利用抗萎锈灵基因carboxin为筛选标记的球孢白僵菌遗传转化方法
专利汇可以提供利用抗萎锈灵基因carboxin为筛选标记的球孢白僵菌遗传转化方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种利用抗萎锈灵基因carboxin为筛选标记的球孢白僵菌遗传转化方法，包括以下步骤：1)遗传转化载体的构建；2)球孢白僵菌原生质体的制备及转化；3)PEG介导的遗传转化体系建立；4)平均转化效率分析；5)PCR检测；6) 荧光 观察。本发明利用抗 杀菌剂 萎锈灵基因为筛选标记，成功进行球孢白僵菌遗传转化，转化效率达到26个转化子/μgDNA，拓宽了球孢白僵菌遗传转化筛选标记基因范围，解决bar基因存在的安全性问题。，下面是利用抗萎锈灵基因carboxin为筛选标记的球孢白僵菌遗传转化方法专利的具体信息内容。
1.一种利用抗萎锈灵基因carboxin为筛选标记的球孢白僵菌遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)遗传转化载体的构建：利用NotI和NodI限制性内切酶对otef:CAR载体和PF载体同时进行双酶切并连接，将抗萎锈灵基因carboxin构建到pgpdA为启动子，含有绿色荧光蛋白GFP标记基因，TtrpC为终止子的遗传转化载体上，构建PgpdA：car:GFP转化载体；
2)球孢白僵菌原生质体的制备及转化
原生质体的获得
(1)将培养好的白僵菌菌液用漏斗过滤到空瓶中，留下滤布中得到的菌丝体；
(2)渗透压缓冲液洗涤2-3遍，并用小勺收集菌丝到6mL EP管中；
(3)在EP管中加入4mL的LB液体培养基，8μL β-巯基乙醇，摇菌丝，使菌丝充分混入缓冲液中；
(4)28℃下100r/min培养20-25min；
(5)将小管第二次过滤，收集菌丝体，并用渗透压缓冲液洗涤两次；
(6)用小勺刮下滤布上的菌丝到新的EP管，加入4mL渗透压缓冲液，再加入0.1g的酶粉振荡；
(7)28℃下100r/min培养1h，并镜检观察，此时视野中应得到透明圆球状的原生质体；
萎锈灵抗性浓度的筛选
将制备的原生质体分别涂布于含有不同浓度梯度萎锈灵的查氏培养基上，萎锈灵浓度分别为0.5、1、2、3、4mg/ml培养基，并设置不含萎锈灵的培养基为对照，26℃培养48h后，观察菌落生长情况；
3)PEG介导的遗传转化体系建立
(1)将得到的原生质体悬液吸取400μL到三个新的EP管中，做好标记，分别为CK对照和PgpdA：car:GFP质粒；
(2)对应管中分别加入10μLPgpdA：car:GFP质粒，质粒浓度60.5ug/μL，冰浴20min；
(3)每个管中各加入100μL PEG4000溶液，混匀，冰浴20min；
(4)各加入2mLPEG4000，混匀，常温放置5min；
(5)加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀释；
(6)吸200μL于软琼脂平板上，封口标记，于28℃恒温箱培养24h；
(7)将1mL的渗透压缓冲液打在软琼脂平板上，重复吸打；吸出100μL均匀涂在带有萎锈灵抗性的查氏培养基上，于28℃恒温箱培养并观察；
4)平均转化效率分析
(1)对PgpdA：car:GFP载体进行球孢白僵菌原生质体遗传转化，每个载体转化5个平板；
(2)转化后对每个转化平板进行转化子数量的统计，取平均值，进行统计分析；
转化子的PCR检测及荧光观察
(1)利用灭菌环将查氏培养基上的转化子小心挑出，在提前准备的PDA平板上画多个“Z”字，分别标记为转PgpdA：car:GFP和CK；
(2)将划好的平板置于26℃恒温培养箱恒温培养3d；
(3)此时得到转化子第一代，继续挑出孢子划线在新的PDA培养基上，培养3d得到第二代孢子；
(4)同上述过程，得到第三代转化子孢子，在超净工作台中挑出，置于SDY培养基中摇
2-3d；
5)PCR检测：利用氯化苄法提取球孢白僵菌转化子基因组DNA，然后利用基因组做模版，利用GFP基因特异性引物，进行PCR及电泳检测；
6)荧光观察：菌丝从PDA上刮下后置于SDAY培养基中摇三天，将实验控制在相同的培养条件及时间，在培养第48h置于倒置荧光显微镜下观察。
利用抗萎锈灵基因carboxin为筛选标记的球孢白僵菌遗
传转化方法
技术领域
背景技术
发明内容
具体实施方式
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