分钟，形成初乳化液(o/w)。使用强制通气(forced air)(15分钟)并搅拌 (6-8小时)，蒸发溶剂并硬化微粒。在硬化后，通过过滤收集所述微粒， 并在分析前于真空中干燥。核心装载量(CL)、包封效率(EE)、粒径(PS) 和内容物最初释放量(IR)的数据示于表1中。

实施例5-含有PEG-leu-脑啡肽缀合物的单相微粒的制备和特征

如下制备含有PEG-leu-脑啡肽的单相微粒：将50mg PEG-leu-脑 啡肽和150mg PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基团；固有 粘度0.61 L/g)溶解于2ml二氯甲烷中。通过使该有机肽/聚合物溶液与 5ml 2.5％PVA涡流振荡3分钟，形成初乳化液(o/w)。通过搅拌/真空 蒸发2小时，从该微粒中移去有机溶剂。在微粒变硬后，通过过滤收 集所述微粒，并在分析前于真空中干燥。核心装载量(CL)、包封效率 (EE)、粒径(PS)和内容物最初释放量(IR)的数据示于表1中。

实施例6-聚乙二醇化的leu-脑啡肽增加的药物装载量

表1的数据显示PEG 5000与leu-脑啡肽的共价结合对于双乳化技 术可增加药物的装载量(CL)达0.07％到0.36％，对于单相方法可增加 0.3％到3.95％。对两种方法而言，聚乙二醇化也导致包封效率的极大 改善。聚乙二醇化的最初释放量(“爆发释放”)比通过单相制备的未聚乙 二醇化的肽的最初释放量稍低(更好)，并且对于聚乙二醇化的肽，其 药心装载量超过10倍。药心装载量越高，为了达到所需的药物剂量而 给予患者的生物可降解的药物传递体系的剂量就越小。

表1、leu-脑啡肽和PEG-leu-脑啡肽微粒的特征     leu-脑啡肽     PEG-leu-脑啡肽 双乳化  单相  双乳化  单相  TL(％)a 1.64  10  1.64  10  CL(％) 0.07  0.3  0.36  3.95  EE(％) 4.43  3.04  17  40.3  PS(μm) 50-250  20-100  50-200  40-100  IR(％) 47.1  22.5  ND  20.8

理论装载量(活性物的重量/活性物和聚合物的总重量)

CL-核心装载量(在微粒中单独的活性物的重量百分比Wt％)

EE-包封效率(在制备过程中包封的活性物的％)

PS-平均粒径(从SEM估计)

IR-从37℃下的含有0.02％吐温20和25％EtOH的PBS(50mM，pH 7.2)中，体外分解1小时时的最初释放量

ND-未能检测出

II.传递Biphalin的制剂的制备、特征和给药方法

实施例7-聚乙二醇化的Biphalin增加的药物装载量和减少的爆发释 放

Biphalin是一种在哺乳动物中具有止痛活性的合成肽。与两个PEG 2000链连接，使其在静脉内给药后比未聚乙二醇化的肽具有更长的止 痛作用持续时间。可按照以下实施例所述，比较Biphalin和聚乙二醇 化的Biphalin在PLGA微粒包封中的行为。如表2所示，聚乙二醇化 的Biphalin比未聚乙二醇化的肽具有更高的药心装载量、更高的包封 效率和更低的最初释放水平(爆发释放)。

实施例8-含有biphalin的常规(w1/o/w2)微粒的制备和特征

如下制备含有PEG-biphalin的常规w1/o/w2微粒：将Biphalin溶解 于PBS∶DMSO∶乙酸(5∶1∶1.5)的三重混合物中，使终浓度为35mg/ml。 将PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；酸末端基团；固有粘度0.16L/g)溶解 于二氯甲烷中，使终浓度为200mg/ml。通过以10000rpm的速度，将 200μL的肽溶液与3ml的聚合物溶液匀化3分钟，制成初乳化液 (w/o)。将该初乳化液倾入到100ml 0.5％PVA溶液中，并以750rpm 搅拌3小时。在溶剂已经蒸发并且微粒已经变硬后，用水洗涤该微粒， 通过过滤收集，并在分析前于真空中干燥。核心装载量(CL)、包封效 率(EE)、粒径(PS)和内容物最初释放量(IR)的数据见表2中所示。

实施例9-含有PEG-biphalin缀合物的常规(w1/o/w2)微粒的制备和特 征

如下制备含有PEG-biphalin的常规w1/o/w2微粒：将PEG-biphalin 溶解于PBS中，使终浓度为50mg/ml。将PLGA(50∶50丙交酯∶乙交 酯；酸末端基团；固有粘度0.16 L/g)溶解于二氯甲烷中，使终浓度为 200mg/ml。通过以10000rpm的速度，将200μL的肽溶液与3ml的 聚合物溶液匀化3分钟，制成初乳化液(w/o)。将该初乳化液倾入到100 ml 0.5％PVA溶液中，并以750rpm搅拌3小时。在溶剂已经蒸发并且 微粒已经变硬后，用水洗涤该微粒，通过过滤收集，并在分析前于真 空中干燥。核心装载量(CL)、包封效率(EE)、粒径(PS)和内容物最初释 放量(IR)的数据示于表2中。

实施例10-含有biphalin的单相微粒的制备和特征

如下制备含有未修饰的biphalin的单相微粒：将20mg biphalin和 180mg PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基团；固有粘度 0.61L/g)溶解于2ml 1∶3的乙酸∶二氯甲烷混合物中。通过使该油相与 5ml 1％PVA涡流振荡3分钟，形成初乳化液。通过在搅拌下真空蒸发 4小时，从最初的o/w乳化液中移去有机溶剂。在移除溶剂后，通过 过滤收集变硬的微粒，并用蒸馏的去离子水洗涤数次以便移除任何非 特异性结合的PVA或biphalin。最后在分析前，于真空中干燥该微粒。 核心装载量(CL)、包封效率(EE)、粒径(PS)和内容物最初释放量(IR)的 数据示于表2中。

实施例11-含有PEG-biphalin缀合物的单相微粒的制备和特征

如下制备含有PEG-biphalin的单相微粒：将180mg PLGA(50∶50 丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基团；固有粘度0.61L/g)和20mg PEG- biphalin溶解于2ml二氯甲烷中。通过使该聚合物/肽溶液与5ml 2.5％ 聚乙烯醇(PVA，80-85％水解)涡流振荡3分钟，形成初乳化液。通过在 搅拌下真空蒸发4小时，从该初乳化液(o/w)中移去有机溶剂。通过过 滤收集变硬的微粒，并用蒸馏水洗涤数次以便移除任何非特异性结合 的PVA或PEG-biphalin。最后，在分析前，于真空中干燥该微粒。核 心装载量(CL)、包封效率(EE)、粒径(PS)和内容物最初释放量(IR)的数 据示于表2中。

实施例12-给予生物可降解的微球中的聚乙二醇化的biphalin后对 哺乳动物的止痛作用

为了评估按照本发明给药biphalin在体内传递的改善，如下进行 一个比较研究：聚乙二醇化的biphalin PLGA微球可按照实施例9所 述，通过双乳化方法制备。将所述微球悬浮在带有0.5％Tween-20的 羧甲基纤维素(5％)水溶液的媒介物中。然后皮下给予Spragur-Dawley 大鼠一个有效剂量，并且通过，例如，摆尾(tail-flick)试验测量止痛作 用。包封的PEG-biphalin微球比未包封的PEG-biphalin对照注射剂具 有持续更长的止痛作用。该实验可用通过实施例11的单相方法制备的 PLGA-包封的PEG-biphalin重复进行，结果类似。

表2、Biphalin和PEG-Biphalin微粒的特征 Biphalin      PEG-Biphalin 双乳化  单相  双乳化  单相  TL(％)a 1.0  10  1.64  10  CL(％) 0.24  0.36  1.48  6.86  EE(％) 14.28  3.64  90.52  68.6  PS(μm) 50-250  20-100  20-200  20-100  IR(％) ND  49.4  19  15.6

a理论装载量(活性物的重量/活性物和聚合物的总重量)

CL-核心装载量(在微粒中单独的活性物的重量百分比Wt％)

EE-包封效率(在制备过程中包封的活性物的％)

PS-平均粒径(从SEM估计)

IR-从37℃下的含有0.02％吐温20和25％EtOH的PBS(50mM，pH 7.2)中，体外分解1小时时的最初释放量

ND-未能检测出

III传递胰岛素的制剂的制备、特征和给药方法

实施例13-聚乙二醇-共轭的人胰岛素(PEG-胰岛素)的制备

按如下方法用聚乙二醇共价修饰人胰岛素：将116mg重组人胰岛 素溶解于4ml含有200μL TEA的无水DMSO中。将1g mPEG(5000)-SPA溶解于10ml无水DMSO中，并通过直接注射加入 到所述胰岛素溶液中。让该反应在室温下进行过夜(6-10小时)或直到 ＞90％的蛋白质聚乙二醇化。通过从Et2O中沉淀(2x)，分离未反应的 PEG和聚乙二醇化的胰岛素。终产物为＞95％聚乙二醇化的白色颗粒 固体(通过RP-HPLC分析)。

实施例14-含有人胰岛素的常规(w1/o/w2)微粒的制备和特征

如下制备含有人胰岛素的常规w1/o/w2微粒：将重组人胰岛素溶 解于DMSO∶0.1N HCl(1∶1)中，使终浓度为50mg/ml，并将PLGA(50∶50 丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基团；固有粘度0.61 L/g)溶解于二氯甲 烷中，使终浓度为200mg/ml。通过以10000rpm的速度，将200μL 的所述蛋白质溶液与3ml的聚合物溶液匀化3分钟，制成初乳化液 (w/o)。将初乳化液加入到100ml 0.5％PVA溶液中，并在真空下搅拌 3-6小时。移除有机溶剂，过滤微粒，用水洗涤数次，并在分析前于真 空中干燥。该微粒的特征示于表3中。

实施例15-含有PEG-胰岛素缀合物的常规(w1/o/w2)微粒的制备和特 征

如下制备含有PEG-胰岛素的常规w1/o/w2微粒：将PEG-胰岛素溶 解于DMSO∶H2O(1∶2)的混合物中，使终浓度为50mg/ml，并将 PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基团；固有粘度0.61 L/g) 溶解于二氯甲烷中，使终浓度为200mg/ml。通过以10000rpm的速度， 将200μL的所述蛋白质溶液与3ml的聚合物溶液匀化3分钟，制成初 乳化液(w/o)。将初乳化液加入到100ml 0.5％PVA溶液中，并在真空 下搅拌3-6小时。移除有机溶剂，过滤微粒，用水洗涤数次，并在分 析前于真空中干燥。该微粒的分析结果示于表3中。

实施例16-含有人胰岛素的单相微粒的制备和特征

如下制备含有人胰岛素的单相微粒：将20mg重组人胰岛素(Zn2+- 胰岛素盐)溶解于2ml乙酸∶二氯甲烷(1.4∶1)混合物中。将180mg PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基团；固有粘度0.61 L/g) 溶解于该有机的肽溶液中。通过使该有机肽/聚合物溶液与5ml 1％ PVA涡流振荡3分钟，形成初乳化液。通过在搅拌下真空蒸发2小时， 移去有机溶剂。将部分变硬的微粒加入到含有100ml水的烧杯中，再 搅拌2小时以便彻底移除所有的有机溶剂。过滤收集微粒、用水洗涤 数次，并在分析前于真空中干燥。该微粒的分析结果示于表3中。

实施例17-含有PEG-胰岛素缀合物的单相微粒的制备和特征

如下制备含有PEG-胰岛素的单相微粒：将63mg PEG-胰岛素和 137mg PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基团；固有粘度0.61 L/g)溶解于2ml二氯甲烷中。通过使该油相与5ml 1％PVA涡流振荡3 分钟，形成初乳化液。通过真空蒸发2小时，随后在环境温度下搅拌1 小时完成有机溶剂的移除。通过过滤收集变硬的微粒，用水洗涤数次， 并在分析前于真空中干燥。该微粒的分析结果示于表3中。

实施例18-聚乙二醇化的胰岛素增加的药物装载量和包封效率

表3的数据显示聚乙二醇化的胰岛素可增加通过单相和双乳化方 法制备的PLGA微球中的药物装载量。聚乙二醇化的胰岛素还具有较 高的包封效率，当使用高生物活性肽和蛋白质时，这是一个主要的优 势。

表3、胰岛素和PEG-胰岛素微粒的特征         胰岛素       PEG-胰岛素  双乳化  单相   双乳化   单相  TL(％)a  1.64  10   1.64   31.5  CL(％)  0.23  0.6   0.54   15.5  EE(％)  13.86  6   33   49.2  PS(μm)  100-350  30-100   50-250   50-100

a理论装载量(活性物的重量/活性物和聚合物的总重量)

CL-核心装载量(在微粒中单独的活性物的重量百分比Wt％)

EE-包封效率(在制备过程中包封的活性物的％)

PS-平均粒径(从SEM估计)

实施例19-PLGA-包封的PEG-胰岛素的降血糖作用

将PEG-胰岛素PLGA微球和等剂量的游离胰岛素皮下给予正常 的大鼠。定时抽取血液并防止凝血。通过标准试验测量血液的葡萄糖 水平。如表4显示，与未修饰胰岛素所观察到的数据相比，使用在PLGA 微球中的PEG-胰岛素显著抑制血糖中最初的降低。另外，这些数据很 重要地显示PEG-胰岛素微球制剂以生物活性的形式释放其药物，在体 内动物模型中，能够有效地降低血糖水平，而没有未修饰的、常规制 剂的“爆发释放”作用。

表4、胰岛素和PEG-胰岛素微粒的体内研究  胰岛素(Humulin-U)        PEG-胰岛素 时间(小时)  ％BGLa  SD  ％BGLa  SD  0  100  0  100  0  1  25.8  6.6  111.1  16  2  14.9  11.4  86.5  17.6  4  68.1  11.6  97  13.3  6  89.3  7  98.5  12.1  8  75  1.7  82  6.8  12  75.8  8.2  88.8  6.6

a％BGL表示将所示的葡萄糖值标准化为基础水平的百分率

IV、传递GM-CSF的制剂的制备和特征

实施例20-聚乙二醇缀合的GM-CSF的制备

按如下方法将GM-CSF共价连接到聚乙二醇(PEG)上：在室温下， 将100mg GM-CSF溶解于10ml pH7.5的磷酸盐缓冲液中。然后加入 100mg tresyl-单甲氧基-聚乙二醇(MW＝5000道尔顿)，搅拌该混合物1 小时。通过凝胶色谱层析，将未反应的GM-CSF和聚乙二醇化的 GM-CSF部分从未反应的tresyl-单甲氧基-聚乙二醇分离出来。然后将 聚乙二醇化的GM-CSF透析到100mM Tris缓冲液中，并调节到50 mg/ml的浓度。

实施例21-包封的聚乙二醇化的GM-CSF的微粒制备

如下制备包封的聚乙二醇化的GM-CSF的微粒：将6.0g PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；固有粘度0.35 L/g)溶解于2ml乙酸乙酯 中。加入1ml实施例20的聚乙二醇化的GM-CSF，并用匀浆器以 10,000rpm快速搅拌，制成油包水乳化液。然后抽吸该聚合物/药物/ 乙酸乙酯乳化液通过一个静力搅拌器与泵出的含有1％聚乙烯醇(PVA) 的水流结合。该作用制成一种w/o/w乳化液，随后搅拌下，将其加入 到1升5C的水中。在2小时后，在一个25微米筛网上收集含有聚乙 二醇化的GM-CSF的变硬的PLGA微球，干燥。所产生的微球粒径范 围将在25-200μm之间。

实施例22-包封的聚乙二醇化的GM-CSF的纳米粒制备

如下制备包封的聚乙二醇化的GM-CSF的纳米粒：将3.0gm PLGA(与实施例21相同的材料)溶解于5ml二氯甲烷和5ml丙酮中。 加入0.5ml来自实施例20的聚乙二醇化的GM-CSF，并用匀化器以 10,000rpm搅拌该混合物。将该混合物加入到200ml含有5％PVA的 水中。然后以15,000rpm匀化该混合物，匀化时间要求能形成直径小 于1.0微米的纳米粒。通过真空移除有机溶剂，从水中回收纳米球， 干燥。

等价物

只是使用常规的实验方法，本领域的技术人员将能识别，或能够 确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等价物。以下权利要求 将囊括此类等价物。另外，此中引用的所有专利和出版物的全部内容 通过引用结合到本文中。

有关的申请

本申请要求2000年10月31日递交、标题为“提高生物活性分子 传递的方法和组合物”的美国临时申请序号60/244,499的优先权，该 申请的内容通过引用结合到本文中。