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蛋白质或肽的缓释给药组合物

阅读：500发布：2020-08-08

专利汇可以提供蛋白质或肽的缓释给药组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种新型的液体组合物，适用于原位形成药性持久的储库系统，以便以可控方式输送蛋白质或肽。本发明的组合物包括：(a)一种疏水非聚合载体材料；(b)溶解该疏水非聚合材料的水溶性的生物可相容的有机溶剂；(c)与一个或多个增强制剂性能的化合物共价结合的一种蛋白质或肽。本发明还提供一种制造和使用该组合物的方法。，下面是蛋白质或肽的缓释给药组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种蛋白质或肽的缓释组合物，包括：
(a)一疏水非聚合载体材料；
(b)一能与水混溶的药学上可接受的溶剂；和
(c)与一个或多个增强制剂性能的化合物共价结合的蛋白质或肽。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中疏水非聚合载体材料具有低结晶度和非极性性质。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中疏水非聚合载体材料是37℃下粘度为至少
5000cP的液体，其在环境温度或生理条件下不结晶。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中疏水非聚合载体材料包含一个或多个非聚合的酯或混合酯。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中疏水非聚合载体材料是由对具有至少20个羟基的多元醇用羧酸酯化而形成的。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中羧酸包括具有超过2个碳原子的有机酸，例如脂肪酸。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中疏水非聚合载体材料是乙酸异丁酸蔗糖酯(SAIB)。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中药学上可接受的溶剂在25℃下按重量算至少
1％能与水混溶。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中药学上可接受的溶剂选自如下组：苯甲醇、己内酰胺、己内酯、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、乳酸乙酯、甘油、甘油缩甲醛、糖原质(四甘醇)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、聚乙二醇、PEG-300、PEG-400、甲氧基聚乙二醇、mPEG-350、烷氧基聚乙二醇、碳酸丙烯酯、三醋精、柠檬酸三乙酯和上述的组合。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中蛋白质或肽选自如下组：催产素、加压素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、催乳激素、促黄体激素(luteinising hormone)、黄体生成素释放激素(LHRH)、LHRH激动剂、LHRH拮抗剂、生长激素(包括人类、猪和牛)、生长激素释放因子、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF-I、IGF-II)、红细胞生成素(包括带有红血球生成活性的所有蛋白质)、生长激素抑制素、胰高血糖素、白介素、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、胃泌激素、四肽胃泌素、五肽促胃酸激素、尿抑胃激素、肠促胰液素、降血钙素、脑啡肽、内啡肽、血管紧缩素、促甲状腺素释放激素(TRH)、肿瘤坏死因子(TNF)、甲状旁腺素(PTH)、神经生长因子(NGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞刺激因子(M-CSF)、肝素酶、血管内皮生长因子(VEG-F)、骨形成蛋白(BMP)、人心钠素(hANP)、胰高血糖素样肽(GLP-1、GLP2)、艾塞那肽(Exendin-3、Exendin-4等)、酪酪肽(PYY)、肾素、缓激肽、杆菌肽、多黏菌素、黏菌素、短杆菌酪肽，短杆菌肽、环孢菌素(包括其合成类似物及其药学活性片段)、酶类、细胞因子、抗体、疫苗、抗生素、糖蛋白、卵泡刺激素、京都啡肽(kyotorphin)、促吞噬激素(taftsin)、胸腺生成素、胸腺肽、胸腺刺激素(thymostimulin)、胸腺体液因子、血清胸腺因子、集落刺激因子、胃动素、蛙皮素、强啡肽(dinorphin)、神经降压肽、雨蛙肽、尿激酶、激肽释放酶、肽物质类似物和拮抗剂、血管紧张肽II、血液凝血因子VII和IX、溶菌酶，短杆菌肽(gramicidines)、黑素细胞刺激素、甲状腺激素释放激素、促甲状腺激素、肠促胰酶素、胆囊收缩素、人胎盘催乳素、促血小板生成素(TPO)、人绒毛膜促性腺激素、蛋白质合成促进因子、抑胃肽、血管活性肠肽、血小板源生长因子、及上述的合成类似物和改性物和药学活性片段以及上述的药学上可接受的盐。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中增强制剂性能的化合物是亲水的、亲油的或两亲性的。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中增强制剂性能的化合物是一小分子或一聚合物。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中增强制剂性能的化合物是任一水溶性的线性或支链的亲水聚合物。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中增强制剂性能的化合物选自如下组：聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、糖等。
15.根据权利要求11所述的组合物，其中增强制剂性能的化合物包含一亲油部分，该亲油部分选自组：C4-36烷基、C4-36链烯基、C4-36链二烯基、生育酚和甾族残基。
16.根据权利要求11所述的组合物，其中增强制剂性能的化合物是具有下列通式的两亲性分子：
L-S-(OC2H4)mOH (式1)
其中L是亲油性部分，优选为选自C4-36烷基、C4-36链烯基、C4-36链二烯基、生育酚和甾族残基，以及其中S是一连接，选自于如下组：酯基、酰胺基、仲或叔胺基、氨基甲酸酯基、磺酸酯基、硫酸酯基、磷酸酯基、膦酸酯基或者醚基，其中m的范围为1-1000。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中两亲性分子的亲油部分包括月桂酰
(laurly)、棕榈酰、硬脂酰、油烯基、二十酰和二十二酰。
18.根据权利要求1所述的组合物，其中蛋白质或肽与一个或多个包含(a)线性聚乙二醇部分和(b)亲油性部分的两亲性分子共价结合，其中蛋白质或肽、聚乙二醇和亲油性部分被构象配置以使亲油性部分在外部能与亲油环境或细胞膜相互作用。
19.根据权利要求1所述的组合物，其中结合物中蛋白质或肽与增强制剂性能的化合物的摩尔比率根据蛋白质或肽的性质而在1∶1至1∶10之间改变。
20.根据权利要求1所述的组合物，其中疏水非聚合载体材料是乙酸异丁酸蔗糖酯(SAIB)，其中药学上可接受溶剂是N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，其中肽或蛋白质与一两亲性分子结合。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中生物活性物质选自如下的组：奥曲肽或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。

说明书全文

蛋白质或肽的缓释给药组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及蛋白质或肽的缓释给药领域，以及用于对被疏水性非聚合载体材料共价改性和配置的蛋白质或肽缓释给药的组合物和方法，

背景技术

[0002] 已经公开了疏水性非聚合材料、特别是高粘非聚合液体材料用作生物可降解系统，用于生物活性化合物的可控释放给药(Smith和Tipton，Pharmaceutical Research，13(9)，S300，1996)。疏水性非聚合材料通常基本上不溶于水。疏水非聚合材料可以是一种高粘液体，其37℃下的粘度至少5000cP，并且在环境温度或生理条件下不结晶。当这样的材料与少量增塑溶剂混合时，混合物的粘度要比单独的非聚合液体材料的粘度要低得多。
这一低粘度溶液可以容易的与生物活性化合物一起配置，获得的低粘度液体制剂可以容易的对目标的身体给药以在原位形成高粘度的药性持久储库。

[0003] 美国专利5747058、5968542、6051558和6992065公开了包含疏水非聚合液体载体材料的原位形成储库系统的代表性例子。这些专利中描述的组合物包含例如为乙酸异丁酸蔗糖酯(SAIB)的疏水性高粘度非聚合液体材料、水溶性或能与水混溶的有机溶剂、以及一生物活性物质。这样的组合物可以容易的制备和以低粘度溶液的形式的形式给目标的身体给药。一旦进入身体，溶剂分散或扩散进入周围组织，这导致非聚合材料的析出或凝结，以形成封装有生物活性物质的高粘度凝胶、半固体或固体储库。接着通过储库的溶解、扩散和/或降解释放生物活性物质。

[0004] 然而，由于非聚合载体材料的疏水性质，许多生物活性试剂，特别是疏水性肽与带电荷和极性蛋白质，可能与非聚合载体材料不相容，导致不稳定的液体制剂。已经发现一组合物，包含疏水性非聚合液体材料、肽和有机溶剂，当其在环境温度放置短时间时，发生了相分离。此外，蛋白质或肽，由于他们的亲核性质，可能在有机溶剂的溶液/悬浮液中与非聚合载体材料相互影响或反应。

[0005] 互相影响/反应将导致非聚合载体材料的加速降解，还可能化学改变蛋白质或肽。载体材料与蛋白质或肽在制剂中的不稳定性导致了不能制备具有合理贮存期的合适组合物，以及妨碍了制剂通过给药形成稳定的储库以获得期望的释放性质。此外，突释是这类液体制剂的典型性质。不可控初始突释是不期望的，尤其是对于低治疗指数的蛋白质或肽。尽管公开了一些聚合添加剂用于调节这样的制剂的释放速率，获得的结果并不完全满意。

[0006] 因此，需要一种能解决这些问题的组合物，其可用于治疗有效量的蛋白质或肽在一段长时间内的缓释给药。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种新型的液体组合物，适合于原位形成药性持久的储库系统以用可控的持续方式传送蛋白质或肽。本发明的组合物包括：(a)一种疏水非聚合载体材料；(b)一种能与水混溶的生物可相容的有机溶剂，该有机溶剂溶解该疏水非聚合材料并显著降低组合物的粘度以便于制备和给药；和(c)与一个或多个增强制剂性能的化合物共价结合的一种蛋白质或肽。其中，非聚合材料基本上不溶于水，并且可以是一种高粘液体，其
37℃下的粘度至少5000cP，并且在环境温度或生理条件下不结晶。本发明的组合物还包括可选的一种添加剂，以获得期望的释放性质。本发明还提供一种制造和使用该组合物的方法。

[0008] 相应的，蛋白质或肽优选为与一增强制剂性能的化合物共价连接，该化合物能稳定该蛋白质或肽、提高与非聚合载体材料的相容性，并且改善蛋白或肽的释放曲线。一个合适的增强制剂性能的化合物可以是亲水的、亲油的或两亲性的。化合物可以是小分子或者聚合物。合适的增强制剂性能的化合物通过可降解或不可降解键与蛋白或肽连接。获得的结合物优选的保留未改性的蛋白质或肽的一些或所有的自然生物活性。

[0009] 接着结合蛋白质或肽被混合在或分散在疏水非聚合载体材料中。可选的，疏水性非聚合载体材料优选为与水溶性或能与水混溶的溶剂相混合，例如与N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)或者乙醇混合，以形成低粘度溶液。然后，这个低粘度溶液被用来溶解或悬浮结合蛋白质或肽，以形成一均匀溶液或均质悬浮液。通常的，包含未结合的蛋白质或肽或其例如为醋酸盐的简单盐的这样的制剂会发生快速相分离。然而，惊奇的发现本发明的蛋白质或肽与增强制剂性能的化合物的通过共价键的结合能防止相分离以保持制剂的物理稳定性。此外，通常的，未复合的蛋白或肽或其例如为醋酸盐的简单盐在配制过程和接下来的存储过程中易于化学降解。还发现本发明的蛋白质或肽与增强制剂性能的化合物的共价结合物能防止这样的化学降解或使其最小化。本发明的增强的化学和物理稳定性的组合物将允许人开发出一具有期望特性的和合理保质期的稳定产品。

[0010] 当本发明的液体组合物与水环境接触时，例如与患者的身体中的生物液体接触时，水溶性或能与水混溶的溶剂分散或扩散到周围的水或生物液体中。同时，不溶于水的非聚合载体材料析出或凝结，以形成高粘凝胶、半固体或固体储库，蛋白质或肽被圈闭或封装在其中。由于溶剂的快速扩散，通常在储库的形成过程中观察到蛋白质或肽的高初期突释。然而，出乎意料的发现蛋白质或肽与增强制剂性能的化合物的通过共价键的结合物显著的降低了突释，并且相对于包含未结合的蛋白或肽，改善了蛋白或肽的整体释放曲线。一旦储库形成，通过非聚合载体材料的溶解、扩散和/或降解从非聚合基体中释放蛋白或肽。

[0011] 根据本发明，组合物可选择的包括改进组合物的添加剂，以获得蛋白质或肽的期望释放曲线。添加剂包括但不限于突释效应降低材料、释放速率调节剂、pH调节剂、抗氧剂、增溶剂等。添加剂可以是聚合或非聚合材料，包括生物可降解的或非生物可降解的聚合物、碳水化合物或碳水化合物衍生物、有机或无机化合物。

[0012] 本发明的组合物可以是能使用注射器或类似装置给药的粘性或非粘性液体、或凝胶。组合物可以通过皮下注射、肌内注射、腹腔内注射或者皮内注射给药，以在原位形成储库。组合物还可以口服或局部给药。当对目标的身体给药时，蛋白质或肽的可控释放能根据组合物的构成持续一段期望的时间。通过适当的选择非聚合载体材料和其他赋形剂，蛋白质或肽的持续释放的时间可以被控制在从几天、到数周、到一年的时间段内。

[0013] 本发明的其他目标或特征在通过下文的详细描述再结合附图将变得清楚。可以理解的是，附图仅被设计用于阐述的目的，而非作本发明的限制性定义，用作所附权利要求书的参考。应该进一步被理解的是附图并不一定是按比例画的，除非指出，他们仅用来概念性的描述这方面的结构和步骤。

附图说明

[0014] 附图中：

[0015] 图1所示是制剂在室温下24h时拍的照片；

[0016] 图2所示是奥曲肽从包含(a)OCT-Ac和(b)PAL-PEG-BA-OCT的SAIB/NMP制剂中的体外释放曲线。

具体实施方式

[0017] 本发明关系到一惊奇的发现：用增强制剂性能的化合物对蛋白或肽的共价改性能够制备蛋白质或肽在疏水非聚合材料中的稳定制剂，防止或最小化在配制过程和接下来的存储过程中蛋白或肽的降解/反应，并且改善蛋白或肽的缓释曲线。该惊奇的发现导致开发了一种组合物，该组合物适合于原位形成一储库系统，以通过持续的可控方式输送蛋白质或肽。

[0018] 本发明提供了一组合物，包括：(a)一种疏水非聚合载体材料；(b)能与水混溶的药学上可接受的溶剂；(c)与一个或多个增强制剂性能的化合物共价结合的一蛋白质或肽。本发明的组合物可选的还包括一种添加剂，以获得期望的释放性质。本发明还提供一种制造和使用该组合物的方法。

[0019] 疏水的非聚合材料用作载体，以控制蛋白质或肽的缓释。对本领域技术人员而言有许多药学上可接受的非聚合材料用来制备合适的药物组合物，用于各种蛋白质或肽的缓释给药。与疏水的非聚合给药系统和制备相关的专利的代表性例子包括美国专利5736152、5888533、6120789、5968542、和5747058，这些专利的全部通过引用全部并入本文。

[0020] 合适的非聚合载体材料包括但不限于胆甾醇基酯，例如为胆甾醇硬脂酸酯；C16-C32一、二和三酸甘油酯，例如单油酸甘油酯、单亚油酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、单廿二烷酸甘油酯、单肉豆蔻酸甘油酯、甘油单癸烯酸酯(glyceryl monodicenoate)、甘油二棕榈酸酯、双廿二烷酸甘油酯、甘油二肉豆蔻酸酯、甘油二癸烯酸酯(glyceryl didecenoate)、甘油三廿二烷酸酯、甘油三豆蔻酸酯、甘油三癸烯酸酯(glyceryl tridecenoate)、甘油三硬脂酸酯及上述的混合物；蔗糖脂肪酸酯，例如为蔗糖二硬脂酸酯和蔗糖棕榈酸酯；山梨醇酐脂肪酸酯，例如为山梨醇酐单硬脂酸酯、山梨醇酐单棕榈酸酯和山梨醇酐三硬脂酸酯；脂肪醇和脂肪酸的酯，例如为十六烷酸鲸蜡醇酯和鲸蜡硬脂醇棕榈酸酯；磷脂质，包括卵磷脂(lecithin)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和上述的溶源性衍生物；鞘氨醇及其衍生物；神经髓鞘磷脂，例如为硬脂酰、棕榈酰和二十三醇神经髓鞘磷脂(tricosanyl spingomyelins)；神经酰胺，例如为硬脂酰和棕榈酰神经酰胺；
鞘糖脂；和上述的结合和混合物。

[0021] 优选的非聚合载体材料为那些具有低结晶度、非极性并且疏水的材料。更优选的，非聚合载体材料是粘性液体。非聚合液体材料优选为疏水的、基本不溶于水的、其37℃下的粘度至少5000cP，并且在环境温度或生理条件下不结晶。这里所用的，术语“疏水或不溶于水”指的是材料25℃在水中的溶解度小于其重量的百分之一。术语“非聚合”指的是酯或混合酯，用于形成酯的酸的部分中基本上没有重复单元。用于形成酯或混合酯的酸部分可以包括少量的重复单元(即，低聚物)，例如二聚物、三聚物、四聚物和五聚物。通常，酸部分的重复单元应该小于5。

[0022] 特别的，疏水非聚合载体材料可以是一个或多个非聚合酯或混合酯。代表性的酯由少于20个羟基基团的多元醇形成，该多元醇被羧酸酯化。合适的多元醇包括2-24个碳原子的单官能的和多官能的醇、糖醇、单糖、二糖、寡糖和聚醚醇。更特别的，多醇可以是十二烷醇、己二醇、丙三醇、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、肌糖、聚甘油、聚乙二醇、聚丙二醇、聚(乙烯-co-丙烯)乙二醇、聚乙烯醇等。

[0023] 用于形成疏水非聚合载体材料的羧酸包括具有超过两个碳原子的有机酸，例如脂肪酸。这些羧酸可以是饱和的、不饱和的、芳香族的(芳基或芳烷基)和线性的或支链结构。这些羧酸还可以具有一个或多个羟基基团或其他基团，例如环、硝基等。更特别的，这些羧酸包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、硫辛酸、己酸、庚酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、苯甲酸、乙醇酸、乳酸、D-羟基己酸、辛酸、癸酸、正十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸(hexadecanoic acid)、十八烷酸(octadecanoic acid)、花生酸(eicosanoic acid)、廿二烷酸和其他脂肪酸。

[0024] 疏水的非聚合载体材料优选为具有不产生任何非生物可相容性或有毒代谢物的生物可降解性。当疏水非聚合载体材料与可与水混溶的溶剂混合时，能够获得具有显著较低粘性的溶液。低粘度溶液可以容易的与蛋白或肽一起用于制备本发明的组合物。低粘度还使得组合物能容易的施加到目标的身体。疏水非聚合载体材料与溶剂的比率可以很容易的调节，以获得期望的粘度。

[0025] 在一优选的实施方式中，乙酸异丁酸蔗糖酯(SAIB)用作疏水的非聚合载体材料。SAIB是用两醋酸和六异丁酸基团对蔗糖酯化的混合酯。该酯是完全非结晶的，并且其粘度在30℃下超过100000cP。酯的粘度可以通过轻微升高温度或添加溶剂而显著降低。SAIB可以在商业上从伊士曼化学公司(Eastman Chemical Company，USA)获得，可以根据美国专利2931802描述的步骤进行合成。在一实施方式中，SAIB可以被加热并与共价结合有至少一个增强制剂性能的化合物的蛋白质或肽混合，以制备一悬浮液。可选择的，SAIB可以混有大量的生物可相容的溶剂，以获得低粘度溶液，该溶液可以很容易的与蛋白或肽一起进行配制，以获得可注射溶液或悬浮液。

[0026] 在本发明的组合物中可供选用的合适溶剂为生物可相容的且水溶性的或能与水混溶分散的。溶剂在25℃时在水中的溶解度至少为1％、优选为至少3％、更优选的为至少7％的重量。当与疏水非聚合载体材料联用时，与非聚合载体材料单独使用相比，溶剂能显著降低混合物的粘度。这样的较低粘度液体组合物可以进一步的与蛋白质或肽一起配制，以用于缓释给药。合适溶剂的非限制性例子包括丙酮、苯甲醇、丁烯二醇、己内酰胺、己内酯、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、甘油、甘油缩甲醛、糖原质(四甘醇)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、聚乙二醇、PEG-300、PEG-400、甲氧基聚乙二醇、mPEG-350、烷氧基聚乙二醇、碳酸丙烯酯、2-吡咯烷酮、三醋精、柠檬酸三乙酯和上述的组合。

[0027] 这里所使用的，肽是由α氨基酸按照确定顺序连接形成的短聚合物。在一个氨基酸残基及下一个氨基酸残基之间的链接已知是酰胺键或肽键。蛋白质是多肽分子(或者由多个多肽子单元构成)。区别在于肽短而多肽/蛋白质长。这里所使用的肽、多肽和蛋白质是可交换使用的，并且代表的是相同类型的分子。

[0028] 本发明的合适的生物活性蛋白质或肽包括具有至少一个官能团的任一蛋白质或肽，该官能团能被共价改性并保留一部分或全部的他们的生物活性。本发明的蛋白质或肽包括但不限于催产素、加压素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、催乳激素、促黄体激素(luteinising hormone)、黄体生成素释放激素(LHRH)、LHRH激动剂、LHRH拮抗剂、生长激素(包括人类、猪和牛)、生长激素释放因子、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF-I、IGF-II)、红细胞生成素(包括带有红血球生成活性的所有蛋白质)、生长激素抑制素、胰高血糖素、白介素、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、胃泌激素、四肽胃泌素、五肽促胃酸激素、尿抑胃激素、肠促胰液素、降血钙素、脑啡肽、内啡肽、血管紧缩素、促甲状腺素释放激素(TRH)、肿瘤坏死因子(TNF)、甲状旁腺素(PTH)、神经生长因子(NGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞刺激因子(M-CSF)、肝素酶、血管内皮生长因子(VEG-F)、骨形成蛋白(BMP)、人心钠素(hANP)、胰高血糖素样肽(GLP-1、GLP-2)、艾塞那肽(Exendin-3、Exendin-4等)、酪酪肽(PYY)、肾素、缓激肽、杆菌肽、多黏菌素、黏菌素、短杆菌酪肽，短杆菌肽、环孢菌素(其中包括合成类似物及其药学活性片段)、酶类、细胞因子、抗体、疫苗、抗生素、糖蛋白、卵泡刺激素、京都啡肽(kyotorphin)、促吞噬激素(taftsin)、胸腺生成素、胸腺肽、胸腺刺激素(thymostimulin)、胸腺体液因子、血清胸腺因子、集落刺激因子、胃动素、蛙皮素、强啡肽(dinorphin)、神经降压肽、雨蛙肽、尿激酶、激肽释放酶、肽物质类似物和拮抗剂、血管紧张肽II、血液凝血因子VII和IX、溶菌酶，短杆菌肽(gramicidines)、黑素细胞刺激素、甲状腺激素释放激素、促甲状腺激素、肠促胰酶素、胆囊收缩素、人胎盘催乳素、促血小板生成素(TPO)、人绒毛膜促性腺激素、蛋白质合成促进因子、抑胃肽、血管活性肠肽、血小板源生长因子、及上述的合成类似物和改性物和药学活性片段。

[0029] 在一优选的方面，蛋白质或多肽与一增强制剂性能化合物共价连接。共价连接的蛋白或肽保留部分或全部生物活性，并增强了母剂(parent agent)的制剂性能。本文中所使用的“增强制剂性能的化合物”是能与蛋白或肽共价结合、并且获得的结合物基本上保留了蛋白或肽的至少部分生物活性的化合物。结合蛋白或肽更易于与非聚合载体材料一起配制，获得的制剂与使用非结合蛋白或肽获得的制剂相比更均一和稳定。结合物增强了物理-化学稳定性，改善了蛋白或酶从包含了疏水非聚合载体材料的给药系统中的释放曲线。蛋白质或酶的共价改性还可导致延长体内储库半衰期，降低抗原性和免疫原性，抗蛋白水解，提高生物利用度，以及降低毒性。

[0030] 本文中所使用的，术语“增强制剂性能的化合物”指的是在共价结合后能改善蛋白或肽在本发明的非聚合载体材料中的制剂性能的任意分子。化合物可以是亲水性的、亲油性的或两亲性的。化合物可以是小分子或者一聚合物。用于增强制剂性能的化合物的标准是指在共价改性后能保留蛋白或肽的部分或全部生物活性，并在与本发明的非聚合载体材料一起配制后改善性能特性。本发明的增强制剂性能的化合物与蛋白或肽的结合物保留至少10％的蛋白或肽的原始生物活性，优选的至少25％的蛋白或肽的原始生物活性，更优选的至少50％蛋白或肽的原始生物活性。本发明的增强制剂性能的化合物与蛋白或肽的结合物改善了制剂的物理和化学稳定性，同时减少了初始突释。

[0031] 在一优选的实施方式中，增强制剂性能的化合物指的是任一亲水聚合物。亲水聚合物是水溶性的，并且可以是线性的或支链聚合物。非限制性的代表性例子包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、糖等。优选的，聚合物的分子量为大约200道尔顿至大约50000道尔顿的范围内。用在本发明中的亲水聚合物通常具有至少一活性基团，其能用于通过氨基、羧基、巯基、磷酸酯或羟基官能团与目标蛋白质或肽共价连接。现有技术中公开了连接和聚乙二醇化的各种方法(美国专利4,179,337；5,446,090；
5,880,255；和 6,113,906；M.J.Roberts，M.D.Bentley 和 J.M.Harris，Chemistry for peptide and protein PEGylation，Advanced Drug Delivery Reviews，2002，54(4)，
459-476.F.M.Veronese，Peptide and protein PEGylation：a review of problems and solutions，Biomaterials，2001，22，405-417)。这里所引的这些专利、文献和参考资料的全部内容通过引用的方式全部并入本文。

[0032] 在另一优选的实施方式中，增强制剂性能的化合物是一疏水性或亲油性分子。典型的，亲油性分子在20℃下在水中的溶解度小于1％重量百分比。合适的亲油性增强制剂性能的化合物优选为选自于C4-36烷基、C4-36链烯基、C4-36链二烯基、生育酚和甾族残基。术语“C4-36烷基”、“C4-36链烯基”“C4-36链二烯基”的目的是覆盖4-36个碳原子的直链和支链，优选为直链，饱和的、一元不饱和的和二元不饱和的烃。优选的，亲油性分子具有与细胞膜的高亲和力，且能与血浆蛋白例如白蛋白相互作用，以与未改性的蛋白或肽相比延长改性蛋白或肽的体内半衰期。更特别的，亲油性增强制剂性能的化合物是具有至少4个碳原子的饱和的或不饱和烃基或羧基酰基。羧基酰基可以是己酰基、月桂酰(laurly)、棕榈酰、硬脂酰、油烯基、二十酰和二十二酰。烃基可以是己基、十二烷基和十八基。

[0033] 在另一优选的实施方式中，增强制剂性能的化合物包括任一两亲性分子。术语“两亲性”指的是具有亲水性和亲油性特性且可溶于水和油性溶剂的任一分子。本发明中所使用的两亲性分子包括亲水性和亲油性部分。亲油性部分优选为上述的天然脂肪酸或烷基链。亲水部分选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、糖等。亲水性部分优选为具有少于1000乙二醇单元的聚乙二醇(PEG)。可以调节亲油部分和亲水部分的大小和组成，以获得期望的两亲性。

[0034] 增强制剂性能的化合物与蛋白或肽的共价结合物与天然蛋白质或肽相比可以提高治疗效果。结合通常可以通过官能团的反应来完成，例如生物活性分子中的胺与增强制剂性能的化合物中的酸或其他反应基团之间的反应。可选的，蛋白质或肽与增强制剂性能的化合物之间的结合是通过可降解的或不可降解的额外的部分完成的，例如桥、间隔段或键合部分。现有技术中已经公开了代表性的例子(例如，日本专利申请1,254,699；美国专利5,693,609；WO95/07931；美国专利5,750,497；和WO96/29342。还参见Hashimoto，M.等，Pharmaceutical Research，6：171-176(1989)，和Lindsay，D.G.等，Biochemical J.，121：737-745(1971))。酰化肽的更多例子可以在WO98/08871、WO98/08872、WO99/43708中找到。
这里所引的这些专利、文献和参考资料的全部内容通过引用的方式全部并入本文。

[0035] 在本发明的一个实施方式中，棕榈酸被N-羟基丁二酰亚胺活化，接着与奥曲肽，一个八肽，上的胺基团反应，以通过棕榈基亲油性部分和肽之间的酰胺键形成一结合物。奥曲肽上有两个伯胺基。通过控制反应条件接着通过分离，两个胺基能同时结合或仅一个胺基可选择性的结合。

[0036] 在另一实施方式中，癸酸，一个具有醛基的亲油性化合物，与奥曲肽上的胺基反应，以通过仲胺连接形成一结合物。通过控制反应条件接着通过分离，两个胺基能同时结合或仅一个胺基结合。

[0037] 在另一实施方式中，棕榈酸通过六个胺基以不同的比率与溶菌酶进行结合。当棕榈酸与溶菌酶的比率小于6时，溶菌酶上的结合位置是随机的，取决于每个胺基的活性。

[0038] 根据本发明，亲油性部分可以先与一亲水部分共价连接以形成一两亲性分子。本发明的两亲性分子可以具有一个或多个合适的官能团，或者被改性成具有一个或多个合适的官能团，以与一肽或蛋白质进行共价连接。合适的官能团选自羟基、胺基(伯胺基或仲胺基)、硫醇基、羧基、醛基、异氰酸基(isocynato group)、磺酸基、硫酸基、磷酸基、膦酸基、烯丙卤基、苄基卤基、取代苄基卤基和环氧乙基(oxiranyl)。

[0039] 通过酯基、酰胺基、仲胺基或叔胺基、氨基甲酸酯基、磺酸酯基、硫酸酯基、磷酸酯基、膦酸酯基或乙醚基团，一蛋白质或肽可以直接或间接与一个或多个两亲性部分连接。

[0040] 优选的，蛋白质或肽与一个或多个包含(a)亲水性部分和(b)亲油性部分的两亲性分子共价结合，其中两亲性分子的平衡的亲水性和亲油性特性给予了结合物在生物液体或水性溶液中合适的溶解度。

[0041] 更优选的，蛋白质或肽与一个或多个包含(a)线性聚乙二醇部分和(b)亲油性部分的两亲性分子共价结合，其中蛋白质或肽、聚乙二醇和亲油性部分被构象配置以使亲油性部分外部能与亲油环境或细胞膜相互作用。这样的两亲性改性蛋白或肽相对于未结合的蛋白或肽，具有增强的抗在体外和体内与非聚合载体材料反应的耐化学性。

[0042] 优选的，两亲性分子具有下列通式：

[0043] L-S-(OC2H4)mOH (式1)

[0044] 其中L是亲油性部分，优选为选自C4-36烷基、C4-36链烯基、C4-36链二烯基、生育酚和甾族残基，以及其中S是一连接，选自下列组：酯基、酰胺基、仲胺基或叔胺基、氨基甲酸酯基、磺酸酯基、硫酸酯基、磷酸酯基、膦酸酯基或其它基团，以及其中m的范围为1-1000。聚乙二醇(PEG)-油性结合物，例如为1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(羧基(聚乙二醇))、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(马来酰亚胺(聚乙二醇))、
1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(PDP(聚乙二醇))、1，2，-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(胺基(聚乙二醇))等，也可以与蛋白质或肽结合。

[0045] 在一具体实施方式中，16个碳原子的烷基通过醚键与聚乙二醇分子共价结合。获得的两亲性分子具有一个羟基，其能被活化或衍生化以与蛋白质或肽上的合适的官能团反应。在本发明的一个具体实施方式中，两亲性分子被衍生化以具有一个醛端基。接着该两亲性分子通过与奥曲肽上的胺基反应，接着用NaCNBH3还原，从而与奥曲肽共价结合。通过控制反应条件接着通过分离，奥曲肽上的两个胺基能同时被结合或仅一个胺基可选择性的被结合。通过仲胺形成的结合物并不改变未结合奥曲肽的电荷特性。这一性质有利于保留蛋白质或肽的活性。

[0046] 在另一实施方式中，两亲性分子单棕榈酰聚乙二醇酯(monopalmitylpoly(ethylene glycol))(Mn-1124)被4-硝基酚氯甲酸酯活化。然后两亲性分子通过与奥曲肽上的胺基反应而与奥曲肽共价结合。通过控制反应条件接着通过分离，奥曲肽上的两个胺基能同时被结合或仅一个胺基可选择性的被结合。

[0047] 根据本发明，用一个或多个增强制剂性能的化合物共价改性的蛋白质或肽包括，例如，改性蛋白或肽的药学上可接受的盐和复合物。改性可以在蛋白质或肽的一个或多个位置上进行。这样的蛋白质或肽还包括，例如，特定位置改性蛋白质或肽以及单位置改性和多位置改性蛋白质或肽的混合物。

[0048] “药学上可接受的盐”指的是蛋白质或肽上的一个或多个带电基团与一个或多个药学上可接受的无毒性的阳离子或阴离子形成的盐。有机和无机盐包括，例如，从酸制备的盐，酸例如为盐酸、硫酸、磺酸、酒石酸、富马酸、氢溴酸、乙醇酸、柠檬酸、马来酸、磷酸、琥珀酸、醋酸、硝酸、苯甲酸、抗坏血酸、p-甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸、丙酸、碳酸等，或例如铵盐、钠盐、钾盐、钙盐、或镁盐。

[0049] 根据本发明，组合物可选的包括改进组合物的添加剂，以获得蛋白质或肽的期望释放曲线。可以包括添加剂以调节释放速度和稳定蛋白质或肽。合适的添加剂可以是任一聚合的或非聚合材料，包括生物可降解的或非生物可降解的聚合物、碳水化合物或碳水化合物衍生物、有机或无机化合物。添加剂可以用作例如抗氧化剂、pH稳定剂、抗刺激剂、分散剂、膨胀剂、粘结剂等。

[0050] 美国专利5,747,058描述了一些合适的添加剂，该专利的全部内容通过引用被并入本文。优选的，合适的添加剂是生物可相容的和/或生物可降解的聚合物。这样的聚合物包括但不限于聚乳酸、聚乙醇酸交酯、聚己内酯、聚酸酐、聚胺、聚氨酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚二恶烷酮(polydioxanones)、聚缩醛、聚维酮(polyketals)、聚碳酸酯、聚磷酸酯(polyphosphoesters)、聚氧杂酯(polyoxaesters)、聚原碳酸酯(polyorthocarbonates)、聚磷腈、琥珀酸酯(succinates)、聚苹果酸、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚氧化纤维素(polyhydroxycellulose)、甲壳素、壳聚糖、透明质酸和上述的共聚物、三元共聚物和混合物。

[0051] 根据本发明，组合物可选的包括还原剂、抗氧化剂和自由基清除剂以稳定组合物。例子有，但不限于，半胱氨酸或者蛋氨酸、d-α生育酚醋酸酯、消旋α维生素E、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚(butylated hydroxyanidole)，叔丁基羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole)，丁基羟基醌(butylatedhydroxyquinone)，羟基茴香二丁酯(butylhydroxyanisol)，羟基香豆素(hydroxycomarin)，二丁基羟基甲苯，脑磷脂(cephalm)，没食子酸乙酯，没食子酸丙酯，没食子酸辛酯，没食子酸月桂酯，羟苯丙酯(propylhydroxybenzoate)，三羟基丁酰苯(trihydroxybutyrophenone)，二甲基苯酚，二叔丁基苯酚(ditertbutylphenol)，维生素E和卵磷脂。

[0052] 因此，本发明的组合物包括一疏水的非聚合载体材料、一可选的药学上可接受的有机溶剂、一与增强制剂性能的化合物共价结合的蛋白或肽、以及可选的一添加剂。

[0053] 当被植入时，本发明的组合物提供了一粘性凝胶或者固体储库，用于蛋白或肽的可控缓释。可控释放可以持续需要的一段时间，其取决于组合物的构成。正确选择非聚合载体材料以及其他组分，缓释的时间可以被控制在期望的时间，从几天到数月。

[0054] 在本发明的组合物的制备和给药的优选方法中，用一增强制剂性能的化合物对蛋白质或肽进行共价改性。根据蛋白质或肽的性质，结合物中蛋白质或肽与增强制剂性能的化合物的摩尔比率是可变的，例如，从1∶1至1∶10。共价结合的蛋白质或肽可以与疏水的非聚合载体材料以及一可选的药学上可接受的溶剂和其他可选添加剂合并在一起作为一个具有合适保质期的单相制剂。

[0055] 在本发明的另一个优选的制备中，共价结合蛋白和组合物的其它组分分别放在不同的容器内(即，注射器)。在对目标的身体的植入位置给药之前，容器内的物质可以与组合物的其它组分一起直接混合。

[0056] 根据本发明，组合物优选是一均匀溶液或均质悬浮液。给药前保持制剂的均一性是获得一致的储库系统以便生物活性物质可控缓释的关键，实际上，制剂的均一性必须被保持至少一个小时，以便允许制剂的可重复制备，和原位形成储库系统。本文中所使用的均一性可以通过用5ml的玻璃试管测量制剂的顶部和底部的蛋白质或肽的比率或分布来确定。如果比率等于1.0，则制剂具有完美的均一性。如果比率小于1.0，表明发生了相分离。优选的，组合物保持0.9的均一性至少一小时，更优选的，组合物保持0.9的均一性至少24小时，最优选的，组合物保持0.9的均一性至少7天。

[0057] 根据本发明，组合物包含相对于组合物的总重的大约10％至大约99.5％的疏水非聚合材料，优选的在25％至95％之间。组合物还包括大约0％至大约50％的药学上可接受溶剂，大约0.1％-大约40％的蛋白质或肽。组合物还包括大约1％至大约25％的添加剂。

[0058] 在一优选的实施方式中，乙酸异丁酸蔗糖酯(SAIB)用作疏水的非聚合载体材料，选用NMP作为溶剂。肽或蛋白质选自如下的组：奥曲肽或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。蛋白质或肽优选与一两亲性分子结合。获得的结合物可以与SAIB/NMP溶液一起形成缓释制剂。

[0059] 根据本发明，本文中所描述的组合物可以对需要蛋白质或肽的缓释给药的目标的身体给药。本文中所使用的，术语“目标”的目的是包括温血动物，优选哺乳动物，最优选人类。

[0060] 本文中所使用的，术语“给药”指的是对一目标通过合适的途径分配、分发或涂敷一组合物(即，药物制剂)以便输送该组合物至目标的期望位置。通常可以通过皮下注射、肌内注射、腹腔内注射或皮内注射以及通过口腔、直肠、阴道或者鼻对目标施加一组合物，以基于已知参数提供期望剂量的蛋白质或肽，用于使用蛋白质或肽治疗各种疾病。

[0061] 本文中所使用的术语“可控缓释给药”包括，例如，在给药后，体内蛋白质或肽的持续输送一段时间，优选的至少几天到几周或几月。蛋白质或肽的可控缓释给药可以被证明，例如通过药剂一段时间的持续治疗效果(例如，对于奥曲肽，肽的缓释给药可以通过一段时间的持续的IGF-1抑制来证明)。可选择的，奥曲肽的缓释给药可以通过检测一段时间内肽在体内的存在来证明。

[0062] 在这一应用中，权利要求中对于即成液体药物组合物的各种具体实施方式还可以想象在细节上做必要的修改用于形成这样的组合物的即成方法以及用于形成埋植剂的即成方法。

[0063] 实施例：

[0064] 下列实施例阐述了本发明的组合物和方法，且不以任何方式限制本发明。下列实施例仅意图解释如何根据本发明制备可用的药物输送系统的教导。

[0065] 实施例1.棕榈酰-奥曲肽(PAL-OCT)的制备

[0066] 将50mg的奥曲肽乙酸酯溶解在1ml的包含100μl三乙胺(TEA)的无水二甲基亚砜(DMSO)中。将40.2mg的棕榈酸N-羟基丁二酰亚胺酯(Mw353.50)溶解在3ml无水DMSO中，然后加入到肽溶液中。反应在室温下进行3小时。将混合物倒入二乙醚中以沉淀棕榈酰化的奥曲肽。用二乙醚清洗沉淀两次，然后在真空下干燥。获得的酰化肽为白色粉末。

[0067] 实施例2.棕榈酰-奥曲肽(PAL-OCT)的制备

[0068] 将50mg的奥曲肽乙酸酯溶解在1000μl的包含100μl三乙胺(TEA)的无水二甲基亚砜(DMSO)中。将17.1mg的棕榈酸N-羟基丁二酰亚胺酯(Mw353.50)溶解在3ml无水DMSO中，然后通过直接注入添加到肽溶液中。反应在室温下进行一夜。将混合物倒入二乙醚中以沉淀棕榈酰化的奥曲肽。用二乙醚清洗沉淀两次，然后在真空下干燥。获得的酰化肽为白色粉末。

[0069] 实施例3.癸醛-奥曲肽(DCL-OCT)的制备

[0070] 将50mg的奥曲肽溶解在2ml的20mM硼氢钠(Mw62.84，NaCNBH3)(2.51mg)在pH为5的0.1M醋酸盐缓冲溶液中。将13.7mg的癸醛(Mw156.27)(OCT∶DCL＝1∶2)通过直接注入加入到肽溶液中。反应在4℃下进行一夜。通过离心分离混合物。冷冻干燥沉淀的DCL-OCT。

[0071] 实施例4.棕榈酰-溶菌酶(PAL-Lyz，3∶1)的制备

[0072] 将302mg的溶菌酶(Mw14,500)溶解在1000μl的包含200μl TEA的无水DMSO中。将18.25mg的棕榈酸N-羟基丁二酰亚胺酯(Mw353.50)溶解在3ml无水DMSO中，然后通过直接注入添加到蛋白质溶液中。反应在室温下进行一夜。在二乙醚中沉淀PAL-Lyz，移除有机溶剂后，冷冻干燥最终产物。

[0073] 实施例6.棕榈酰-溶菌酶(PAL-Lyz，5∶1)的制备

[0074] 将50mg的溶菌酶(Mw14,500)溶解在水中，调节pH到9.58。冷冻干燥溶液。接着将干燥粉末溶解在3mlDMSO中。然后将322μl的20mg/ml棕榈酸N-羟基丁二酰亚胺酯(Mw353.50)在无水DMSO的溶液通过直接注入添加到蛋白质溶液中。反应在4℃下进行一夜。在二乙醚中沉淀PAL-Lyz，移除有机溶剂后，冷冻干燥最终产物。

[0075] 实施例7.棕榈酰-溶菌酶(PAL-Lyz，13∶1)的制备

[0076] 将50mg的溶菌酶(Mw14,500)溶解在水中，调节pH到9.58。冷冻干燥溶液。接着将干燥粉末溶解在3mlDMSO中。然后将799μl的20mg/ml棕榈酸N-羟基丁二酰亚胺酯(Mw353.50)在无水DMSO的溶液通过直接注入添加到蛋白质溶液中。反应在4℃下进行一夜。在二乙醚中沉淀PAL-Lyz，移除有机溶剂后，冷冻干燥最终产物。

[0077] 实施例8.棕榈酰-溶菌酶(PAL-Lyz)的制备

[0078] 将溶菌酶添加到PAL-NHS在包含2％脱氧胆酸盐(DOC)的PBS(pH8.0)的溶液中。混合物在37℃下培养6小时。离心分离混合物以移除未反应的PAL-NHS。产物用包含0.15％DOC的PBS透析48小时(PAL-NHS∶溶菌酶＝15∶1)

[0079] 实施例9.单棕榈酰聚乙二醇酯-丁醛、二乙缩醛的制备

[0080] 将单棕榈酰聚乙二醇酯(平均Mn～1124)(5.0g，4.45mmol)与甲苯(75ml)的混合物通过减压蒸馏出甲苯而进行共沸干燥。将干燥的单棕榈酰聚乙二醇酯溶解在无水甲苯(50ml)中，无水甲苯中已添加了20％(w/w)叔丁醇钾在THF(4.0ml，6.6mmol)和4-氯丁醛二乙缩醛(0.96g，5.3mmol，Mw180.67)的溶液。在氩气氛围下在100-105℃下搅拌混合物一夜。冷却至室温后，过滤混合物，并在0-5℃下添加到150ml乙醚中。过滤出沉淀产物，并减压干燥。

[0081] 实施例10.奥曲肽在N-端胺基位置与单棕榈酰聚乙二醇的结合物(PAL-PEG-BA-OCT)

[0082] 在一代表性的制备中，201.6mg的单棕榈酰聚乙二醇酯-丁醛二乙缩醛(PAL-PEG-BADA)溶解在10ml的0.1M的磷酸(pH2.1)中，加热获得的溶液至50℃1小时，然后冷却至室温。用1N的NaOH调节溶液pH至5.5，将获得的溶液添加到195.3mg的奥曲肽在3.5ml的0.1M磷酸钠缓冲液(pH5.5)的溶液中。1小时后，添加18.9mg的NaCNBH3至浓度20mM。反应在室温下继续一夜。接着反应混合物用MW截至值为2000道尔顿的膜透析，或者加载到带有C-18柱的制备型HPLC中。纯化的结合奥曲肽主要是带有一伯胺(赖氨酸)和一仲胺(N端)的单一化合物。

[0083] 实施例11.包含奥曲肽的制剂的制备和体外性质

[0084] 奥曲肽醋酸酯(OCT-Ac)和奥曲肽结合物(PAL-PEG-BA-OCT)粉末溶解在NMP中。接着将包含奥曲肽的不同形式的溶液与NMP(90％w/w)中的SAIB溶液完全混合。如表1所示所有制剂中奥曲肽的含量大约6％。

[0085] 表1.包含奥曲肽的制剂

[0086]

[0087] 上述制备的制剂保持在室温下(～22℃)。在预先确定的时间点，记录制剂的外观，收集小份的上层液体和底部组合物并用HPLC分析奥曲肽含量。通过直接观察确定制剂的物理稳定性，或使用奥曲肽子上层液体和底层组合物中的含量的比率来确定制剂的物理稳定性。如果比率等于1.0，则制剂是均一的和稳定的。如果比率小于1.0，表明发生了相分离。

[0088] 当OCT-Ac与SAIB/NMP溶液一起时，立即发生相分离。观察到厚的固体沉淀，获得不均匀的制剂。厚聚集物沉淀下来，随着时间在底部形成一黄色粘相。这一不均一的制剂将阻塞针头，不适用于注射。当PAL-PEG-BA-OCT与SAIB/KMP溶液一起时，获得清澈溶液，适用于注射。

[0089] 图1所示是制剂在室温下24小时后拍取的照片。包含OCT-Ac的制剂发生了明显的相分离，但是包含PAL-PEG-BA-OCT的没有。如表2所示，两天后底部相的奥曲肽的浓度是上部相中奥曲肽浓度的20倍。5天后，比率降低至小于0.03。令人惊奇的，在包含PAL-PEG-BA-OCT的制剂中没有观察到相分离。此外，在包含OCT-Ac的制剂的底部相中观察到稍微更多的NMP。

[0090] 表2：在室温下两天后奥曲肽和NMP在上部相中与在底部相中的比率

[0091]制剂 OCT比率 NMP比率

[0092]

[0093] 此外，发现奥曲肽在包含OCT-Ac的制剂中不稳定。如表3所示，当组分混合时，立即产生了奥曲肽的不纯物。两个小时后，大约4％的奥曲肽降解或反应。7天后，超过半数的上层相中的奥曲肽以及超过20％的底部相中的奥曲肽被降解，表明系统不适用于肽的缓释给药。然而，出乎意料的发现，从包含PAL-PEG-BA-OCT的制剂中检测到很少或没有奥曲肽的降解，即使是室温下三个月后(表3)。在包含PAL-PEG-BA-OCT的制剂中没有观察到相分离。

[0094] 表3：室温下一段时间内制剂中奥曲肽的纯度

[0095]时间(天) OCT-Ac/SAIB/NMP PAL-PEG-BA-OCT/SAIB/NMP
0.08 96.1 100
1 90.8 99.9
2 71.9 ND
5 48.7 ND
7 41.0 99.8
112 33.9 100

[0096] 实施例12.不同制剂的奥曲肽的体外释放

[0097] 通过将奥曲肽乙酸酯(OCT-Ac)和奥曲肽结合物(PAL-PEG-BA-OCT)粉末和NMP中的SAIB溶液(90％w/w)混合制备制剂。如表4所示的每个制剂中奥曲肽的含量大约6％。

[0098] 表4 包含奥曲肽的制剂

[0099]

[0100] 由于包含OCT-Ac的制剂的物理不稳定性，在试剂制备后立即进行体外释放试验。使用一小份悬浮液进行体外释放。在一4ml的玻璃瓶中，将包含奥曲肽的每个制剂大约
0.1ml注入3ml释放缓冲液(PBS7.4，包含0.1％叠氮化钠)中。将瓶子在37℃下培养，在不同时间点取样。在每个时间点，移除2ml的释放介质，加入2ml的新释放介质。通过HPLC使用一YMC-PackODS-120A柱分析收集样品的肽浓度和完整性。每个制剂使用三份样品。

[0101] 如图2所示，包含OCT-Ac的制剂的OCT的释放显示出高的初始突释。超过60％的奥曲肽在24小时内被释放，超过90％的奥曲肽在两周后被释放。然而，令人惊奇的，从包含PAL-PEG-BA-OCT的制剂中的OCT的释放并不显示出许多初始突释。小于5％的奥曲肽在24小时内从包含PAL-PEG-BA-OCT的制剂中释放，接着是一段时间内的渐进释放。

[0102] 实施例13.聚乙二醇结合GM-CSF的制备

[0103] GM-CSF可以根据如下步骤与聚乙二醇(PEG)共价结合：100mg的GM-CSF在室温下溶解在10ml的pH7.5的磷酸盐缓冲剂中。接着加入100mg的TM-PEG(Mw＝5000道尔顿)，搅拌混合物1小时。通过凝胶色谱将未反应的GM-CSF和PEG化的GM-CSF从未反应的TM-PEG中分离出来。接着PEG化的GM-CSF被透析入100mM的Tris缓冲液中，并调节浓度为50mg/ml。

[0104] 实施例14.PEG结合人类胰岛素的制备(PEG-胰岛素)

[0105] 人类胰岛素被聚乙二醇共价改性的步骤如下：116mg的重组人类胰岛素溶解在4ml的包含200μlTEA的无水DMSO中。1g的mPEG(5000)-SPA溶解在10ml的无水DMSO中，并通过直接注射添加到胰岛素溶液中。反应在室温下进行一夜(＞10小时)或者直至＞
90％的蛋白质被聚乙二醇化。通过沉淀两次将未反应的PEG和PEG化的胰岛素从乙醚中分离。通过RP-HPLC分离最终产物。

[0106] 实施例15.PEG化的溶菌酶(PEG-Lyz)的制备

[0107] 将硼酸盐缓冲液(20mM，pH9.0)中的溶菌酶溶液(0.4％w/v，5ml)冷却至4℃。209mg的MPEG-SS(Mw2000，11mol过量)缓慢添加到蛋白质溶液中。反应在4℃下进行一夜并伴有端对端旋转(end to end rotation)，通过添加10mol过量甘氨酸停止反应。用3500道尔顿孔尺寸的膜用去离子水对反应混合物进行透析。透析样品在不添加任何添加剂的水中冻干，存储在-20℃下。

[0108] 本发明不受上述实施例所限制，上述实施例仅用作举例，但可以在所附的专利权利要求保护范围之内进行各种修改。

[0109] 因此，由于本发明已经显示和描述并指出了应用于本发明的优选实施方式的根本新特性，可以理解为本领域技术人员在不偏离本发明的精神的情况下可以对阐述的装置以及他们的操作在形式上和细节上进行的各种省略、取代和改变。例如，已经清楚的表明那些元素和/或方法步骤的所有组合，以基本相同的方式，实现基本相同的功能，获得相同的结果，都在本发明的范围之内。而且，应该认识到本发明任一公开的构成或实施方式中所显示的和/或描述的结构和/或元件和/或方法步骤可以包含任何其他常规设计选择中所公开的或描述的或建议的构成或具体实施方式。因此，目的是仅由本发明所附的权利要求的范围进行限定。

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蛋白质或肽的缓释给药组合物

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