用经不可切割接头连接的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物靶向特定细胞群的方法、所述偶联物和制备所述偶联物的方法
专利汇可以提供用经不可切割接头连接的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物靶向特定细胞群的方法、所述偶联物和制备所述偶联物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种方法，用于将美登木素 生物 碱 靶向选择细胞群，方法包括：用细胞结合剂美登木素生物碱偶联物 接触 怀疑含有所述选择细胞群的细胞群或组织，其中一个或多个美登木素生物碱通过不可切割的接头共价连接于所述细胞结合剂，并且所述细胞结合剂结合选择细胞群中的细胞。，下面是用经不可切割接头连接的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物靶向特定细胞群的方法、所述偶联物和制备所述偶联物的方法专利的具体信息内容。
1.使美登木素生物碱靶向选择细胞群的方法，方法包括：用细胞 结合剂美登木素生物碱偶联物接触怀疑含有所述选择细胞群的细胞群 或组织，其中一个或多个美登木素生物碱通过不可切割接头共价连接 于所述细胞结合剂并且所述细胞结合剂结合选择细胞群中的细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中所述不可切割接头基本上抗酸诱 导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割或二硫 键切割。
3.权利要求1所述的方法，其中所述不可切割接头不具有硫原子。
4.权利要求3所述的方法，其中所述接头来源于基于二羧酸的部 分。
5.权利要求4所述的方法，其中所述接头来源于基于α，ω-二羧酸 的部分，其中所述α，ω-二羧酸的通式是HOOC-Xl-Yn-Zm-COOH，其 中X是具有2至20个碳原子的线性或分支的烷基、烯基或炔基，Y是 具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基，Z是具有6至10个碳原子的 取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的杂环基团，其中杂原子 选自N、O或S，并且其中l、m和n的每一个是0或1，条件是它们 不同时均为0。
6.权利要求5所述的方法，其中所述α，ω-二羧酸是己二酸、戊 二酸、庚二酸、己烯-1，6-二酸、戊烯-1，5-二酸、环己烷-二酸或环己烯- 二酸。
7.权利要求1所述的方法，其中所述不可切割接头带有硫原子。
8.权利要求7所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基于马 来酰亚胺的部分。
9.权利要求8所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基于马 来酰亚胺的部分，选自：N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷 羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧 基-(6-酰氨基己酸酯)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥珀酰亚 胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε- 马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、m-马来酰亚胺苯甲酰基 -N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺乙酸基)-琥珀酰亚胺酯 (AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、 N-琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)、和N-(p-马来 酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMPI)。
10.权利要求9所述的方法，其中所述不可切割接头来源于 SMCC。
11.权利要求7所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基于卤 代乙酰基的部分。
12.权利要求11所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基于 卤代乙酰基的部分，选自N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯 (SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯 (SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。
13.权利要求12所述的方法，其中所述不可切割接头来源于 SIAB。
14.权利要求1所述的方法，其中所述接头位于至少一个美登木素 生物碱的C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基中的任一 处。
15.权利要求1所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱是 美登木醇的含N-甲基-丙氨酸的酯。
16.权利要求1所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱是 美登木醇的含N-甲基-半胱氨酸的酯。
17.权利要求1所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱被 表示为式(II’-L)、(II’-D)或(II’-D，L)：
其中：
Y1’代表
(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡ C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-，
其中：
R1至R12每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R12可以是H；
A、B和D，每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环 烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基；
l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的每一个独立地是0或从1至5 的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为 0；和
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处 带有侧链的美登木素生物碱。
18.权利要求17所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
19.权利要求17所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H，R5、 R6、R7和1R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或其中 R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并且n 是0。
20.权利要求1所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱被 表示为式(II-L)、(II-D)或(II-D，L)：
其中：
Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中：
R1至R8每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R8可以是H；
l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外，n可以是0； 和
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处 带有侧链的美登木素生物碱。
21.权利要求20所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
22.权利要求20所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H，R5、 R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或其中 R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并且n 是0。
23.权利要求1所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱被 表示为式41’：
其中：
Y1’代表
(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡ C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-，
其中：
R1至R12每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R12可以是H；
A、B和D，每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环 烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基；和
l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的每一个独立地是0或从1至5 的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为 0。
24.权利要求23所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
25.权利要求23所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H，R5、 R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或其中 R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并且n 是0。
26.权利要求1所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱被 表示为41：
其中：
Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中：
R1至R8每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R8可以是H；和
l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外，n可以是0。
27.权利要求26所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
28.权利要求26所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H，R5、 R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或其中 R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并且n 是0。
29.权利要求1所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱是 DM1。
30.权利要求1所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱是 DM3。
31.权利要求1所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱是 DM4。
32.权利要求1所述的方法，其中用不含硫的交联剂修饰所述美登 木素生物碱，得到式5化合物：
其中X是具有2至20个碳原子的线性或分支的烷基、烯基或炔基， Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基，Z是具有6至10个碳原 子的取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的杂环基团，其中杂 原子选自N、O或S，并且l、m和n的每一个是0或1，条件是它们 不同时均为0；以及E和羰基一同形成活性酯如N-羟基琥珀酰亚胺基 和硫代琥珀酰亚胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺基酯、N-羟基硫代邻 苯二甲酰亚胺基酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯、3- 磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯，和磺酰基四氟苯 酯。
33.权利要求1所述的方法，其中用不含硫的交联剂修饰所述美登 木素生物碱，得到式6化合物：
其中n代表从3至24的整数，并且E和羰基一同形成活性酯如 N-羟基琥珀酰亚胺基和硫代琥珀酰亚胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺 基酯、N-羟基硫代邻苯二甲酰亚胺基酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、 2，4-二硝基苯酯、3-磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯， 和磺酰基四氟苯酯。
34.权利要求1所述的方法，其中用不含硫的交联剂修饰所述美登 木素生物碱，得到式7化合物：
其中R是H或SO3-Na+。
35.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂结合于肿瘤细 胞；病毒感染细胞、微生物感染细胞、寄生虫感染细胞、自体免疫细 胞、活化细胞、骨髓细胞、活化的T细胞、B细胞、或黑素细胞；表 达CD33、CD19、CanAg、CALLA、或Her-2抗原的细胞；或表达胰 岛素生长因子受体、表皮生长因子受体或叶酸受体的细胞。
36.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂结合于细胞，所 述细胞选自：乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、直肠癌细胞、 胃癌细胞、鳞癌细胞、小细胞肺癌细胞、睾丸癌细胞、和神经母细胞 瘤细胞。
37.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶细 胞结合的抗体、单链抗体、抗体片段，特异地和靶细胞结合的单克隆 抗体、单链单克隆抗体、单克隆抗体片段，特异地和靶细胞结合的嵌 合抗体、嵌合抗体片段，特异地和靶细胞结合的结构区抗体、结构区 抗体片段，淋巴因子，激素，维生素，生长因子，集落刺激因子或营 养物运输分子。
38.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是干扰素、IL2、 IL3、IL4、IL6、胰岛素、促甲状腺激素释放激素、黑素细胞刺激素、 类固醇激素、生长激素释放抑制因子、EGF、TGF-α、FGF、G-CSF、 VEGF、MCSF、GM-CSF、叶酸、转铁蛋白、雌激素、雌激素类似物、 雄激素、或雄激素类似物。
39.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶细 胞结合的抗体、单链抗体或抗体片段。
40.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶细 胞结合的表面重构的抗体、表面重构的单链抗体、或表面重构的抗体 片段。
41.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶细 胞结合的人源化的抗体、人源化的单链抗体、或人源化的抗体片段。
42.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶细 胞结合的单克隆抗体、单链单克隆抗体、或单克隆抗体片段。
43.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶细 胞结合的表面重构的单克隆抗体、表面重构的单链单克隆抗体、或表 面重构的单克隆抗体片段。
44.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶细 胞结合的人源化的单克隆抗体、人源化的单链单克隆抗体、或人源化 的单克隆抗体片段。
45.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶细 胞结合的嵌合抗体、嵌合抗体片段、结构区抗体、或结构区抗体片段。
46.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和肿瘤 细胞结合的单克隆抗体、单链单克隆抗体、或单克隆抗体片段。
47.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和肿瘤 细胞结合的表面重构的单克隆抗体、表面重构的单链单克隆抗体、或 表面重构的单克隆抗体片段。
48.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和肿瘤 细胞结合的人源化的单克隆抗体、人源化的单链单克隆抗体、或人源 化的单克隆抗体片段。
49.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和肿瘤 细胞结合的嵌合抗体、嵌合抗体片段、结构区抗体、或结构区抗体片 段。
50.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和直肠 癌细胞或乳腺癌细胞结合的单克隆抗体、单链单克隆抗体、或单克隆 抗体片段。
51.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和直肠 癌细胞或乳腺癌细胞结合的表面重构的单克隆抗体、表面重构的单链 单克隆抗体、或表面重构的单克隆抗体片段。
52.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和直肠 癌细胞或乳腺癌细胞结合的人源化的单克隆抗体、人源化的单链单克 隆抗体、或人源化的单克隆抗体片段。
53.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和乳腺 癌细胞结合的表面重构的单克隆抗体、表面重构的单链单克隆抗体、 或表面重构的单克隆抗体片段。
54.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和乳腺 癌细胞结合的人源化的单克隆抗体、人源化的单链单克隆抗体、或人 源化的单克隆抗体片段。
55.权利要求1至34中的任一项所述的方法，其中所述细胞结合 剂是抗-CanAg抗体、抗CD-19抗体、抗CD-33抗体、抗CALLA抗体、 抗EGFR抗体、抗CD-56抗体、抗IGF-IR抗体、或抗Her2抗体。
56.权利要求1至34中的任一项所述的方法，其中所述细胞结合 剂是表面重构的抗体My9-6、KS77、或N901。
57.权利要求1至34中的任一项所述的方法，其中所述细胞结合 剂是曲妥珠单抗、B4抗体或huC242抗体。
58.权利要求1至34中的任一项所述的方法，其中所述细胞结合 剂是huC242抗体。
59.权利要求1至34中的任一项所述的方法，其中所述细胞结合 剂是曲妥珠单抗。
60.权利要求1所述的方法，其中与包括至少一个经可切割接头连 接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物 的毒性较低。
61.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂美登木素生物碱 偶联物的血浆清除和单独的抗体大约相同。
62.权利要求1所述的方法，其中与包括至少一个经可切割接头连 接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物 的最大耐受剂量较高。
63.权利要求1所述的方法，其中与包括至少一个经可切割接头连 接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物 的生物活性持久性较高。
64.权利要求1所述的方法，其中与包括至少一个经可切割接头连 接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物 对抗原阴性细胞的活性较低。
65.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂美登木素生物碱 偶联物显示出最小的旁观者效应。
66.清除细胞的方法，所述方法包括：用细胞结合剂美登木素生物 碱偶联物接触所述细胞，其中一个或多个美登木素生物碱通过不可切 割的接头共价连接于所述细胞结合剂，以及所述细胞结合剂结合于所 述细胞。
67.权利要求66所述的方法，其中所述不可切割接头基本上抗酸 诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割或二 硫键切割。
68.权利要求66所述的方法，其中所述不可切割接头不带有硫原 子。
69.权利要求68所述的方法，其中所述接头来源于基于二羧酸的 部分。
70.权利要求69所述的方法，其中所述接头来源于基于α，ω-二羧 酸的部分，其中所述α，ω-二羧酸的通式是HOOC-Xl-Yn-Zm-COOH， 其中X是具有2至20个碳原子的线性或分支的烷基、烯基或炔基，Y 是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基，Z是具有6至10个碳原子 的取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的杂环基团，其中杂原 子选自N、O或S，并且其中l、m和n的每一个是0或1，条件是它 们不同时均为0。
71.权利要求70所述的方法，其中所述α，ω-二羧酸是己二酸、 戊二酸、庚二酸、己烯-1，6-二酸、戊烯-1，5-二酸、环己烷-二酸或环己 烯-二酸。
72.权利要求66所述的方法，其中所述不可切割接头带有硫原子。
73.权利要求72所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基于 马来酰亚胺的部分。
74.权利要求73所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基于 马来酰亚胺的部分，选自：N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己 烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1- 羧基-(6-酰氨基己酸酯)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥珀酰 亚胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、 ε-马来酰亚胺己酸N-羟琥珀酰亚胺酯(EMCS)、m-马来酰亚胺苯甲酰 基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺乙酸基)-琥珀酰亚胺 酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(3-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、 N-琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)、和N-(p-马来 酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMPI)。
75.权利要求74所述的方法，其中所述不可切割接头来源于 SMCC。
76.权利要求72所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基于 卤代乙酰基的部分。
77.权利要求76所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基于 卤代乙酰基的部分，选自N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯 (SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯 (SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。
78.权利要求77所述的方法，其中所述不可切割接头来源于 SIAB。
79.权利要求66所述的方法，其中所述接头位于至少一个美登木 素生物碱的C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基中的任 一处。
80.权利要求66所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱 是美登木醇的含N-甲基-丙氨酸的酯。
81.权利要求66所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱 是美登木醇的含N-甲基-半胱氨酸的酯。
82.权利要求66所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱 被表示为式(II’-L)、(II’-D)或(II’-D，L)：
其中：
Y1’代表
(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡ C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-，
其中：
R1至R12每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R12可以是H；
A、B和D，每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环 烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基；
l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的每一个独立地是0或从1至5 的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为 0；和
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处 带有侧链的美登木素生物碱。
83.权利要求82所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
84.权利要求82所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H，R5、 R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或其中 R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并且n 是0。
85.权利要求66所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱 被表示为式(II-L)、(II-D)或(II-D，L)：
其中：
Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中：
R1至R8每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R8可以是H；
l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外，n可以是0； 和
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处 带有侧链的美登木素生物碱。
86.权利要求85所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
87.权利要求85所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H，R5、 R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或其中 R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并且n 是0。
88.权利要求66所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱 被表示为式41’：
其中：
Y1’代表
(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡ C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-，
其中：
R1至R12每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R12可以是H；
A、B和D，每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环 烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基；和
l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的每一个独立地是0或从1至5 的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为 0。
89.权利要求88所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
90.权利要求89所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H，R5、 R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或其中 R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并且n 是0。
91.权利要求66所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱 被表示为41：
其中：
Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中：
R1至R8每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R8可以是H；和
l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外，n可以是0。
92.权利要求91所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
93.权利要求91所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H，R5、 R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或其中 R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并且n 是0。
94.权利要求66所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱 是DM1。
95.权利要求66所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱 是DM3。
96.权利要求66所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱 是DM4。
97.权利要求66所述的方法，其中用不含硫的交联剂修饰所述美 登木素生物碱，得到式5化合物：
其中X是具有2至20个碳原子的线性或分支的烷基、烯基或炔基， Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基，Z是具有6至10个碳原 子的取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的杂环基团，其中杂 原子选自N、O或S，并且l、m和n的每一个是0或1，条件是它们 不同时均为0；以及E和羰基一同形成活性酯如N-羟基琥珀酰亚胺基 和硫代琥珀酰亚胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺基酯、N-羟基硫代邻 苯二甲酰亚胺基酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯、3- 磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯，和磺酰基四氟苯 酯。
98.权利要求66所述的方法，其中用不含硫的交联剂修饰所述美 登木素生物碱，得到式6化合物：
其中n代表从3至24的整数，并且E和羰基一同形成活性酯如 N-羟基琥珀酰亚胺基和硫代琥珀酰亚胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺 基酯、N-羟基硫代邻苯二甲酰亚胺基酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、 2，4-二硝基苯酯、3-磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯， 和磺酰基四氟苯酯。
99.权利要求66所述的方法，其中用不含硫的交联剂修饰所述美 登木素生物碱，得到式7化合物：
其中R是H或SO3-Na+。权利要求63所述的方法，其中所述细胞 结合剂结合于肿瘤细胞；病毒感染细胞、微生物感染细胞、寄生虫感 染细胞、自体免疫细胞、活化细胞、骨髓细胞、活化的T细胞、B细 胞、或黑素细胞；表达CD33、CD19、CanAg、CALLA、或Her-2抗 原的细胞；或表达胰岛素生长因子受体、表皮生长因子受体或叶酸受 体的细胞。
100.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂结合于细胞， 所述细胞选自：乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、直肠癌细 胞、胃癌细胞、鳞癌细胞、小细胞肺癌细胞、睾丸癌细胞、和神经母 细胞瘤细胞。
101.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶 细胞结合的抗体、单链抗体、抗体片段，特异地和靶细胞结合的单克 隆抗体、单链单克隆抗体、单克隆抗体片段，特异地和靶细胞结合的 嵌合抗体、嵌合抗体片段，特异地和靶细胞结合的结构区抗体、结构 区抗体片段，淋巴因子，激素，维生素，生长因子，集落刺激因子或 营养物运输分子。
102.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是干扰素、 IL2、IL3、IL4、IL6、胰岛素、促甲状腺激素释放激素、黑素细胞刺激 素、类固醇激素、生长激素释放抑制因子、EGF、TGF-α、FGF、G-CSF、 VEGF、MCSF、GM-CSF、叶酸、转铁蛋白、雌激素、雌激素类似物、 雄激素、或雄激素类似物。
103.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶 细胞结合的抗体、单链抗体或抗体片段。
104.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶 细胞结合的表面重构的抗体、表面重构的单链抗体、或表面重构的抗 体片段。
105.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶 细胞结合的人源化的抗体、人源化的单链抗体、或人源化的抗体片段。
106.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶 细胞结合的单克隆抗体、单链单克隆抗体、或单克隆抗体片段。
107.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶 细胞结合的表面重构的单克隆抗体、表面重构的单链单克隆抗体、或 表面重构的单克隆抗体片段。
108.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶 细胞结合的人源化的单克隆抗体、人源化的单链单克隆抗体、或人源 化的单克隆抗体片段。
109.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和靶 细胞结合的嵌合抗体、嵌合抗体片段、结构区抗体、或结构区抗体片 段。
110.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和肿 瘤细胞结合的单克隆抗体、单链单克隆抗体、或单克隆抗体片段。
111.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和肿 瘤细胞结合的表面重构的单克隆抗体、表面重构的单链单克隆抗体、 或表面重构的单克隆抗体片段。
112.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和肿 瘤细胞结合的人源化的单克隆抗体、人源化的单链单克隆抗体、或人 源化的单克隆抗体片段。
113.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和肿 瘤细胞结合的嵌合抗体、嵌合抗体片段、结构区抗体、或结构区抗体 片段。
114.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和直 肠癌细胞或乳腺癌细胞结合的单克隆抗体、单链单克隆抗体、或单克 隆抗体片段。
115.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和直 肠癌细胞或乳腺癌细胞结合的表面重构的单克隆抗体、表面重构的单 链单克隆抗体、或表面重构的单克隆抗体片段。
116.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和直 肠癌细胞或乳腺癌细胞结合的人源化的单克隆抗体、人源化的单链单 克隆抗体、或人源化的单克隆抗体片段。
117.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和乳 腺癌细胞结合的表面重构的单克隆抗体、表面重构的单链单克隆抗体、 或表面重构的单克隆抗体片段。
118.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和乳 腺癌细胞结合的人源化的单克隆抗体、人源化的单链单克隆抗体、或 人源化的单克隆抗体片段。
119.权利要求66至99中的任一项所述的方法，其中所述细胞结 合剂是抗-CanAg抗体、抗CD-19抗体、抗CD-33抗体、抗CALLA抗 体、抗EGFR抗体、抗CD-56抗体、抗IGF-IR抗体、或抗Her2抗体。
120.权利要求66至99中的任一项所述的方法，其中所述细胞结 合剂是表面重构的抗体My9-6、KS77、或N901。
121.权利要求66至99中的任一项所述的方法，其中所述细胞结 合剂是曲妥珠单抗、B4抗体或huC242抗体。
122.权利要求66至99中的任一项所述的方法，其中所述细胞结 合剂是huC242抗体。
123.权利要求66至99中的任一项所述的方法，其中所述细胞结 合剂是表面重构的C242抗体。
124.权利要求66所述的方法，其中与包括至少一个经可切割接头 连接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱偶 联物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物的毒性较低。
125.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂美登木素生物 碱偶联物的血浆清除和单独的抗体大约相同。
126.权利要求66所述的方法，其中与包括至少一个经可切割接头 连接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱偶 联物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物的最大耐受剂量较高。
127.权利要求66所述的方法，其中与包括至少一个经可切割接头 连接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱偶 联物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物的生物活性持久性较高。
128.权利要求66所述的方法，其中与包括至少一个经可切割接头 连接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱偶 联物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物对抗原阴性细胞的活性较低。
129.权利要求66所述的方法，其中所述细胞结合剂美登木素生物 碱偶联物显示出最小的旁观者效应。
130.治疗病痛的方法，所述病痛选自肿瘤、自身免疫病、移植排 斥、移植物抗宿主病、病毒感染、和寄生虫感染，所述方法包括：向 需要治疗的对象给予有效量的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中一个或多个美登木素生物碱通过不可切割接头共价连接于细胞结合 剂，以及细胞结合剂和病痛的患病细胞或感染细胞相结合。
131.权利要求130所述的方法，其中所述肿瘤选自：肺癌、乳腺 癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌和淋巴器官癌症。
132.权利要求130所述的方法，其中所述自身免疫病选自系统性 红斑狼疮、风湿性关节炎和多发性硬化。
133.权利要求130所述的方法，其中所述移植排斥选自：肾移植 排斥、心脏移植排斥和骨髓移植排斥。
134.权利要求130所述的方法，其中所述病毒感染选自CMV、 HIV和AIDS。
135.权利要求130所述的方法，其中所述寄生虫感染选自贾第鞭 毛虫病、阿米巴病和血吸虫病。
136.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述不可切 割接头基本上抗酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯 酶诱导的切割或二硫键切割。
137.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述不可切 割接头不带有硫原子。
138.权利要求137所述的方法，其中所述接头来源于基于二羧酸 的部分。
139.权利要求138所述的方法，其中所述接头来源于基于α，ω- 二羧酸的部分，其中所述α，ω-二羧酸的通式是 HOOC-Xl-Yn-Zm-COOH，其中X是具有2至20个碳原子的线性或分支 的烷基、烯基或炔基，Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基， Z是具有6至10个碳原子的取代的或未取代的芳基，或取代的或未取 代的杂环基团，其中杂原子选自N、O或S，并且l、m和n的每一个 是0或1，条件是它们不同时均为0。
140.权利要求139所述的方法，其中所述α，ω-二羧酸是己二酸、 戊二酸、庚二酸、己烯-1，6-二酸、戊烯-1，5-二酸、环己烷-二酸或环己 烯-二酸。
141.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述不可切 割接头带有硫原子。
142.权利要求141所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基 于马来酰亚胺的部分。
143.权利要求142所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基 于马来酰亚胺的部分，选自：N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环 己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷 -1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥 珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯 (GMBS)、ε-马来酰亚胺己酸N-羟琥珀酰亚胺酯(EMCS)、m-马来酰亚 胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺乙酸基)- 琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸 酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)、 和N-(p-马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMPI)。
144.权利要求143所述的方法，其中所述不可切割接头来源于 SMCC。
145.权利要求141所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基 于卤代乙酰基的部分。
146.权利要求145所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基 于卤代乙酰基的部分，选自N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸 酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯 (SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。
147.权利要求146所述的方法，其中所述不可切割接头来源于 SIAB。
148.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述接头位 于至少一个美登木素生物碱的C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或 C-20去甲基中的任一处。
149.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述至少一 个美登木素生物碱是美登木醇的含N-甲基-丙氨酸的酯。
150.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述至少一 个美登木素生物碱是美登木醇的含N-甲基-半胱氨酸的酯。
151.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述至少一 个美登木素生物碱被表示为式(II’-L)、(II’-D)或(II’-D，L)：
其中：
Y1’代表
(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡ C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-，
其中：
R1至R12每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R12可以是H；
A、B和D，每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环 烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基；
l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的每一个独立地是0或从1至5 的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为 0；和
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处 带有侧链的美登木素生物碱。
152.权利要求151所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
153.权利要求151所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H， R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或 其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并 且n是0。
154.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述至少一 个美登木素生物碱被表示为式(II-L)、(II-D)或(II-D，L)：
其中：
Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中：
R1至R8每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R8可以是H；
l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外，n可以是0； 和
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处 带有侧链的美登木素生物碱。
155.权利要求154所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
156.权利要求154所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H， R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或 其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并 且n是0。
157.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述至少一 个美登木素生物碱被表示为式41’：
其中：
Y1’代表
(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt (CR3CR4)nCR1R2S-，
其中：
R1至R12每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R12可以是H；
A、B和D，每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环 烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基；和
l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的每一个独立地是0或从1至5 的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为 0。
158.权利要求157所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
159.权利要求157所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H， R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或 其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并 且n是0。
160.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述至少一 个美登木素生物碱被表示为41：
其中：
Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中：
R1至R8每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R8可以是H；和
l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外，n可以是0。
161.权利要求160所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
162.权利要求160所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H， R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或 其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并 且n是0。
163.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述至少一 个美登木素生物碱是DM1。
164.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述至少一 个美登木素生物碱是DM3。
165.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述至少一 个美登木素生物碱是DM4。
166.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中用不含硫的 交联剂修饰所述美登木素生物碱，得到式5化合物：
其中X是具有2至20个碳原子的线性或分支的烷基、烯基或炔基， Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基，Z是具有6至10个碳原 子的取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的杂环基团，其中杂 原子选自N、O或S，并且l、m和n的每一个是0或1，条件是它们 不同时均为0；以及E和羰基一同形成活性酯如N-羟基琥珀酰亚胺基 和硫代琥珀酰亚胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺基酯、N-羟基硫代邻 苯二甲酰亚胺基酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯、3- 磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯，和磺酰基四氟苯 酯。
167.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中用不含硫的 交联剂修饰所述美登木素生物碱，得到式6化合物：
其中n代表从3至24的整数，并且E和羰基一同形成活性酯如 N-羟基琥珀酰亚胺基和硫代琥珀酰亚胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺 基酯、N-羟基硫代邻苯二甲酰亚胺基酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、 2，4-二硝基苯酯、3-磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯， 和磺酰基四氟苯酯。
168.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中用不含硫的 交联剂修饰所述美登木素生物碱，得到式7化合物：
其中R是H或SO3-Na+。
169.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述细胞结 合剂是特异地和病痛的患病细胞或感染细胞结合的抗体、单链抗体或 抗体片段。
170.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述细胞结 合剂是特异地和病痛的患病细胞或感染细胞结合的表面重构的抗体、 表面重构的单链抗体、或表面重构的抗体片段。
171.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述细胞结 合剂是特异地和病痛的患病细胞或感染细胞结合的人源化的抗体、人 源化的单链抗体、或人源化的抗体片段。
172.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述细胞结 合剂是特异地和病痛的患病细胞或感染细胞结合的单克隆抗体、单链 单克隆抗体、或单克隆抗体片段。
173.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述细胞结 合剂是特异地和病痛的患病细胞或感染细胞结合的表面重构的单克隆 抗体、表面重构的单链单克隆抗体、或表面重构的单克隆抗体片段。
174.权利要求130至135的任一项所述的方法，其中所述细胞结 合剂是特异地和病痛的患病细胞或感染细胞结合的人源化的单克隆抗 体、人源化的单链单克隆抗体、或人源化的单克隆抗体片段。
175.权利要求130所述的方法，其中所述细胞结合剂是抗-CanAg 抗体、抗CD-19抗体、抗CD-33抗体、抗CALLA抗体、抗EGFR抗 体、抗CD-56抗体、抗IGF-IR抗体、或抗Her2抗体。
176.权利要求130所述的方法，其中所述细胞结合剂是表面重构 的抗体My9-6、KS77、或N901。
177.权利要求130所述的方法，其中所述细胞结合剂是曲妥珠单 抗、B4抗体或huC242抗体。
178.权利要求130所述的方法，其中所述细胞结合剂是huC242 抗体。
179.权利要求130所述的方法，其中所述细胞结合剂是表面重构 的C242抗体。
180.体外应用以处理下列物质的方法：处理自体骨髓细胞，这是 在将它们植入同一患者之前实施的，目的是清除患病细胞或肿瘤细胞； 处理骨髓细胞或其它组织，这是在移植它们之前实施的，目的是清除 活性T细胞(competent T cell)并防止移植物抗宿主病(GVHD)；处理细 胞培养物，目的是清除不表达靶抗原的所需变异体之外的所有细胞； 或处理细胞培养物，目的是清除表达不需要的抗原的变异细胞；方法 包括，用有效量的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物处理细胞，其中 一个或多个美登木素生物碱通过不可切割接头共价连接于细胞结合 剂，以及细胞结合剂和欲清除的细胞相结合。
181.权利要求180所述的方法，其中所述不可切割接头基本上抗 酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割或 二硫键切割。
182.权利要求180所述的方法，其中所述不可切割接头不带有硫 原子。
183.权利要求182所述的方法，其中所述接头来源于基于二羧酸 的部分。
184.权利要求183所述的方法，其中所述接头来源于基于α，ω- 二羧酸的部分，其中所述α，ω-二羧酸的通式是 HOOC-Xl-Yn-Zm-COOH，其中X是具有2至20个碳原子的线性或分支 的烷基、烯基或炔基，Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基， Z是具有6至10个碳原子的取代的或未取代的芳基，或取代的或未取 代的杂环基团，其中杂原子选自N、O或S，并且l、m和n的每一个 是0或1，条件是它们不同时均为0。
185.权利要求184所述的方法，其中所述α，ω-二羧酸是己二酸、 戊二酸、庚二酸、己烯-1，6-二酸、戊烯-1，5-二酸、环己烷-二酸或环己 烯-二酸。
186.权利要求180所述的方法，其中所述不可切割接头带有硫原 子。
187.权利要求186所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基 于马来酰亚胺的部分。
188.权利要求187所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基 于马来酰亚胺的部分，选自：N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环 己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷 -1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥 珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯 (GMBS)、ε-马来酰亚胺己酸N-羟琥珀酰亚胺酯(EMCS)、m-马来酰亚 胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺乙酸基)- 琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸 酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)、 和N-(p-马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMPI)。
189.权利要求180所述的方法，其中所述不可切割接头来源于 SMCC。
190.权利要求186所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基 于卤代乙酰基的部分。
191.权利要求190所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基 于卤代乙酰基的部分，选自N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸 酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯 (SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。
192.权利要求191所述的方法，其中所述不可切割接头来源于 SIAB。
193.权利要求180所述的方法，其中所述接头位于至少一个美登 木素生物碱的C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基中的 任一处。
194.权利要求180所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物 碱是美登木醇的含N-甲基-丙氨酸的酯。
195.权利要求180所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物 碱是美登木醇的含N-甲基-半胱氨酸的酯。
196.权利要求180所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物 碱被表示为式(II’-L)、(II’-D)或(II’-D，L)：
其中：
Y1’代表
(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡ C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-，
其中：
R1至R12每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R12可以是H；
A、B和D，每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环 烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基；
l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的每一个独立地是0或从1至5 的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为 0；和
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处 带有侧链的美登木素生物碱。
197.权利要求196所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
198.权利要求196所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H， R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或 其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并 且n是0。
199.权利要求180所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物 碱被表示为式(II-L)、(II-D)或(II-D，L)：
其中：
Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中：
R1至R8每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R8可以是H；
l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外，n可以是0； 和
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处 带有侧链的美登木素生物碱。
200.权利要求199所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
201.权利要求199所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H， R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或 其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并 且n是0。
202.权利要求180所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物 碱被表示为式41’：
其中：
Y1’代表
(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡ C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-，
其中：
R1至R12每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R12可以是H；
A、B和D，每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环 烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基；和
l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的每一个独立地是0或从1至5 的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为 0。
203.权利要求202所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
204.权利要求202所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H， R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或 其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并 且n是0。
205.权利要求180所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物 碱被表示为41：
其中：
Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中：
R1至R8每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R8可以是H；
l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外，n可以是0； 和
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处 带有侧链的美登木素生物碱。
206.权利要求205所述的方法，其中所述R1是甲基并且R2是H， 或R1和R2是甲基。
207.权利要求205所述的方法，其中所述R1是甲基，R2是H， R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或 其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并 且n是0。
208.权利要求180所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物 碱是DM1。
209.权利要求180所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物 碱是DM3。
210.权利要求180所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物 碱是DM4。
211.权利要求180所述的方法，其中用不含硫的交联剂修饰所述 美登木素生物碱，得到式5化合物：
其中X是具有2至20个碳原子的线性或分支的烷基、烯基或炔基， Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基，Z是具有6至10个碳原 子的取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的杂环基团，其中杂 原子选自N、O或S，并且l、m和n的每一个是0或1，条件是它们 不同时均为0；以及E和羰基一同形成活性酯如N-羟基琥珀酰亚胺基 和硫代琥珀酰亚胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺基酯、N-羟基硫代邻 苯二甲酰亚胺基酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯、3- 磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯，和磺酰基四氟苯 酯。
212.权利要求180所述的方法，其中用不含硫的交联剂修饰所述 美登木素生物碱，得到式6化合物：
其中n代表从3至24的整数，并且E和羰基一同形成活性酯如 N-羟基琥珀酰亚胺基和硫代琥珀酰亚胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺 基酯、N-羟基硫代邻苯二甲酰亚胺基酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、 2，4-二硝基苯酯、3-磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯， 和磺酰基四氟苯酯。
213.权利要求180所述的方法，其中用不含硫的交联剂修饰所述 美登木素生物碱，得到式7化合物：
其中R是H或SO3-Na+。
214.权利要求180所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和 欲清除的细胞结合的抗体、单链抗体或抗体片段。
215.权利要求180所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和 欲清除的细胞结合的表面重构的抗体、表面重构的单链抗体、或表面 重构的抗体片段。
216.权利要求180所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和 欲清除的细胞结合的人源化的抗体、人源化的单链抗体、或人源化的 抗体片段。
217.权利要求180所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和 欲清除的细胞结合的单克隆抗体、单链单克隆抗体、或单克隆抗体片 段。
218.权利要求180所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和 欲清除的细胞结合的表面重构的单克隆抗体、表面重构的单链单克隆 抗体、或表面重构的单克隆抗体片段。
219.权利要求180所述的方法，其中所述细胞结合剂是特异地和 欲清除的细胞结合的人源化的单克隆抗体、人源化的单链单克隆抗体、 或人源化的单克隆抗体片段。
220.权利要求180所述的方法，其中与包括至少一个经可切割接 头连接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱 偶联物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶 联物的毒性较低。
221.权利要求180所述的方法，其中所述细胞结合剂美登木素生 物碱偶联物的血浆清除和单独的抗体大约相同。
222.权利要求180所述的方法，其中与包括至少一个经可切割接 头连接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱 偶联物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶 联物的最大耐受剂量较高。
223.权利要求180所述的方法，其中与包括至少一个经可切割接 头连接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱 偶联物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶 联物的生物活性持久性较高。
224.权利要求180所述的方法，其中与包括至少一个经可切割接 头连接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱 偶联物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶 联物对抗原阴性细胞的活性较低。
225.权利要求180所述的方法，其中所述细胞结合剂美登木素生 物碱偶联物显示出最小的旁观者效应。
226.细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其具有至少一个经不可 切割接头连接于细胞结合剂的美登木素生物碱，条件是当所述细胞结 合剂是抗体时，该接头不来自下列交联剂：琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰 亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、硫代-SMCC、m-马来酰亚胺苯甲 酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、硫代-MBS和N-琥珀酰亚胺基-碘乙 酸酯(SIA)。
227.细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其具有至少一个经不可 切割接头连接于细胞结合剂的美登木素生物碱，条件是所述细胞结合 剂不是抗体。
228.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述不可切割接头基本上抗酸诱导的切割、光诱导的切割、 肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割或二硫键切割。
229.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述不可切割接头不带有硫原子。
230.权利要求229所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述接头来源于基于二羧酸的部分。
231.权利要求230所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述接头来源于基于α，ω-二羧酸的部分，其中所述α，ω-二羧酸的 通式是HOOC-Xl-Yn-Zm-COOH，其中X是具有2至20个碳原子的线 性或分支的烷基、烯基或炔基，Y是具有3至10个碳原子的环烷基或 环烯基，Z是具有6至10个碳原子的取代的或未取代的芳基，或取代 的或未取代的杂环基团，其中杂原子选自N、O或S，并且其中l、m 和n的每一个是0或1，条件是它们不同时均为0。
232.权利要求231所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述α，ω-二羧酸是己二酸、戊二酸、庚二酸、己烯-1，6-二酸、戊烯 -1，5-二酸、环己烷-二酸或环己烯-二酸。
233.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述不可切割接头带有硫原子。
234.权利要求233所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述不可切割接头来源于基于马来酰亚胺的部分。
235.权利要求234所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述不可切割接头来源于基于马来酰亚胺的部分，选自：N-琥珀酰 亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基 -4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)(LC-SMCC)、 κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁 酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺己酸N-羟琥珀酰亚胺酯 (EMCS)、m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α- 马来酰亚胺乙酸基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来 酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺苯 基)-丁酸酯(SMPB)、和N-(p-马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMPI)。
236.权利要求235所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述不可切割接头是SMCC。
237.权利要求233所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述不可切割接头来源于基于卤代乙酰基的部分。
238.权利要求237所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述不可切割接头来源于基于卤代乙酰基的部分，选自N-琥珀酰亚 胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯 (SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰 氨基)丙酸酯(SBAP)。
239.权利要求238所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述不可切割接头来源于SIAB。
240.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述接头位于至少一个美登木素生物碱的C-3羟基、C-14羟 甲基、C-15羟基或C-20去甲基中的任一处。
241.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述至少一个美登木素生物碱是美登木醇的含N-甲基-丙氨酸 的酯。
242.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述至少一个美登木素生物碱是美登木醇的含N-甲基-丙氨酸 的酯。
243.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述至少一个美登木素生物碱被表示为式(II’-L)、(II’-D)或 (II’-D，L)：
其中：
Y1’代表
(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡ C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-，
其中：
R1至R12每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R12可以是H；
A、B和D，每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环 烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基；
l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的每一个独立地是0或从1至5 的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为 0；和
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处 带有侧链的美登木素生物碱。
244.权利要求243所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述R1是甲基并且R2是H，或R1和R2是甲基。
245.权利要求243所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述R1是甲基，R2是H，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的 每一个是1，并且n是0；或其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的 每一个是H，l和m是1，并且n是0。
246.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述至少一个美登木素生物碱被表示为式(II-L)、(II-D)或 (II-D，L)：
其中：
Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中：
R1至R8每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R8可以是H；
l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外，n可以是0； 和
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处 带有侧链的美登木素生物碱。
247.权利要求246所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述R1是甲基并且R2是H，或R1和R2是甲基。
248.权利要求246所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述R1是甲基，R2是H，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的 每一个是1，并且n是0；或其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的 每一个是H，l和m是1，并且n是0。
249.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述至少一个美登木素生物碱被表示为式41’：
其中：
Y1’代表
(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡ C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-，
其中：
R1至R12每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R12可以是H；
A、B和D，每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环 烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基；
l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的每一个独立地是0或从1至5 的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为 0；和
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处 带有侧链的美登木素生物碱。
250.权利要求249所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述R1是甲基并且R2是H，或R1和R2是甲基。
251.权利要求249所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述R1是甲基，R2是H，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的 每一个是1，并且n是0；或其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的 每一个是H，l和m是1，并且n是0。
252.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述至少一个美登木素生物碱被表示为41：
其中：
Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中：
R1至R8每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R8可以是H；和
l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外，n可以是0。
253.权利要求252所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述R1是甲基并且R2是H，或R1和R2是甲基。
254.权利要求252所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述R1是甲基，R2是H，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的 每一个是1，并且n是0；或其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的 每一个是H，l和m是1，并且n是0。
255.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述至少一个美登木素生物碱是DM1。
256.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述至少一个美登木素生物碱是DM3。
257.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述至少一个美登木素生物碱是DM4。
258.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中用不含硫的交联剂修饰所述美登木素生物碱，得到式5化合 物：
其中X是具有2至20个碳原子的线性或分支的烷基、烯基或炔基， Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基，Z是具有6至10个碳原 子的取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的杂环基团，其中杂 原子选自N、O或S，并且l、m和n的每一个是0或1，条件是它们 不同时均为0；以及E和羰基一同形成活性酯如N-羟基琥珀酰亚胺基 和硫代琥珀酰亚胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺基酯、N-羟基硫代邻 苯二甲酰亚胺基酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯、3- 磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯，和磺酰基四氟苯 酯。
259.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中用不含硫的交联剂修饰所述美登木素生物碱，得到式6化合 物：
其中n代表从3至24的整数，并且E和羰基一同形成活性酯如 N-羟基琥珀酰亚胺基和硫代琥珀酰亚胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺 基酯、N-羟基硫代邻苯二甲酰亚胺基酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、 2，4-二硝基苯酯、3-磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯， 和磺酰基四氟苯酯。
260.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中用不含硫的交联剂修饰所述美登木素生物碱，得到式7化合 物：
其中R是H或SO3-Na+。
261.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述细胞结合剂结合于肿瘤细胞；病毒感染细胞、微生物感 染细胞、寄生虫感染细胞、自体免疫细胞、活化细胞、骨髓细胞、活 化的T细胞、B细胞、或黑素细胞；表达CD33、CD19、CanAg、CALLA、 或Her-2抗原的细胞；或表达胰岛素生长因子受体、表皮生长因子受体 或叶酸受体的细胞。
262.权利要求261所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂结合于细胞，所述细胞选自：乳腺癌细胞、前列腺 癌细胞、卵巢癌细胞、直肠癌细胞、胃癌细胞、鳞癌细胞、小细胞肺 癌细胞、睾丸癌细胞、和神经母细胞瘤细胞。
263.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和靶细胞结合的抗体、单链抗体、抗体片 段，特异地和靶细胞结合的单克隆抗体、单链单克隆抗体、单克隆抗 体片段，特异地和靶细胞结合的嵌合抗体、嵌合抗体片段，特异地和 靶细胞结合的结构区抗体、结构区抗体片段，淋巴因子，激素，维生 素，生长因子，集落刺激因子或营养物运输分子。
264.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述细胞结合剂是淋巴因子、激素、维生素、生长因子、集 落刺激因子或营养物运输分子
265.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述细胞结合剂是干扰素、IL2、IL3、IL4、IL6、胰岛素、 促甲状腺激素释放激素、黑素细胞刺激素、类固醇激素、生长激素释 放抑制因子、EGF、TGF-α、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF、 叶酸、转铁蛋白、雌激素、雌激素类似物、雄激素、或雄激素类似物。
266.权利要求权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶 联物，其中所述细胞结合剂是特异地和靶细胞结合的抗体、单链抗体 或抗体片段。
267.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和靶细胞结合的表面重构的抗体、表面重 构的单链抗体、或表面重构的抗体片段。
268.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和靶细胞结合的人源化的抗体、人源化的 单链抗体、或人源化的抗体片段。
269.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和靶细胞结合的单克隆抗体、单链单克隆 抗体、或单克隆抗体片段。
270.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和靶细胞结合的表面重构的单克隆抗体、 表面重构的单链单克隆抗体、或表面重构的单克隆抗体片段。
271.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和靶细胞结合的人源化的单克隆抗体、人 源化的单链单克隆抗体、或人源化的单克隆抗体片段。
272.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和靶细胞结合的嵌合抗体、嵌合抗体片段、 结构区抗体、或结构区抗体片段。
273.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和肿瘤细胞结合的单克隆抗体、单链单克 隆抗体、或单克隆抗体片段。
274.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和肿瘤细胞结合的表面重构的单克隆抗 体、表面重构的单链单克隆抗体、或表面重构的单克隆抗体片段。
275.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和肿瘤细胞结合的人源化的单克隆抗体、 人源化的单链单克隆抗体、或人源化的单克隆抗体片段。
276.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和肿瘤细胞结合的嵌合抗体、嵌合抗体片 段、结构区抗体、或结构区抗体片段。
277.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和直肠癌细胞或乳腺癌细胞结合的单克隆 抗体、单链单克隆抗体、或单克隆抗体片段。
278.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和直肠癌细胞或乳腺癌细胞结合的表面重 构的单克隆抗体、表面重构的单链单克隆抗体、或表面重构的单克隆 抗体片段。
279.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和直肠癌细胞或乳腺癌细胞结合的人源化 的单克隆抗体、人源化的单链单克隆抗体、或人源化的单克隆抗体片 段。
280.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和直肠癌细胞或乳腺癌细胞结合的表面重 构的单克隆抗体、表面重构的单链单克隆抗体、或表面重构的单克隆 抗体片段。
281.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是特异地和乳腺癌细胞结合的人源化的单克隆抗 体、人源化的单链单克隆抗体、或人源化的单克隆抗体片段。
282.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是抗-CanAg抗体、抗CD-19抗体、抗CD-33抗体、 抗CALLA抗体、抗EGFR抗体、抗CD-56抗体、抗IGF-IR抗体、或 抗Her2抗体。
283.权利要求282所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述美登木素生物碱是DM1、DM2或DM3。
284.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是表面重构的抗体My9-6、KS77、或N901。
285.权利要求284所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述美登木素生物碱是DM1、DM2或DM3。
286.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是曲妥珠单抗、B4抗体或huC242抗体。
287.权利要求286所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述美登木素生物碱是DM1、DM2或DM3。
288.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是huC242抗体。
289.权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其 中所述细胞结合剂是表面重构的C242抗体。
290.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中与包括至少一个经可切割接头连接于细胞结合剂的美登木素 生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物相比，所述包括不可切割 接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物的毒性较低。
291.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述细胞结合剂美登木素生物碱偶联物的血浆清除和单独的 抗体大约相同。
292.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中与包括至少一个经可切割接头连接于细胞结合剂的美登木素 生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物相比，所述包括不可切割 接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物的最大耐受剂量较高。
293.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中与包括至少一个经可切割接头连接于细胞结合剂的美登木素 生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物相比，所述包括不可切割 接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物的生物活性持久性较高。
294.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中与包括至少一个经可切割接头连接于细胞结合剂的美登木素 生物碱的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物相比，所述包括不可切割 接头的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物对抗原阴性细胞的活性较 低。
295.权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱偶联 物，其中所述细胞结合剂美登木素生物碱偶联物显示出最小的旁观者 效应。
296.组合物，包括权利要求226所述的细胞结合剂美登木素生物 碱偶联物和载体。
297.组合物，包括权利要求227所述的细胞结合剂美登木素生物 碱偶联物和载体。
298.权利要求296或297所述的组合物，其中所述不可切割接头 基本上抗酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导 的切割或二硫键切割。
299.权利要求296或297所述的组合物，其中所述不可切割接头 不带有硫原子。
300.权利要求299所述的组合物，其中所述接头来源于基于二羧 酸的部分。
301.权利要求300所述的组合物，其中所述接头来源于基于α， ω-二羧酸的部分，其中所述α，ω-二羧酸的通式是 HOOC-Xl-Yn-Zm-COOH，其中X是具有2至20个碳原子的线性或分支 的烷基、烯基或炔基，Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基， Z是具有6至10个碳原子的取代的或未取代的芳基，或取代的或未取 代的杂环基团，其中杂原子选自N、O或S，并且其中l、m和n的每 一个是0或1，条件是它们不同时均为0。
302.权利要求301所述的组合物，其中所述α，ω-二羧酸是己二 酸、戊二酸、庚二酸、己烯-1，6-二酸、戊烯-1，5-二酸、环己烷-二酸或 环己烯-二酸。
303.权利要求296或297所述的组合物，其中所述不可切割接头 带有硫原子。
304.权利要求303所述的组合物，其中所述不可切割接头来源于 基于马来酰亚胺的部分。
305.权利要求304所述的组合物，其中所述不可切割接头来源于 基于马来酰亚胺的部分，选自：N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基) 环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷 -1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥 珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯 (GMBS)、ε-马来酰亚胺己酸N-羟琥珀酰亚胺酯(EMCS)、m-马来酰亚 胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺乙酸基)- 琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸 酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)、 和N-(p-马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMPI)。
306.权利要求305所述的组合物，其中所述不可切割接头是 SMCC。
307.权利要求303所述的组合物，其中所述不可切割接头来源于 基于卤代乙酰基的部分。
308.权利要求307所述的组合物，其中所述不可切割接头来源于 基于卤代乙酰基的部分，选自N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲 酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸 酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。
309.权利要求308所述的组合物，其中所述不可切割接头来源于 SIAB。
310.权利要求296或297所述的组合物，其中所述接头位于至少 一个美登木素生物碱的C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去 甲基中的任一处。
311.权利要求296或297所述的组合物，其中所述至少一个美登 木素生物碱是美登木醇的含N-甲基-丙氨酸的酯。
312.权利要求296或297所述的组合物，其中所述至少一个美登 木素生物碱是美登木醇的含N-甲基-半胱氨酸的酯。
313.权利要求296或297所述的组合物，其中所述至少一个美登 木素生物碱被表示为式(II’-L)、(II’-D)或(II’-D，L)：
其中：
Y1’代表
(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡ C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-，
其中：
R1至R12每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R12可以是H；
A、B和D，每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环 烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基；
l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的每一个独立地是0或从1至5 的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为 0；和
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处 带有侧链的美登木素生物碱。
314.权利要求313所述的组合物，其中所述R1是甲基并且R2是 H，或R1和R2是甲基。
315.权利要求313所述的组合物，其中所述R1是甲基，R2是H， R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或 其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并 且n是0。
316.权利要求296或299所述的组合物，其中所述至少一个美登 木素生物碱被表示为式(II-L)、(II-D)或(II-D，L)：
其中：
Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中：
R1至R8每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R8可以是H；
l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外，n可以是0； 和
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处 带有侧链的美登木素生物碱。
317.权利要求316所述的组合物，其中所述R1是甲基并且R2是 H，或R1和R2是甲基。
318.权利要求316所述的组合物，其中所述R1是甲基，R2是H， R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或 其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并 且n是0。
319.权利要求296或297所述的组合物，其中所述至少一个美登 木素生物碱被表示为式41’：
其中：
Y1’代表
(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt (CR3CR4)nCR1R2S-，
其中：
R1至R12每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R12可以是H；
A、B和D，每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环 烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基；和
l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的每一个独立地是0或从1至5 的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为 0。
320.权利要求319所述的组合物，其中所述R1是甲基并且R2是 H，或R1和R2是甲基。
321.权利要求319所述的组合物，其中所述R1是甲基，R2是H， R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或 其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并 且n是0。
322.权利要求296或297所述的组合物，其中所述至少一个美登 木素生物碱被表示为41：
其中：
Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中：
R1至R8每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R8可以是H；和
l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外，n可以是0。
323.权利要求323所述的组合物，其中所述R1是甲基并且R2是 H，或R1和R2是甲基。
324.权利要求323所述的组合物，其中所述R1是甲基，R2是H， R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；或 其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，并 且n是0。
325.权利要求296或297所述的组合物，其中所述至少一个美登 木素生物碱是DM1。
326.权利要求296或297所述的组合物，其中所述至少一个美登 木素生物碱是DM3。
327.权利要求296或297所述的组合物，其中所述至少一个美登 木素生物碱是DM4。
328.权利要求296或297所述的组合物，其中用不含硫的交联剂 修饰所述美登木素生物碱，得到式5化合物：
其中X是具有2至20个碳原子的线性或分支的烷基、烯基或炔基， Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基，Z是具有6至10个碳原 子的取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的杂环基团，其中杂 原子选自N、O或S，并且l、m和n的每一个是0或1，条件是它们 不同时均为0；以及E和羰基一同形成活性酯如N-羟基琥珀酰亚胺基 和硫代琥珀酰亚胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺基酯、N-羟基硫代邻 苯二甲酰亚胺基酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯、3- 磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯，和磺酰基四氟苯 酯。
329.权利要求296或297所述的组合物，其中用不含硫的交联剂 修饰所述美登木素生物碱，得到式6化合物：
其中n代表从3至24的整数，并且E和羰基一同形成活性酯如 N-羟基琥珀酰亚胺基和硫代琥珀酰亚胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺 基酯、N-羟基硫代邻苯二甲酰亚胺基酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、 2，4-二硝基苯酯、3-磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯， 和磺酰基四氟苯酯。
330.权利要求296或297所述的组合物，其中用不含硫的交联剂 修饰所述美登木素生物碱，得到式7化合物：
其中R是H或SO3-Na+。
331.权利要求296或297所述的组合物，其中所述细胞结合剂结 合于肿瘤细胞；病毒感染细胞、微生物感染细胞、寄生虫感染细胞、 自体免疫细胞、活化细胞、骨髓细胞、活化的T细胞、B细胞、或黑 素细胞；表达CD33、CD19、CanAg、CALLA、或Her-2抗原的细胞； 或表达胰岛素生长因子受体、表皮生长因子受体或叶酸受体的细胞。
332.权利要求331所述的组合物，其中所述细胞结合剂结合于细 胞，所述细胞选自：乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、直肠 癌细胞、胃癌细胞、鳞癌细胞、小细胞肺癌细胞、睾丸癌细胞、和神 经母细胞瘤细胞。
333.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和靶细胞结合的抗体、单链抗体、抗体片段，特异地和靶细胞结合的 单克隆抗体、单链单克隆抗体、单克隆抗体片段，特异地和靶细胞结 合的嵌合抗体、嵌合抗体片段，特异地和靶细胞结合的结构区抗体、 结构区抗体片段，淋巴因子，激素，维生素，生长因子，集落刺激因 子或营养物运输分子。
334.权利要求296或297所述的组合物，其中所述细胞结合剂是 淋巴因子、激素、维生素、生长因子、集落刺激因子或营养物运输分 子。
335.权利要求296或297所述的组合物，其中所述细胞结合剂是 干扰素、IL2、IL3、IL4、IL6、胰岛素、促甲状腺激素释放激素、黑素 细胞刺激素、类固醇激素、生长激素释放抑制因子、EGF、TGF-α、 FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF、叶酸、转铁蛋白、雌激素、 雌激素类似物、雄激素、或雄激素类似物。
336.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和靶细胞结合的抗体、单链抗体或抗体片段。
337.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和靶细胞结合的表面重构的抗体、表面重构的单链抗体、或表面重构 的抗体片段。
338.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和靶细胞结合的人源化的抗体、人源化的单链抗体、或人源化的抗体 片段。
339.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和靶细胞结合的单克隆抗体、单链单克隆抗体、或单克隆抗体片段。
340.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和靶细胞结合的表面重构的单克隆抗体、表面重构的单链单克隆抗体、 或表面重构的单克隆抗体片段。
341.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和靶细胞结合的人源化的单克隆抗体、人源化的单链单克隆抗体、或 人源化的单克隆抗体片段。
342.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和靶细胞结合的嵌合抗体、嵌合抗体片段、结构区抗体、或结构区抗 体片段。
343.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和肿瘤细胞结合的单克隆抗体、单链单克隆抗体、或单克隆抗体片段。
344.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和肿瘤细胞结合的表面重构的单克隆抗体、表面重构的单链单克隆抗 体、或表面重构的单克隆抗体片段。
345.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和肿瘤细胞结合的人源化的单克隆抗体、人源化的单链单克隆抗体、 或人源化的单克隆抗体片段。
346.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和肿瘤细胞结合的嵌合抗体、嵌合抗体片段、结构区抗体、或结构区 抗体片段。
347.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和直肠癌细胞或乳腺癌细胞结合的单克隆抗体、单链单克隆抗体、或 单克隆抗体片段。
348.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和直肠癌细胞或乳腺癌细胞结合的表面重构的单克隆抗体、表面重构 的单链单克隆抗体、或表面重构的单克隆抗体片段。
349.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和直肠癌细胞或乳腺癌细胞结合的人源化的单克隆抗体、人源化的单 链单克隆抗体、或人源化的单克隆抗体片段。
350.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和直肠癌细胞或乳腺癌细胞结合的表面重构的单克隆抗体、表面重构 的单链单克隆抗体、或表面重构的单克隆抗体片段。
351.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是特异地 和乳腺癌细胞结合的人源化的单克隆抗体、人源化的单链单克隆抗体、 或人源化的单克隆抗体片段。
352.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是抗 -CanAg抗体、抗CD-19抗体、抗CD-33抗体、抗CALLA抗体、抗 EGFR抗体、抗CD-56抗体、抗IGF-IR抗体、或抗Her2抗体。
353.权利要求352所述的组合物，其中所述美登木素生物碱是 DM1、DM2或DM3。
354.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是表面重 构的抗体My9-6、KS77、或N901。
355.权利要求354所述的组合物，其中所述美登木素生物碱是 DM1、DM2或DM3。
356.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是曲妥珠 单抗、B4抗体或huC242抗体。
357.权利要求356所述的组合物，其中所述美登木素生物碱是 DM1、DM2或DM3。
358.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是huC242 抗体。
359.权利要求296所述的组合物，其中所述细胞结合剂是表面重 构的C242抗体。
360.权利要求296或297所述的组合物，其中与包括至少一个经 可切割接头连接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木 素生物碱偶联物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素 生物碱偶联物的毒性较低。
361.权利要求296或297所述的组合物，其中所述细胞结合剂美 登木素生物碱偶联物的血浆清除和单独的抗体大约相同。
362.权利要求296或297所述的组合物，其中与包括至少一个经 可切割接头连接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木 素生物碱偶联物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素 生物碱偶联物的最大耐受剂量较高。
363.权利要求296或297所述的组合物，其中与包括至少一个经 可切割接头连接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木 素生物碱偶联物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素 生物碱偶联物的生物活性持久性较高。
364.权利要求296或297所述的组合物，其中与包括至少一个经 可切割接头连接于细胞结合剂的美登木素生物碱的细胞结合剂美登木 素生物碱偶联物相比，所述包括不可切割接头的细胞结合剂美登木素 生物碱偶联物对抗原阴性细胞的活性较低。
365.权利要求296或297所述的组合物，其中所述细胞结合剂美 登木素生物碱偶联物显示出最小的旁观者效应。
366.制备权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱 偶联物的方法，所述方法包括：
(a)提供细胞结合剂
(b)用交联剂修饰所述细胞结合剂，和
(c)连接修饰的细胞结合剂和美登木素生物碱或含硫醇美登 木素生物碱，从而在细胞结合剂和美登木素生物碱或含硫醇美登木素 生物碱之间提供不可切割接头，生成偶联物。
367.制备权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱 偶联物的方法，所述方法包括：
(a)提供美登木素生物碱或含硫醇美登木素生物碱，
(b)用交联剂修饰所述美登木素生物碱或含硫醇美登木素生 物碱，从而形成不可切割接头，和
(c)连接修饰的美登木素生物碱或含硫醇美登木素生物碱以 及细胞结合剂，从而在细胞结合剂和美登木素生物碱或含硫醇美登木 素生物碱之间提供不可切割接头，生成偶联物。
368.制备权利要求226或227所述的细胞结合剂美登木素生物碱 偶联物的方法，所述方法包括：
(a)提供美登木素生物碱，
(b)用不含硫的交联剂修饰所述美登木素生物碱，产生美登木 素生物碱的酯，和
(c)连接所述美登木素生物碱的酯和细胞结合剂，从而在细胞 结合剂和美登木素生物碱之间提供不可切割接头，生成偶联物。
369.式5化合物：
其中X是具有2至20个碳原子的线性或分支的烷基、烯基或炔基， Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基，Z是具有6至10个碳原 子的取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的杂环基团，其中杂 原子选自N、O或S，并且l、m和n的每一个是0或1，条件是它们 不同时均为0；以及E和羰基一同形成活性酯如N-羟基琥珀酰亚胺基 和硫代琥珀酰亚胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺基酯、N-羟基硫代邻 苯二甲酰亚胺基酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯、3- 磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯，和磺酰基四氟苯 酯。
370.式6化合物：
其中n代表从3至24的整数，并且E和羰基一同形成活性酯如 N-羟基琥珀酰亚胺基和硫代琥珀酰亚胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺 基酯、N-羟基硫代邻苯二甲酰亚胺基酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、 2，4-二硝基苯酯、3-磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯， 和磺酰基四氟苯酯。
371.式7化合物：
其中R是H或SO3-Na+。
372.下式的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物：
曲妥珠单抗-SMCC-美登木素生物碱。
373.下式的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物：
曲妥珠单抗-SMCC-DM1。
374.下式的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物：
huC242-SMCC-美登木素生物碱。
375.下式的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物：
huC242-SMCC-DM1。
技术领域
[02]符合本发明的一种方法涉及，用经不可切割接头(non-cleavable linker)连接的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物(cell-binding agent maytansinoid conjugates)靶向特定细胞群。符合本发明的另一种方法是 制备所述偶联物的方法。符合本发明的一种组合物涉及新颖的细胞结 合剂美登木素生物碱偶联物，其中将美登木素生物碱经不可切割接头 连接于细胞结合剂。符合本发明的另一种组合物涉及新颖的美登木素 生物碱酯(maytansinoid esters)。
背景技术
[04]天然发生的和合成的C-3酯可以被分为两组：
(a)带有简单羧酸的C-3酯(美国专利4,248,870；4,265,814； 4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,317,821；4,322,348和4,331,598)， 和
(b)带有N-甲基-L-丙氨酸衍生物的C-3酯(美国专利4,137,230 和4,260,608；和Kaiwa等人，32 Chem.Pharm.Bull.3441-3451(1984))。
[05]发现组(b)的酯比组(a)的酯更有细胞毒性。
[06]美登素是有丝分裂抑制剂。已报道，用美登素在体内处理L1210 细胞，导致细胞的67％积累在有丝分裂期。据报道，未被处理的对照 细胞显示了范围在3.2％至5.8％之间的有丝分裂指数(Sieber等人.43 Bibl.Haematol.495-500(1976))。用海胆卵和蛤卵进行的实验表明，美 登素通过抑制微管蛋白质(microtubule)——微管蛋白(tubulin)的聚 合而干扰微管的形成，从而抑制有丝分裂(Remillard等人，189 Science 1002-1005(1975))。
[07]在体外，已发现P388、L1210和LY5178鼠白血病细胞悬液被美 登素抑制，美登素的剂量是10-3至10-1μg/ml，其中P388细胞系最为敏 感。也已显示，美登素是人鼻咽癌细胞的体外生长的活性抑制剂，并 且据报道，人急性淋巴细胞白血病系C.E.M.被低至10-7μg/ml的浓度所 抑制(Wolpert-DeFillippes等人，24 Biochem.Pharmacol.1735-1738 (1975))。
[08]也已显示，美登素在体内是活性的。在50倍至100倍的剂量范围 内，P388淋巴细胞白血病系统中的肿瘤生长被抑制，这表明了高的治 疗指数；用L1210鼠白血病系统、人Lewis肺癌系统和人B-16黑素癌 系统，也可以显示出显著的抑制活性(Kupchan，33 Ped.Proc.2288-2295 (1974))。
[09]由于美登木素生物碱是高度细胞毒性的，预期它们在治疗许多疾 病如癌症中有用。此预期尚需实现。美登素的临床试验不是令人满意 的，这归因于许多副作用(Issel等人，5 Cancer Treat.Rev.199-207 (1978))。对中枢神经系统和胃肠症状的不利作用(adverse effect)是一些 患者拒绝进一步治疗的原因(Issel at 204)，并且美登素似乎和周围神经 病相关，该周围神经病可能是累积的(Issel at 207)。
[10]因此，应用靶向技术(targeting techniques)将药物选择性地输送至靶 细胞(target cell)。对几种药物研究了可切割的和不可切割的接头，但是 在大多数情形下，包括美登木素生物碱的情形下，体外细胞毒性实验 揭示了，抗体-药物偶联物极少达到与游离的非连接药物相同的细胞毒 性能力。因此，普遍接受的是，为了使美登木素生物碱的靶向输送有 效，美登木素生物碱和细胞结合剂之间的连接必需是可切割的。
[11]此外，在免疫毒素(immunotoxin)领域中，已显示，含有接头的偶 联物，所述接头在单克隆抗体和有催化活性的蛋白毒素(toxins)之间具 有二硫桥键，比含其它接头的偶联物更具细胞毒性。参见，Lambert 等人，260 J.Biol.Chem.12035-12041(1985)；Lambert等人， Immunotoxins 175-209(A.Frankel，ed.1988)，和Ghetie等人，48 Cancer Res.2610-2617(1988)。这归因于细胞内谷胱甘肽的高浓度，其有助于 有效切割抗体分子和毒素之间二硫键。最近，经不可切割接头SMCC 连接于抗Her2乳腺癌抗体TA.1的美登木素生物碱偶联物显示出，比 经带有可切割二硫键的接头连接于TA.1的美登木素生物碱偶联物的效 力低200倍(Chari等人，52 Cancer Res.127-133(1992))。
[12]因此，试图找到通过含二硫的可切割接头连接的细胞毒性偶联物。 Shen等人描述了甲氨蝶呤转化为巯基乙酰胺衍生物，随后通过二硫键 与聚-D-赖氨酸(poly-D-lysine)连接(260 J.Biol.Chem.10905-10908 (1985))。也描述了制备含三硫的毒性药物加利车霉素(calicheamicin)与 抗体的偶联物(Menendez等人，Fourth International Conference on Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer，San Diego，Abstract 81(1989))。
[13]美国专利5,208,020和5,416,064，其全部公开内容在此特意并入作 为参考，公开了细胞毒性偶联物，其包括经可切割接头连接于特异性 美登木素生物碱衍生物的细胞结合剂，所述接头如含有二硫基团的接 头、含有酸不稳定基团的接头、含有光不稳定基团的接头、含有肽酶 不稳定基团的接头、和含有酯酶不稳定基团的接头。
[14]美国专利6,333,410B1，其全部公开内容特别地在此并入作为参考， 公开了制备和纯化用于和细胞结合剂连接的含硫醇的美登木素生物碱 的过程，以及美国专利6,441,163B1，其全部公开内容特别地在此并入 作为参考，公开了制备美登木素生物碱和细胞结合剂的细胞毒性偶联 物的一步法，其中接头是含二硫的可切割接头。
[15]此外，美国专利5,208,020教导了带有不可切割接头的抗体-美登木 素生物碱偶联物，其中接头包括马来酰亚胺基团(maleimido group)。然 而，该参考文献中没有实验数据证明这种偶联物对治疗疾病有效。
[16]出乎意料地，现在发现，经不可切割接头连接的美登木素生物碱 和细胞结合剂的细胞毒性偶联物非常有效，并且在许多情形下，比具 有可切割接头的美登木素生物碱和细胞结合剂的偶联物有出乎意料的 优势。
发明概述
[17]下面描述的本发明的例证性、非限制性实施方案克服了上述不利 之处和上面没有描述的其它不利之处。同时，本发明不需要克服上述 不利之处，下面描述的本发明的例证性、非限制性实施方案可以不克 服上述的任何问题。
[18]本发明的一个方面是，将美登木素生物碱(maytansinoid)靶向 (target)选择细胞群(selected cell population)的方法，包括，用细胞结合 剂美登木素生物碱偶联物接触细胞群或组织，该细胞群或组织被怀疑 含有来自所述选择细胞群的细胞，其中一个或多个美登木素生物碱通 过不可切割接头连接于细胞结合剂。
[19]本发明的另一方面是治疗肿瘤、自身免疫病、移植排斥、移植物 抗宿主病、病毒感染、寄生虫感染和其它疾病的方法，所述疾病可以 通过靶向疗法来治疗，其中靶向制剂(targeting agent)是细胞结合剂，所 述方法包括，向需要治疗的患者给予有效量的细胞结合剂美登木素生 物碱偶联物，其中一个或多个美登木素生物碱被连接于细胞结合剂， 或所述偶联物的药学上可接受的制剂(formulation)或溶剂合物 (solvate)。
[20]本发明的另一方面是细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其中一 个或多个美登木素生物碱经不可切割接头连接于细胞结合剂。
[21]本发明的另一方面是包括上述偶联物的组合物。
[22]本发明的另一方面是制备上述偶联物的方法。
[23]本发明的另一方面是新颖的美登木素生物碱酯。
附图简述
[24]图1显示了SMCC的结构。
[25]图2显示了DM1的结构。
[26]图3以图形显示了FACS结合试验(FACS binding assay)的结果，该 试验比较huC242抗体和抗体-美登木素生物碱偶联物 huC242-SMCC-DM1。
[27]图4以图形显示了huC242-SMCC-DM1的细胞毒性。
[28]图5显示了huC242-SMCC-DM1的尺寸排阻色谱(size exclusion chromatography)。
[29]图6A-C和图7以图形显示了，与用含二硫的接头制备的偶联物相 比，huC242-SMCC-DM1的细胞毒性。
[30]图8A-D以图形显示了连接于多种细胞结合剂的SMCC-DM1偶联 物的细胞毒性。
[31]图9以图形显示了抗体-美登木素生物碱偶联物 huC242-SIAB-DM1的细胞毒性。
[32]图10A以图形显示了，huC242-SMCC-DM1对抗SCID小鼠中的 COLO205人结肠癌异种移植物(xenografts)的抗肿瘤活性。
[33]图10B以图形显示了，huC242-SMCC-DM1对抗SCID小鼠中的 SUN16人胃肿瘤异种移植物的抗肿瘤活性。
[34]图10C以图形显示了，曲妥珠单抗-SMCC-DM1 (trastuzumab-SMCC-DM1)对抗SCID小鼠中的人MCF7肿瘤异种移植 物的抗肿瘤效应。
[35]图11以图形显示了，与用含二硫的接头制备的偶联物相比， huC242-SMCC-DM1的血浆清除率。
[36]图12A-C以图形显示了，与用含二硫的接头制备的偶联物相比， huC242-SMCC-DM1的急性毒性试验(acute toxicity studies)的结果。
[37]图13显示了，与用含二硫的接头制备的偶联物相比， huC242-SMCC-DM1显示的细胞周期停滞(cell cycle arrest)和细胞破坏 活性的持久性。
[38]图14A-D显示了用含二硫的接头制备的偶联物相比， huC242-SMCC-DM1的最小旁观者效应(bystander effect)活性。
[39]图15显示了基于马来酰亚胺(maleimido)的交联剂(cross-linking agent)的代表性结构。
[40]图16显示了基于卤代乙酰基(haloacetyl)的交联剂的代表性结构。
[41]图17显示了抗体-SMCC-DM1偶联物的结构。
[42]图18显示了抗体-SIAB-DM1偶联物的结构。
[43]图19显示了抗体-SMCC-DM4偶联物的结构。
[44]图20显示了抗体-SIAB-DM4偶联物的结构。
[45]图21显示了经不含S的不可切割接头连接的美登木素生物碱细胞 结合剂偶联物的合成过程。
[46]图22以图形显示了huC242-不含S的不可切割接头-DM1的细胞 毒性。
[47]图23以图形显示了huC242-不含S的不可切割接头-DM1的FACS 结合试验结果。
[48]图24以图形显示了HER2 ECD平板结合试验的结果，将曲妥珠单 抗和抗体-美登木素生物碱偶联物曲妥珠单抗-SMCC-DM1相比较。
[49]图25以图形显示了曲妥珠单抗-SMCC-DM1的细胞毒性和特异 性。
[50]图26显示了曲妥珠单抗-SMCC-DM1的尺寸排阻色谱。
[51]图27以图形显示了HER2 ECD平板结合试验的结果，将曲妥珠单 抗和抗体-美登木素生物碱偶联物曲妥珠单抗-SIAB-DM1相比较。
[52]图28以图形显示了曲妥珠单抗-SIAB-DM1的细胞毒性和特异性。
[53]图29显示了曲妥珠单抗-SIAB-DM1的尺寸排阻色谱。
本发明代表性实施方案详述
[54]本领域揭示了，修饰现有药物而不减低其细胞毒性潜能，是极端 困难的。然而，美国专利6,441,163 B1、6,333,410 B1、5,416,064和 5,208,020证明，可以经可切割接头，特别是含二硫基团的可切割接头， 将美登木素生物碱连接于合适的细胞结合剂，产生有效的细胞毒剂。 细胞结合剂美登木素生物碱偶联物使美登木素生物碱的细胞毒性作用 充分地以靶向方式被应用，仅对抗不需要的细胞，从而避免了由于损 害非靶向的健康细胞造成的副作用。
[55]本发明人出乎意料地发现，经不可切割接头连接于细胞结合剂的 美登木素生物碱，在几个重要方面优于经可切割接头连接的美登木素 生物碱。具体来说，当和含有可切割接头的偶联物相比时，带有不可 切割接头的偶联物显示了同等的体外和体内抗肿瘤活性，而在血浆清 除率和毒性方面，带有不可切割接头的偶联物显示了显著的降低。
[56]因此，本发明提供了改进的方法，用于靶向细胞，特别是欲被破 坏的细胞如肿瘤细胞(特别是实体瘤细胞)、病毒感染细胞、微生物感染 细胞、寄生虫感染细胞、自体免疫细胞(产生自身抗体的细胞)、活化细 胞(参与移植排斥或移植物抗宿主病的那些细胞)、或任何其它形式的患 病或非正常细胞，同时显示出最小的副作用。
[57]用于本发明方法的偶联物带有一个或多个美登木素生物碱，通过 不可切割的接头连接于细胞结合剂。在制备偶联物的一种方法中，首 先用交联剂如SMCC修饰细胞结合剂，例如抗体。在第二步骤中，带 有硫醇基团的活性美登木素生物碱，如DM1，和修饰的抗体反应，产 生抗体-美登木素生物碱偶联物。选择性地，可以用交联剂修饰美登木 素生物碱，随后使美登木素生物碱和细胞结合剂反应。参见，例如， 美国专利6,441,163 B1号。
合适的美登木素生物碱
[58]适用于本发明的美登木素生物碱在本领域中是已知的，并且可以 根据已知方法从天然来源分离，用遗传工程技术生产(参见，Yu等人， 99 PNAS 7968-7973(2002))，或根据已知方法合成制备。
[59]合适的美登木素生物碱的例子包括美登木醇和美登木醇类似物 (analogues)。合适的美登木醇类似物的例子包括包括那些具有修饰的 芳环和那些在其它位置带有修饰的化合物。
[60]具有修饰的芳环的合适的美登木醇类似物的具体例子包括：
(1)C-19-脱氯(美国专利4,256,746号)(经安丝菌素P2的LAH 还原而制备)；
(2)C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利 4,361,650和4,307,016号)(用链霉菌(Streptomyces)或放线菌 (Actinomyces)经去甲基化，或用LAH经脱氯化而制备)；和
(3)C-20-脱甲氧基，C-20-酰氧基(-OCOR)，+/-脱氯(美国 专利4,294,757号)(用酰基氯经酰化作用而制备)。
[61]在其它位置有修饰的合适的美登木醇类似物的具体例子包括：
(1)C-9-SH(美国专利4,424,219号)(通过美登木醇与H2S或 P2S5反应而制备)；
(2)C-14-烷氧甲基(去甲氧基/CH2OR)(美国专利4,331,598号)；
(3)C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利 4,450,254号)(从诺卡氏菌属(Nocardia)制备)；
(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利4,364,866号)(由链霉菌经美 登木醇的转化而制备)；
(5)C-15-甲氧基(美国专利4,313,946和4,315,929号)(从滑桃 树(Trewia nudiflora)分离)；
(6)C-18-N-去甲基(美国专利4,362,663和4,322,348号)(由链 霉菌进行美登木醇去甲基化而制备)；和
(7)4，5-脱氧(美国专利4,371,533号)(经美登木醇的三氯化肽 /LAH还原而制备)。
[62]已知美登木醇上的许多位点用作连接位点，这取决于连接的类型。 例如，对于形成酯键，带有羟基的C-3位点、用羟甲基修饰的C-14位 点、用羟基修饰的C-15位点和带有羟基的C-20位点，都是合适的。 然而C-3位点是优选的，并且美登木醇的C-3位点是特别优选的。
[63]根据本发明，优选的美登木素生物碱具有游离的硫醇基团。包括 游离硫醇基团的特别优选的美登木素生物碱包括含N-甲基-丙氨酸的 酯，美登木醇的含N-甲基-半胱氨酸的酯是美登木醇及其类似物的C-3 酯。优选的酯包括美登木醇的含N-甲基-丙氨酸的酯和含N-甲基-半胱 氨酸的酯。带有硫醇基团的美登木醇酯的合成方法在以前已经描述过， 例如美国专利5,208,020，Chari等人，52 Cancer Res.，127-131(1992)，和 Liu等人，93 Proc Natl.Acad.Sci.，8618-8623(1996)。此外，美国专利 6,333,410 B1，其全部公开内容在此并入作为参考，提供了制备和纯化 含硫醇美登木素生物碱的方法，所述美登木素生物碱适于和细胞结合 剂连接。
[64]下面示例的本发明的许多偶联物应用含硫醇美登木素生物碱 DM1，正式的命名是N2’-脱乙酰-N2’-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素。DM1 由下列结构式表示：
[65]含硫醇的美登木素生物碱DM1的合成方法在以前已经描述过(美 国专利5,208,020号)。
[66]美国专利申请10/849,136，其全部公开内容在此并入作为参考，描 述了含空间位阻(sterically hindered)硫醇的美登木素生物碱，其在带有 硫醇官能团的α-碳上具有一个或两个烷基取代基。此外，带有巯基的 美登木素生物碱的酰化的氨基酸侧链的酰基，在酰胺的羰基和硫原子 之间，具有至少3个碳原子的线性链长度。这些新颖的美登木素生物 碱适用于本发明。
[67]可以参照美国专利申请10/849,136，特别是其中的图3，描述具有 空间位阻硫醇基团的美登木素生物碱的合成方法。
[68]在本发明的一个方面，美登木素生物碱含有空间位阻的硫醇基团， 并且被表示为式(II’-L)、(II’-D)或(II’-D，L)：
在式(II’)中，
Y1’代表
(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt (CR3CR4)nCR1R2SH。
A、B和D，每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环 烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基。
R1至R12每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R12可以是H。
l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的每一个独立地是0或从1至5 的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为 0。
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基 (desmethyl)处带有侧链的美登木素生物碱。
[69]用于本发明的另一种美登木素生物碱被表示为式(II-L)、(II-D)或 (II-D，L)：
在式(II)中，
Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SH。
R1至R8每一个独立地是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、 具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯 基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2至R8可以是H。
l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外，n可以是0。
May代表在C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基 (desmethyl)处带有侧链的美登木醇。
[70]另一有用的美登木素生物碱被表示为式41’：
其中，取代基如上面的式(II’)所定义。
[71]另一有用的美登木素生物碱被表示为式41：
其中，取代基如上面的式(II)所定义。
[72]优选的是任意上述化合物，其中R1是H并且R2是甲基，或者R1 和R2是甲基。
[73]特别优选的是任意上述化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、 R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，并且n是0；和其中R1 和R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m是1，并且n是 0的那些化合物。
[74]进一步地，优选L-氨酰基立体异构体。
[75]具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基的例子包括但不限于，甲 基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、丙烯基、丁烯基和己烯基。
[76]具有3至10个碳原子的分支烷基或烯基的例子包括但不限于，异 丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、1-乙基丙基、异丁烯基和异 戊烯基。
[77]具有3至10个碳原子的环状烷基或烯基的例子包括但不限于，环 丙基、环丁基、环戊基、环己基、环戊烯基和环己烯基。
[78]简单的芳基(simple aryls)包括具有6至10个碳原子的芳基，取代 的芳基包括具有6至10个碳原子的芳基，其带有至少一个含1至4个 碳原子的烷基取代基，或烷氧基取代基如甲氧基、乙氧基，或卤素取 代基或硝基取代基。
[79]含有6至10个碳原子的简单的芳基的例子包括但不限于苯基和萘 基。
[80]取代的芳基的例子包括但不限于硝基苯基、二硝基苯基。
[81]杂环芳基包括具有3至10元环的基团，其含有一个或两个选自N、 O或S的杂原子。
[82]杂环芳基的例子包括但不限于，吡啶基、硝基吡啶基、吡咯基 (pyrollyl)、噁唑基、噻吩基、噻唑基和呋喃基。
[83]杂环烷基包括环状化合物，其包括3至10元环体系，包含一个或 两个杂原子，选自N、O或S。
[84]杂环烷基的例子包括但不限于，二氢呋喃、四氢呋喃、吡咯烷基、 哌啶基、哌嗪基和吗啉基(morpholino)。
[85]特别优选的、包括含有空间位阻硫醇键侧链的美登木素生物碱是 美登木素生物碱N2’-脱乙酰-N2’-(4-巯基-1-氧戊基)-美登素(被称为 DM3)和N2’-脱乙酰-N2’-(4-甲基-4-巯基-1-氧戊基)-美登素(被称为 DM4)。DM3和DM4被表示为下列结构式：
细胞结合剂
[86]本发明的化合物作为治疗剂的有效性取决于对合适的细胞结合剂 的仔细选择。细胞结合剂可以是目前已知的，或是正在成为已知的任 意种类，包括肽和非肽物质。通常地，它们可以是抗体(特别是单克 隆抗体)、淋巴因子、激素、生长因子、维生素、营养输送分子(如转 铁蛋白)、或特异地和靶结合的任意其它的细胞结合分子或物质。
[87]可以被应用的细胞结合剂的更具体的例子包括：
多克隆抗体和单克隆抗体；包括完整的人抗体；
单链抗体(多克隆抗体和单克隆抗体)；
抗体片段(多克隆抗体和单克隆抗体)如Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv (Parham，131 J.Immunol.2895-2902(1983)；Spring等人，113 J.Immunol. 470-478(1974)；Nisonoff等人，89 Arch.Biochem.Biophys.230-244 (1960))；
嵌合抗体及其抗原结合片段；
结构区抗体(domain antibodies)(dAbs)及其抗原结合片段，包括 camelid抗体(Desmyter等，3 Nature Struct.Biol，752，1996)；
称作新抗原受体(new antigen receptors)(IgNAR)的鲨鱼抗体 (Greenberg等，374 Nature，168，1995；Stanfield等305 Science 1770-1773，2004)；
干扰素(例如，α、β、γ)；
淋巴因子如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6；
激素如胰岛素、TRH(促甲状腺激素释放激素)、MSH(黑素细胞刺 激素)、类固醇激素如雄激素和雌激素；
生长因子和集落刺激因子如EGF、TGF-α、FGF、VEGF、G-CSF、 M-CSF和GM-CSF(Burgess，5 Immunology Today 155-158(1984))；
转铁蛋白(O′Keefe等，260 J.Biol.Chem.932-937(1985))；和
维生素，如叶酸盐或酯。
[88]单克隆抗体技术使得以特异的单克隆抗体的形式产生极度特异的 细胞结合剂。在本领域中，制备单克隆抗体的技术是特别公知的，所 述抗体是通过用感兴趣的抗原免疫小鼠、大鼠、仓鼠或任意其它的哺 乳动物而产生的，所述抗原例如完整的靶细胞、从靶细胞分离的抗原、 全病毒、减毒的全病毒和病毒蛋白如病毒衣壳蛋白。也可以应用致敏 的人细胞。制备单克隆抗体的另一种方法是应用scFv(单链可变区) 噬菌体文库，特别是人scFv噬菌体文库(参见，例如，Griffiths等， 美国专利5,885,793和5,969,108号；McCafferty等，WO 92/01047； Liming等，WO 99/06587)。此外，也可以应用美国专利5,639,641号 中公开的表面重构抗体，如可以应用人源化的抗体。
[89]对合适的细胞结合剂的选择，取决于欲靶向的特定细胞群，但通 常地，如果可以得到合适的人单克隆抗体，则优选人单克隆抗体。
[90]例如，单克隆抗体J5是鼠IgG2a抗体，其对普通型急性淋巴细胞 白血病抗原(CALLA)具有特异性(Ritz等，283 Nature 583-585(1980))， 如果靶细胞表达CALLA，如在急性淋巴细胞白血病时，可以应用该抗 体。
[91]单克隆抗体MY9是鼠IgG1抗体，其特异性结合于CD33抗原(J.D. Griffin等8 Leukemia Res.，521(1984))，如果靶细胞表达CD33，例如 在急性骨髓性白血病(AML)中，可以应用该抗体。
[92]类似地，单克隆抗体抗B4，也可以互换地称为B4，是鼠IgG1， 其结合于B细胞上的CD19抗原(Nadler等，131 J.Immunol.244-250 (1983))，如果靶细胞是表达此抗原的B细胞或患病细胞，例如在非霍 奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病中，可以应用该抗体。
[93]此外，单克隆抗体C242，其结合于CanAg抗原(美国专利5,552,293 号)，可以用其治疗表达CanAg的肿瘤，如直肠癌、胰腺癌、非小细胞 肺癌和胃癌。HuC242是单克隆抗体C242的人源化形式，在美国专利 5,552,293中描述，其杂交瘤保藏于欧洲生物制品收藏中心(ECACC)， 保藏编号(identification Number)是90012601。人源化形式可以通过应用 CDR-移植方法学(CDR-grafting methodology)(美国专利5,585,089； 5,693,761和5,693,762号)或表面重构方法学(resurfacing methodology)(美国专利5,639,641号)而制备。也可以用HuC242治疗表 达CanAg的肿瘤，如直肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和胃癌。
[94]进一步地，可以用抗体曲妥珠单抗治疗乳腺癌和其它癌症，如表 达Her2抗原的前列腺癌和卵巢癌。
[95]结合于胰岛素生长因子受体的抗-IGF-IR抗体也是有用的。
[96]可以用例如抗-MUCI抗体，如抗-HMFG-2(Taylor-Papadimitriou等， 28.Int.J.Cancer 17-21，1981)或hCTM01(56 Cancer Res. 5179-5185，1996)和抗-PSMA(前列腺特异性膜抗原)如J591(Liu等57 Cancer Res.3629-3634，1997)，分别成功地靶向于卵巢癌和前列腺癌。
[97]可以用非抗体分子靶向特定细胞群。例如，可以将结合于骨髓细 胞的GM-CSF用作细胞结合剂，靶向于来自急性髓性白血病的患病细 胞。此外，可以用与活化的T细胞结合的IL-2预防移植排斥，用以治 疗和预防移植物抗宿主病和治疗急性T细胞白血病。可以用结合于黑 素细胞的MSH治疗黑素瘤。可以用叶酸靶向于卵巢癌和其它肿瘤上表 达的叶酸受体。可以用表皮生长因子(EGF)靶向于鳞癌如肺部和头部以 及颈部的鳞癌。可以用生长激素释放抑制因子靶向神经母细胞瘤和其 它肿瘤类型。可以分别用雌激素(或雌激素类似物)或雄激素(或雄激素 类似物)作为细胞结合剂，成功地靶向乳腺癌和睾丸癌。
交联剂(cross-linking reagent)
[98]美登木素生物碱是通过交联剂的方式连接于细胞结合剂的，所述 交联剂在反应时，在美登木素生物碱和细胞结合剂之间形成不可切割 接头。
[99]如此处所应用，“接头”(linker)是将细胞结合剂共价连接于美登木 素生物碱的任何化学部分。在一些情况下，接头的一部分是美登木素 生物碱提供的。例如，DM1，其为含硫醇美登木素生物碱(图2)，是天 然的美登木素生物碱——美登素的衍生物，并且提供了一部分接头。 美登素C-3羟基处的侧链终止于-CO-CH3，DM1的侧链终止于 -CO-CH2-CH2-SH。因此，最终的接头是由两个部分组成的，交联剂被 导入细胞结合剂和来自DM1的侧链中。
[100]可切割接头是，在适度条件下可以被切割的接头，即，在所述 条件下，美登木素生物碱药物的活性未受影响。许多已知接头属于此 范围内，描述于下。
[101]含二硫的接头是可以通过二硫交换(disulfide exchange)而切割的 接头，这在生理条件下可以发生。
[102]酸不稳定接头是，在酸性pH下可切割的接头。例如，一些细胞 内区室如胞内体(endosome)和溶酶体，具有酸性的pH值(pH4-5)， 提供了适于切割酸不稳定接头的条件。
[103]在体表和可以接受光的许多体腔中，光不稳定接头是有用的。 此外，红外光可以穿透组织。
[104]一些接头可以被肽酶切割。仅一些肽容易在细胞内或细胞外被 切割。参见，Trouet等，79 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，626-629(1982)和 Umemoto等43 Int.J.Cancer，677-684(1989)。此外，肽由α-氨基酸和 肽键组成，肽键在化学上是一个氨基酸的羧酸酯和第二个氨基酸的α- 氨基之间的酰胺键。其它的酰胺键，如赖氨酸的羧酸酯和ε-氨基之间 的键，被理解为不是肽键，并且被认为是不可切割的。
[105]一些接头可以被酯酶切割。同样地，仅一些酯可以被存在于细 胞内和细胞外的酯酶切割。酯由羧酸和醇缩合形成。简单酯是简单醇 生成的酯，如脂族醇以及小的环状醇和小的芳香醇。例如，本发明的 发明人没有发现在美登素C-3处切割酯的酯酶，原因是该酯的醇组分 美登木醇，是非常大和非常复杂的。
[106]不可切割的接头是，能够以稳定的共价方式将美登木素生物碱 连接于细胞结合剂，并且不被归入如上列出的可切割接头范围的任何 化学部分。因此，不可切割接头基本上抗酸诱导的切割、光诱导的切 割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割。
[107]“基本上抗”(substantially resistant)切割意味着，在细胞结合剂 美登木素生物碱偶联物群的至少80％、优选地至少85％、更优选地至 少90％、甚至更优选地至少95％、和最优选地至少99％中，接头中或 与接头相连的化学键保持不被酸、光不稳定切割剂、肽酶、酯酶或化 学或生理化合物所切割，所述化合物切割可切割接头中的化学键(如二 硫键)，持续时间是用上述任何制剂处理几小时至几天内。
[108]此外，“不可切割”(non-cleavable)是指，在美登木素生物碱或细 胞结合剂不丧失其活性的条件下，接头中或与接头相连的化学键抵抗 切割的能力，所述切割是由酸、光不稳定切割剂、肽酶、酯酶或切割 二硫键的化学或生理化合物诱导的。
[109]本领域的普通技术人员将容易地将不可切割接头和可切割接头 区分开来。
[110]用于检验一个接头是否基本上抗切割的合适对照物(control)的 例子是，带有化学键如二硫键的接头，其对上述任意制剂的切割敏感。 在从几小时至几天之间的时间段内，典型地是4小时至5天，通过用 ELISA、HPLC或其它合适的方法测定偶联物的稳定性，可以检验接头 是否基本上抗切割。可以用ELISA分析测定稳定的偶联物的血浆浓度 水平。
[111]不可切割接头也被表征为，含有不可切割接头的偶联物的体内 半衰期比含有可切割接头的偶联物的半衰期通常长大约20％。在小鼠 中，经不可切割接头连接的IgG-美登木素生物碱偶联物的体内半衰期 是至少4天。
[112]在美登木素生物碱和细胞结合剂之间形成不可切割接头的合适 的交联剂，是本领域中已知的，并且可以形成含有硫原子(如SMCC) 或不带有硫原子的不可切割接头。
[113]在美登木素生物碱和细胞结合剂之间形成不可切割接头的优选 的交联剂，包括基于马来酰亚胺或卤代乙酰基的部分。根据本发明， 将这种不可切割接头表述为，来源于基于马来酰亚胺或卤代乙酰基的 部分。包括基于马来酰亚胺部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺基4-(马 来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚 胺甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)，其为SMCC的“长链”类 似物(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、 γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺己酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚 胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺乙酸基)-琥珀酰亚胺酯[AMAS]、琥珀 酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基 4-(p-马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)、和N-(p-马来酰亚胺苯基)异氰 酸酯(PMPI)(关于基于马来酰亚胺的交联剂的代表性结构，参见图15)。 这些交联剂形成不可切割接头，所述接头来源于基于马来酰亚胺的部 分。
[114]包括基于卤代乙酰基部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺基-4-(碘 乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥 珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯 (SBAP)(关于基于卤代乙酰基的交联剂的代表性结构，参见图16)。这 些交联剂形成不可切割接头，所述接头来源于基于卤代乙酰的部分。
[115]尽管图15和16中描述的活性酯是由N-琥珀酰亚胺基和硫代琥 珀酰亚胺基酯组成的，但也可以应用其它活性酯，如N-羟基邻苯二甲 酰亚胺基酯、N-羟基硫代邻苯二甲酰亚胺基酯、邻-硝基苯酯、对-硝基 苯酯、2，4-二硝基苯酯、3-磺酰基-4-硝基苯酯、3-羧基-4-硝基苯酯、五 氟苯酯，和磺酰基四氟苯酯。
[116]特别优选的交联剂形成不含有硫原子的不可切割接头。图21显 示了与交联剂发生衍生作用(derivatized with)的美登木素生物碱分子， 所述交联剂来源于α，ω-二羧酸(烷烃或烯烃二酸，其中烷烃或烯烃有 3-24个碳原子)。当与细胞结合剂反应时，交联剂将形成不含硫的不可 切割接头(不含S的不可切割接头)。
[117]图21的美登木素生物碱分子是如下制备的。首先，在二环己基 碳二亚胺存在下，用一当量的2-三甲基甲硅烷乙醇 (2-trimethysilylethanol)处理，制备己二酸(也称作己二酸(hexanedioic acid)或1，6-己烷二羧酸)单酯。用异丁基氯甲酸酯活化剩余的羧酸基团， 随后和N-甲基-L-丙氨酸反应，产生酰化的N-甲基-L-丙氨酸。在二环 己基碳二亚胺和氯化锌存在下，和美登木醇反应，随后用氯化四丁基 铵去除三甲基甲硅烷保护基团，生成带有游离羧基的美登木素生物碱 的酯。在二环己基碳二亚胺存在下和硫代N-羟基琥珀酰亚胺反应，酯 化羧基，生成美登木醇的活性酯，其可以和细胞结合剂反应，得到不 含有硫原子的不可切割的偶联物。
[118]应用上述方法，不含硫原子的不可切割接头也可以来源于基于 其它二羧酸的部分。基于其它二羧酸的合适部分包括但不限于，通式 (IV)的α，ω-二羧酸：
HOOC-Xl-Yn-Zm-COOH
(IV)
[119]在式(IV)中，X是具有2至20个碳原子的线性或分支的烷基、 烯基或炔基，Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基，Z是具有 6至10个碳原子的取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的杂环 基团，其中杂原子选自N、O或S，并且其中l、m和n的每一个是0 或1，条件是它们不同时均为0。
[120]美登木素生物碱可以由式5表示，所述美登木素生物碱被衍生， 以含有活性酯，该活性酯可以和细胞结合剂直接反应，形成带有不含S 的不可切割接头的偶联物：
其中X、Y、Z、l、m和n均如上面的式(IV)所定义，进一步地， 其中E和羰基一同形成活性酯如N-羟基琥珀酰亚胺基和硫代琥珀酰亚 胺基酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺基酯、N-羟基硫代邻苯二甲酰亚胺基 酯邻-硝基苯酯、对-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯、3-磺酰基-4-硝基苯酯、 3-羧基-4-硝基苯酯、五氟苯酯，和磺酰基四氟苯酯。
[121]优选的是衍生的美登木素生物碱，表示为式6：
其中n代表从3至24的整数，E和式5的美登木素生物碱的限定相同。
[122]更优选的实施方案是衍生的美登木素生物碱，表示为式7：
其中R是H或SO3-Na+。
[123]式5、6和7的化合物是新的美登木素生物碱。
[124]具有2至20个碳原子的线性烷基、烯基或炔基的例子包括但不 限于，乙基、丙基、丁基、戊基、己基、丙烯基、丁烯基和己烯基。
[125]具有2至20个碳原子的分支烷基、烯基或炔基的例子包括但不 限于，异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、1-乙基丙基、异丁 烯基、异戊烯基、乙炔基、丙炔基(炔丙基)、1-丁炔基、2-丁炔基，和1- 己炔基。
[126]具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基的例子包括但不限于， 环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环戊烯基、环己烯基和环庚二烯 基。
[127]含有6至10个碳原子的芳基的例子包括但不限于，苯基和萘基。
[128]取代的芳基的例子包括但不限于，硝基苯基和二硝基苯基。
[129]杂环芳基包括但不限于，具有3至10元环的基团，其含有一个 或两个选自N、O或S的杂原子。
[130]取代的和未取代的杂环芳基的例子包括但不限于，吡啶基、硝 基吡啶基、吡咯基(pyrollyl)、噁唑基、噻吩基、噻唑基和呋喃基。
[131]杂环烷基包括但不限于环状化合物，其包括3至10元环体系， 包含一个或两个杂原子，选自N、O或S。
[132]杂环烷基的例子包括但不限于，二氢呋喃、四氢呋喃、四氢吡 咯基(tetrahydropyrollyl)、哌啶基、哌嗪基和吗啉基。
[133]通式HOOC-Xl-Yn-Zm-COOH的α，ω-二羧酸的例子包括但不限 于，己二酸、戊二酸、庚二酸、己烯-1，6-二酸、戊烯-1，5-二酸、环己烷 -二酸、和环己烯-二酸。
细胞毒性偶联物的合成
[134]可以用任何目前已知或以后开发出的技术，形成细胞结合剂和 美登木素生物碱的偶联物。
[135]连接细胞结合剂和美登木素生物碱的方法通常涉及两个反应步 骤。在一种方法中，其描述于美国专利5,208,020中，可以用交联剂修 饰细胞结合剂如抗体，以导入一个或多个活性基团，通常是1-10个。 然后，使修饰的细胞结合剂与一个或多个含硫醇的美登木素生物碱反 应，生成偶联物。
[136]选择性地，如美国专利6,441,163 B1所公开，首先可以用交联 剂修饰含硫醇的美登木素生物碱，随后使修饰的美登木素生物碱和细 胞结合剂反应。例如，可以使含硫醇的美登木素生物碱和图15描述的 马来酰亚胺化合物或图16描述的卤代乙酰基化合物反应，得到带有活 性琥珀酰亚胺基酯或硫代琥珀酰亚胺基酯的美登木素生物碱硫醚。含 有活性接头部分的这些美登木素生物碱和细胞结合剂的反应，提供了 产生不可切割的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物的另一方法。
[137]如上所公开，在本发明的另一方面，可以首先用基于二羧酸的 交联剂而衍生不含硫原子的美登木素生物碱，随后使美登木素生物碱 和细胞结合剂反应，形成偶联物，其中美登木素生物碱通过不含S的 不可切割接头连接于细胞结合剂。
[138]典型地，每个抗体连接平均1-10个美登木素生物碱。可以通过 Sephadex G-25柱纯化偶联物。
[139]美国专利5,208,020和6,441,163 B1的全部公开内容特别地在此 并入作为参考。
[140]本发明的代表性偶联物是抗体-美登木素生物碱衍生物，抗体片 段-美登木素生物碱衍生物，生长因子-美登木素生物碱偶联物如表皮生 长因子(EGF)-美登木素生物碱衍生物，激素-美登木素生物碱偶联物如 促黑素细胞激素(MSH)-美登木素生物碱衍生物、促甲状腺激素(TSH)- 美登木素生物碱衍生物、雌激素-美登木素生物碱衍生物、雌激素类似 物-美登木素生物碱衍生物、雄激素-美登木素生物碱衍生物、雄激素类 似物-美登木素生物碱衍生物，和维生素-美登木素生物碱偶联物如叶酸 美登木素生物碱。
[141]抗体、抗体片段、蛋白激素、蛋白生长因子和其它蛋白的美登 木素生物碱偶联物是以相同的方法制备的。例如，可以用上面提到的 不可切割的交联剂修饰肽和抗体。抗体在含水缓冲液中的溶液可以和 摩尔数过量的抗体修饰交联剂(antibody-modifying cross-linking reagent) 温育，抗体修饰交联剂如琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1- 羧酸酯(SMCC)、硫代-SMCC、-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚 胺酯(MBS)、硫代-MBS、琥珀酰亚胺基-碘乙酰酯、或N-琥珀酰亚胺基 -4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺 甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)，其为SMCC的长链类似物 (LC-SMCC)、硫代-LC-SMCC、κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥珀酰亚胺 基酯(KMUA)、硫代-KMUA、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯 (GMBS)、硫代-GMBS、ε-马来酰亚胺己酸N-羟琥珀酰亚胺酯(EMCS)、 硫代-EMCS、N-(α-马来酰亚胺乙酸基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、硫代 -AMAS、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、硫 代-SMPH、N-琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)、 硫代-SMPH、N-(p-马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMPI)、N-琥珀酰亚胺基 -4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、 N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸 酯(SBAP)，如文献中所描述。参见，Yoshitake等，101 Eur.J.Biochem. 395-399(1979)；Hashida等，J.Applied Biochem.56-63(1984)；和Liu 等，18 690-697(1979)；Uto等，138 J.Immunol.Meth.87-94(1991)；Rich 等18 J.Med.Chem.1004-1010(1975)；Kitagawa and Aikawa，79 J. Biochem.(Tohyo)233-236(1976)；Tanimori等，62 J.Immunol.Meth. 123-128(1983)；Hashida等，6 J.Appl.Biochem.56-63(1984)；Thorpe 等，140 Eur.J.Biochem.63-71(1984)，Chrisey等24 Nucl.Acid Res. 3031-3039(1996)，Annunziato等，4 Bioconjugate Chem.212-218(1993)， Rector等，24 J.Immunol.Meth.321-336(1978)，和Inman等2 Bioconjugate.Chem.458-463(1991)。
[142]然后，用含硫醇美登木素生物碱处理修饰的抗体(1.25摩尔当量/ 马来酰亚胺基或碘乙酰基)，产生偶联物。使混合物在大约4℃温育过 夜。经Sephadex G-25柱凝胶过滤纯化抗体-美登木素生物碱偶联物。 分光光度法测定252nm和280nm处的吸光度的比值，确定每个抗体分 子结合的美登木素生物碱分子的数目。典型地，每个抗体结合平均1-10 个美登木素生物碱。
[143]一种优选的方法是，用琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环 己烷-1-羧酸酯(SMCC)修饰抗体，导入马来酰亚胺基，随后使修饰的抗 体与含硫醇美登木素生物碱反应，得到硫醚连接的偶联物。也得到了 每个抗体分子带有1至10个药物分子的偶联物。抗体-美登木素生物碱 偶联物的例子显示于图17-20。
[144]相似地，例如，通过和适当保护的含硫醇的氯化羧酸(carboxylic acid chloride)如3-S-乙酰丙酰氯(3-S-acetylpropanoyl chloride)反应，雌激 素和雄激素细胞结合剂如雌二醇和雄二醇的C-17羟基可以被酯化。也 可以应用其它酯化方法，如文献中所述(Haslam，36 Tetrahedron 2400-2433(1980))。然后，保护的或含游离硫醇的雄激素或雌激素可以 和含硫醇美登木素生物碱反应，生成偶联物。偶联物可以经柱层析在 硅胶上纯化，或经HPLC纯化。
[145]一种特别优选的方法是，用交联剂修饰美登木素生物碱，所述 交联剂导致不含任何硫原子的连接，随后使修饰的美登木素生物碱和 抗体反应，生成偶联物。
本发明的细胞毒性偶联物的治疗效应
[146]可以评价本发明的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，评价它 们在体外抑制多种细胞系增殖的能力。例如，可以用细胞系如人结肠 癌细胞系COLO 205、人黑素瘤细胞系A-375、人骨髓白血病细胞系 HL 60、人乳腺癌细胞系SKBR3、或人表皮样癌细胞系KB评价这些偶 联物的细胞毒性。可以将欲被评价的细胞暴露于化合物24小时，并通 过已知方法直接分析来测定细胞的存活分数。(参见，例如，Goldmacher 等，135 J.Immunol.3648-3651(1985)，和Goldmacher等，102 J.Cell Biol.1312-1319(1986).)。然后，从分析结果可以计算出IC50值。
[147]高细胞毒性被定义为，显示出IC50值(毒性物质的抑制浓度，所 述毒性物质允许的存活分数为0.5)为大约10-8M或更低的细胞毒性，这 是用SKBR3在体外暴露于药物24小时时所测定的。
[148]图4显示了本发明的抗体-美登木素生物碱偶联物的体外效力和 靶特异性。用交联剂SMCC的huC242与DM1的偶联物对于破坏抗原 阳性的SKBR3细胞，是高度有效的，IC50值是3.5×10-12M。与之对 照，抗原阴性的A-375细胞的敏感度低大约800倍，这说明本发明的 美登木素生物碱偶联物是高度有效的和高度特异的。
[149]在克隆形成试验(clonogenic assay)(图6A-C)和间接细胞毒性试 验(图7)中，与用含二硫的接头制备的偶联物相比，huC242-SMCC-DM1 偶联物具有相同的或更大的效力。基于以前公开的数据，这些结果是 出乎意料的，以前公开的数据证明，通过SMCC连接于美登木素生物 碱的抗Her2抗体不显示特异活性(Chari等，52 Cancer Res.127-133 (1992)。
[150]用SMCC不可切割接头制备的偶联物的活性不限于huC242偶 联物。用抗Her2抗体曲妥珠单抗；抗CD33抗体My9-6；抗EGFR抗 体KS77；和抗CD56抗体N901的SMCC-DM1偶联物也观察到体外特 异活性(图8A-D和25)。
[151]此外，在体外显示出特异活性的带有不可切割接头的偶联物不 限于SMCC接头。在体外克隆形成试验中，用不可切割接头SIAB合 成的DM1的huC242偶联物，显示了效力和抗原特异性细胞毒性(图9)。 进一步地，在克隆形成试验中，用SIAB合成的DM1的曲妥珠单抗偶 联物也是细胞毒性的(图28)。进一步地，在体外克隆形成试验中， huC242-不含S的不可切割接头-DM1偶联物也证实了效力和抗原特异 性细胞毒性(antigen-specific cytotoxicity)(图22)。
[152]应用SMCC接头的抗体与DM1的偶联物在小鼠中显示了对抗 人肿瘤异种移植物的效应(图10A-C)。用huC242-SMCC-DM1处理 SNU16胃肿瘤移植物之后，观察到肿瘤生长的显著抑制(图10A)。在 不影响小鼠体重的偶联物剂量下观察到此抗肿瘤活性，小鼠体重是药 物毒性的一个衡量标准。用huC242-SMCC-DM1偶联物处理带有 COLO205结肠癌肿瘤异种移植物的小鼠，导致肿瘤完全消退，一些小 鼠在处理后2个月期间保持没有可检测到的肿瘤(图10B)。再次地，在 不影响小鼠体重的偶联物浓度下得到此活性。在带有MCF-7乳腺癌细 胞系的小鼠肿瘤异种移植物模型中，曲妥珠单抗-SMCC-DM1偶联物也 显示出显著的肿瘤消退作用(图10C)。
[153]用不可切割接头SMCC合成的抗体-美登木素生物碱偶联物的 血浆清除率(plasma clearance)是非常慢的，并且比得上抗体单独的清除 率。这与用相对不稳定的二硫键制备的偶联物如huC242-SPP-DM1的 血浆清除形成鲜明的对照。例如，SMCC偶联物清除的半衰期是大约 320小时，而SPP偶联物的半衰期是40-50小时范围(图11)。然而，每 一类偶联物的抗体组分的清除率是相同的，这提示，在SPP-DM1偶联 物的情形下，测定的偶联物清除率的差异归因于美登木素生物碱从抗 体偶联物的丢失。不可切割的SMCC接头从而比SPP-DM1偶联物对 存在于体内的美登木素生物碱-接头切割活性更具有抵抗性。进一步地， 与SPP-DM1偶联物相比，SMCC连接的偶联物的清除率降低，导致动 物的美登木素生物碱总暴露量增加几乎5倍，如曲线下面积(AUC)所测 定。在一些情形下，此增加的暴露对药物效应可以有实质上的影响。
[154]与用可切割的二硫接头制备的偶联物相比，用不可切割接头如 SMCC制备的美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示出不曾意料的增加 的耐受能力(tolerability)。在雌性CD-1小鼠中进行了应用单次静脉内剂 量的急性毒性试验。通过监测小鼠死亡(图12A和B)以及毒性体征(图 12C和D)，在每一偶联物的4个逐渐上升的系列剂量范围，对 huC242-SMCC-DM1偶联物(不可切割)和用含有可切割二硫键的接头 制备的huC242偶联物的耐受能力进行比较。SMCC-DM1偶联物的最 大耐受剂量(MTD)比检测的最高剂量(150mg/kg)高，而二硫连接的偶联 物SPP-DM1的MTD范围是45-90mg/kg。在150mg/kg时，SMCC-DM1 处理组的所有小鼠存活，而在处理后96小时，SPP-DM1处理组的所有 小鼠中观察到致死毒性(lethal toxicity)。
[155]认为美登木素生物碱偶联物通过抑制微管蛋白质的聚合而施加 其细胞破坏的活性。微管蛋白质多聚化的这种抑制导致细胞周期停滞， 主要在G2/M期。由抗体-美登木素生物碱偶联物造成的细胞抗原依赖 性停滞在G2/M期，可以通过流式细胞仪分析来监测(图13)。用 huC242-SPP-DM1或huC242-SMCC-DM1偶联物处理COLO205细胞， 导致在6-10小时的完全G2/M期停滞。然而，在处理后30小时，由于 用二硫连接的huC242-SPP-DM1偶联物处理而停滞的一些细胞，逃脱 了细胞周期停滞并重新开始细胞分裂。令人惊讶的是，在此较晚的时 间点，用不可切割偶联物处理的细胞不逃脱细胞周期阻滞。这两种偶 联物活性的持久性的差异也反映在30小时时间点处的死亡细胞的百分 数上，如应用台盼兰进行的染料排斥试验(dye exclusion assay)所断定。 这些结果证明了该分子事件的不曾预料的持久性，所述事件是用不可 切割的SMCC接头偶联物处理而诱导的。
[156]用不可切割接头制备的偶联物相比于具有可切割二硫接头的偶 联物的另一方面是，当其密切接近抗原阳性细胞时，对抗原阴性细胞 没有活性，这在此被称为旁观者效应。即，用不可切割接头制备的偶 联物有最小的旁观者活性。当分别培养时，huC242-SPP-DM1(可切割) 和huC242-SMCC(不可切割)偶联物均对抗原阳性COLO205细胞系显 示出细胞破坏活性，并且对抗原阴性细胞系Namalwa没有活性(图 14A-D)。然而，用huC242-SPP-DM1处理COLO205和Namalwa的共 培养物揭示，偶联物甚至对抗原阴性Namalwa细胞显示出显著的细胞 破坏活性。与之对照，在这些情况下，huC242-SMCC-DM1偶联物不 显示任何这样的旁观者活性。甚至在Namalwa细胞和抗原阳性 COLO205细胞共培养时，用huC242-SMCC-DM1偶联物没有观察到对 Namalwa细胞的细胞破坏活性。如此体外分析所测定，不可切割偶联 物的这种最小旁观者活性，可以有助于急性毒性试验中观察到的带有 不可切割接头的偶联物的耐受能力增加。
[157]上面的实验结果说明，和以前描述的细胞结合剂美登木素生物 碱偶联物相比，本发明的带有不可切割接头的美登木素生物碱偶联物 具有大大改进的抗肿瘤活性。
使用方法
[158]可以将上述偶联物用于将美登木素生物碱靶向于选择细胞群的 方法，方法包括：用细胞结合剂美登木素生物碱偶联物接触怀疑含有 选择细胞群的细胞群或组织，其中一个或多个美登木素生物碱通过不 可切割接头共价连接于细胞结合剂，并且细胞结合剂结合于选择细胞 群中的细胞。
[159]也可以将上述偶联物用于破坏细胞的方法中，方法包括：用细 胞结合剂美登木素生物碱偶联物接触细胞，其中一个或多个美登木素 生物碱通过不可切割接头共价连接于细胞结合剂，并且细胞结合剂和 细胞结合。
[160]也可以将上述偶联物用于治疗病痛的方法中，所述病痛包括但 不限于，恶性肿瘤、自身免疫病、移植排斥、移植物抗宿主病、病毒 感染、微生物感染、和寄生虫感染，方法包括：向需要治疗的对象给 予有效量的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其中一个或多个美登 木素生物碱通过不可切割接头共价连接于细胞结合剂，并且细胞结合 剂与病痛的患病细胞或感染细胞结合。
[161]可以根据本发明方法治疗的医疗状况的例子包括但不限于任何 类型的恶性肿瘤，包括例如，肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肾 癌、胰腺癌、卵巢癌和淋巴器官癌症；自身免疫病如系统性红斑狼疮、 风湿性关节炎、和多发性硬化；移植排斥如肾移植排斥、肝移植排斥、 肺移植排斥、心脏移植排斥和骨髓移植排斥；移植物抗宿主病；病毒 感染如CMV感染、HIV感染、AIDS等等；和寄生虫感染如贾第鞭毛 虫病、阿米巴病、血吸虫病、和如本领域的普通技术人员所确定的其 它疾病。
[162]本方法可以在体外或体内实施。
[163]可以将上述偶联物用于体外应用的方法，以处理例如自体骨髓 细胞，这是在将它们植入同一患者之前实施的，目的是破坏患病细胞 或恶性细胞；处理骨髓细胞或其它组织，这是在移植它们之前实施的， 目的是破坏T细胞和其它淋巴样细胞(lymphoid cells)并防止移植物抗 宿主病(GVHD)；处理细胞培养物，目的是破坏除不表达靶抗原的所需 变异体(variants)之外的所有细胞；或处理细胞培养物，目的是破坏表达 不期望抗原的变异细胞；方法包括，用有效量的细胞结合剂美登木素 生物碱偶联物处理细胞，其中一个或多个美登木素生物碱通过不可切 割接头共价连接于细胞结合剂，并且细胞结合剂结合于欲破坏的细胞。
[164]本领域的普通技术人员容易确定临床和非临床体外用途的情 况。
[165]例如，可以如下进行处理。可以从患者或其它个体采集骨髓， 然后在含有血清的培养基中温育，培养基中加入本发明的细胞毒剂， 浓度范围是从大约10pM至1nM，在大约37℃持续大约30分钟至大约 48分钟。本领域的普通技术人员可以容易地确定确切的浓度条件和温 育时间，即剂量。温育之后，用含有血清的培养基洗涤骨髓细胞，并 且根据已知方法经静脉回输给患者。在采集骨髓和再输注处理细胞的 时间之间，患者接受其它治疗如消融化疗过程或全身放疗过程的情况 下，可以用标准的医疗设备，将处理的骨髓细胞冷冻保存在液氮中。
[166]对于临床体内用途，可以将细胞毒剂以溶液或冻干粉末供应， 所述溶液或冻干粉末被检测了无菌状态和内毒素水平。如下是给予偶 联物的合适方案的例子。可以每周给予偶联物，持续4周，给予的是 静脉丸剂(intravenous bolus)的形式。丸剂量(Bolus doses)可以在50至 500ml的标准生理盐水中给予，生理盐水中可以加入5至10ml的人血 清白蛋白。剂量将是，每次给药10mg至2000mg，静脉内给予(范围是 每日100ng至20mg/kg)。治疗4周之后，患者可以在每周的基础上(on weekly basis)继续接受治疗。
[167]关于给药路径、赋形剂、稀释剂、剂量、时间等等的具体的体 内临床方案，可以由本领域的普通技术人员随临床情况允许而确定。
[168]如果需要，可以随偶联物给予其它的活性剂如其它抗肿瘤剂。 新的偶联物、组合物和制备偶联物的方法
[169]尽管经不可切割接头连接的抗体和美登木素生物碱的一些偶联 物是已知的，但是其它的偶联物是新的。因此，提供了细胞结合剂美 登木素生物碱偶联物，其具有至少一个美登木素生物碱，通过不可切 割接头和细胞结合剂相连接，如果当细胞结合剂是抗体时，该接头不 包括来自下述交联剂的基团，所述交联剂选自：琥珀酰亚胺基4-(N- 马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、硫代-SMCC、m-马来酰亚 胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、硫代-MBS和琥珀酰亚胺基- 碘乙酸酯。
[170]可以制备新的偶联物，并如上述应用。
[171]组合物包括细胞结合剂美登木素生物碱偶联物和载体。
[172]载体可以是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[173]合适的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂是公知的，并且 可以由本领域的普通技术人员随临床情况允许而确定。
[174]合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的例子包括：(1)Dulbecco磷酸 盐缓冲盐水，pH是大约7.4，含有或不含有大约1mg/ml至25mg/ml 的人血清白蛋白，(2)0.9％生理盐水(0.9％w/v NaCl)，和(3)5％(w/v)葡 萄糖；并且也可以含有抗氧化剂如色胺和稳定剂如吐温20。
[175]对于这些新的偶联物，也提供了合成方法。
[176]制备细胞结合剂美登木素生物碱偶联物的方法之一包括：
(a)提供细胞结合剂
(b)用交联剂修饰细胞结合剂，和
(c)连接修饰的细胞结合剂和美登木素生物碱或含硫醇美登木 素生物碱，从而在细胞结合剂和美登木素生物碱或含硫醇美登木素生 物碱之间提供不可切割接头，生成偶联物。
[177]制备细胞结合剂美登木素生物碱偶联物的另一方法包括：
(a)提供美登木素生物碱或含硫醇美登木素生物碱，
(b)用交联剂修饰美登木素生物碱或含硫醇美登木素生物碱，从 而形成不可切割接头，和
(c)连接修饰的美登木素生物碱或含硫醇美登木素生物碱和细 胞结合剂，从而在细胞结合剂和美登木素生物碱或含硫醇美登木素生 物碱之间提供不可切割接头，生成偶联物。
[178]制备细胞结合剂美登木素生物碱偶联物的另外的方法包括：
(a)提供美登木素生物碱，
(b)修饰美登木素生物碱，以提供带有活性酯的不含硫的美登木 醇，和
[179](c)连接修饰的美登木素生物碱和细胞结合剂，从而在细胞结合 剂与美登木醇之间提供不含S的不可切割接头，生成偶联物。这些方 法在上面详述以及在此处引用并特别地在此并入作为参考的美国专利 中描述。
实施例
[180]现在，将参考非限制性实施例阐述本发明。如无其它陈述，所 有的百分数、比值、份(parts)等等，是以重量计的。
[181]用于下列试验的缓冲液是：50mM磷酸钾(KPi)/50mM氯化钠 (NaCl)/2mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH值是6.5(缓冲液A)；lx磷酸 盐缓冲盐水(PBS)，pH值是6.5(缓冲液B)；和0.1M KPi缓冲液/2mM EDTA，pH值是7.5(分析缓冲液)。
[182]SMCC(产品号22360，M.W.334.33g/mole)和SIAB(产品号 22329，M.W.402.15g/mole)购自Pierce。huC242抗体是人源化形式的单 克隆抗体C242，描述于美国专利5,552,293，其杂交瘤保藏为ECACC 保藏号(Identification Number)90012601)。曲妥珠单抗得自Genentech。 DM1(游离硫醇形式；M.W.737.5g/mole)如以前在美国专利5,208,020 和6,333,410 B1所描述而制备。
[183]用购自Amersham Biosciences的层析柱(Sephadex G25 NAP-25 预填充柱(Amersham 17-0852-02)；HiPrep 26/10脱盐柱(Desalting Columns)，Sephadex G25优质树脂(fine resin)，3个串联(3 connected in series)(Amersham 17-5087-01))进行层析。也应用TSK-GEL G3000SWXL层析柱(TOSOH Bioscience，08541)，其带有TSK Column Guard SWxl(TOSOH Bioscience 08543)。
[184]用于下列试验的溶剂是二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺 (DMA)、乙醇(EtOH)和溶于DMSO的100mM Ellman′s Reagent(DTNB， 可以从Cayman Chemical得到)。
实施例1A
制备huC242-SMCC-DM1偶联物
a.制备和测定huC242抗体
[185]用280nm处的消光系数1.48(mg/mL)-1和分子量147,000g/mole， 测定抗体浓度。
b.制备和测定SMCC贮存液
[186]在二甲基亚砜中制备20mM的SMCC溶液(6.69mg/mL)。在分 析缓冲液(Assay Buffer)中稀释溶液1/40，在302nm处测定样品的吸光 度。用消光系数602M-1cm-1计算贮存液的浓度。
c.制备和测定DM1贮存液
[187]在二甲基乙酰胺(DMA)中制备10mM的DM1溶液(游离硫醇形 式)(7.37mg/mL)(图2)。在280nm处测定贮存液溶于乙醇(EtOH)的稀 释液的吸光度。用280nm处的消光系数5700M-1计算贮存DM1的浓度。 用Ellman′s试剂(DTNB)测定游离的巯基或硫醇基(-SH)在贮存DM1制 备物中的浓度。在分析缓冲液中制备贮存液的稀释液，分析缓冲液制 备为3％(v/v)DMA，随后加入溶于DMSO的100mM DTNB(1/100th 体积)。测定412nm处的吸光度针对空白试剂的增加值，用消光系数 14150-1cm-1计算浓度。用Ellman′s分析得到的-SH浓度代表连接条件下 计算的DM1贮存浓度。
d.用SMCC交联剂修饰huC242
[188]将抗体分为2个样品；一个用7.5倍过量摩尔数的SMCC交联 剂修饰，另一个用8.5倍过量摩尔数的SMCC交联剂修饰。在8mg/mL 抗体时使样品反应。在含有DMSO(5％v/v)的缓冲液A(95％v/v)中进 行反应，室温下持续2小时，同时搅拌。
e.G25层析以去除过量的SMCC
[189]在缓冲液A中平衡1.5×4.9cm Sephadex G25树脂预填充柱， 使huC242-SMCC反应混合物通过该柱进行凝胶过滤。上样和洗脱体积 根据制造商的说明书确定。用上述消光系数分析修饰的抗体洗脱液， 以确定抗体浓度。对于7.5倍过量摩尔数的SMCC反应，修饰抗体的 产率是74.6％；对于8.5倍过量摩尔数的SMCC反应，修饰抗体的产 率是81.6％。
f.连接huC242-SMCC和DM1
[190]使修饰的抗体样品和比接头过量1.7倍的DM1反应(假设每个抗 体5个接头)。在2.5mg/mL抗体浓度下进行反应，所述抗体溶于具有 DMA(3％v/v)的缓冲液A(97％v/v)中。加入DM1之后，室温下温育反 应物大约20小时，同时搅拌。
g.通过G25层析纯化偶联物
[191]使连接反应混合物通过1.5×4.9cm的在缓冲液B中平衡的 Sephadex G25树脂预填充柱进行凝胶过滤。上样和洗脱体积根据制造 商的说明书确定。通过测定252nm和280nm处的洗脱物的吸光度，确 定每摩尔huC242连接的DM1分子数目。发现7.5倍过量摩尔数的 SMCC样品的DM1/抗体比值是3.54，发现8.5倍过量摩尔数的SMCC 样品的DM1/抗体比值是3.65。连接步骤的产率分别是83.7％和75.4 ％。将两个连接物合并在一起，进行无菌过滤并重新分析药物和抗体 浓度。将合并的样品指定为Lot#1713-146C，并分析其结合、细胞毒 性、特异性、聚合程度以及游离药物含量。
表I.huC242-SMCC-DM1的特性
参考号 (Reference Number) 最终的蛋白浓度 (mg/ml) 最终的DM1浓 度(μg/ml) DM1/Ab 1713-146C 1.77 29.96 3.05
实施例1B
huC242-SMCC-DM1的体外检测
a.结合(Binding)
[192]在COLO205细胞上，用间接方法，比较huC242抗体和 huC242-SMCC-DM1的结合亲和力(bindind affinity)。结果显示于图3。 裸抗体(naked antibody)以5.1×10-1M的KD结合，偶联物以5.52× 10-10M的KD结合。因此，与DM1连接似乎不改变huC242的结合亲 和力。
b.细胞毒性和特异性
[193]用持续暴露克隆形成试验(continuous exposure clonogenic assay) 评价huC242-SMCC-DM1偶联物的体外细胞毒性和特异性。结果显示 于图4。huC242-SMCC-DM1对于破坏抗原阳性SKBR3细胞是有效的 (IC50＝3.5×10-12M)。特异性是通过比较靶SKBR3细胞的IC50值和抗 原阴性细胞系A375的IC50值显示的，其中偶联物的IC50值大于3.0× 10-9M。
c.尺寸排阻色谱分析
[194]用TSK3000尺寸排阻柱分析偶联物，发现其为96.0％的单体(图 5)。
d.游离药物
[195]用ELISA测定游离药物的百分数，发现其为4.4％。
实施例2A
制备曲妥珠单抗-SMCC-DM1偶联物
[196]抗体曲妥珠单抗从Genentech得到，用于用不可切割的异双功能 (heterobifunctional)交联剂SMCC和DM1连接。抗体从pH6.0的50mM 磷酸钾/2mM EDTA，缓冲交换进入pH6.5的50mM磷酸钾/50mM氯 化钠/2mM EDTA(缓冲液A)。然后，在抗体和DM1连接之前，使抗体 和7.5倍摩尔数过量的SMCC接头反应，并经Sephadex G25树脂纯化。 再次用Sephadex G25树脂纯化最终的偶联物。得到的偶联物含有每摩 尔抗体3.1摩尔DM1。
a.制备和测定抗体曲妥珠单抗
[197]使溶于pH6.0的50mM磷酸钾/2mM EDTA缓冲液的曲妥珠单 抗通过用缓冲液A平衡的Sephadex G25柱，并洗脱为缓冲液A。用产 色的鲎变形细胞溶解产物试验(chromogenic Lymulus amoebocyte lysate(LAL))法(Cambrex)，检测本试验的所有缓冲液为，不含内毒素。 用280nm处的消光系数1.45mL mg-1cm-1和分子量145,423g，测定抗 体浓度。
b.制备和测定SMCC贮存液
[198]在DMSO中制备20mM的SMCC溶液(6.69mg/mL)。在分析缓 冲液中稀释该溶液1/40，在302nm处测定样品的吸光度。用摩尔消光 系数602M-1cm-1计算贮存液的浓度。
c.制备和测定DM1贮存液
[199]在DMA中制备10mM的DM1溶液(游离硫醇形式)(7.37mg/mL) (图2)。在280nm处测定贮存液溶于乙醇(EtOH)的稀释液的吸光度。用 280nm处的摩尔消光系数5700M-1计算贮存的DM1的浓度。用Ellman′s 试剂(DTNB)测定游离-SH在贮存的DM1制备物中的浓度。在分析缓冲 液中制备贮存液的稀释液，分析缓冲液制备为3％(v/v)DMA，随后加 入溶于DMSO的100mM DTNB(1/100th体积)。测定412nm处的吸光 度针对空白试剂的增加值，用消光系数14150M-1cm-1计算浓度。用 Ellman′s分析得到的-SH浓度代表连接条件下计算的DM1贮存浓度。
d.用SMCC交联剂修饰曲妥珠单抗
[200]在20mg/mL抗体时，用7.5倍过量摩尔数的SMCC修饰抗体。 在具有DMSO(5％v/v)的缓冲液A(95％v/v)中进行反应，室温下持续2 小时，同时搅拌。
e.G25层析以去除过量的SMCC
[201]使曲妥珠单抗-SMCC反应混合物通过1.5×4.9cm的在缓冲液 A中平衡的Sephadex G25树脂预填充柱进行凝胶过滤。上样和洗脱体 积根据制造商的说明书确定(Amersham Biosciences)。用上述消光系数 分光光度法分析修饰的抗体溶液的浓度。基于蛋白浓度，修饰抗体的 产率是88％。
f.连接曲妥珠单抗-SMCC和DM1
[202]使修饰的抗体和比接头过量1.7倍的DM1反应(假设每个抗体5 个接头)。在10mg/mL抗体浓度下进行反应，所述抗体溶于具有DMA (6％v/v)的缓冲液A(94％v/v)中。加入DM1之后，室温下温育反应物 16.5小时，同时搅拌。
g.经G25层析纯化偶联物
[203]使连接反应混合物通过1.5×4.9cm的在缓冲液B中平衡的 Sephadex G25树脂预填充柱进行凝胶过滤。上样和洗脱体积根据制造 商的说明书确定(Amersham Biosciences)。通过测定252nm和280nm处 的洗脱物的吸光度，确定每摩尔曲妥珠单抗连接的DM1分子数目。发 现DM1/抗体比值是3.13，连接步骤的产率是95.7％。基于起始抗体， 连接的曲妥珠单抗的总产率是84％。分析得到的偶联物的结合、细胞 毒性、特异性、聚合程度以及游离药物含量。
表II.曲妥珠单抗-SMCC-DM1的特性
参考号 最终的蛋白浓度 (mg/ml) 最终的DM1浓 度(μg/ml) DM1/Ab 1762-14 6.71 106 3.13
实施例2B
曲妥珠单抗-SMCC-DM1的体外检测
[204]结合试验显示，抗体和DM1的连接不影响表观KD；裸曲妥珠 单抗抗体和曲妥珠单抗-SMCC-DM1偶联物对ECD平板有相同的结合 亲和力(5.5×10-11M)。对样品的体外细胞毒性评价显示，曲妥珠单抗 -SMCC-DM1偶联物既是高度毒性的(对抗原阳性细胞系的IC50是3.6× 10-12M)也是特异性的(对抗原阴性细胞系的IC50大于3.0×10-9M)。
a.结合
[205]用Genentech提供的HER2 ECD平板结合试验比较曲妥珠单抗 和曲妥珠单抗-SMCC-DM1的结合亲和力。结果显示于图24。裸抗体 和偶联物均以5.5×10-11M的表观KD结合。因此，与DM1连接不改变 曲妥珠单抗的结合亲和力。
b.细胞毒性和特异性
[206]用持续暴露克隆形成试验(continuous exposure clonogenic assay) 评价曲妥珠单抗-SMCC-DM1偶联物的体外细胞毒性和特异性。结果显 示于图25。曲妥珠单抗-SMCC-DM1对破坏抗原阳性SKBR3细胞是有 效的(IC50＝3.6×10-12M)。比较靶SKBR3细胞的IC50值和抗原阴性细 胞系A375的IC50值时，显示了特异性，后者中偶联物的IC50值大于 3.0×10-9M。
c.尺寸排阻色谱分析
[207]用TSK3000尺寸排阻柱分析偶联物，发现其为95.3％的单体(图 26)。
d.游离药物分析
[208]用ELISA测定游离药物的百分数，发现其为3.4％。
e.内毒素水平
[209]用色谱LAL试验(chromatographic LAL test)检测偶联物，发现含 有0.03EU/mg。
实施例3A
制备曲妥珠单抗-SIAB-DM1偶联物
[210]曲妥珠单抗抗体从Genentech得到，用于用不可切割的异双功能 交联剂SIAB和DM1连接。在pH6.5时，使抗体和7.0倍摩尔数过量 的SIAB接头反应，并经Sephadex G25F树脂纯化。合并含有抗体的部 分，在pH6.5及室温的标准连接条件下、但是是在暗处，和DM1反应 过夜。从反应容器移除等分试样(aliquot)，并分析确定DM1的并入情 况。NAP 5过滤后，等分试样被测定为，仅有1.4药物/Ab。向反应物 加入另外的8倍过量的SIAB，持续2小时，然后在加入另外的1.5倍 过量的DM1/SIAB之前，将pH增加至8。使反应进行，并且用Sephadex G25F树脂纯化。得到的偶联物含有每摩尔抗体3.42摩尔DM1。
a.测定曲妥珠单抗
[211]用280nm处的消光系数1.45mL mg-1cm-1和分子量145,423g， 测定抗体浓度。
b.制备和测定SIAB贮存液
[212]在DMSO中制备18mM的SIAB溶液(7.2mg/mL)。记录稀释入 pH4缓冲液的溶液的波长扫描，仅用于信息目的。
c.制备和测定DM1贮存液
[213]在DMA中制备大约30mM的DM1溶液(游离硫醇形式)。用 Ellman′s试剂(DTNB)测定游离-SH在贮存的DM1制备物中的浓度。在 分析缓冲液中制备贮存液的稀释液，分析缓冲液制备为3％(v/v)DMA， 随后加入溶于DMSO的100mM DTNB(1/100体积)。测定412nm处的 吸光度针对空白试剂的增加值，用摩尔消光系数14150M-1cm-1计算浓 度。用Ellman′s分析得到的-SH浓度代表以连接状态计算的DM1贮存 浓度。
d.用SIAB交联剂修饰曲妥珠单抗
[214]在20mg/mL抗体时，用7.0倍过量摩尔数的SIAB修饰抗体。 在具有DMSO(5％v/v)的缓冲液A(95％v/v)中进行反应，室温下持续2 小时，同时搅拌。
e.G25层析以去除过量的SIAB
[215]使曲妥珠单抗-SIAB反应混合物通过在缓冲液A中平衡的 HiPrep 26/10脱盐柱(Desalting Columns)凝胶过滤。在280nm，似乎 存在来自SIAB试剂的干扰，因此假定修饰抗体的产率是100％并且假 定5个接头/抗体的修饰用于确定连接反应中的DM1量。
f.连接曲妥珠单抗-SIAB和DM1
[216]使修饰的抗体和比接头过量1.7倍的DM1反应，如上所述，假 设产率是100％和5个交联剂/抗体。估计反应物中的抗体浓度是 12.5mg/ml，并且在具有DMA(3％v/v)的缓冲液A(97％v/v)中进行反 应。加入DM1之后，室温下在暗处温育反应物16.5小时，同时搅拌。
g.连接反应物分析
[217]移除反应混合物的0.25mL等分试样，并通过在缓冲液B中平衡 的预填充Sephadex G25柱进行凝胶过滤。通过测定252nm和280nm 处的洗脱物的吸光度，确定每摩尔曲妥珠单抗连接的DM1分子数目。 DM1/抗体比值仅为1.4。
h.附加修饰/连接反应
[218]加入另外的8倍摩尔数过量的SIAB，并使之在室温下温育2小 时。加入比SIAB摩尔数过量1.5倍的DM1，添加1NNaOH使反应的 pH值增加至8。室温暗处温育反应物，并经在缓冲液B中平衡的G25F 树脂柱凝胶过滤。
i.合并和表征偶联物
[219]合并含有蛋白的部分，过滤并在252nm以及280nm处测定吸光 度。检测偶联物样品的内毒素水平、结合、特异以及非特异细胞毒性、 单体百分数和游离药物水平。
表III.曲妥珠单抗-SIAB-DM1的特性
参考号 最终的蛋白浓度 (mg/ml) 最终的DM1浓 度(μg/ml) DM1/Ab 1806-32 5.62 97.3 3.42
实施例3B
曲妥珠单抗-SIAB-DM1的体外检测
[220]结合试验显示，抗体和DM1的连接不影响表观KD；裸曲妥珠 单抗和曲妥珠单抗-SIAB-DM1有相似的结合亲和力(Ab的表观KD是 1.2×10-10M，偶联物的表观KD是1.9×10-10M)。对样品的体外毒性评 价显示，曲妥珠单抗-SIAB-DM1偶联物既是高度毒性的(对抗原阳性细 胞系SKBR3的IC50是5×10-12M)也是特异性的(对于抗原阴性细胞系 A375的IC50大于3.0×10-9M)。
a.结合
[221]用Genentech提供的HER2 ECD平板结合分析比较曲妥珠单抗 和曲妥珠单抗-SIAB-DM1的结合亲和力。结果显示于图27。裸露的曲 妥珠单抗和曲妥珠单抗-SIAB-DM1有相似的结合亲和力(抗体的表观 KD是1.2×10-10M，偶联物的表观KD是1.9×10-10M)。
b.细胞毒性和特异性
[222]对样品的体外细胞毒性评价显示，曲妥珠单抗-SIAB-DM1偶联 物既是高度毒性的(对抗原阳性细胞系SKBR3的IC50＝5×10-12M)也是 特异性的(对于抗原阴性细胞系A375的IC50大于3.0×10-9M)。参见图 28。
c.尺寸排阻色谱分析
[223]用TSK3000尺寸排阻柱分析偶联物，发现其为96.4％的单体(图 29)。
d.游离药物
[224]用ELISA测定游离药物的百分数，发现其为0.35％。
e.内毒素水平
[225]用色谱LAL试验检测偶联物，发现其含有＜0.04 EU/mg。
实施例4
huC242与形成不含S不可切割接头的交联剂的连接
a.合成
[226]在DMA中制备交联剂的贮存液(其结构参见图21)，去除(spin out)不溶性沉淀物，用ε280＝5700M-1cm-1的消光系数确定残余溶液的 浓度，该消光系数是DM1在此波长下的消光系数。由于没有测定此物 质的真正消光系数，这仅是对浓度的估计值。应该指出，DM1的ε252/ ε280是4.7(在ETOH中)，而此交联剂溶液的ε252/ε280(在pH7.5缓冲 液中)被测定为1.42，表明或是不同消光值(extinction)或是存在杂质。
[227]用2.8mg/ml huC242抗体，以2mg的水平进行连接反应，所述 抗体溶于缓冲液E中的16％DMA中，pH7.5(缓冲液E＝50mM磷酸 钠、150mM NaCl、10mM EDTA)。根据贮存液中的估计的交联剂浓度， 应用30当量的交联剂/抗体(应用10当量交联剂/抗体的较早试验产生 了仅具有0.9DM1/抗体的偶联物)。使反应进行3小时，然后经过Nap 10 (G25)柱纯化偶联物。过滤后(Millex GV过滤器，0.2μm孔径)，偶联 物具有2.56 DM1/抗体(Lot#1749-119A，抗体回收＝78％)。经HPLC (HiPrep柱)测定偶联物的等分试样中的游离DM1，在12.09′处观察到相 当大的DM1峰。从而将样品在缓冲液B中透析，以去除此峰，然后重 新分析。最终的偶联物样品(Lot#1749-124A)经HPLC分析没有游离的 DM1，并且有1.84 DM1/抗体。对偶联物进行SEC HPLC，显示出其为 97％的单体抗体。
b.细胞毒性和结合
[228]发明人对huC242-不含S的不可切割接头-DM1偶联物进行细胞 毒性和结合研究。偶联物比游离抗体的表观离解常数(apparent dissociation constant)高大约2倍(参见图23)，并且其体外细胞毒性是可 以和huC242-SMCC-DM1相比美的(不含S的不可切割接头偶联物的 IC50＝7.0×10-12M)(参见图22)。
[229]尽管参考其具体实施方案详细描述了本发明，但对本领域的技 术人员显然的是，可以在其中进行各种变化和修改，而不背离本发明 的精神和范围。
[230]此处引用的所有专利、出版物和其它参考文献特别地以其整体 并入，作为参考。
[01]本申请要求2003年10月10日提交的美国临时申请系列号 60/509,901的权益，其全部公开内容在此并入，作为参考。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种生物多糖溶降解制备水溶寡聚衍生物的方法 | 2020-05-16 | 921 |
| 合成的免疫受体及其使用方法 | 2020-05-20 | 572 |
| 一种多功能土墒材料的生产方法 | 2020-05-21 | 546 |
| 一种尿促性腺激素的纯化方法 | 2020-05-25 | 153 |
| 农业组合物 | 2020-05-11 | 171 |
| 一种香蕉用肥料及其制备方法 | 2020-05-12 | 650 |
| CO2和其它C1底物转化为纯素营养素、肥料、生物刺激素的微生物转化以及用于加速土壤碳封存的系统 | 2020-05-14 | 760 |
| 一种生物刺激素及其制备方法和在调理酸性土壤中的应用 | 2020-05-23 | 15 |
| 核酸输送的区室化方法及其组合物和应用 | 2020-05-08 | 290 |
| 一种修复污染土质和促进植物抗逆性的制剂及其制备方法 | 2020-05-17 | 196 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
