改善动物的生长性能的方法
阅读：1015发布：2021-02-23
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1.一种改善动物的生长性能的方法，所述方法包括给需要的动物施用 生长促进量的一或多种抗炎剂的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中该抗炎剂任选与可药用载体、助剂或 赋形剂联合施用。
3.一种改善动物的生长性能的方法，所述方法包括给需要的动物施用 组合物的步骤，所述组合物包含与抗生素协同的抗炎剂并任选与可药用载 体、助剂或赋形剂组合，其中该组合物实现协同生长促进效果。
4.一种改善动物的生长性能的方法，所述方法包括给需要的动物施用 增加或补充内源性抗炎剂水平的化合物或组合物的步骤，其中相对于未施 用该化合物或组合物的动物的生长性能而言，提高了生长性能。
5.根据权利要求4的方法，其中所述化合物或组合物在施用生长促进 量的一或多种抗炎剂之前、一起或之后施用。
6.根据权利要求4或5的方法，其中该化合物或组合物包含促炎细胞 因子受体拮抗剂。
7.根据权利要求6的方法，其中该拮抗剂是TNF-α受体、GM-CSF受 体、IL-6受体、IL-1受体、IL-4受体或IL-8受体的拮抗剂。
8.根据权利要求4-6之任一项的方法，其中该化合物或组合物包含 IL-10、1，8-萘磺内酰胺取代的化合物或喹喔啉化合物。
9.根据权利要求4或5的方法，其中该化合物或组合物通过减少促炎 细胞因子量来增加内源性抗炎剂水平。
10.根据权利要求1-3或5之任一项的方法，其中该抗炎剂为具有抗炎 效果的可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或 其生物活性片段，或者选自双氯酚酸、二氟尼柳、依托度酸、氟尼辛、非 诺洛芬、夫洛非宁、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸、 甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奥沙普嗪、保泰松、吡罗昔康、 舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸和托美汀的抗炎剂。
11.根据权利要求10的方法，其中该可溶性细胞因子受体或其生物活 性片段选自能改善动物生长性能的TNFα受体、IL-6受体、IL-1受体、IL-4 受体，IL-8受体或其组合。
12.根据权利要求10的方法，其中该可溶性细胞因子受体或其生物活 性片段为IL-1受体、IL-4受体、IL-8受体或其组合。
13.根据权利要求10的方法，其中该可溶性细胞因子受体或其生物活 性片段为IL-1受体。
14.根据权利要求10的方法，其中该细胞因子受体拮抗剂或其生物活 性片段选自IL-1ra、IL-6ra、IL-8ra和TNF-αra。
15.根据权利要求14的方法，其中该细胞因子受体拮抗剂或其生物活 性片段为IL-1ra。
16.根据权利要求10的方法，其中该细胞因子抑制因子或其生物活性 片段选自TNF阻断因子和TNF-α抑制剂。
17.根据权利要求1、2、4-16之任一项的方法，所述方法还包括施用 抗生素的步骤。
18.根据权利要求3的方法，其中施用抗生素的步骤在施用抗炎剂之前 或之后。
19.根据权利要求3或权利要求17的方法，其中该抗生素选自阿莫西 林、青霉素、普鲁卡因、氨苄西林、氯唑西林、青霉素G、苄星青霉素、 苯乙苄胺、头孢噻呋、头孢洛宁、头孢呋辛、红霉素、泰洛星、替米考星、 竹桃霉素、吉他霉素、林可霉素、壮观霉素、四环素、土霉素、金霉素、 新霉素、安普霉素、链霉素、阿伏帕星、二甲硝咪唑、磺胺(包括甲氧苄啶 和二氨藜芦啶)、杆菌肽、维吉霉素、莫能霉素、沙利霉素、拉沙洛西、甲 基盐霉素和奥拉喹多或其组合。
20.根据权利要求19的方法，其中该抗生素为林可霉素、壮观霉素或 阿莫西林或其组合。
21.根据权利要求1-20之任一项的方法，其中该给药是口服、局部或 肠胃外给药。
22.根据权利要求21的方法，其中肠胃外给药采用皮下注射、气溶胶、 静脉内、肌肉内、鞘内、胸骨内注射、输液技术或被囊化细胞。
23.根据权利要求1-22之任一项的方法，其中该给药是单个剂量单位 或多个剂量单位。
24.根据权利要求1-20之任一项的方法，其中该给药是作为在水和/或 饲料中的添加剂口服施用的。
25.根据权利要求1-24之任一项的方法，其中该动物的生长性能选自 生长速率增加、饲料利用率增加、最终增重、清理后增重和脂肪含量降低。
26.根据权利要求1-24之任一项的方法，其中动物生长性能的改善是 由于免疫增强、抗寄生虫或抗微生物效应、抗炎效应或应激降低引起的。
27.根据权利要求1-26之任一项的方法，其中该动物是偶蹄动物或鸟 类。
28.根据权利要求27的方法，其中该偶蹄动物选自牛、猪、羊、骆驼、 山羊和马。
29.根据权利要求27的方法，其中该鸟类选自小鸡、火鸡、鹅和鸭。
30.根据权利要求27的方法，其中该动物是牛、猪或羊。
31.一种促进生长的组合物，所述组合物包含一或多种抗炎剂和一或多 种可药用载体、助剂或赋形剂。
32.根据权利要求31的促进生长的组合物，其中该组合物包含选自以 下的抗炎剂：可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制 因子或其生物活性片段、双氯酚酸、二氟尼柳、依托度酸、氟尼辛、非诺 洛芬、夫洛非宁、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸、 甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奥沙普嗪、保泰松、吡罗昔康、 舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸和托美汀。
33.根据权利要求32的促进生长的组合物，其中该组合物包含一或多 种可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生 物活性片段和一或多种不同的可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、 细胞因子抑制因子或其生物活性片段或一或多种不同的抗炎剂。
34.根据权利要求32的促进生长的组合物，其中该组合物包含一种可 溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活 性片段和一种不同的抗炎剂或可药用载体、助剂或赋形剂。
35.根据权利要求32的促进生长的组合物，其中该可溶性细胞因子受 体或其生物活性片段选自TNFα受体、IL-6受体、IL-1受体、IL-4受体，IL-8 受体或其组合。
36.根据权利要求32的促进生长的组合物，其中该可溶性细胞因子受 体或其生物活性片段是IL-1受体、IL-4受体、IL-8受体或其组合。
37.根据权利要求32的促进生长的组合物，其中该可溶性细胞因子受 体或其生物活性片段是IL-1受体。
38.根据权利要求32的促进生长的组合物，其中该细胞因子受体拮抗 剂或其生物活性片段选自IL-1ra、IL-6ra、IL-8ra和TNF-αra。
39.根据权利要求32的促进生长的组合物，其中该细胞因子受体拮抗 剂或其生物活性片段是IL-1ra。
40.根据权利要求32的促进生长的组合物，其中该细胞因子抑制因子 或其生物活性片段选自TNF阻断因子和TNF-α抑制剂。
41.根据权利要求31-40之任一项的促进生长的组合物，所述组合物还 包含一或多种抗生素。
42.根据权利要求41的促进生长的组合物，其中该抗生素选自阿莫西 林、青霉素、普鲁卡因、氨苄西林、氯唑西林、青霉素G、苄星青霉素、 苯乙苄胺、头孢噻呋、头孢洛宁、头孢呋辛、红霉素、泰洛星、替米考星、 竹桃霉素、吉他霉素、林可霉素、壮观霉素、四环素、土霉素、金霉素、 新霉素、安普霉素、链霉素、阿伏帕星、二甲硝咪唑、磺胺(包括甲氧苄啶 和二氨藜芦啶)、杆菌肽、维吉霉素、莫能霉素、沙利霉素、拉沙洛西、甲 基盐霉素和奥拉喹多或其组合。
43.根据权利要求42的促进生长的组合物，其中该抗生素是林可霉素、 壮观霉素或阿莫西林或其组合。
44.一种改善动物的生长性能的方法，所述方法包括给需要的动物施用 编码一或多种抗炎剂的核酸分子，其中该核酸分子的表达产生有效生长促 进量的一或多种抗炎剂。
45.根据权利要求44的方法，其中该核酸分子是DNA、cDNA、RNA 或其杂合分子。
46.根据权利要求44或权利要求45的方法，其中该核酸分子是全长分 子或其生物活性片段。
47.根据权利要求30-32之任一项的方法，其中该核酸分子是编码可溶 性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性 片段的DNA分子。
48.根据权利要求47的方法，其中该DNA编码选自TNFα受体、IL-6 受体、IL-1受体、IL-4受体和IL-8受体或其组合的细胞因子受体，或者选 自IL-1ra、IL-6ra和TNF-αra的细胞因子受体拮抗剂。
49.根据权利要求44-48之任一项的方法，其中该核酸分子结合到动物 基因组或者是染色体外元件。
50.根据权利要求44-49之任一项的方法，其中该核酸分子通过皮下、 静脉内或肌内注射施用或者作为气溶胶施用。
51.根据权利要求50的方法，其中该核酸分子的施用量为约 1μg-2000μg/剂。
52.根据权利要求50的方法，其中该核酸分子的施用量为约 5μg-1000μg/剂。
53.根据权利要求52的方法，其中该核酸分子的施用量为约6μg-200μg/ 剂。
54.根据权利要求44-53之任一项的方法，其中该核酸分子在载体中或 作为裸DNA施用。
55.根据权利要求54的方法，其中该载体为猪腺病毒载体。
56.一种构建体，用于体内递送有效量的细胞因子受体、细胞因子受体 拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段，所述构建体包含：
a)编码细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其 生物活性片段的核苷酸序列；
b)包含调控序列的载体，其中该调控序列的载体能调控a)的核苷酸序 列的表达，从而产生细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制 因子或其生物活性片段，进而改善动物的生长性能。
57.用于改善动物的生长性能的试剂盒，所述试剂盒包含：
a).一或多种抗炎剂；
b).该抗炎剂的递送装置；和
c).本发明方法的使用说明。
技术领域
本发明广义上涉及一种改善动物的生长性能的方法。具体而言，本发 明涉及一种改善动物的生长性能的方法，包括给需要的动物施用生长促进 量的一或多种抗炎剂的步骤。
背景技术
在许多国家的农业中，工业化家畜饲养系统已变得普遍。工业化动物 饲养业技术已用于饲养家禽、猪和牛，并导致由这些动物产生的食品的产 量大大增加。
家畜的工业化饲养要求生长速率和饲料转化效率的最大化，以降低单 元生产成本。这个要求导致所谓的“饲料添加剂”的发展和广泛使用。
饲料添加剂有两个一般目的。一个目的是在健康和营养不成问题的动 物中在增加生长速率和/或增加饲料转化效率方面提高动物的性能。另一目 的是在目前密集饲养的实践中不可避免发生的外伤或“应激(stresss)”期间 保持动物的健康，从而使动物不患病。
在20世纪50年代早期，研究者意外地发现鸡饲料中的抗生素成分是 一种“生长因子”。该发现大大改变了牲畜和家畜产业，并在经济上惠及制 药公司。食用动物(feed animal)目前在高度控制条件下饲养并接受含有多种 生长促进添加剂的特制饲料。
对动物进行常规抗生素给药几乎是普遍的，因为发现往动物饲料中加 入少量抗生素如青霉素、四环素和磺胺二甲嘧啶(sulfamethasine)增加猪和牛 的生长。1979年，在美国饲养的约70％的肉牛和小牛，90％的猪，和基本 上100％的小鸡食用抗生素作为其每日饲料的一部分。这种使用，数量为约 美国所售抗生素的40％，估计使消费者每年在食品成本上节省35亿美元。
在经过优化能促进生长的现代条件下饲养的动物接受含有高比例蛋白 质和高百分率的谷物的食物，所述蛋白质通常为大豆或棉籽食物形式(肉和 骨或血食物在澳大利亚广泛使用)；所述谷物如玉米或买罗高粱(milo)，这是 高粱的一种类型(澳大利亚的小麦和大麦)。已被使用的食物添加剂包括激素 如二乙基-己烯雌酚和镇定剂(未广泛用于猪)，前者还增大体重增加的速率； 后者防止由于封闭条件引起的应激效应造成疾病或重量损失。
牛通常需要5千克饲料来产生1千克的体重增加。如果在最佳生长促 进条件下并采用强化饲料，仅用3千克的饲料使它们增加1千克。
虽然激素和抗生素大大增加食物动物的生长速率，使用这些添加剂并 非没有问题。一种用作生长兴奋剂的激素，二乙基-己烯雌酚或DES已表明 是一种致癌物质，在大部分国家已被禁止进一步应用。
当在动物饲料中混合抗生素时，化合物扩散到整个环境，使微生物与 该抗生素接触。微生物持续暴露于抗生素对微生物造成生物压力，使之对 抗生素形成耐受性。这可能导致产生耐受抗生素的微生物，并使其特别严 重和难以治疗感染。
抗生素耐受微生物是潜在的严重病原体，因为它难以控制。如果有机 体导致动物或人感染，则该感染可能不被常规抗生素控制。如果感染严重， 则可能没有时间确定哪种抗生素可有效对抗感染性细菌。该问题在肉中抗 生素耐受性生物被那些自身也服用抗生素来治疗疾病的人食用时特别严 重。抗生素抑制呼吸道和胃肠道中许多正常的微生物。这使耐受性微生物 快速增殖，并产生更为严重的疾病。食物中的抗生素耐受性生物体和对人 的无效抗生素治疗共同造成过去几年中在美国报道的大部分由沙门氏菌食 物中毒导致的死亡。
饲料堆中抗生素耐受性细菌的增加和由抗生素耐受性细菌导致的许多 严重的传染病的结果是，关于禁止在动物饲料中使用抗生素的管理压力在 增加。实际上，世界卫生组织和澳大利亚政府具体指出需要使用环保的备 选方法来控制感染。从现在开始在家畜饲料和水中禁用或撤出多种抗生素 可能(i)增加动物的感染发生率，从而降低生长性能，(ii)进一步降低动物的 健康、生育力和繁殖性能。因此，对于新的、安全和有效的食用动物的生 长刺激剂以及通过增加健康来降低疾病的需求是迫切的且越来越多。
不用抗生素而促进动物生长的多种尝试已被人采用，其中许多利用了 复杂和间接的方法。这些包括皮下植入激素或由复合物制备的具有阳离子 的络合盐(例如参见美国专利6,197,815；美国专利3,991,750；美国专利 4,067,994)。这些尝试无一被证明是简单或有效的。因此，仍需要一种不依 赖使用抗生素或复杂工艺的改善动物的生长性能的方法。
现在申请人惊奇地发现，施用抗炎剂，特别是细胞因子受体拮抗剂如 白介素(IL)-1ra，可增加动物的生长性能，同时减少抗生素的用量。申请人 还证明类似的生长性能效果可以通过施用可溶性细胞因子受体如TNFα受 体、IL-6受体、IL-4受体和IL-8受体，或者细胞因子阻断因子如TNF阻断 因子(Bargetzki等，Cancer Research 53：4010-13(1993)；Engelmann等，Journal of Biological Chemistry 264：11974-80(1989))或TNF-α抑制剂(Engelmann等， Journal of Biological Chemistry 265：1531-6(1990)；Seckinger等，European Journal of Immunology 20：1167-74(1990))来实现。
无意受任何具体理论或假设的限制，申请人认为在已施用抗炎剂的动 物中观察到生长性能的增加是由四种关键效果的互相作用导致的，它们是：
1).自身的抗炎效果；
2).免疫增强效果；
3).抗寄生虫和抗微生物效果；和
4).应激降低。
这些效果中的每一种，单独或一起，深深地影响动物的健康和安宁 (welfare)，进而影响动物的生长性能，从而影响肉质量。例如：
1).抗炎
慢性炎症通常见于家畜，并与由持续感染和环境刺激引起的免疫活化 有关。炎症在针对感染的免疫反应的启动中起重要作用，但慢性免疫活化， 特别是持续感染或微生物负载(load)，可对生长和发育具有有害效果，并可 减小接种疫苗的效力。过度的免疫活化的结果包括产生炎性细胞因子、发 烧、食欲不振、从肌肉中再吸收氨基酸和从肉类生产中移走营养物。抗炎 剂可以减少慢性免疫活化的病变，例如通过降低炎性细胞因子如IL-1、IL-6、 TGF-α、IL-11、IL-18、IL-12、IL-17、LIF、IFN-α、IL-8、TNF-α和GM-CSF 的效果来实现。或者，通过施用这些炎性细胞因子的可溶性细胞因子受体， 即IL-1受体、IL-8受体、TNF-α受体、IL-6受体等，可以减少过量的循环 炎性细胞因子。细胞因子受体拮抗剂如IL-1ra、IL-6ra或TNF-αra可以竞争 性抑制这些促炎细胞因子与它们各自的膜表达型受体结合，可以用于改善 这些细胞因子的作用。
2).免疫增强效果
a).TH1/TH2免疫反应
炎性反应不可避免地与身体的免疫系统有关。免疫细胞因子调节网络 和身体的其它调节系统之间存在互相作用。对感染或抗原的免疫反应可敏 锐地偏向(bias)其中一方。免疫反应可以概括为T细胞反应类型生。T辅助 细胞1(TH1)类型反应主要涉及细胞介导的免疫，而TH2类型反应一般涉及 体液免疫。TH1和TH2类型细胞亚群参与调节许多由细胞因子类型限定的 免疫反应。TH2细胞表达细胞因子白介素(IL)-4、IL-5、IL-10和IL-13。IL-3 表达对TH1和TH2T细胞而言是共有的。然而，TH1细胞表达IL-2、IFNγ 和TNFβ。这些TH2细胞因子影响B细胞发育并促进体液反应如抗体分泌。 两种类型的TH细胞通过它们分泌的细胞因子来彼此影响。例如，TH2细胞 因子如IL-10可以抑制TH1功能。其它细胞因子还可以影响TH1或TH2发 育，例如TNFβ已知可以下调TH1反应。
已知当不存在侵袭性抗原时，Th1细胞的作用对身体有害。抗炎剂抑制 Th1细胞中IFN-γ的产生。抗炎剂还抑制Th1细胞的过度产生，因此提高 Th2(抗体分泌)细胞的产生，因为这些细胞彼此交叉调节。这意味着通过施 用具体抗炎剂可以抑制促炎细胞因子的量。或者，通过施用细胞因子的可 溶性细胞因子受体(如IL-1、IL-4、IL-8、GM-CSF、IL-6或TNF-α)、细胞 因子受体拮抗剂或细胞因子抑制因子，可减少TH1细胞过度产生细胞因子。
b).抗体同种型转换
抗体是除去感染或提供针对性保护所必需的。成熟B细胞在抗原刺激 之后经历抗体种类转换的过程。TH细胞在物理接触和称为转换因子的细胞 因子作用下，调节同种型转换。已知单独或组合参与同种型转换的一些细 胞因子是IL-4、IL-5、TNFβ、IL-1、IL-2、IL-6和IL-13。IL-4和IL-5协同 增加IgG1反应。例如，最佳的IgG1反应还需要IL-2。IL-1可以提高在IL-5 存在下的IgA的产量。TNFβ诱导IgA产生。
c).免疫功能障碍
大部分生产特性的遗传潜能是由出生预先决定的。许多因素(应激、疾 病、营养、免疫等)决定是否获得这种潜能。抗原暴露的水平和时间影响和 确立免疫系统的“偏向”。大部分免疫反应偏向促进对细菌和病毒的免疫的 类型或者促进对许多寄生虫的免疫的类型。虽然动物的基因型可影响这种 偏向，但新生儿对抗原和感染的早期经历可以使免疫反应性偏向一种或另 一种类型。这种偏向依据随后的抗原暴露而改变。基于对生产特征的选择 而进行的饲养程序似乎消耗病损害免疫竞争力或反应性。这种改变还由于 持续地向水和饲料中添加抗生素而进一步加剧，从而预期导致获得有效免 疫反应的遗传潜能发生改变。
d).粘膜免疫
家畜感染的最易发区是粘膜部位，主要是胃肠道和肺。因此，粘膜免 疫系统是抵抗病原体和疾病的第一卫队。细胞因子，特别是IL-5、IL-4、IL-6 和IL-10，在粘膜免疫反应的调节和效力中起明显作用。
IL-5和IL-6作用于粘膜免疫系统中淋巴细胞的B-1和B-2亚种群。IL-5 或IL-6或其受体生产的缺陷导致负责粘膜中保护性反应的抗体同种型IgA 的产生明显受损。类似地，IL-5、IL-6和趋化因子MIP-1α具有增加IgA对 粘膜疫苗的反应的能力。IL-4对粘膜组织有免疫调节作用，主要通过增强 TH2反应，从而增加抗体的生产。IL-4被认为是通过涉及TH2途径的肺粘 膜免疫反应的形成所必需的。IL-4和IL-5都在肺内协力工作，其中IL-4使 初始(naive)T细胞发生TH2表型，其通过随后的活化而分泌IL-5，导致嗜 酸性粒细胞蓄积。而且，IL-4和IL-10在粘膜耐受性中起作用，因而帮助调 节和减弱肠内过敏性反应，并使动物对肠的慢性炎症的敏感性降低。
3).抗寄生虫和抗微生物效果
a).抗寄生虫效果
对病原体的获得性免疫反应一般属于细胞介导(TH1)或抗体介导(TH2) 类型中的一种，且它受细胞因子调控。TH2反应中涉及的细胞因子是吸引 人的治疗靶体，因为它们可以对抗外寄生物和胃肠蠕虫(worm)提供保护， 并抑制由TH1细胞因子诱导的炎症。TH2细胞因子诱导嗜酸性粒细胞增多、 IgE合成和粘液产生，从而增强对抗蠕虫和其它肠寄生虫的保护作用。
b).抗微生物效果
虽然在营养、疫苗、化学物质和抗生素方面有所发展，但微生物感染 仍是世界范围内影响经济和健康的问题。针对微生物病原体的免疫反应包 括二种识别系统。第一卫队是先天性免疫，如果需要的话，随后发生适应 性反应(细胞介导的反应和抗体反应)。通过用包括保泰松、氟尼辛葡甲胺 (meglumine)和酮洛芬或静脉内DMSO在内的抗炎剂减少炎症，流向受染组 织的血流得到改善，进而促进先天性免疫帮助克服感染。此过程可以通过 使用血管舒张药如乙酰基丙嗪、苯氧苄胺、异克舒令(esoxsuprine)、己酮可 可碱(pentoxifylline)、阿斯匹林和肝素来得到促进。备选方法是施用已知炎 性细胞因子如IL-1、TNF-α、IL-6和IL-8的可溶性细胞因子受体。
4).应激降低
工业化环境中的许多条件有助于减少饲料摄入、降低生长速率并使屠 宰后畜体(carcasss)质量下降。尽管倾注广泛的研究努力要评价应激物影响许 多物种性能的机理，但家畜产业中的长期问题未解决。应激，特别是早期 和持续的应激，导致免疫功能障碍、下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)活性和 脑中化学物质失衡。神经和免疫系统是整体性的，形成独立的神经免疫网 络。抑郁、生理或情绪应激可激活那些改变免疫功能的内分泌系统，进而 引起脑内生理和化学改变。同样，感染形式的免疫应激通过细胞因子和其 它可溶性介质激活神经-内分泌系统以诱导应激，进而损害生殖力 (productivity)。细胞因子介导免疫、内分泌和中枢神经系统之间的相互作用。 以前认为是免疫抑制，但现在有确切证据表明应激诱导TH1/TH2免疫反应 偏移，造成免疫调节异常而不是免疫抑制。细胞因子影响体内平衡途径的 潜能导致产生评价免疫系统活性的需要。
发明概述
在最广义方面，本发明提供一种改善动物生长性能的方法，所述方法 包括给需要的动物施用生长促进量的一或多种抗炎剂的步骤。
该抗炎剂优选增强或补充动物自身的抗炎系统。
本发明还提供一种改善动物的生长性能的方法，所述方法包括给需要 的动物施用增加或补充内源性抗炎剂水平的化合物或组合物的步骤，其中 相对于未施用该化合物或组合物的动物的生长性能而言，提高了生长性能。
优选，该化合物或组合物在施用生长促进量的一或多种抗炎剂之前、 一起或之后施用的。
更优选该化合物或组合物包含促炎细胞因子受体拮抗剂。还更优选， 该化合物或组合物包含TNF-α受体、GM-CSF受体、IL-6受体、IL-1受体、 IL-4受体或IL-8受体的拮抗剂。最优选该化合物或组合物包含IL-10、1，8- 萘磺内酰胺(1，8-napthosultam)取代的化合物或喹喔啉(quinoxaline)化合物。
或者，该化合物或组合物通过减少促炎细胞因子量来增加内源性抗炎 剂水平。因此，该化合物或组合物包含能增加促炎细胞因子的循环、可溶 性细胞因子受体的量的试剂。
本发明还提供一种改善动物的生长性能的方法，所述方法包括给需要 的动物施用组合物，其包含与抗生素协同的抗炎剂，并且其任选与可药用 载体、助剂或赋形剂组合，其中该组合物实现协同生长促进效果。
优选，该抗炎剂是具有抗炎效果的的任何可溶性细胞因子受体、细胞 因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段或者选自双氯酚酸 (diclofenac)、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、氟尼辛(flunix)、非 诺洛芬(fenoprofen)、夫洛非宁(floctafenine)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛 芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、甲氯芬那酸 (meclofenamate)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美 酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、奥沙普嗪(oxaprozin)、保泰松 (phenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、替诺昔康 (tenoxicam)、噻洛芬酸(tiaprofenic)和托美汀(tolmetin)的抗炎剂。优选该可溶 性细胞因子受体或其生物活性片段选自能改善动物的生长性能的TNFα受 体、IL-6受体、IL-1受体、IL-4受体和IL-8受体或其组合。更优选，可溶 性细胞因子受体或其生物活性片段为IL-1受体。
优选，该细胞因子受体拮抗剂或其生物活性片段选自IL-1ra、IL-6ra、 IL-8ra和TNF-αra。更优选，该细胞因子受体拮抗剂或其生物活性片段是 IL-1ra。
优选，该细胞因子抑制因子或其生物活性片段选自TNF阻断因子和 TNF-α抑制剂。
在一个具体实施方案中，通过将一或多种抗炎剂与一或多种可药用载 体、助剂或赋形剂组合而将本发明的抗炎剂配制成促进生长的组合物。更 优选，通过将一或多种可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞 因子抑制因子或其生物活性片段或者一或多种其它抗炎剂或可药用载体、 助剂或赋形剂组合而配制成促进生长的组合物。可以使用任何已知的可药 用载体、助剂或赋形剂，只要它不会对抗炎剂的生长促进效果有不利影响。
因此，在第二方面本发明提供一种促进生长的组合物，其包含一或多 种抗炎剂及一或多种可药用载体、助剂或赋形剂。优选，该组合物包含选 自下组的抗炎剂：可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子 抑制因子或其生物活性片段、双氯酚酸、二氟尼柳、依托度酸、氟尼辛、 非诺洛芬、夫洛非宁、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那 酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奥沙普嗪、保泰松、吡罗 昔康、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸和托美汀。
更优选，该组合物包含一或多种可溶性细胞因子受体、细胞因子受体 拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段和一或多种不同的可溶性细 胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段 或一或多种抗炎剂。最优选，该组合物包含一种可溶性细胞因子受体、细 胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段和一种不同的抗 炎剂或者可药用载体、助剂或赋形剂。
包含抗生素的组合物有助于限制动物的微生物载量，从而帮助抗抗炎 剂改善动物的生长性能。特别优选的抗生素是已经用于常规动物生产环境 的抗生素。但具体地，优选抗生素选自阿莫西林(amoxycylin)、氨苄西林 (ampicillin)、安普霉素(apramycin)、阿伏帕星(avoparcin)、杆菌肽(bacitracin)、 苯乙苄胺(benethamine)、苄星青霉素(benzathine)、头孢噻呋(ceftiofur)、头孢 呋辛(cefuroxime)、头孢洛宁(cephalonium)、金霉素(chlortetracyclin)、氯唑西 林(cloxacilline)、二甲硝咪唑(dimetridazole)、红霉素(erythromycin)、吉他霉 素(ketasamycin)、拉沙洛西(lasalocid)、林可霉素(lincomycin)、莫能霉素 (monensin)、甲基盐霉素(narasin)、新霉素(neomycin)、竹桃霉素 (oleandomycin)、土霉素(oxytetracycline)、奥拉喹多(olaquindox)、青霉素、 青霉素G、普鲁卡因(procaine)、壮观霉素(spectinomycin)、链霉素、四环素、 替米考星(tilmicosin)、甲氧苄啶(trimethoprim)、泰洛星(tylosin)、沙利霉素 (salinomycin)、磺胺(包括和二氨藜芦啶(diaveridine))和维吉霉素 (virginiamycin)或其组合。最优选抗生素为阿莫西林、林可霉素或壮观霉素。
根据抗炎剂的活性、给药方式、动物的年龄和体重，可以使用不同剂 量的抗炎剂。但在一些环境下，更高或更低的剂量可能是合适的。给药可 以通过单次施用单个剂量单元或者多个较小剂量单元的形式来完成，还可 以通过在具体时间间隔多次施用细分的剂量来完成。
但是，可以理解，任何具体动物的特定剂量水平取决于多种因素，包 括所用的特定抗炎剂的活性、年龄、体重、总体健康水平、性别、饮食、 给药时间和给药途径、排泄速率和抗炎剂或抗生素组合。但是，通常优选 的给药途径选自口服、局部给药和肠胃外给药。
肠胃外给药包括皮下注射、气溶胶、静脉内、肌肉内、鞘内注射、输 液技术或被囊化细胞。
本发明抗炎剂或组合物还可作为动物用水和/或饲料的添加剂施用。
动物的生长性能可以由任何已知的方法确定，包括生长速率增加、饲 料利用率增加、最终增重、清理后(dressed)增重和脂肪含量降低。本领域技 术人员可以进一步认识到，动物生长性能的改善可以是免疫增强、抗寄生 虫或抗微生物效果、抗炎效果或应激降低导致的。更优选，免疫增强可以 由TH1/TH2免疫反应、抗体同种型转换、血细胞生成、免疫功能改善、粘 膜免疫、对体内平衡过程如食欲、内分泌或神经-内分泌过程的有益效果导 致。
本领域技术人员可以认识到，这里公开的方法和组合物可以用于任何 期望改善生长性能的动物。但是，本发明特别用于食用动物，即通常在农 场饲养以进行肉类生产的动物。优选，动物为高等偶蹄动物(Artiodactyl)或 鸟类。偶蹄动物包括牛、猪、羊、骆驼、山羊和马。鸟类包括小鸡、火鸡、 鹅和鸭。更优选，本发明涉及选自牛、猪、羊、骆驼、山羊、马和小鸡的 动物。最优选动物为牛、猪或羊。
在第三方面，抗炎剂作为编码该抗炎剂的核酸分子施用，因而该核酸 分子在动物中表达时产生生长促进量的抗炎剂。因此，本发明提供一种改 善动物的生长性能的方法，所述方法包括给需要的动物施用编码一或多种 抗炎剂的核酸分子的步骤，其中该核酸分子的表达产生有效的生长促进量 的一或多种抗炎剂。
该核酸分子可以是DNA、cDNA、RNA或它们的杂合分子。可以清楚 地理解，术语核酸分子包括全长分子或其生物活性片段。
优选该核酸分子为编码可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、 细胞因子抑制因子或其生物活性片段的DNA分子。最优选，该DNA编码 选自TNFα受体、IL-6受体、IL-1受体、IL-4受体和IL-8受体或其组合的 细胞因子受体或者选自IL-1ra、IL-6ra和TNF-αra的细胞因子受体拮抗剂。
该核酸分子可整合至动物基因组，或可作为染色体外元件存在。
该核酸分子可以通过已知的方法施用；但是，优选皮下、静脉内或肌 内注射或者作为气溶胶施用。
核酸的施用量取决于给药途径和部位以及由该核酸分子编码的具体细 胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段。 如这里所述，引入200μg的编码细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细 胞因子抑制因子或其生物活性片段的核酸分子足以改善动物的生长性能。 因此，优选将约200μg-1,000μg的编码细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、 细胞因子抑制因子或其生物活性片段的核酸分子引入动物。
该核酸分子还可以在载体，例如猪腺病毒载体中递送。还可以作为裸 DNA递送。
因此，在第四方面，本发明提供一种用于体内递送有效量的细胞因子 受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段的构建 体，所述构建体包含：
a)一种编码细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子 或其生物活性片段的核苷酸序列；
b)一种包含调控序列的载体，其中该调控序列能调控a)的核苷酸序列 的表达，从而产生细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因 子或其生物活性片段，进而改善动物的生长性能。
修饰和变体形式的构建体可以通过化学或酶处理在体外产生，或者通 过重组DNA技术在体内产生。这些构建体可以不同于公开的构建体，例如 区别在于一或多种核苷酸取代、缺失或插入，但基本上保持本发明构建体 或核酸分子的生物活性。
本发明还提供试剂盒。因此，在第五方面，本发明提供一种用于改善 动物的生长性能的试剂盒，所述试剂盒包含：
a).一或多种抗炎剂；
b).递送该抗炎剂的装置；和
c).本发明方法的使用说明。
适宜的缓冲剂和离子盐也可以包括在试剂盒中。
附图说明
图1表示在饲料内含或不含抗生素的情况下，用IL-1ra或盐水处理的 猪在断奶期的最初4周的增重速率(柱表示组平均值+SEM)。
图2表示在饲料内含或不含抗生素的情况下，用IL-1ra或盐水处理的 猪在断奶期第5或6周的增重速率(柱表示组平均值+SEM)。
图3表示在饲料内含或不含抗生素的情况下，用IL-1ra或盐水处理的 猪在断奶期(D7-D42)和生长期(D79和D93)的增重速率(柱表示组平均值 +SEM)。
图4表示在饲料内含或不含抗生素的情况下，用IL-1ra或盐水处理的 猪在结束期(finisher phase)的增重速率。
图5表示在断奶期在存在或不存在饲料内药物的情况下，用盐水或 IL-1ra处理的猪屠宰时的平均重量。
图6表示在断奶期在存在或不存在饲料内药物的情况下，用IL-1ra或 盐水处理的猪的平均清理后重量(温尸体重量)。
图7表示在断奶期在存在或不存在饲料内药物的情况下，用盐水或 IL-1ra处理的猪的饲料转化率。计算的是结束期(第93天-第133天)的饲料 转化率。
图8表示用IL-1ra或盐水处理并被供给0、低水平和正常水平的抗生素 药物的猪在断奶期结束时的平均重量。
图9表示用IL-1ra或盐水处理并被供给0、低水平和正常水平的抗生素 药物的猪在断奶期间有关体重损失发生率和死亡率的产量损失。
图10表示用IL-1ra或盐水处理并被供给0、低水平和正常水平的抗生 素药物的猪在断奶期结束时的总组重。
图11表示用IL-1ra或盐水处理并被供给0、低水平和正常水平的抗生 素药物的猪在生长期结束时的平均重量。
图12表示用IL-1ra或盐水处理并被供给0、低水平和正常水平的抗生 素药物的猪在结束期结束时的平均重量。
图13表示用IL-1ra或盐水处理并被供给0、低水平和正常水平的抗生 素药物的猪在屠宰时的平均P2背膘(backfat)测量。
图14表示在最初用大肠杆菌攻击后从用盐水、IL-1ra或安普霉素 (Apralan)处理5天的猪收集的粪便中培养的大肠杆菌。数据点表示组平均值 和标准误差。
图15表示用IL-1ra或安普霉素处理的猪与盐水对照组相比，在大肠杆 菌攻击后5天的总粪便培养物得分减小的百分率。
图16表示被大肠杆菌攻击并经IL-1ra、盐水或安普霉素处理的猪在5 天中的腹泻和湿粪便记录。柱表示各组的总记录；任何组的最大记录为40。
图17表示与盐水对照组相比，用IL-1ra或安普霉素处理的猪中大肠杆 菌感染的临床症状(粪便状况)的降低百分率。
图18表示用IL-1ra、盐水或安普霉素处理的猪在死后沿胃肠道不同区 域所得样品的大肠杆菌培养物得分。SI指小肠。柱表示组平均值和标准误 差。
图19表示与盐水处理的对照组相比，用IL-1ra或安普霉素处理的猪在 死后的大肠杆菌培养物得分的减小百分率。
图20表示用IL-1ra、盐水或安普霉素处理的猪在死后胃肠道的所有区 域的总大肠杆菌培养物得分。柱表示组平均值和标准误差。
图21表示与盐水处理的对照组相比，用IL-1ra或安普霉素处理的猪在 死后肠中存在的总大肠杆菌水平的减小百分率。
图22表示用IL-1ra、盐水或安普霉素处理的猪在死后前肠和后肠中的 大肠杆菌培养物得分。柱表示组平均值和标准误差。
图23表示与盐水对照组相比，用IL-1ra或安普霉素处理的猪在死后前 肠和后肠区域中得到的大肠杆菌培养物得分的减小百分率。
图24表示用IL-1ra或盐水处理的猪在死后沿胃肠道不同区域所取样品 的螺旋体(spirochaete)培养得分。柱表示组平均值。
图25表示与盐水对照组相比用IL-1ra处理的猪在死后的螺旋菌培养物 得分的减小百分率。
图26表示用盐水或IL-1ra处理并受猪痢疾攻击的猪在死后的粪便状 况。
图27表示用IL-1ra或盐水处理并受猪痢疾攻击的猪的外周血液中促炎 细胞因子TNFα的mRNA的表达。
图28表示用IL-1ra或盐水处理并受猪痢疾攻击的猪的外周血液中促炎 细胞因子IL-8的mRNA的表达。
图29表示用IL-1ra或盐水处理并受猪痢疾攻击的猪的外周血液中促炎 细胞因子IL-1的mRNA的表达。
图30表示用重组IL-1ra、质粒IL-1ra、NSAID氟尼辛、质粒对照或盐 水对照处理，然后用App攻击的猪在2周中的平均重量增量。柱表示组平 均值和标准误差。
图31表示用盐水、氟尼辛、重组IL-1ra、质粒对照或质粒IL-1ra处理 的猪在用App攻击的14天期间增加的总重。柱表示组平均值和标准误差。
图32表示用盐水、氟尼辛、重组IL-1ra、质粒对照或质粒IL-1ra处理 的猪在用App攻击的14天期间的日增加速率。柱表示组平均值和标准误差。
图33表示与盐水对照组相比，用氟尼辛或IL-1ra处理后用App攻击 14天的猪的增重变化百分率。
图34表示与盐水对照组和质粒对照组相比，用IL-1ra质粒处理后用 App攻击14天的猪的增重变化百分率。
图35表示用盐水、氟尼辛、重组IL-1ra、质粒IL-1ra或质粒对照处理 后用App攻击的猪的血清中TNFα蛋白的水平。柱表示组平均值和标准误 差。
图36表示用盐水、氟尼辛、重组IL-1ra、质粒对照或质粒IL-1ra处理 并用App攻击的猪的外周血液中促炎细胞因子IL-6的mRNA的表达。NS 指该时间点无样品。柱表示组平均值和标准误差。
图37表示用盐水、氟尼辛、重组IL-1ra、质粒对照或质粒IL-1ra处理 并用App攻击的猪在攻击的第一周的30次观察中，App疾病的临床症状得 分。柱表示组平均值和标准误差。最大可能得分是240。
图38表示与相关的对照组相比，用氟尼辛、重组IL-1ra或质粒IL-1ra 处理并用App攻击的猪的疾病临床症状的降低百分率。
图39表示用盐水、氟尼辛、重组IL-1ra、质粒对照或质粒IL-1ra处理 并用App攻击的猪在验尸时以胸膜炎得分(0-5)表示的胸膜炎程度。柱表示 组平均值和标准误差。
图40表示与相关的对照组相比，用氟尼辛、重组IL-1ra或质粒IL-1ra 处理并用App攻击的猪的胸膜炎减少百分率。
图41表示用盐水、氟尼辛、重组IL-1ra、质粒对照或质粒IL-1ra处理 并用App攻击的猪在验尸时以受染肺的重量百分率表示的胸膜肺炎程度。 柱表示组平均值和标准误差。
图42表示与相关的对照组相比，用氟尼辛、重组IL-1ra或质粒IL-1ra 处理并用App攻击的猪的受影响的肺质量的减小百分率。
图43表示用盐水、低或高剂量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)处理的猪在 App攻击的最初10天期间的日增重速率。柱表示组平均值和标准误差。
图44表示用盐水、低或高剂量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)处理的猪在 App攻击的第二个10天期间的日增重速率。柱表示组平均值和标准误差。
图45表示用盐水、低或高剂量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)处理的猪在 App攻击的总共21天期间总共增加的重量。柱表示组平均值和标准误差。
图46表示与盐水处理的对照组相比，用低和高剂量的IL-1ra或 IL-1ra+IL-4(syn)预防性处理的猪在App攻击21天期间增重的改善百分率。
图47表示用盐水、低或高剂量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)处理的猪在 App攻击的总共21天期间以总肺重百分率表示的受App损害影响的肺的数 量。柱表示组平均值和标准误差。
图48表示用盐水、低或高剂量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)处理的猪在 App攻击的总共21天期间的肺的胸膜炎得分。柱表示组平均值和标准误差。
图49表示用盐水、低或高剂量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)处理的猪在 App攻击的总共21天期间在死亡后所取的肺组织中促炎细胞因子，IL-8的 mRNA的表达。柱表示组平均值和标准误差。
图50表示用盐水、低或高剂量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)处理的猪在 App攻击的总共21天期间在死亡后所取的肺组织中促炎细胞因子TNFα的 mRNA的表达。柱表示组平均值和标准误差。
图51表示用App攻击后，用高或低剂量的IL-1ra、用盐水或用速解灵 (excenel)处理的猪在攻击后第2周的增重。柱表示组平均值和标准误差。
图52表示用App攻击后，用高或低剂量的IL-1ra、用盐水或用速解灵 处理的猪的饲料摄入。柱表示组平均值和标准误差。
图53表示用App攻击后，用高或低剂量的IL-1ra、用盐水或用速解灵 处理的猪的饲料转化率。柱表示组平均值和标准误差。
图54表示用App攻击后，用高或低剂量的IL-1ra、用盐水或用速解灵 处理的猪对被杀死的App的刺激发生的反应中淋巴细胞的增殖能力。柱表 示组平均值和标准误差。
图55表示用App攻击后，用高或低剂量的IL-1ra、用盐水或用速解灵 处理的猪在死后在肺中发现的促炎细胞因子IL-8的mRNA水平。柱表示组 平均值和标准误差。
发明详述
除非另外指出，本发明的实施利用本技术领域内的常规的分子生物学、 细胞生物学和重组DNA技术。这些技术对本领域技术人员来说是已知的， 并在文献中作了充分说明。例如参见Sambrook和Russell“Molecular Cloning： A Laboratory Manual”(2001)(Green Publishing，New York)；Cloning：A Practical Approach，″Volumes I and II(D.N.Glover，ed.，1985)(Green Publishing，New York)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait，ed.，1984)； ″Nucleic Acid Hybridisation″(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1985)； “Antibodies：A Laboratory Manual”(Harlow & Lane，eds.，1988)；″Transcription and Translation″(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1984)；″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney，ed.，1986)；″Immobilised Cell and Enzymes″(IRL Press， 1986)；B.Perbal，″A Practical Guide to Molecular Cloning″(1984)，and Sambrook等，″Molecular Cloning：a Laboratory Manual″(1989).Ausubel，F 等，1989-1999，“Current Protocols in Molecular Biology”(Green Publishing， New York)。
在描述本发明的方法和组合物之前，应理解本发明不限于所述的特定 材料和方法，因为这些是可以变化的。还应理解，这里所用的技术仅用于 描述具体实施方案，而不意在限定本发明的范围，该范围仅由所附的权利 要求限定。必须注意到这里和所附的权利要求中所用的单数形式“一种”和 “该”包括复数含义，除非上下文清楚地表明其它情况。因此，例如“可溶性 细胞因子受体”包括多种这类细胞因子受体，而“抗生素”指一或多种抗生素 和本领域技术人员已知的其等同物等等。除非另外定义，这里所用的所有 的技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员常规理解的含义相同 的含义。虽然与这里所述的材料和方法类似或等同的任何材料和方法可以 用于实施和试验本发明，但现在描述优选的材料和方法。
这里提及的所有出版物被引用以描述和公开该出版物中报道的并可以 用于本发明的方案、试剂和载体。不应该将此理解为由于先前的发明而认 为本发明不被赋予先于这些内容的权利。
应该理解，本发明的方法和组合物用于改善动物的“生长性能”。术语“生 长性能”在本领域已知指动物的生长速率和饲料利用率的标准，还指动物的 最终重量，和动物的清理后重量与尸体的脂肪含量。动物的“生长速率”是 动物活体的单位增重速率，而“饲料利用率”是动物活体每单位增重所需的饲 料量。动物的“最终重量”是在指定年龄屠宰的动物的重量，而“清理后重量” 是已除去内脏、脚、猪脚或蹄的尸体的重量。“脂肪含量”是整理后尸体的 脂肪量。生长速率、饲料利用率、最终重量和清理后重量以及尸体脂肪含 量的标准的测定方法是本领域已知的。例如参见Manipulating Pig Production VI，VII & VIII.1997，1999 & 2001，Ed.P.D.Cranwell，Australian Pig Science Association，Werribee，Victoria，Australia。随时间连续测定活体重量得到生长 速率。随时间连续测定饲料消失和活体重量得到饲料利用率。尸体脂肪含 量一般通过测定在P2位置的以毫米为单位的背膘厚度来推定。因此，在本 发明中术语“生长性能”意指动物的生长速率、饲料利用率、最终或清理后重 量和尸体的脂肪含量中的一或多种标准的改善。
这里所用的术语“动物”意指任何需要增强生长性能的动物。例如， 哺乳动物偶蹄目或鸟类鸟纲所包括的动物。
偶蹄动物包括约150种活物种，分成9个科：猪(Suidae)、美洲野猪 (Tayassuidae)、河马(hippopotamidae)、骆驼(Camelidae)、鼷鹿(Tragulidae)、 长颈鹿和霍加皮(Giraffidae)、鹿(Cervidae)、叉角羚(Antilocapridae)和牛、羊、 山羊与羚羊(Bovidae)。许多这些动物在许多国家用作食用动物。更重要的 是，关于本发明，许多经济上重要的动物如山羊、羊、牛和猪具有非常类 似的生物学，并共享高度基因组同源性。更重要的是，已知一些动物如山 羊和羊与马和驴可以进行种间交配。
这里所用的术语“鸟”和“鸟类”意指包括所有的鸟类，包括但不限 于小鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉鸡，它们可以工业化饲养用于产蛋或肉。 此术语还包括雄性和雌性的任何鸟类物种。因此，术语“鸟”和“鸟类” 具体包括小鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉鸡的母鸡、公鸡和公鸭(drake)。优 选小鸡和火鸡。
所有偶蹄动物具有类似的包括细胞因子系统的炎性系统，因为它们具 有例如白介素，GM-CSF、干扰素α、β和γ以及它们各自的受体。在大部分 的物种中，编码这些细胞因子的基团定位在一些染色体的特定区域。例如， 在人当中，白介素5基因定位在染色体5q23-31的与编码GM-CSF、M-CSF、 IL-3和IL-4的基因相同的区域。更重要的是，许多细胞因子和它们的受体 在不同的物种之间具有高度氨基酸序列同源性。例如，本领域已知猪与牛、 绵羊(ovine)和马等动物的白介素5共享多达90％的氨基酸(例如见Sylvin等 (2000)，Immunogenetics，51：59-64)。实际上，即使象小鼠和人这样有明显区 别的物种也共享多达70％的氨基酸序列同一性(例如参见Dictionary of Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim)。且已知人 IL-10与牛、鼠和绵羊IL-10具有明显程度的序列同源性(Dutia等，(1994) Gene；149：393-4)。
本领域还已知许多细胞因子具有物种交叉反应性。例如，IL-4具有一 定的交叉物种反应性，而IL-5具有高水平的交叉物种反应性，Dictionary of Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim。但是，应该指 出现有技术文献中所述的交叉反应性涉及体外试验和一些体内实验，但不 涉及生长性能。
还已知细胞因子以刺激或抑制方式调节细胞因子受体的表达，借此通 过其它细胞因子来调控细胞因子的生物活性。一些细胞因子共享共同的可 能具有调控效果的受体亚基。例如，GM-CSF受体表现出与其它造血生长因 子的受体(包括IL-2-β、IL-3、IL-6、IL-7、Epo和催乳素受体)的显著同源性 (例如见Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia- www.copewithCytokines. de)。还已知IL-3能上调小鼠巨噬细胞的GM-CSF受体表达，IL-3也上调 节人和小鼠骨髓细胞的IL-1受体表达，IL-4上调IL-11型受体表达并下调 IL-2受体表达。IL-7上调IL-4受体表达，而TNFα上调IL-3和GM-CSF受 体表达(Dictionary of Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers， Weinheim)。
与偶蹄动物类似，鸟类也具有共同的细胞因子系统，包括白介素。因 此，这里所用的术语“鸟类细胞因子受体”或“鸟细胞因子受体”意指与鸟类物 种产生的细胞因子相对应的任何细胞因子受体。
由于许多食用动物具有共同的祖先和生物学水平，许多物种如牛、羊、 山羊和猪的细胞因子的高度氨基酸序列同源性和其它炎性过程，以及细胞 因子的交叉物种反应水平，本领域技术人员将认识到这里公开的组合物和 方法可用于所有食用动物和所有细胞因子受体。
本领域技术人员将进一步认识到这里公开的组合物和方法可以直接外 推至包括本发明的其它方面。例如，提供特定细胞因子受体拮抗剂的数据； 但是不应将这些理解为限定本发明。实际上，所公开的细胞因子受体拮抗 剂是特别选出以例示本发明范围的。例如，许多细胞因子共享受体或受体 亚基。例如，IL-3、IL-5和GM-CSF共享受体亚基(Dictionary of Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim)。IL-4共享IL-2 和IL-7的共同亚基(Dictionary of Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim)。一些细胞因子具有类似的基因结构，并群集至一个 染色体上，例如人和小鼠的IL-3、IL-4、IL-5、GM-CSF和IL-13(Dictionary of Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim)。
以上描述只为举例说明本发明在所涉动物类型方面的范围。但是，还 容易地看到术语“细胞因子受体”或“细胞因子受体拮抗剂”还应被广义理解， 且不限于所公开的实验数据。例如，术语“细胞因子受体”包括一或多种IL-1 受体、IL-6受体、TGF-β受体、IL-11受体、IL-18受体、IL-12受体、IL-17 受体、LIF受体、IFN-γ受体、IL-8受体、TNF-α受体和GM-CSF受体，为 可溶形式。术语“受体拮抗剂”包括IL-1ra、IL-4ra、IL-8ra、GM-CSFra、IL-6ra 或TNF-αra。
在一个特别优选的实施方案中，本发明方法的最初步骤包括给动物施 用生长促进量的一或多种抗炎剂。
这里所用的术语“抗炎剂”指能降低炎症的任何化合物或组合物。例如， 可以使用具有抗炎效果的可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细 胞因子抑制因子或其生物活性片段。或者，可以使用抗炎剂如双氯酚酸、 二氟尼柳、依托度酸、氟尼辛、非诺洛芬、夫洛非宁、氟比洛芬、布洛芬、 吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普 生、奥沙普嗪、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸或托美 汀。还已知皮质类固醇药物是强抗炎剂，它们广泛用于抑制免疫反应的有 害效果。因此，在一个实施方案中可以使用皮质类固醇药物。
在另一个实施方案中，术语“抗炎剂”包括增加促炎细胞因子的可溶性 受体量的任何化合物或组合物。
如上述，生长性能是可以测定的；但是，生长性能增加的原因是略复 杂的问题。无意受任何具体理论或假设限制，本申请人认为施用抗炎剂以 多种补充方式起作用，从而导致改善生长性能。例如，本申请人已发现通 过增强食用动物的免疫力，避免了原料损失(stock loss)并改善随后的生长性 能。因此，本发明提供降低动物对感染的易感性的方法。所述方法用于降 低对由细菌、病毒或寄生虫导致的感染的易感性。
本申请人还已发现，将一或多种抗炎剂和一或多种抗生素一起施用也 可改善动物的生长性能，并减少抗生素的总用量。据信抗生素将动物的微 生物载量限制在阈值水平，从而使施用的抗炎剂能发挥对生长性能的效果。
因此，本申请人认为抗炎剂并非自身用作生长促进剂(虽然这是可能 的)，可以理解施用抗炎剂可以通过激活能被抗炎剂激活的免疫反应的体液 和细胞武器而导致改善生长性能。
这里所用的术语“生长促进量”意指有效导致上述的生长性能增加的本 发明抗炎剂的量。例如，增加生长速率、饲料利用率、增加最终体重、增 加尸体清理后重量或降低脂肪含量。
这里所用术语“给药”指本发明组合物的递送方式。该术语还指组合 物的剂量。根据抗炎剂的活性和动物的年龄与体重、可以改变抗炎剂的给 药方式和剂量。可以理解，任何特定动物的特定剂量水平取决于多种因素， 包括所用的特定抗炎剂的活性、年龄、体重、总体健康水平、性别、饮食、 给药时间、给药途径、排泄速率和抗炎剂或抗生素组合。但是，通常优选 的给药途径选自口服、局部给药和肠胃外给药。
肠胃外给药包括皮下注射、气溶胶、静脉内、肌肉内、鞘内注射或输 液技术和被囊化细胞。
这里所用的术语“上调”指引起蛋白或肽的生产、分泌或利用率增加(因 此增加浓度)。因此动物或鸟类的内源性抗炎剂的上调方法指与未处理的动 物或鸟类相比，使动物或鸟类的抗炎剂的产量、分泌或利用率增加的方法。
术语“内源性”意指在被研究的受试者、细胞或系统内产生。因此， 增加抗炎剂的内源性水平意指给动物施用一或多种化合物以使动物中抗炎 剂的总量高于正常存在量。增加抗炎剂的内源性水平意指给动物施用一或 多种化合物，其中该化合物增加动物细胞或组织的抗炎剂生产，从而有效 地增加动物的抗炎剂总量。抗炎剂的内源性水平还可以通过降低抗炎剂的 转化率来得以有效地增加。例如，本发明的一或多种化合物在施用于动物 时可以通过抑制蛋白水解酶的效果来降低内源性抗炎剂的蛋白水解率。
许多物质能刺激内源性抗炎剂(例如细胞因子受体、IL-4和IL-16或细 胞因子受体拮抗剂)的上调。例如，WO93/18783中提示IL-10上调IL-1受 体拮抗剂的表达。而且，化合物如1，8-萘磺内酰胺取代的化合物或喹喔啉化 合物已知上调细胞因子受体拮抗剂如IL-8。例如参见国际专利申请 WO99/36070和WO99/42461，它们在此被引用作为参考。
降低或改善促炎细胞因子如IL-1的效果的备选方法是从循环中除去这 些物质。例如，已知存在能与配体结合从而防止它们与其受体结合的因子。 例如已知上文讨论的TNF阻断因子和TNF-α抑制剂与TNF结合。
术语“生物活性片段”指抗炎剂的片段，其对动物的生物或生理效果 基本上类似于衍生它的完整抗炎剂。例如，IL-1受体拮抗剂的生物活性片 段可以是IL-1受体拮抗剂的具有约5个以上氨基酸残基的任何部分，它包 含生物活性部位或者保留IL-1受体拮抗剂活性。例如，当IL-1受体拮抗剂 部分保留与上述IL-1受体结合的能力时，此部分是IL-1受体拮抗剂的“生 物活性片段”。通常，这种IL-1受体拮抗剂的片段是能竞争性抑制IL-1与 IL-1受体结合的片段。
由此可见，可以在该方法中施用足以提供一些或全部IL-1ra功能的 IL-1ra的片段，或者足以提供一些或全部IL-1ra功能的任何其它分子，而不 是施用IL-1ra。例如，这种片段或分子能提供一些或全部IL-1ra功能，包括 阻断IL-6和IL-8生产。典型地，这种片段或分子能竞争性抑制IL-1ra和/ 或IL-1与IL-1受体结合。因此，在一个实施方案中，本发明包括施用足以 提供一些或全部IL-1ra功能的IL-1ra片段，或者足以提供一些或全部IL-1ra 功能的分子。
本发明还涉及可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子 抑制因子或其生物活性片段的氨基酸序列变体。例如，可将一个或多个氨 基酸残基加到上述可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子 抑制因子或其生物活性的片段序列或其片段的N-或C末端或者内部。上述 可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子序列或它 们的片段的氨基酸序列变体，其中该序列或其片段的一个或多个氨基酸残 基缺失，并任选被一个或多个氨基酸残基取代；和以上可溶性细胞因子受 体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段的衍生物， 其中氨基酸残基已被共价修饰，因而所得的产物为非天然存在的氨基酸。 而且术语“生物活性片段”包括可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗 剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段的所有这些变体，只要该变体保 留衍生它的完整可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑 制因子或其生物活性片段的生物活性。
本文中“可药用载体、助剂或赋形剂”是用于将抗炎剂和/或抗生素递送 至动物的可药用溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体，并根据 计划的给药方式进行选择。
术语“基本上同源”可以核酸和/或氨基酸序列，它意指具体受试序列， 例如突变体序列，由参照序列经一或多种取代、缺失或加入而演变，其最 终效果不导致参照和受试序列之间的不利的功能差异。为本发明的目的， 认为具有等同生物活性和等同表达特征的序列基本上是同源的。认为具有 较小程度的同一性、相当的生物活性和等同表达特征的序列是等同的。
“微生物的”指由细菌、真菌(例如酵母)、病毒(例如杆状病毒)或植物表 达系统制备的重组蛋白。作为一种产物，“重组微生物的”定义一种基本上 不含天然内源性物质且不伴有相关的天然糖基化作用的动物蛋白。大部细 菌培养物，例如大肠杆菌中表达的蛋白没有发生糖基化修饰；在酵母和昆 虫细胞中表达的蛋白具有不同于哺乳动物细胞中表达的糖基化模式。
“核酸分子”或“多核酸分子”指所有形式的脱氧核糖核酸和核糖核酸，即 单链和双链DNA、cDNA、mRNA等。
“双链DNA分子”指在其正常、双链螺旋中的聚合形式的脱氧核苷酸(腺 嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)，该术语仅指该分子的一级和二级结构， 并不限制它的任何三级结构。因此此术语包括可见于线性DNA分子(例如 限制性片段)、病毒、质粒和染色体中的双链DNA。在讨论具体双链DNA 分子的结构时，本文对序列的描述可以按一般规律，仅提供沿非转录DNA 链(即与mRNA具有序列同源性结构的链)的5′-3′方向的序列。
如果一种DNA序列根据遗传密码进行翻译产生一种氨基酸序列(即该 DNA序列“编码”该氨基酸序列)，则该DNA序列“对应”于该氨基酸序列。
如果二种DNA序列编码相同的氨基酸序列，则一种DNA序列“对应” 于另一种DNA序列。
当至少约85％，优选至少约90％，最优选至少约95％的核苷酸与确定 长度的DNA序列匹配时，两种DNA序列“基本上相似”。基本上类似的序 列可以用Southern杂交实验，在例如与具体系统有关的严谨条件下来鉴定。 适宜杂交条件的确定在本领域技术范围内。例如参见Sambrook等，DNA Cloning，vols.I，II and III.Nucleic Acid Hybridization。但是，通常核酸分子 的杂交或退火的“严谨条件”是这样的条件：
(1)利用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M NaCl/0.0015M柠檬 酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，在50℃进行洗涤，或者
(2)在杂交期间使用变性试剂如甲酰胺(例如50％(vol/vol)甲酰胺)以及 0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液， pH6.5，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，42℃的条件。
另一个实例是使用50％甲酰胺、5X SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸 钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5 XDenhardt溶液、超声处理 的鲑精DNA(50μg/mL)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，42℃的条件，并在 42℃用0.2X SSC和0.1％SDS洗涤。
DNA构建体的“异源”区或结构域是较大分子中在其天然状态下不与 其结合的可鉴定的DNA片段。因此，当异源区编码哺乳动物基团时，该基 因侧翼一般具有在来源生物基因组中并非位于所述哺乳动物基因组DNA侧 翼的DNA。异源区的另一实例是一种构建体，其中编码序列本身不在自然 中发现(例如一种cDNA，其中基因组编码序列包含具有不同于天然基因的 密码子的内含子或合成序列)。等位基因变异或天然存在的突变事件不产生 这里定义的DNA的异源区。
“编码序列”是符合读框(in-frame)的密码子序列，它对应于或编码蛋白或 肽序列。两种编码序列或它们的互补序列编码相同的氨基酸序列时，这两 种编码序列彼此对应。与适宜的调控序列结合的编码序列可以在体内转录 和翻译成多肽。多腺苷酸化信号和转录终止序列一般位于编码序列的3′端。
“启动子序列”是一种能与细胞中的RNA聚合酶结合并引起下游(3′向) 编码序列转录的DNA调控区。当结合启动子序列的RNA聚合酶将编码序 列转录成mRNA，而mRNA进而转录成由该编码序列编码的蛋白时，编码 序列“受控于”细胞内的启动子序列。
为本发明的目的，启动子序列3′末端被编码序列的翻译起始密码子结 合，并向上游延伸，以便包括引起超过背景的可检测水平的转录所需的最 少量碱基或元件。在启动子序列内可以发现转录起始位点(可方便地用核酸 酶S1作图来限定)以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合域(共有序列)。真 核生物启动子一般，但不总是包含“TATA”盒和“CAT”盒；原核生物启动子 除了-10和-35共有序列之外还包含Shine-Delgarno序列。
当将外源DNA引入细胞壁内侧时，称细胞被这些外源DNA“转化”。 外源DNA可以整合或不整合(共价连接)至组成细胞基因组的染色体DNA。 例如在原核生物和酵母中，外源DNA可以保留在附加元件如质粒上。关于 真核细胞，稳定转化的细胞是通过染色体复制而将异源DNA遗传给子细胞 的那些细胞。这种稳定性通过真核细胞建立由包含异源DNA的子细胞群组 成的细胞系或克隆的能力来证明。
DNA的“整合”可以利用微量注射法、基因枪法(boilistics)、电穿孔法或 脂质转染法将DNA传至细胞，然后利用非同源重组来实现。本发明还包括 备选方法如异源重组，和/或限制酶介导的整合(REMI)或转座子，并可以认 为它们是改进的整合方法。
“克隆”是通过有丝分裂由单一细胞或共同祖先衍生的细胞群。
因此“细胞”、“宿主细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且所 有这些术语应被理解为包括子代。“细胞系”是能在体外稳定生长许多代的原 代细胞的克隆。因此，术语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细 胞和由其衍生的培养物，而与该培养物传代的次数无关。还应该理解，由 于有意或无意的突变，所有子代的DNA含量可能不完全相同。
载体用于将外源物质，例如DNA、RNA或蛋白引入生物体。典型的载 体包括重组病毒(用于DNA)和脂质体(用于蛋白)。“DNA克隆载体”是自主 复制的DNA分子，例如质粒、噬菌体或粘粒。通常，DNA克隆载体包含 一个或少数限制性核酸内切酶识别位点，在这些位点可以以可测定的方式 切割这种DNA序列而不损失载体的基本生物功能，并可以将DNA片段剪 接到所述位点以使其复制和克隆。克隆载体还可以包含适于在鉴定该克隆 载体转化的细胞时用到的标记。
“表达载体”类似于DNA克隆载体，但包含能指导适宜宿主细胞进行蛋 白合成的调控序列。这一般是指与RNA聚合酶结合，并引起mRNA转录的 启动子，以及指导mRNA翻译成多肽的核糖体结合位点和起始信号。将DNA 序列掺入表达载体的适宜位点和正确读框中，然后用该载体转化适宜宿主 细胞，能产生对应于该DNA序列的mRNA，并通常产生由该DNA序列编 码的蛋白。
为本发明的目的，启动子序列3′末端被编码序列的翻译起始密码子结 合，并向上游延伸，以便包括引起超过背景的可检测水平的转录所需的最 少量碱基或元件。在启动子序列内可以发现转录起始位点(可方便地用核酸 酶S1作图来限定)以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合域(共有序列)。
“异源”元件是相对宿主细胞而言外来的元件，或者与宿主细胞同源但在 宿主细胞中处于并非该元件通常可见的位置的元件。
DNA的“消化”是指利用仅作用于DNA的一些部位的酶催化裂解DNA。 这些酶称为限制酶或限制核酸内切酶，而这种酶裂解的DNA内的位点称为 限制位点。如果DNA内存在多个限制位点，则消化将产生两个或更多个线 性DNA片段(限制性片段)。这里所用的多种限制酶是可商购的，并使用由 酶制造商确定的它们的反应条件、辅助因子和其它要求。限制酶一般由缩 写来指定，它包括一个大写字母，其后是代表获得每种限制酶的原始微生 物的其它字母，然后是指示具体酶的数字。一般地，约1μg的DNA用在约 20μl缓冲液中的约1-2单位的酶消化。关于具体限制酶的适宜缓冲液和底物 量由制造商特别指明，和/或在本领域已知。
指定DNA片段经限制性消化后的“回收”或“分离”通过以下方法来完 成：在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上进行电泳来分离称为“限制性片段”的 消化产物，根据相对于已知分子量的标记DNA片段的迁移来鉴定目标片段， 切割包含目标片段的凝胶部分，并从凝胶中分离DNA，例如电洗脱分离。
“连接”指在双链DNA片段之间形成磷酸二酯键的过程。除非另外特别 说明，连接使用已知的缓冲液和条件，采用10单位T4 DNA连接酶每0.5μg 约等摩尔量的待连接DNA片段来完成。
“寡核苷酸”是通过已知方法(包括例如三酯、亚磷酰胺或膦酸酯化学)， 例如Engels等，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.28：716-734(1989)所述方法合成 的短长度、单链或双链聚脱氧核苷酸。然后通过，例如聚丙烯酰胺凝胶电 泳纯化。
本文中“聚合酶链反应”或“PCR”一般指目标核苷酸序列的体外扩增方 法，可参见美国专利4,683,195。一般地，PCR法包括使用两种能优先与模 板核酸杂交的寡核苷酸引物进行引物延伸合成的反复循环。通常用于PCR 法的引物与模板内待扩增核苷酸序列的末端或侧翼的核苷酸序列互补，也 可以使用与待扩增的核苷酸序列互补的引物。Wang等，PCR Protocols， pp.70-75(Academic Press，1990)；Ochman等，PCR Protocols，pp.219-227； Triglia等，Nucl.Acids Res.16：8186(1988)。
“PCR克隆”指采用PCR法扩增相应细胞或组织的核酸中的具体目标核 苷酸序列，包括总基因组DNA和由细胞总RNA转录的cDNA。Frohman 等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：8998-9002(1988)；Saiki等，Science 239：487 -492(1988)；Mullis等，Meth.Enzymol.155：335-350(1987)。
“载体”或“构建体”指质粒或病毒或基因组整合体，其包含具有以下成分 的转录单元：(1)在基因表达中具有调控作用的一或多种遗传元件，例如启 动子或增强子，(2)转录成mRNA并翻译成蛋白的结构或编码序列，和(3) 适宜的转录起始和终止序列。欲用于酵母或真核表达系统的结构单元包括 前导序列，其使宿主细胞将翻译的蛋白分泌到细胞外。或者，当重组蛋白 在无前导序列或转运序列的情况下表达时，它可以包括N-末端蛋氨酸残基。 该残基随后从表达的重组蛋白切出或不切出而得到最终产物。一般地，重 组表达载体包括允许转化宿主细胞的复制起点和可选择的标记和来自高表 达基团的启动子以引起下游结构序列的转录。异源结构序列在适宜的时期 与下列物质组装：翻译起始和终止序列，优选能指导翻译蛋白分泌至胞质 空间或细胞外介质的前导序列。可选地，异源序列可以编码融合蛋白，该 融合蛋白包括赋予目标特征(例如稳定或更简易纯化所表达的重组产物)的 N-末端识别肽。本发明优选的重组表达载体是病毒载体(例如猪腺病毒载 体)、哺乳动物细胞(例如猪细胞)、植物细胞和细菌细胞。
术语″免疫反应″意指脊椎动物受试者的免疫系统对抗原或抗原决定簇 的任何反应。例举性的免疫反应包括体液免疫反应(例如抗原特异性抗体的 产生)和细胞介导的免疫反应(例如淋巴细胞增殖)，见下文。
术语“系统性免疫反应”意指与淋巴结节、脾或肠相关的淋巴样组织 中的免疫反应，其中产生免疫系统的细胞，例如B淋巴细胞。例如，系统 性免疫反应可以包括产生血清IgG。而且，系统性免疫反应指在血流中循环 的抗原特异性抗体和在系统性隔室如脾和淋巴结的淋巴样组织中的抗原特 异性细胞。作为对照，与肠相关的淋巴样组织(GALT)是粘膜免疫系统的一 个组分，因为对肠抗原/病原体作出反应的抗原特异性细胞可在GALT中诱 导并检测。
由于细胞因子受体和细胞因子受体拮抗剂在所有食用动物物种中内源 性表达，且其中的许多具有高度交叉反应性，由此可见来自一个物种的细 胞因子受体和细胞因子受体拮抗剂可以施用于不同物种的动物，反之亦然。 例如当动物为猪时，可以将人细胞因子受体如IL-1受体用于所公开的方法。 并不要求具体细胞因子受体或细胞因子受体拮抗剂与在动物中内源性表达 的细胞因子受体或细胞因子受体拮抗剂完全相同。
在一个实施方案中，本发明的方法包括：
(1)在施用一或多种抗生素之前、同时或之后施用一或多种抗炎剂；或
(2)施用包含一或多种抗炎剂和一或多种抗生素的组合物。
(3)施用不含任何抗生素的一或多种抗炎剂。
本发明的抗炎剂或组合物可以通过口服、局部或肠胃外途径，以包含 无毒的常规可药用载体、助剂和赋形剂的单位剂量配制剂来给药。本文术 语肠胃外包括皮下注射、气溶胶、静脉内、肌肉内、鞘内、颅内注射或输 液技术。
本发明还提供适用于本发明改善生长性能的新方法的局部、口服和肠 胃外用药物配制剂。本发明的组合物可以作为片剂、水性或油性悬浮液、 锭剂、糖锭、散剂、颗粒剂、乳剂、胶囊、糖浆或酏剂口服给药。口服组 合物可以包含一或多种选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的试剂，以 产生药学上优质可口的制剂。片剂包含与适于配制片剂的无毒可药用载体、 助剂或赋形剂混合的活性成分。
这些载体、助剂或赋形剂可以是，例如(1)惰性稀释剂，例如碳酸钙、 乳糖、磷酸钙或磷酸钠；(2)造粒和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；(3)粘 合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和(4)润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸 或滑石。这些片剂可以无包衣或者由已知技术包衣以延迟在胃肠道中崩解 和吸收，借此提供较长时间的持续作用。例如可以使用延时材料如单硬脂 酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。还可以使用美国专利4,256,108、4,160,452和 4,265,874所述的技术进行包衣，以形成渗透性治疗片剂来进行控释。
用于本发明的方法的抗炎剂和抗生素可以通过在体内应用、肠胃外注 射或缓慢输液一段时间而单独或共同给药。给药可以是静脉内、动脉内、 腹膜内、肌内、皮下、腔内或透皮给药。
用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。 非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机 酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和 缓冲介质。肠胃外赋形剂包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化 钠，乳酸化林格氏静脉内赋形剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例 如基于林格氏右旋糖的补充剂)等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如 抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、生长因子和惰性气体等。
本发明包括用于改善生长性能的多种组合物。根据本发明一个实施方 案的组合物通过用载体、助剂、赋形剂或添加剂将一或多种抗炎剂(含有或 不含有一或多种抗生素)配制成适于对动物给药的剂型来制备。
适用于本发明的这个方面的抗生素是通常在动物饲养业中用作动物用 水和/或饲料的添加剂并用于限制动物的微生物载量的那些抗生素。这些抗 生素的实例包括林可霉素、壮观霉素和阿莫西林。在澳大利亚，将抗生素 用于食用动物的用途详见“The use of antibiotics in food-producing动物s： antibiotic-resistant bacteria in Animals and humans”。关于抗生素耐受性的联合 专家咨询委员会的报告(JETACAR)，澳大利亚共和国，1999。
抗生素可以施用于动物，其用量与常规施用于动物以减少动物的微生 物载量的量相同。抗生素的所述量是本领域已知的，可参见上述JETACAR。
常用的载体、助剂或赋形剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露糖醇 和其它糖、滑石、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动 物和植物油、聚乙二醇和溶剂，如无菌水、醇、甘油和多羟基醇。静脉内 赋形剂包括液体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合 剂和惰性气体。其它可药用载体包括水溶液、无毒赋形剂，包括盐、防腐 剂、缓冲剂等，例如见Remington′s Pharmaceutical Sciences，15th ed.Easton： Mack Publishing Co.，1405-1412，1461-1487(1975)和The National Formulary XIV.，14th ed.Washington：American Pharmaceutical Association(1975)，该文献 内容在此被引用作为参考。该药物组合物的多个组分的pH和精确浓度可以 根据本领域常识调节。参见Goodman and Gilman′s，The Pharmacological Basis for Therapeutics(7th ed.)。
根据本发明的药物组合物可以以生长促进量进行局部或系统给药。这 种应用的有效量当然取决于抗炎剂和动物的重量与一般状况。一般地，体 外使用的剂量可以为所述组合物原位给药的量提供有用的指导。许多考虑 在例如Langer，Science，249：1527，(1990)中作了描述。口服配制剂可以是硬 明胶胶囊的形式，其中将活性成分与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙 或高岭土)混合。它们还可以是软明胶胶囊的形式，其中活性成分与水或油 介质(如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
水悬浮液通常包含与适于制备水悬浮液的赋形剂混合的活性成分。这 类赋形剂可以是(1)助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素，羟丙基甲 基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯胶；(2)分散或润 湿剂，它可以是(a)天然存在的磷脂，例如卵磷脂；(b)烯化氧与脂肪酸的缩 合产物，例如聚环氧乙烷硬脂酸酯；(c)环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物， 例如十七碳乙烯氧基鲸蜡醇；(d)氧化乙烯与由脂肪酸与己糖醇衍生的部分 酯的缩合产物，例如聚环氧乙烷山梨醇一油酸酯或(e)环氧乙烷与由脂肪酸 和己糖醇酐衍生的部分酯的缩合产物，例如聚氧化乙烯脱水山梨醇一油酸 酯。
组合物可以是无菌注射用水性或油性悬液形式。这种悬液可以根据已 知方法，使用上述适宜的分散剂或润湿剂和助悬剂来制备。无菌注射制剂 还可以是在肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的无菌注射液，例如在1，3- 丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的赋形剂和溶剂为水、林格氏溶液和 等渗氯化钠溶液。此外，无菌、固化的油常用作溶剂或悬浮介质。为此目 的，可以使用任何温和的固化油，包括合成的甘油一酸酯或甘油二酸酯。 此外，脂肪酸，例如油酸可用于制备注射剂。
本发明的抗炎剂和组合物还可以脂质体递送系统的形式(例如小单层囊 泡、大单层囊泡和多层囊泡)给药。脂质体可以由不同的磷脂，例如胆固醇、 硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。
本发明的抗炎剂或组合物的剂量水平等级为约1微克至约50微克每千 克体重，优选的剂量范围为约5微克至约20微克每千克体重每次服药(可以 一次或多次服药)(约100微克至约500微克每只动物每次服药)。可以与载 体物质组合以制备单一剂量(single dose)的抗炎剂量将随动物和具体给药模 式而变。例如，欲用于对猪进行静脉内给药的制剂可以包含约20μg至1g 的抗炎剂和可以为全部组合物的约5-95％的适宜且方便量的载体物质。单位 剂量形式通常包含约5μg-500mg的抗炎剂。
但是可以理解，任何具体动物的具体剂量水平取决于多个因素，包括 所用的具体抗炎剂的活性、年龄、体重、总体健康水平、饮食、给药时间、 给药途径、排泄率和药物组合。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，一或多种抗炎剂在体内表达 而不是外源施用。例如，通过插入编码抗炎剂的结构DNA序列和适当的翻 译起始与终止信号，使其与功能性启动子处在可操作性阅读状态，可以产 生能在体内表达抗炎剂的表达载体。该载体包含一个或多个表型可选择的 标记和复制起点，以确保在宿主内扩增。适于转化的原核宿主包括大肠杆 菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属、链单胞菌属(Streptomonas)和葡萄球菌属的多个 物种，也可以选择其它物种。在将适宜的宿主菌株转化和表达之后，将细 胞再培养一段时间。细胞通常通过离心来收集，用物理或化学方法破裂， 并保留所得的粗提取物以作进一步纯化。多种哺乳动物细胞培养物系统还 可以用于表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的实例包括Gluzman，Cell 23：175(1981)所述的猴肾成纤维细胞的COS-7系和其它能表达相容载体的 细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系，当然还有猪细胞。 哺乳动物表达载体将包含复制起点、适宜的启动子和增强子，还包含任何 需要的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终 止序列和5′-侧翼非转录序列。由SV40病毒基因组衍生的DNA序列，例如， SV40起点、早期启动子、增强子、剪接位点和多腺苷酸化位点可以用来提 供所需的非转录性遗传元件。在细菌培养物中产生的重组蛋白一般通过以 下方法分离：首先从细胞碎片进行提取，然后进行一次或多次盐析、水溶 液离子交换或大小排阻层析处理步骤。必要时，用蛋白再折叠步骤实现成 熟蛋白构型。最后，可以将高效液相色谱法(HPLC)用于最终的纯化步骤。 用于蛋白表达的微生物细胞可以用任何适宜的方法破裂，包括冷冻-融化循 环、超声处理、机械破裂或利用细胞溶解试剂。表达纯化所用标签序列的 表达系统的应用将简化纯化。本文所述重组表达系统在诱导与DNA片段或 待表达的合成基团连接的调控元件时表达异源蛋白。不含细胞的翻译系统 也可以用于利用由本发明的DNA构建体衍生的RNA生产猪细胞因子。适 用于原核生物和真核生物宿主的克隆和表达载体见Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor，N.Y.，1985)，该文献的内 容在此被引用作为参考。
编码具体抗炎剂的核酸优选为质粒DNA或病毒载体形式(它是由腺病 毒、逆转录病毒、痘病毒，特别是痘苗病毒或MVA病毒、疱疹病毒、腺伴 随病毒等衍生的载体)的形式。编码具体抗炎剂的核酸通过感染性病毒颗粒 或者以合成载体(阳离子脂类、脂质体，阳离子聚合物等)，或经改造的细胞 (用该核酸转染或转导的细胞)或未经改造的细胞(它天然包含该核酸)的形式 转运。
根据另一优选的变体，目标核酸由有复制缺陷的腺病毒载体(不能在宿 主细胞中自主复制)携带。腺病毒的技术在现有技术中有描述(例如参见 Graham and Prevec in Methods in Molecular Biology，1991，vol 7，pp.109-128， ed E.J.Murey，The Human Press Inc)。有利地，本发明范围内所用的腺病毒 载体由腺病毒的基因组衍生，它包含至少ITR(反向末端重复)和壳体化序列， 并缺乏所有或部分E1腺病毒区。此外，它可以缺乏所有或部分E3腺病毒 区。但是，根据一个有利的实施方案，优先保留编码多肽，特别是糖蛋白 gp19 k的部分E3区(Gooding等，Critical Review of Immunology，1990，10： 53-71)，从而使其能逃避宿主的免疫系统。而且，该载体可以包括附加的缺 失和突变，它们尤其影响所有或部分的选自E2、E4、L1、L2、L3、L4和 L5区的一个或多个区域(例如参见WO 94/28152)。为了例示这一点，可以提 及影响E2A区的DBP(代表DNA结合蛋白)基因的温度敏感性突变(Ensinger 等，J.Virol.，1972，10：328-339)。另一变体或吸引人的组合是缺失E4区， 但编码开放读框(ORFs)6和7的序列除外(这些限制性缺陷不要求E4功能互 补；Ketner等，Nucleic Acids Res.，1989，17：3037-3048)。优选将目标基因插 入载体代替缺失的腺病毒区，特别是E1区。使用许多目标基因时，它们可 以插在病毒基因组的相同位点或不同位点，并可以处在相同的调控元件或 独立元件的控制之下，且如果合适的话，它们中的一些可以与其它的取向 相反，以便在其表达水平下的干扰现象最小化。重组腺病毒载体的基因组 可以通过分子生物学技术或通过同源重组(参见WO 96/17070)来制备。
在本发明的范围内使用的腺病毒载体在能反式提供缺陷功能的补充细 胞系中繁殖以产生形成感染性病毒颗粒所需的肽。例如，利用细胞系293 来补充E1功能(Graham等，J.Gen.Virol.，1977，36：59-72)或利用国际申请 WO 97/04119所述的细胞系来进行双互补。还可以使用适宜的细胞系和辅助 病毒以补充所有缺陷功能。从细胞培养物中回收产生的病毒颗粒，如果需 要的话，用本领域中的技术纯化(氯化铯梯度，色谱步骤等)。
本发明范围内所用的腺病毒载体可以由源自人、犬、鸟类、牛、鼠、 绵羊、猪或猴子的腺病毒的基因组衍生，或者由包含不同来源的腺病毒基 因组片段的杂合体衍生。更具体而言，可以提及来源于犬的CAV-1或CAV-2 腺病毒、来源于鸟类的DAV，或者来源于牛的III型Bad(Zakharchuk等， Arch.Virol.，1993，128：171-176；Spibey and Cavanagh，J.Gen.Virol.，1989，70： 165-172；Jouvenne等，Gene，1987，60：21-28；Mittal等，J.Gen.Virol.，1995，76： 93-102)。但是，优选研究对具体动物物种有特异性的腺病毒载体。
本发明的方法可以具体化为试剂盒的形式。
该试剂盒包括含有一或多种抗炎剂的第一容器，用于递送试剂的装置 和使用说明。
在适用于密集的动物生产的实施方案中，该试剂盒还可以包括含有一 或多种抗生素的第二容器。备选试剂盒包括含有一或多种编码抗炎剂的核 酸分子的第一容器(如果将它施用于动物，则在动物上表达该核酸分子时产 生生长促进量的抗炎剂)，用于递送试剂的装置和使用说明。
使用说明使农场主或其它动物饲养实践者能施用抗炎剂或核酸分子， 以提高该动物相对于未施用这种试剂或核酸分子的动物的生长促进作用。
在整个说明书中，词“包括(comprise)”和该词的变型，例如“包括 (comprising)”和“包括(comprises)”意指“包括但不限于”，并且不意在排除其 它添加剂、组分、整数或步骤。
仅通过参照以下非限制性实施例的方式进一步描述本发明。但应该理 解，以下的实施例仅是例示性的，不应以任何方式被认为是对上述本发明 的一般性的限制。例如，虽然主要的实施例与猪有关，但应理解本发明还 可以用于这里公开的其它动物，包括例如羊、牛和小鸡。
实施例1
重组IL-1RA作为生长促进剂以代替饲料内的抗生素
进行此实验以确定IL-1ra是否能够在工业化环境中改善断奶猪的生长 性能和健康。我们还希望研究IL-1ra作为饲料中的抗生素药物的替代物的 潜能。
实验设计
重组猪IL-1ra在大肠杆菌(E.coli)中表达，并用polyHis标记系统进行纯 化。在开始实验前在生物分析中测定IL-1ra的生物活性。
将雄性断奶猪(28天大)以每组20只分配到表1所述的处理组。各处理 组的平均重量相同，具有相同的方差。将猪以每组畜栏(group pen)20圈养， 其中2个监禁组提供含药物的水并按照目前的工业标准饲养，而另2个畜 栏给予不含药物的水并饲养。如表2所述，每周两次将体积为1ml的重组 IL-1ra或盐水(对照)注入猪，持续断奶期(42天)。
在断奶期开始(0天)和断奶期结束(第42天)时，猪通过静脉穿刺放血以 进行免疫分析。在整个断奶期(第0-42天)每周对猪称重，然后在第79天、 第93天和试验最后一天即第113天试验分别对猪称重，然后屠宰动物并测 定尸体特征。
表1 组 处理 药物 盐水+ 1ml盐水 有 IL-1ra+ 200μg IL-1ra，在1ml盐水中 有 盐水- 1ml盐水 无 IL-1ra- 200μg IL-1ra，在1ml盐水中 无
表2
第0天 对28天大的断奶猪进行称重和分组。
放血。对各组进行注射。
第1天
对各组进行注射。
第6天 称重
对各组进行注射。
第7天(第1周) 对各组进行注射。
第9天 称重
第13天 对各组进行注射。
对各组进行注射。
第14天(第2周) 称重
第16天 对各组进行注射。
第20天 对各组进行注射。
称重。
第21天(第3周) 对各组进行注射。
第23天 对各组进行注射。
第27天 称重
对各组进行注射。
第28天(第4周) 对各组进行注射。称重。最后一次放血。
第30天 移至生长畜圈。
第34天 生长期。所有的猪给予标准饲料，并保持在先前
的组中。
第35天(第5周) 在生长期期间(D73)和结束时(D93)称重。
第37天
第41天 结束期。将猪移至单一畜圈，并测定摄入饲料的
FCR(食物转化率)。所有的猪给予标准完工饲料。
第42天(第6周) 在结束期期间(实验天(D)114)和结束期结束时
(第42-93天) (屠宰D133)称重。测定最终重量，P2背膘，
(第93-133天) 尸体重量，％清理后(dressing)重量。
结果
关于最初4周的处理，用IL-1ra处理的猪在增重率方面与盐水对照组 表现一样好(图1)。但是，当实验和处理进行至断奶期的后几周，即第5和 第6周时，用IL-1ra处理的猪在加药物和不加药物的饲养方案中，其表现 均胜过盐水处理的猪(图2)。而且，用IL-1ra处理并喂饲不含抗生素的食物 的猪的表现与喂饲含药物食物的盐水处理猪的表现一样好(图2，IL-1ra对 盐水+)。用IL-1ra处理并喂饲含药物的食物的猪在断奶的最后2周中有最大 的增加率。
这些结果表明，对于促进工业化条件下猪的生长，IL-1ra处理与饲料内 抗生素应用同样有效。IL-1ra处理的猪在IL-1ra施用4周后的表现改善还意 味着IL-1ra的作用被延迟，或者需要数次处理以产生与饲料内的抗生素类 似的效果。
IL-1ra处理的猪的较高增重率的趋势在整个生长和结束期(分别为第 43-92天，和第93-134天)持续。在第6周停止注射后，用IL-1ra处理并不 提供饲料内药物的猪继续生长的速度与用盐水处理并提供饲料内药物的猪 一样快(图3)。而且，此结果意味着IL-1ra处理对于促进猪增长而言与抗生 素一样有效，这如在断奶期最后2周(图2)和生长期(图3、D79和D93)所示。 IL-1ra的效果似乎在第6周细胞因子处理结束后长久存在。
用IL-1ra处理并提供含药物食物的猪在生长期表现最高的增重率(图3、 D79和D93)，而用盐水处理并喂饲非药物食物的猪在所有处理组中具有最 低的增重率。
在结束期，在断奶期用IL-1ra处理且食物中不加药物的猪在所有的组 中表现最高的增加率(图4)。此结果进一步表明对施用至第6周的IL-1ra的 反应的延迟性，且IL-1ra与目前工业中所用的饲料内的抗生素一样是猪生 长的有效促进剂。
IL-1ra作为生长促进剂的积极效果也由屠宰的猪的平均重量(图5)及其 屠宰之后的温尸体重量(图6)表示。在断奶期在不存在饲料内的抗生素的情 况下用IL-1ra处理的猪在屠宰时比用盐水处理并提供饲料内的抗生素的猪 平均重0.7kg。IL-1ra处理导致的这种重量增长是在这两种处理之间在饲料 转化率方面不存在任何差异的情况下发生的(图7)。在断奶期提供饲料内抗 生素的猪在结束期间的饲料转化率为2.5，而且在不存在饲料内抗生素的存 在下，用IL-1ra处理的猪在结束期间的饲料转化率为2.49。在存在抗生素 的情况下，用IL-1ra处理的猪的温尸体重量大于盐水处理对照组的重量(图 6)。而且，在不存在抗生素的情况下，用IL-1ra处理的猪的温尸体重量等于 喂饲抗生素并用盐水处理的猪的温尸体重量。这些结果表明，IL-1ra处理的 猪比抗生素处理的猪增加更多的重量，这种增加与目前给猪喂养抗生素的 工业化实践一样有效。
结论
1).IL-1ra在不存在饲料内抗生素的情况下改善猪的生长。
2).由IL-1ra处理产生的生长改善等效于通过加入饲料内抗生素所见的 生长改善。
3).与盐水处理的对照组和盐水处理并喂饲抗生素补充食物的猪相比， IL-1ra在不存在饲料内抗生素的情况下改善断奶期最后2周的生长。
4).在断奶期施用IL-1ra对生长的作用被延迟并长时间持续，所述作用 在整个生长和结束期中持续。
5).在生长期，IL-1ra处理的猪与喂饲抗生素的猪生长同样好。
6).在结束期，IL-1ra处理的猪比喂饲抗生素的猪更快生长。
7).与用盐水处理并喂饲抗生素补充食物的猪相比，在断奶期施用 IL-1ra导致屠宰增重。
8).在结束期期间，在断奶期用IL-1ra处理的猪与在断奶期喂饲抗生素 补充食物的猪具有相同的饲料效率。
9).这些结果表明，与目前抗生素补充的猪饲料的工业实践相比，IL-1ra 产生更大的猪，并且不影响饲料转化效率。
实施例2
重组IL-1RA作为生长促进剂用于降低饲料内的抗生素水平
本实验通过比较断奶期、生长期和结束期至屠宰时，雄性和雌性断奶 猪的生长速率和健康而反复对IL-1ra改善猪的性能和/或免疫力进行评价。 此试验设计用于研究给药数个水平的IL-1ra的效果，即从目前用于猪生产 的抗生素给药正常水平至减少抗生素给药和不给药抗生素药物。此实验评 价在正常工业化猪饲养条件下，IL-1ra代替抗生素的能力，并确定在整个动 物生命中持续施用IL-1ra的效果。
实验设计
重组猪IL-1ra在大肠杆菌(E.coli)中表达，并用polyHis标记系统纯化。 在开始实验前，在生物实验中测定IL-1ra的生物活性。
该实验在工业化环境中进行，其中猪在28天大时断奶。所有的注射为 1ml。每种处理对16头猪进行，即每种处理8头雄性和8头雌性猪。处理 组的平均重量与实验开始时类似。
处理方案
组 处理 药物治疗
1 盐水 0
2 盐水 减少
3 盐水 正常
4 IL-1ra 0
5 IL-1ra 减少
6 IL-1ra 正常
所用的符号
-表示在整个试验中在饲料或水中没有补充抗生素。
-0.5表示用于整个试验的单一抗生素。
+表示用于整个试验的正常工业化抗生素方案。
处理
盐水注射，1ml IM颈肌。
100μg IL-1ra注射，1ml IM颈肌。
在断奶期每周两次施用注射剂，并在整个生长期和结束期每周一次施 用注射剂。
在实验开始时(D0，W0)将猪断奶并称重。在以下时期记录体重：整个 断奶期(W0-W6)、生长期期间(W9)、生长期末期(W13)、结束期期间(W16) 和结束期末屠宰前即W19。在实验开始时和在断奶期、生长期及结束期的 末期收集血样。进行血液学和免疫学分析。在屠宰时，记录尸体特征，包 括P2背膘测定值和清理后尸体重量。
结果
在断奶期末期，在所有3种药物水平下，用IL-1ra处理的猪比它们的 盐水对照更重(图8)。显然，用IL-1ra处理但不给药抗生素药物的断奶猪的 重量大于用盐水处理并提供正常水平抗生素的断奶猪的重量(Irap-vs盐水 +，图8)。如预期地，抗生素药物增强盐水处理猪的生长并改善用IL-1ra处 理猪的生长。
抗生素药物的存在对断奶期的猪的健康具有很大影响，这通过出现重 量损失或死亡的猪的数量来测定(图9)。在盐水处理的猪中，抗生素水平的 提高降低出现重量损失或死亡的猪的数量。但是，不管抗生素的水平如何， 用IL-1ra处理的猪表现最少的重量损失或死亡记录。在不存在抗生素的情 况下，用盐水处理的16只猪有一半以上在断奶期表现健康和产量降低。但 是，IL-1ra处理将这种数量降至16头猪中的2头(图9)。断奶期这种健康的 改善和死亡率的降低以及体重增加改善一起导致断奶期末总组重量的明显 差异(图10)。不进行药物治疗、减少药物治疗和完全药物治疗的盐水处理组 分别重292kg、324kg和406kg。IL-1ra处理的猪在断奶期末期的对应总组 重量为369kg、390kg和451kg。IL-1ra处理的这种组重量的增加在零、降 低的和正常的抗生素给药水平下分别反映为生产率增加26.4％、20.4％和 11.1％。
在断奶期，IL-1ra处理的导致的生产率的改善在整个生长和结束期继 续(图11和12)。在生长期末期，不管药物水平如何，用IL-1ra处理的猪比 所有盐水处理的猪都重(图11)。重要的是，与目前药物治疗的工业给药水平 相比，不存在抗生素的情况下，IL-1ra的递送导致生长期末期的重量更高。 盐水处理的猪的最终重量以依赖于剂量的方式受药物治疗影响(图12)，其中 增加药物治疗水平导致屠宰时增重。但是，这种模式不能在IL-1ra处理的 猪中重复。在不存在抗生素药物治疗的情况下，用IL-1ra处理的猪比盐水 处理的猪重16.7％。实际上，不进行药物治疗时，IL-1ra的施用在促进完工 猪的生长方面的表面超过目前工业水平的抗生素治疗(图12)。这些结果表 明，在整个生产期促进猪的生长方面IL-1ra比抗生素治疗更有效。虽然 IL-1ra处理导致屠宰时猪较大，这种重量的增加并不伴随P2背膘增加(图 13)。在不存在抗生素的情况下用IL-1ra处理的猪的P2背膘水平与用盐水处 理并提供完全抗生素药物治疗的猪相当(图13)。这两个结果表明施用IL-1ra 导致的活体重量提高可持续至终产物，产生较瘦的尸体。
结论
1).在饲料内不存在抗生素和具有降低的抗生素水平的情况下，IL-1ra 改善猪的生长。
2).通过IL-1ra处理产生的生长改善超过目前工业水平的抗生素药物治 疗所致的生长改善。
3).IL-1ra改善从断奶期至完工期的整个生产期(production phase)的生 长，导致屠宰时增重。
4).IL-1ra改善断奶猪的健康，这可以由与盐水处理组比较死亡率降低 和体重损失发生率减小看出。
5).施用IL-1ra所致的健康参数的改善大于由抗生素药物治疗导致的 健康参数的改善。
6).连续施用IL-1ra对猪无任何有害效果。
7).IL-1ra改善重量并且不损及尸体质量，这由屠宰时P2背膘值没有改 变看出。
实施例3
递送重组IL-1RA以改善出血性大肠杆菌(E.coli)感染的断奶猪的健康
本研究确定IL-1ra是否能够改善暴露于例如出血性大肠杆菌感染的猪 的健康。进一步的目的在于确定IL-1ra是否能够改善在断奶期被大肠杆菌 感染的猪的生长。它还设计为表明IL-1ra是否能够降低感染率并改善大肠 杆菌感染的猪的健康。最后希望该实验能够评价与目前抗生素处理相比 IL-1ra对断奶猪大肠杆菌感染的预防或治疗潜力。
实验设计
将平均重量为5.4kg的雄性断奶猪分配至包含8只动物的各个组，各组 间平均重量相等。将猪在包含来自每个处理组的复制品的组畜圈中饲养。 给猪无限制地提供丸状饲料和水。
用重组盐水、IL-1ra或抗生素安普霉素处理猪，并根据表3所列的方案 用大肠杆菌攻击。以1ml剂量肌内递送盐水或200μg IL-1ra。安普霉素根据 制造商的指示以12mg/kg的剂量口服递送。大肠杆菌攻击物以含有108 cfu/ml的8ml剂量口服递送。如表3所示，首次用大肠杆菌攻击第-2天、第 0天和第+6天通过静脉穿刺从猪中取血样。分析血液的免疫学参数，包括 白细胞数、分化细胞计数、淋巴细胞亚群计数、IgG水平和细胞因子产量。 在第-2天和第6天试验结束时对猪称重。
从攻击后的第2天至第6天的5天内，每天从每头猪取粪便样品；将 这些样品在羊血琼脂中培养以对大肠杆菌进行定量。绵羊血琼脂上的生长 记分为0-5(其中0为无生长，1表示原代接种体生长，2表示第一划线生长， 3表示第二划线生长，4表示第三划线生长，而5表示在最后的划线中大肠 杆菌生长)。粪便的状况记为正常、湿或腹泻，作为临床症状的指示。
在第7天实验结束时，使猪安乐死，并从胃肠道的不同区域取拭子， 所述区域包括小肠(沿小肠长度25％、50％和75％处)、盲肠和结肠，并取样 原位粪便。将这些死后所取的拭子在绵羊血琼脂中培养以对上述的大肠杆 菌负荷进行定量。
表3
用于检测IL-1RA作为猪大肠杆菌感染预防药的效力的实验方案 试验天 事件 -2 血样 IL-1ra注射 重量 -1 IL-1ra注射 安普霉素口服 0 大肠杆菌攻击 IL-1ra注射 安普霉素口服 血样 1 大肠杆菌攻击 IL-1ra注射 安普霉素口服 2 大肠杆菌攻击 IL-1ra注射 安普霉素口服 粪便拭子 3 大肠杆菌攻击 安普霉素口服 粪便拭子 4 粪便拭子 5 粪便拭子 6 血样 粪便拭子 重量 7 安乐死处死
来自肠和粪便的拭子
结果
与用盐水处理的对照猪相比，用IL-1ra或安普霉素处理的猪表现出粪 便中大肠杆菌排泄减少(图14)。用安普霉素处理的猪在攻击后的第2天至第 5天细菌排泄减少，而IL-1ra处理的猪在第2天至第4天细菌排泄减少。在 攻击后第6天，所有组的细菌排泄相同。对于安普霉素和IL-1ra处理，在 递送最后处理药剂后3天，粪便中大肠杆菌排泄恢复至盐水对照水平。总 之，安普霉素处理的组在所有处理中表现出最少的细菌排泄。
与盐水处理的对照猪相比，安普霉素处理的猪在整个攻击期每组的粪 便得分表现为粪便排泄减少80.9％，而IL-1ra处理的猪与盐水处理的对照猪 相比表现为细菌排泄减少37％(图15)。
在工业化情况下，感染猪的细菌排泄减少将进一步降低畜群或畜圈中 其它成员的交叉感染，从而改善断奶者的健康，并因此改善生长。提高断 奶猪的健康和生长将导致后期产率的改善，因为在断奶期的末期产率的主 要预测物是重量。
临床症状记录为粪便状况的改变，例如湿粪便或腹泻的存在，这在用 IL-1ra或安普霉素处理的猪减少(图16)。与盐水对照或安普霉素处理的猪相 比，用IL-1ra处理的猪具有较少湿粪便和腹泻病例的记录。用安普霉素处 理的猪与盐水对照相比具有较少湿粪便的记录，但还显示为在攻击后的时 间内腹泻流行少量增加。
如果将这些临床症状描述为与盐水对照相比的症状减少百分率，则 IL-1ra处理减少64％的临床症状，而安普霉素导致临床症状减少27％(图17)。
临床症状的结果表明IL-1ra和安普霉素都能减少大肠杆菌(E.coli)感染 的外表症状。在这个关于健康的测定中，IL-1ra的表现超过安普霉素这种目 前大肠杆菌感染的抗生素处理。
与盐水处理的对照相比，安普霉素和IL-1ra处理都导致胃肠道(GIT)所 有区域细菌负荷减少(图18)。用IL-1ra处理的猪显示其小肠和结肠的所有取 样区域的培养物得分最低。IL-1ra和安普霉素处理的猪中，取自盲肠和粪便 的样品的粪便培养物得分同样低。与盐水处理的对照相比，IL-1ra处理导致 小肠前部分中的大肠杆菌减少71％，中段小肠中大肠杆菌减少51％，后段 小肠中大肠杆菌减少47％，盲肠中大肠杆菌减少39％，结肠中大肠杆菌减 少44％，而原位粪便中大肠杆菌减少23％(图19)。
如果记录每头猪的所有培养物得分，并将其用于计算组平均总得分(图 20)，用IL-1ra处理的猪得分可能小于10/30，而盐水处理的猪的得分为17/30， 安普霉素处理的猪的得分为12/30。如果将此数据表示为相对于盐水对照大 肠杆菌培养物得分的减小百分率(图21)，则IL-1ra的预防应用导致胃肠道中 大肠杆菌量减少45％。安普霉素的处理仅能将肠中大肠杆菌集群减少33％。
这些结果表明用IL-1ra处理的猪的细菌负荷最低，这进一步强调这种 制剂对控制幼猪的出血性大肠杆菌的价值。
如果根据肠的位置分离大肠杆菌培养物的死后结果，则可以看到IL-1ra 和安普霉素的作用差异(图22)。小肠(前肠)的大肠杆菌细菌负荷与疾病的严 重程度有关，因为小肠是表现分泌性腹泻的部位。与盐水对照相比IL-1ra 处理将小肠细菌负荷降低55％，而安普霉素导致小肠细菌负荷降低32％(图 23)。与盐水对照相比，在后肠区(盲肠和结肠)记录的安普霉素和IL-1α 处理的细菌负荷类似，分别导致大肠杆菌减少37％和42％(图23)。
IL-1ra优选降低前肠细菌负荷的能力表明这种处理可以降低与出血性 大肠杆菌感染有关的疾病的严重性。实际上，这些结果支持那些关于疾病 临床症状的记录，其中与其它处理相比用IL-1ra处理的猪的腹泻发生率降 低(图16)。因此，IL-1ra可能是目前在养猪业中施用的抗生素的潜在替代物 或佐剂，以控制这种疾病对猪生产的有害作用。
IL-1ra和安普霉素对细菌排泄、临床症状和死后细菌负荷的效果的比 较性总结包括在表4中。
表4
IRAP(IL-1RA)和安普霉素控制断奶幼猪的出血性大肠杆菌感染的治疗 效果的比较总结 与盐水处理的对照相比的变化 安普霉素 IL-1ra 粪便中细菌性排泄物的存在 ↓4天 ↓3天 粪便细菌负荷的变化 ↓↓80.8％ ↓36.5％ 临床症状的变化 ↓27.3％ ↓↓63.6％ 死后的大肠杆菌 ↓32.9％ ↓↓44.6％
前肠的大肠杆 ↓32.1％ ↓↓55.4％ 后肠的大肠杆菌 ↓36.8％ ↓41.7％
结论
1).IL-1ra改善猪的健康，即它减少存在出血性大肠杆菌感染时的出血 性腹泻相关性粪便改变方面的临床病症。
2).由IL-1ra处理产生的健康改善等于，并在一些情况下强于抗生素安 普霉素处理的效果，后者是目前处理猪的出血性大肠杆菌的方法。
3).与盐水处理的对照组相比，IL-1ra处理导致感染期间粪便中细菌排 泄减少。用IL-1ra处理的猪在攻击后的3/5天的细菌排泄比盐水处理的对照 组明显更少。这些结果表明在工业化条件下，减少环境中的细菌负荷可以 降低感染率。
4).与盐水处理的对照组相比，施用IL-1ra的效果导致GIT所有区域的 细菌数减少。
5).明显地，IL-1ra导致在大肠杆菌感染期间小肠(前肠)的细菌负荷降 低55％，其中小肠为分泌性腹泻通常所在的部位。由于小肠细菌负荷与疾 病严重程度有关，因此IL-1ra可能对疾病的进展和病理有显著的治疗效果。
6).IL-1ra处理在减少临床病症、死后肠中存在的大肠杆菌水平以及小 肠重要部位存在的大肠杆菌方面优于目前工业用抗生素即安普霉素的处 理。
实施例4
递送重组IL-1RA以改善致猪痢疾性肠炎性病原体，即猪痢疾短螺旋体 (Serpulina)感染的断奶猪的健康和生产力
本实施例的目的在于确定IL-1ra能否改善导致被猪痢疾的肠炎性病原 体，猪痢疾短螺旋体(Brachyspira(Serpulina)hyodysenteriae)感染的猪的健康。 另一目的在于确定IL-4是否能够在猪痢疾攻击的条件下改善猪的生长速 率。
实验设计
将平均初始重量为6.5kg的雄猪分配到由8只猪组成的各处理组。将猪 在组畜圈中饲养，每个畜圈包含来自各处理组的一个复制品。将一组8只 猪在单独的室内圈养并不被感染，以用作未处理的对照。给猪无限制地提 供丸状饲料和水。
在猪痢疾攻击之前，通过肌内注射200μg重组IL-1ra或1ml盐水处理 猪。根据制造商的说明将盐酸林可霉素作为2ml肌内注射剂递送。在表5 所列的实验方案所述的时间间隔给药细胞因子、抗生素并进行攻击。在第0 天、第1天和第2天用猪痢疾短螺旋体感染猪，所述猪痢疾短螺旋体作为 120ml对数生长期螺旋体培养物的口服丸给予，其包含108个细胞。
在表5所述的时间间隔从每只猪取得粪便拭子和血样。培养粪便拭子 中存在的螺旋体。如以上实施例3所述分析血样的免疫学参数。在整个实 验中每周一次对猪称重，通过在最初攻击后的第19和20天对所述猪进行 安乐死来终止其生命。在死后，培养来自后肠各区域的拭子中存在的螺旋 菌，并记录胃肠组织的大体病理条件。
表5
用于评价IL-1RA作为猪痢疾感染预防性处理的效力的实验过程方案
天 重量 粪便拭 子 感染 流血 注射1ml IL-1ra，或 盐水 注射2ml 林可霉素 杀死 -7 × -6 -5 -4 -3 -2 × -1 × 0 × × × × × 1 × × × 2 × × × 3 × 4 5 × × × × 6 × 7 × × × × 8 × 9 × × × 10 11 12 × × × × 13 × 14 × × × × 15 × 16 × × × 17 18 × × 19 × × 20 × ×
猪死亡后从后肠取得的螺旋菌培养物表明与盐水对照组相比，用IL-1ra 处理猪减少了残留在肠中的螺旋菌的数量(图24)。与盐水处理的对照组相 比，IL-1ra能够降低前结肠、后结肠和粪便中螺旋菌培养物得分。如所预期 的，未受猪痢疾攻击的猪死后其后肠或粪便中没有螺旋菌(数据未显示)。
与盐水处理的猪相比，IL-1ra处理导致前结肠中螺旋菌减少15.8％，后 结肠中螺旋菌减少47.1％，粪便中螺旋菌减少42.1％(图25)。IL-1ra处理的 净效果是整个GIT中螺旋菌减少27％。
除了肠中螺旋菌数量减少之外，IL-1ra处理还减少由粪便状况指示的与 感染有关的临床症状。图26表明与盐水处理的对照组相比，IL-1ra处理的 猪表现较少的痢疾影响的粪便征(湿粘液样并带血)。
与盐水处理的对照组相比，IL-1ra处理能够降低促炎细胞因子TNF、IL-8 和IL-1的产生(图27、28和29)。重要的是，促炎细胞因子与动物的疾病表 现有关，并与在密集饲养的家畜中所见的生产力降低有关。IL-1ra的抗炎能 力可以表现为长期生长改善。实际上，这些结果在以上实施例1、2和3所 述。
而且，猪痢疾的临床症状是推测由炎性介质例如促炎细胞因子加剧的 慢性炎性病理状态。IL-1ra降低这些炎性介质产生的能力可在减少与猪痢疾 感染有关的病理中起一定作用。
这些结果证明，IL-1ra能够减少猪痢疾感染对猪健康的有害效果。已知 IL-1ra对免疫系统具有抗炎效果，因此与痢疾有关的肠炎性病理变化的减少 可有助于细胞因子的抗炎性能和螺旋菌负荷的降低(如图24可见)。
结论
1).与盐水处理相比，用IL-1ra处理猪减少死后后肠和粪便中存在的螺 旋菌的数量。
2).与盐水对照组相比，IL-1ra使通过粪便状况检测到的猪痢疾感染的 临床症状减少。
3).用IL-1ra处理猪导致与生长和生产力受损有关的促炎细胞因子的产 量降低。
4).IL-1ra在以下二种肠感染模型中改善猪的健康：溶血大肠杆菌(E.coli) 和猪痢疾短螺旋体(Serpulina)(猪痢疾)。二种模型中健康的改善均可由感染 期间临床症状减少来描述。在大肠杆菌模型中，健康的改善伴随与死后感 染有关的病理的减少。在猪痢疾模型中，还注意到促炎细胞因子水平降低。 IL-1ra进行预防性处理以改善暴露于大肠杆菌的猪的健康的能力与目前工 业标准抗生素效果相当。因此，IL-1ra具有作为抗生素处理的可替代的选择 或补充，或者预防猪大肠杆菌和猪痢疾的潜能。IL-1ra作为健康促进剂的潜 能可以进一步通过同时应用抗生素治疗剂来得到增强。
实施例5
递送质粒S和重组IL-1RA以改善胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)感染的猪的生长和健康
此实施例的目的在于确定IL-1ra是否可以改善炎性肺病原体，胸膜肺 炎放线杆菌(App)感染的猪的健康。而且，另一目的在于确定IL-1ra是否可 以改善App攻击条件下的猪的生长速率。此外，此实施例的目的是确定 IL-1ra的质粒DNA还是重组递送更为有效。
实验设计
将平均初始重量为52kg的雄性猪分配至表6所列的5个处理组。在组 畜圈中饲养猪，各畜圈包含来自各处理组的复制品。各处理组和各畜圈的 初始重量在开始试验前相等。给猪无限制地提供丸状饲料和水。
将重组IL-1ra和盐水以1ml剂量施用，在耳后皮下给予。质粒以1ml 剂量施用，在后腿经肌肉内给予。例如，氟尼辛以2ml剂量根据制造商的 说明施用，并在颈部肌肉内递送。施用的时间表如下表6所列。
表6
细胞因子实验中所应用的处理和剂量，所述实验用于评价IL-1RA作为 胸膜肺炎放线杆菌感染的预防性处理的效力 处理 处理剂量 盐水 2ml 氟尼辛 2.2mg/kg IL-1ra 100μg 质粒对照 100μg 质粒IL-1ra 100μg
在攻击前，如表7所述用重组细胞因子、氟尼辛或质粒处理猪。麻醉 猪，并在第0天用7.5×105pfu App进行气管内感染。
在攻击后第0、24小时和第4天通过静脉穿刺从猪取血样。如前述分 析血液的免疫参数。从质粒递送起以及攻击后两周内每周对猪称重一次。
表7
评价IL-4作为胸膜肺类放线杆菌感染预防性处理的效力的实验方案 事件 施用时间 质粒递送 -10天 重组递送 -2天和第0天 攻击 第0天 临床观察 攻击后30次
结果
在攻击的一周期间，与盐水处理的对照组相比，IL-1ra改善猪的生长(图 30)。用盐水、氟尼辛(非甾族抗炎药，NSAID)或对照质粒处理的猪表现重 量损失，而用IL-1ra或质粒IL-1ra处理的猪在攻击的一周期间表现出正生 长。在攻击后的一周中，所有组的猪增重，但同样重组IL-1ra处理的猪平 均起来比处理组的猪增加更多的重量。用盐水处理的猪在攻击后第二周明 显恢复，而用IL-1ra处理的猪继续增加重量。在所有组中，用质粒或氟尼 辛处理的猪在攻击第二周生长最为不良。
用App攻击之后的2周期间的增重表明，与盐水处理的对照组相比， 重组IL-1ra处理提高了增重，虽然这种结果在统计学上是不显著的。与盐 水处理的对照组相比，氟尼辛和质粒对照在生长方面表现最差。在攻击后2 周期间IL-1ra质粒在生长方面表现好于质粒对照组(图31)。注意到日增重 率具有类似的表现方式，其中与用盐水处理的对照猪每天增加433g相比， 用重组IL-1ra处理的猪平均每天增加667g。
用重组IL-1ra处理导致相对于盐水对照增重改善53.8％，而NSAID氟 尼辛处理导致增重减少84.6％(图33)。质粒处理与盐水对照相比一般具有 较小的增重，但是与质粒对照相比，IL-1ra质粒使增重改善100％(图34)。
App攻击后，数组中的促炎细胞因子TNFα和IL-6升高。
有趣的是，NSAID氟尼辛不能抑制TNFα的产生(图35)，这可能有助 于解释这组所见的不良生长。与攻击前水平相比，攻击后第13天重组IL-1ra、 质粒对照和IL-1ra质粒都具有降低的TNFα水平。与盐水处理和氟尼辛处 理猪相比，这3种处理在攻击后第13天还具有明显较低的TNFα产生水平 (p＜0.05)。
与盐水处理的对照组相比，所有的处理都降低攻击后24小时的IL-6的 产生(图36)，且这种趋势持续至攻击后第13天。不幸的是，由于取样错误， App攻击后的13天中，盐水处理组的IL-6数据无法补救。，攻击13天后， 与氟尼辛处理的猪相比，用作为质粒或重组体的IL1-ra处理的猪的促炎细 胞因子IL-6的水平降低。
虽然抗炎细胞因子处理可导致循环中促炎细胞因子水平降低，且在一 些情况下改善生长，但促炎细胞因子与生长受损之间的关系仍不清楚。通 常，其中猪的促炎细胞因子水平降低的组是在攻击后第一周还具有最小生 长抑制作用的组。需要进一步的工作来阐明在这种攻击模型下猪的重量损 失的机理。
除了改善猪的生长之外，我们发现细胞因子处理可以改善暴露于App 攻击的猪的健康。图37的数据表明在攻击第一周期间进行的30次观察的 平均临床得分。各头猪表现的症状严重程度，例如嗜睡、咳嗽和呼吸参数 得分为0-8，而死亡或安乐死的猪在后来各次观察中的得分规定为8。与盐 水处理的对照组相比，用重组IL-1ra处理的猪的临床病症显著减少(p＜0.05， 图37)。与盐水和质粒对照组相比，作为质粒递送的IL-1ra还导致临床症状 减少。在所有处理组中，用盐水或氟尼辛处理的猪表现出最多的App临床 病症。
与用盐水处理的猪相比，作为重组体递送的IL-1ra导致临床症状的存 在减少72％(图38)。与盐水处理的对照组相比，以质粒形式递送的IL-1ra 导致减少52％，且与质料处理的对照组相比减少31％(图38)。作为质粒或 重组体递送的IL-1ra比氟尼辛更有效地减少App感染的临床症状。
在试验结束时，使猪安乐死，并取出肺以进行死后检查。对肺的胸膜 炎评分为0-5(图39和40)，且胸膜肺炎程度的确定通过对受影响的肺进行 称重，并表示为总肺重的百分率(图41和42)。用氟尼辛和IL-1ra处理的猪 比盐水对照组具有较轻的胸膜炎(图39)。虽然用作为质粒递送的IL-1ra处理 的猪的胸膜炎比质粒处理的对照组轻，它们的胸膜炎水平相当于盐水处理 的对照组(图39)。与盐水处理的对照组相比，重组IL-1ra将胸膜炎水平降低 22％，而氟尼辛处理将胸膜炎减轻55.6％(图40)。作为质粒递送的IL-1ra 与盐水处理的对照组相比将胸膜炎减轻5.6％，与质粒对照组相比减轻 39.3％(图40)。
与盐水处理的对照组相比，用氟尼辛或重组IL-1ra处理的猪中，App 损伤影响的肺的百分率大大降低(图41)。盐水对照组和质粒对照组具有类似 水平的损伤影响的肺。与盐水和质粒对照组相比，IL-1ra质粒减少App损 伤影响的肺的百分率，但质粒IL-1ra损害App疾病病理的能力不如作为重 组体递送的IL-1ra或氟尼辛明显(图41)。这些结果反映，与盐水处理的对照 组相比，IL-1ra使受影响的肺质量减小73.9％，氟尼辛使之64.1％，质粒IL-1ra 使之36.7％(图42)。
结论
1).与盐水处理的对照组相比，在App攻击的第一周期间重组IL-1ra 能够大大增加猪的生长。攻击2周后，在实验结束时用IL-1ra处理的猪因 此比盐水处理的对照重4kg，这代表生长改善69％。用氟尼辛处理的猪在2 周的攻击期间具有最低的生长。
2).重组IL-1ra、质粒对照和质粒IL-1ra能够降低与不良生长性能有关 的促炎细胞因子TNFα和IL-6的产生。氟尼辛仅能降低IL-6的产生。
3).IL-1ra大大降低攻击期间临床病症的严重程度，作为质粒递送的 IL-1ra也如此。与盐水处理相比，重组IL-1ra将临床症状减少72％，而质粒 IL-1ra将临床症状减少52％。
4).氟尼辛能够降低死后所见的胸膜炎水平。与盐水处理相比，IL-1ra 将胸膜炎减少22％。
5).氟尼辛、IL-1ra和质粒IL-1ra都降低App损伤影响的肺的百分率。 用重组或质粒IL-1ra的处理分别导致App影响的肺的质量减小74％和37％。
6).用IL-1ra处理的猪改善暴露于App攻击的猪的健康和生产力。
7).重组IL-1ra的递送比质粒IL-1ra的递送更为有效。
实施例6
以低和高剂量并与IL-4联用来预防性递送重组IL-1RA的，用于改善被 胸膜肺炎放线杆菌感染的猪的健康和生长
此实施例的目的是确定在炎性肺病原体，胸膜肺炎放线杆菌(App)感染 的猪体内增加IL-1ra的剂量是否能够对改善生长和减轻病理产生更大的影 响。而且，另一目的是确定IL-1ra是否能够与另一种抗炎细胞因子IL-4协 同作用，以增强细胞因子处理对App感染的猪的生长和病理的有益效果。
实验设计
将平均初始重量为56kg的雄性猪分配到表8所述的5个处理组中。在 组畜圈中饲养猪，且每个畜圈包含来自每个处理组的动物；无限制地提供 丸状饲料和水。各处理组和畜圈的初始重量在开始试验前相同。
在耳后经皮下注射以2ml剂量施用重组IL-1ra、IL-4和盐水。因此，协 同组的猪接受1剂量的IL-1ra和1剂量的IL-4。在用App攻击前24小时、 攻击时和攻击后24小时用IL-1ra、IL-1ra+IL-4或盐水处理猪。在第0天麻 醉猪并用7.5×105pfu进行气管内感染。
在自攻击-24小时、+0小时、+24小时和+3周通过静脉穿刺从猪中取 血样。如前述分析血液的免疫学参数。在第-1天、第10天和第3周将猪称 重。
表8
细胞因子实验(N＝8)中所应用的处理和剂量所述实验用于评价不同剂量 的IL-1RA和IL-1RA+IL-4作为胸膜肺炎放线杆菌感染的预防性处理的效力 处理 处理剂量 盐水 2ml IL-1ra低 2μg/kg IL-1ra高 10/kg 协同低 2μg/kg IL-4+2μg/kg IL-1ra 协同高 10μg/kg IL-4+10μg/kg IL-1ra
结果
与实施例5不同的是，用盐水处理的动物在用App攻击的早期没有经 历重量损失(比较图30和图43)。尽管出现这种结果，在用高剂量IL-1ra处 理的猪中看到生长改善(图43)，相当于增重率增加到超过100g/天。共同应 用IL-1ra和IL-4以研究协同作用，这导致与盐水处理的猪相比在App攻击 的前10天期间生长反应受到抑制。组内差异是高的，因此在这种情况下误 差范围(bar)较大并缺少统计学显著性。但是，在实施例5中所见的IL-1ra 改善体重增加的趋势在此实验中可重复。
在攻击的最后10天，用低剂量的IL-1ra或或低剂量的IL 1ra+IL-4处理 的猪分别表现出最大的增重率(图44)，即分别为1250g/天和1306g/天，耳 盐水处理的对照组为1079g/天。用高剂量IL-1ra处理的猪增加1170g/天， 高于盐水处理组的增重率。该高协同剂量导致App攻击后期的增重较低。
用低或高剂量的IL-1ra和低剂量的IL-1ra+IL-4处理的猪显示比盐水处 理的对照组更高的增重(图45)。在攻击期的21天中，用低和高剂量的IL-1ra 处理的猪或低剂量的协同处理的猪分别增加17.9kg和17kg，而盐水处理的 对照组仅增加15.75kg(图45)。因此，与盐水处理的对照组相比，用IL-1ra 或低剂量的IL-1ra+IL-4进行的处理使生长分别改善13.5％和7.9％(图46)。
如实施例5看出，用重组IL-1ra处理猪导致疾病严重程度降低，如在 死后病理结果中记录的那样(图39、40、41和42)。在目前的实施例中，应 用高剂量的IL-1ra降低受App损害影响的肺的量(图47)。类似地，与盐水 处理相比，递送低剂量IL-1ra和IL-4组合物降低受影响的肺的重量。高剂 量的IL-1ra和高剂量的协同处理降低死后所见的胸膜炎的程度(图48)。
与其它处理相比，高剂量IL-1ra和IL-1ra+IL-4处理大大降低促炎细胞 因子IL-8的产量(图49)。IL-8将嗜中性粒细胞募集到肺，而随后的嗜中性 粒细胞脱粒被怀疑是App感染病理的主要因素。因此，肺组织中IL-8水平 降低可能导致暴露于App感染的猪的病理减轻和健康改善。类似地，通过 用高剂量的IL-1ra或低剂量的IL-1ra+IL-4处理，可抑制肺组织中的另一种 促炎细胞因子TNFα的产生(图50)。这些结果表明，App攻击条件下，抗 炎机理可能在这些处理对猪的生长和健康的有益效果中起作用。
结论
1).高剂量的IL-1ra改善攻击早期的生长，而低或高剂量的IL-1ra和低 剂量的IL-1ra+IL-4改善攻击后期的生长。
2).低或高剂量的IL-1ra以及低剂量的IL-1ra+IL-4导致整个攻击期的 体重增加提高。
3).高剂量IL-1ra和低剂量IL-1ra+IL-4减少App损害影响的肺的数量。 高剂量的IL-1ra和IL-1ra+IL-4降低胸膜炎得分。
4).高剂量的IL-1ra和IL-1ra+IL-4具有抗炎效果，这由肺组织中促炎细 胞因子产生减少显示。
5).高剂量的IL-1ra明显降低肺中与病理有关的IL-8的产生。
6).这些结果支持实施例5的结果，起发现在App感染之前或之时给予 IL-1ra治疗改善生长并减少病理。
实施例7
治疗性递送低和高剂量的重组IL-1RA，以改善胸膜肺炎放线杆菌感染 的猪的健康和生长
此实施例的目的在于确定胸膜肺炎放线杆菌(App)感染建立之后IL-1ra 的治疗递送是否能够消除感染并改善猪的生长。
实验设计
将平均初始重量为34.6kg的雄性猪分配至4个每组有9头猪的处理组。 处理为盐水、2μg/天的IL-1ra、10μg/天的IL-1ra和速解灵(Excenel)，目前 App感染的临床处理。将3头猪圈养在一个个畜栏中，且各畜圈有3个复 制品。给猪任意提供丸状饲料和水。各处理组和各畜圈的初始重量在开始 试验前相等。
将猪麻醉，并在第0天用7.5×105pfu进行气管内感染。将重组IL-1ra 和盐水以2ml的剂量，在耳后经皮下给予。根据制造商的说明将速解灵施 用于猪。在用App攻击后24小时、48小时和1周时用IL-1ra、盐水或速解 灵处理猪。
在感染后第0小时、24小时、48小时、1周和2周通过静脉穿刺从猪 中取血样。如前述分析血液的免疫学参数。在攻击前当天以及攻击后第6 天和第13天将猪称重。
结果
在App攻击后的第二周平均重量增加，如图51所示，这表明用低剂量 的IL-1ra处理的猪比其它处理组增加更多的重量。用低剂量IL-1ra处理的 猪在攻击的第2周平均增加5.7kg，相比之下盐水处理的对照组增重4.4kg， 而抗生素处理增加4.9kg(图51)。
而且，与盐水处理相比，IL-1ra处理和用抗生素速解灵处理均可降低日 饲料摄入(图52)。用低和高剂量IL-1ra处理的猪分别消耗1.7和1.8kg饲料 每天，用速解灵处理的猪消耗2kg，而用盐水处理的猪消耗2.2kg。
改善增重和降低饲料摄入的联合效果导致与盐水对照组相比，用低剂 量IL-1ra处理的猪其饲料转化率改善(FCR，饲料：增重)(图53)。IL-1ra处理 将FCR降低1.6，相比之下盐水处理的FCR为2.1。
在被杀死的App存在下，用低剂量IL-1ra处理的猪趋于增强淋巴细胞 的增殖反应(图54)。淋巴细胞扩增试验测定淋巴细胞对具体抗原反应的能 力。在这种情况下，抗原与感染物同源，因此体外高度增殖性反应表明体 内对App病原体的识别和抗御该病原体的动员(mobilization)增强。淋巴细胞 增殖反应所见的趋势与FCR一致——对杀死的App产生最强体外反应的猪 还具有最大的饲料效率，这由FCR减小可证明。因此，IL-1ra可以通过增 强特定的免疫反应性来改善饲料效率和增重。
与其它处理相比，对App感染的猪治疗性递送低剂量的IL-1ra还降低 肺组织中促炎细胞因子IL-8的产生(图55)。与盐水处理的对照组相比，低 剂量的IL-1ra和速解灵处理也降低尾纵隔淋巴结中IL-8的产生，所述淋巴 结引流肺(图56)。而且，这些结果表明IL-1ra调节保护性免疫反应和有害的 炎性反应，从而可以有助于改善App感染的猪的增重和饲料转化率。
结论
1).与抗生素或盐水处理相比，治疗性应用低剂量的IL-1ra改善App感 染的猪的重量增加。
2).与其它处理相比，治疗性施用IL-1ra降低饲料摄入。
3).IL-1ra的治疗性施用大大改善App感染的猪的饲料效率。
4).治疗性递送IL-1ra到App感染的猪中导致细胞免疫反应增强，同时 减轻炎性反应。
家畜的工业化饲养要求生长速率和饲料转化效率的最大化，以降低单 元生产成本。这个要求导致所谓的“饲料添加剂”的发展和广泛使用。
饲料添加剂有两个一般目的。一个目的是在健康和营养不成问题的动 物中在增加生长速率和/或增加饲料转化效率方面提高动物的性能。另一目 的是在目前密集饲养的实践中不可避免发生的外伤或“应激(stresss)”期间 保持动物的健康，从而使动物不患病。
在20世纪50年代早期，研究者意外地发现鸡饲料中的抗生素成分是 一种“生长因子”。该发现大大改变了牲畜和家畜产业，并在经济上惠及制 药公司。食用动物(feed animal)目前在高度控制条件下饲养并接受含有多种 生长促进添加剂的特制饲料。
对动物进行常规抗生素给药几乎是普遍的，因为发现往动物饲料中加 入少量抗生素如青霉素、四环素和磺胺二甲嘧啶(sulfamethasine)增加猪和牛 的生长。1979年，在美国饲养的约70％的肉牛和小牛，90％的猪，和基本 上100％的小鸡食用抗生素作为其每日饲料的一部分。这种使用，数量为约 美国所售抗生素的40％，估计使消费者每年在食品成本上节省35亿美元。
在经过优化能促进生长的现代条件下饲养的动物接受含有高比例蛋白 质和高百分率的谷物的食物，所述蛋白质通常为大豆或棉籽食物形式(肉和 骨或血食物在澳大利亚广泛使用)；所述谷物如玉米或买罗高粱(milo)，这是 高粱的一种类型(澳大利亚的小麦和大麦)。已被使用的食物添加剂包括激素 如二乙基-己烯雌酚和镇定剂(未广泛用于猪)，前者还增大体重增加的速率； 后者防止由于封闭条件引起的应激效应造成疾病或重量损失。
牛通常需要5千克饲料来产生1千克的体重增加。如果在最佳生长促 进条件下并采用强化饲料，仅用3千克的饲料使它们增加1千克。
虽然激素和抗生素大大增加食物动物的生长速率，使用这些添加剂并 非没有问题。一种用作生长兴奋剂的激素，二乙基-己烯雌酚或DES已表明 是一种致癌物质，在大部分国家已被禁止进一步应用。
当在动物饲料中混合抗生素时，化合物扩散到整个环境，使微生物与 该抗生素接触。微生物持续暴露于抗生素对微生物造成生物压力，使之对 抗生素形成耐受性。这可能导致产生耐受抗生素的微生物，并使其特别严 重和难以治疗感染。
抗生素耐受微生物是潜在的严重病原体，因为它难以控制。如果有机 体导致动物或人感染，则该感染可能不被常规抗生素控制。如果感染严重， 则可能没有时间确定哪种抗生素可有效对抗感染性细菌。该问题在肉中抗 生素耐受性生物被那些自身也服用抗生素来治疗疾病的人食用时特别严 重。抗生素抑制呼吸道和胃肠道中许多正常的微生物。这使耐受性微生物 快速增殖，并产生更为严重的疾病。食物中的抗生素耐受性生物体和对人 的无效抗生素治疗共同造成过去几年中在美国报道的大部分由沙门氏菌食 物中毒导致的死亡。
饲料堆中抗生素耐受性细菌的增加和由抗生素耐受性细菌导致的许多 严重的传染病的结果是，关于禁止在动物饲料中使用抗生素的管理压力在 增加。实际上，世界卫生组织和澳大利亚政府具体指出需要使用环保的备 选方法来控制感染。从现在开始在家畜饲料和水中禁用或撤出多种抗生素 可能(i)增加动物的感染发生率，从而降低生长性能，(ii)进一步降低动物的 健康、生育力和繁殖性能。因此，对于新的、安全和有效的食用动物的生 长刺激剂以及通过增加健康来降低疾病的需求是迫切的且越来越多。
不用抗生素而促进动物生长的多种尝试已被人采用，其中许多利用了 复杂和间接的方法。这些包括皮下植入激素或由复合物制备的具有阳离子 的络合盐(例如参见美国专利6,197,815；美国专利3,991,750；美国专利 4,067,994)。这些尝试无一被证明是简单或有效的。因此，仍需要一种不依 赖使用抗生素或复杂工艺的改善动物的生长性能的方法。
现在申请人惊奇地发现，施用抗炎剂，特别是细胞因子受体拮抗剂如 白介素(IL)-1ra，可增加动物的生长性能，同时减少抗生素的用量。申请人 还证明类似的生长性能效果可以通过施用可溶性细胞因子受体如TNFα受 体、IL-6受体、IL-4受体和IL-8受体，或者细胞因子阻断因子如TNF阻断 因子(Bargetzki等，Cancer Research 53：4010-13(1993)；Engelmann等，Journal of Biological Chemistry 264：11974-80(1989))或TNF-α抑制剂(Engelmann等， Journal of Biological Chemistry 265：1531-6(1990)；Seckinger等，European Journal of Immunology 20：1167-74(1990))来实现。
无意受任何具体理论或假设的限制，申请人认为在已施用抗炎剂的动 物中观察到生长性能的增加是由四种关键效果的互相作用导致的，它们是：
1).自身的抗炎效果；
2).免疫增强效果；
3).抗寄生虫和抗微生物效果；和
4).应激降低。
这些效果中的每一种，单独或一起，深深地影响动物的健康和安宁 (welfare)，进而影响动物的生长性能，从而影响肉质量。例如：
1).抗炎
慢性炎症通常见于家畜，并与由持续感染和环境刺激引起的免疫活化 有关。炎症在针对感染的免疫反应的启动中起重要作用，但慢性免疫活化， 特别是持续感染或微生物负载(load)，可对生长和发育具有有害效果，并可 减小接种疫苗的效力。过度的免疫活化的结果包括产生炎性细胞因子、发 烧、食欲不振、从肌肉中再吸收氨基酸和从肉类生产中移走营养物。抗炎 剂可以减少慢性免疫活化的病变，例如通过降低炎性细胞因子如IL-1、IL-6、 TGF-α、IL-11、IL-18、IL-12、IL-17、LIF、IFN-α、IL-8、TNF-α和GM-CSF 的效果来实现。或者，通过施用这些炎性细胞因子的可溶性细胞因子受体， 即IL-1受体、IL-8受体、TNF-α受体、IL-6受体等，可以减少过量的循环 炎性细胞因子。细胞因子受体拮抗剂如IL-1ra、IL-6ra或TNF-αra可以竞争 性抑制这些促炎细胞因子与它们各自的膜表达型受体结合，可以用于改善 这些细胞因子的作用。
2).免疫增强效果
a).TH1/TH2免疫反应
炎性反应不可避免地与身体的免疫系统有关。免疫细胞因子调节网络 和身体的其它调节系统之间存在互相作用。对感染或抗原的免疫反应可敏 锐地偏向(bias)其中一方。免疫反应可以概括为T细胞反应类型生。T辅助 细胞1(TH1)类型反应主要涉及细胞介导的免疫，而TH2类型反应一般涉及 体液免疫。TH1和TH2类型细胞亚群参与调节许多由细胞因子类型限定的 免疫反应。TH2细胞表达细胞因子白介素(IL)-4、IL-5、IL-10和IL-13。IL-3 表达对TH1和TH2T细胞而言是共有的。然而，TH1细胞表达IL-2、IFNγ 和TNFβ。这些TH2细胞因子影响B细胞发育并促进体液反应如抗体分泌。 两种类型的TH细胞通过它们分泌的细胞因子来彼此影响。例如，TH2细胞 因子如IL-10可以抑制TH1功能。其它细胞因子还可以影响TH1或TH2发 育，例如TNFβ已知可以下调TH1反应。
已知当不存在侵袭性抗原时，Th1细胞的作用对身体有害。抗炎剂抑制 Th1细胞中IFN-γ的产生。抗炎剂还抑制Th1细胞的过度产生，因此提高 Th2(抗体分泌)细胞的产生，因为这些细胞彼此交叉调节。这意味着通过施 用具体抗炎剂可以抑制促炎细胞因子的量。或者，通过施用细胞因子的可 溶性细胞因子受体(如IL-1、IL-4、IL-8、GM-CSF、IL-6或TNF-α)、细胞 因子受体拮抗剂或细胞因子抑制因子，可减少TH1细胞过度产生细胞因子。
b).抗体同种型转换
抗体是除去感染或提供针对性保护所必需的。成熟B细胞在抗原刺激 之后经历抗体种类转换的过程。TH细胞在物理接触和称为转换因子的细胞 因子作用下，调节同种型转换。已知单独或组合参与同种型转换的一些细 胞因子是IL-4、IL-5、TNFβ、IL-1、IL-2、IL-6和IL-13。IL-4和IL-5协同 增加IgG1反应。例如，最佳的IgG1反应还需要IL-2。IL-1可以提高在IL-5 存在下的IgA的产量。TNFβ诱导IgA产生。
c).免疫功能障碍
大部分生产特性的遗传潜能是由出生预先决定的。许多因素(应激、疾 病、营养、免疫等)决定是否获得这种潜能。抗原暴露的水平和时间影响和 确立免疫系统的“偏向”。大部分免疫反应偏向促进对细菌和病毒的免疫的 类型或者促进对许多寄生虫的免疫的类型。虽然动物的基因型可影响这种 偏向，但新生儿对抗原和感染的早期经历可以使免疫反应性偏向一种或另 一种类型。这种偏向依据随后的抗原暴露而改变。基于对生产特征的选择 而进行的饲养程序似乎消耗病损害免疫竞争力或反应性。这种改变还由于 持续地向水和饲料中添加抗生素而进一步加剧，从而预期导致获得有效免 疫反应的遗传潜能发生改变。
d).粘膜免疫
家畜感染的最易发区是粘膜部位，主要是胃肠道和肺。因此，粘膜免 疫系统是抵抗病原体和疾病的第一卫队。细胞因子，特别是IL-5、IL-4、IL-6 和IL-10，在粘膜免疫反应的调节和效力中起明显作用。
IL-5和IL-6作用于粘膜免疫系统中淋巴细胞的B-1和B-2亚种群。IL-5 或IL-6或其受体生产的缺陷导致负责粘膜中保护性反应的抗体同种型IgA 的产生明显受损。类似地，IL-5、IL-6和趋化因子MIP-1α具有增加IgA对 粘膜疫苗的反应的能力。IL-4对粘膜组织有免疫调节作用，主要通过增强 TH2反应，从而增加抗体的生产。IL-4被认为是通过涉及TH2途径的肺粘 膜免疫反应的形成所必需的。IL-4和IL-5都在肺内协力工作，其中IL-4使 初始(naive)T细胞发生TH2表型，其通过随后的活化而分泌IL-5，导致嗜 酸性粒细胞蓄积。而且，IL-4和IL-10在粘膜耐受性中起作用，因而帮助调 节和减弱肠内过敏性反应，并使动物对肠的慢性炎症的敏感性降低。
3).抗寄生虫和抗微生物效果
a).抗寄生虫效果
对病原体的获得性免疫反应一般属于细胞介导(TH1)或抗体介导(TH2) 类型中的一种，且它受细胞因子调控。TH2反应中涉及的细胞因子是吸引 人的治疗靶体，因为它们可以对抗外寄生物和胃肠蠕虫(worm)提供保护， 并抑制由TH1细胞因子诱导的炎症。TH2细胞因子诱导嗜酸性粒细胞增多、 IgE合成和粘液产生，从而增强对抗蠕虫和其它肠寄生虫的保护作用。
b).抗微生物效果
虽然在营养、疫苗、化学物质和抗生素方面有所发展，但微生物感染 仍是世界范围内影响经济和健康的问题。针对微生物病原体的免疫反应包 括二种识别系统。第一卫队是先天性免疫，如果需要的话，随后发生适应 性反应(细胞介导的反应和抗体反应)。通过用包括保泰松、氟尼辛葡甲胺 (meglumine)和酮洛芬或静脉内DMSO在内的抗炎剂减少炎症，流向受染组 织的血流得到改善，进而促进先天性免疫帮助克服感染。此过程可以通过 使用血管舒张药如乙酰基丙嗪、苯氧苄胺、异克舒令(esoxsuprine)、己酮可 可碱(pentoxifylline)、阿斯匹林和肝素来得到促进。备选方法是施用已知炎 性细胞因子如IL-1、TNF-α、IL-6和IL-8的可溶性细胞因子受体。
4).应激降低
工业化环境中的许多条件有助于减少饲料摄入、降低生长速率并使屠 宰后畜体(carcasss)质量下降。尽管倾注广泛的研究努力要评价应激物影响许 多物种性能的机理，但家畜产业中的长期问题未解决。应激，特别是早期 和持续的应激，导致免疫功能障碍、下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)活性和 脑中化学物质失衡。神经和免疫系统是整体性的，形成独立的神经免疫网 络。抑郁、生理或情绪应激可激活那些改变免疫功能的内分泌系统，进而 引起脑内生理和化学改变。同样，感染形式的免疫应激通过细胞因子和其 它可溶性介质激活神经-内分泌系统以诱导应激，进而损害生殖力 (productivity)。细胞因子介导免疫、内分泌和中枢神经系统之间的相互作用。 以前认为是免疫抑制，但现在有确切证据表明应激诱导TH1/TH2免疫反应 偏移，造成免疫调节异常而不是免疫抑制。细胞因子影响体内平衡途径的 潜能导致产生评价免疫系统活性的需要。
发明概述
在最广义方面，本发明提供一种改善动物生长性能的方法，所述方法 包括给需要的动物施用生长促进量的一或多种抗炎剂的步骤。
该抗炎剂优选增强或补充动物自身的抗炎系统。
本发明还提供一种改善动物的生长性能的方法，所述方法包括给需要 的动物施用增加或补充内源性抗炎剂水平的化合物或组合物的步骤，其中 相对于未施用该化合物或组合物的动物的生长性能而言，提高了生长性能。
优选，该化合物或组合物在施用生长促进量的一或多种抗炎剂之前、 一起或之后施用的。
更优选该化合物或组合物包含促炎细胞因子受体拮抗剂。还更优选， 该化合物或组合物包含TNF-α受体、GM-CSF受体、IL-6受体、IL-1受体、 IL-4受体或IL-8受体的拮抗剂。最优选该化合物或组合物包含IL-10、1，8- 萘磺内酰胺(1，8-napthosultam)取代的化合物或喹喔啉(quinoxaline)化合物。
或者，该化合物或组合物通过减少促炎细胞因子量来增加内源性抗炎 剂水平。因此，该化合物或组合物包含能增加促炎细胞因子的循环、可溶 性细胞因子受体的量的试剂。
本发明还提供一种改善动物的生长性能的方法，所述方法包括给需要 的动物施用组合物，其包含与抗生素协同的抗炎剂，并且其任选与可药用 载体、助剂或赋形剂组合，其中该组合物实现协同生长促进效果。
优选，该抗炎剂是具有抗炎效果的的任何可溶性细胞因子受体、细胞 因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段或者选自双氯酚酸 (diclofenac)、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、氟尼辛(flunix)、非 诺洛芬(fenoprofen)、夫洛非宁(floctafenine)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛 芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、甲氯芬那酸 (meclofenamate)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美 酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、奥沙普嗪(oxaprozin)、保泰松 (phenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、替诺昔康 (tenoxicam)、噻洛芬酸(tiaprofenic)和托美汀(tolmetin)的抗炎剂。优选该可溶 性细胞因子受体或其生物活性片段选自能改善动物的生长性能的TNFα受 体、IL-6受体、IL-1受体、IL-4受体和IL-8受体或其组合。更优选，可溶 性细胞因子受体或其生物活性片段为IL-1受体。
优选，该细胞因子受体拮抗剂或其生物活性片段选自IL-1ra、IL-6ra、 IL-8ra和TNF-αra。更优选，该细胞因子受体拮抗剂或其生物活性片段是 IL-1ra。
优选，该细胞因子抑制因子或其生物活性片段选自TNF阻断因子和 TNF-α抑制剂。
在一个具体实施方案中，通过将一或多种抗炎剂与一或多种可药用载 体、助剂或赋形剂组合而将本发明的抗炎剂配制成促进生长的组合物。更 优选，通过将一或多种可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞 因子抑制因子或其生物活性片段或者一或多种其它抗炎剂或可药用载体、 助剂或赋形剂组合而配制成促进生长的组合物。可以使用任何已知的可药 用载体、助剂或赋形剂，只要它不会对抗炎剂的生长促进效果有不利影响。
因此，在第二方面本发明提供一种促进生长的组合物，其包含一或多 种抗炎剂及一或多种可药用载体、助剂或赋形剂。优选，该组合物包含选 自下组的抗炎剂：可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子 抑制因子或其生物活性片段、双氯酚酸、二氟尼柳、依托度酸、氟尼辛、 非诺洛芬、夫洛非宁、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那 酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奥沙普嗪、保泰松、吡罗 昔康、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸和托美汀。
更优选，该组合物包含一或多种可溶性细胞因子受体、细胞因子受体 拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段和一或多种不同的可溶性细 胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段 或一或多种抗炎剂。最优选，该组合物包含一种可溶性细胞因子受体、细 胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段和一种不同的抗 炎剂或者可药用载体、助剂或赋形剂。
包含抗生素的组合物有助于限制动物的微生物载量，从而帮助抗抗炎 剂改善动物的生长性能。特别优选的抗生素是已经用于常规动物生产环境 的抗生素。但具体地，优选抗生素选自阿莫西林(amoxycylin)、氨苄西林 (ampicillin)、安普霉素(apramycin)、阿伏帕星(avoparcin)、杆菌肽(bacitracin)、 苯乙苄胺(benethamine)、苄星青霉素(benzathine)、头孢噻呋(ceftiofur)、头孢 呋辛(cefuroxime)、头孢洛宁(cephalonium)、金霉素(chlortetracyclin)、氯唑西 林(cloxacilline)、二甲硝咪唑(dimetridazole)、红霉素(erythromycin)、吉他霉 素(ketasamycin)、拉沙洛西(lasalocid)、林可霉素(lincomycin)、莫能霉素 (monensin)、甲基盐霉素(narasin)、新霉素(neomycin)、竹桃霉素 (oleandomycin)、土霉素(oxytetracycline)、奥拉喹多(olaquindox)、青霉素、 青霉素G、普鲁卡因(procaine)、壮观霉素(spectinomycin)、链霉素、四环素、 替米考星(tilmicosin)、甲氧苄啶(trimethoprim)、泰洛星(tylosin)、沙利霉素 (salinomycin)、磺胺(包括和二氨藜芦啶(diaveridine))和维吉霉素 (virginiamycin)或其组合。最优选抗生素为阿莫西林、林可霉素或壮观霉素。
根据抗炎剂的活性、给药方式、动物的年龄和体重，可以使用不同剂 量的抗炎剂。但在一些环境下，更高或更低的剂量可能是合适的。给药可 以通过单次施用单个剂量单元或者多个较小剂量单元的形式来完成，还可 以通过在具体时间间隔多次施用细分的剂量来完成。
但是，可以理解，任何具体动物的特定剂量水平取决于多种因素，包 括所用的特定抗炎剂的活性、年龄、体重、总体健康水平、性别、饮食、 给药时间和给药途径、排泄速率和抗炎剂或抗生素组合。但是，通常优选 的给药途径选自口服、局部给药和肠胃外给药。
肠胃外给药包括皮下注射、气溶胶、静脉内、肌肉内、鞘内注射、输 液技术或被囊化细胞。
本发明抗炎剂或组合物还可作为动物用水和/或饲料的添加剂施用。
动物的生长性能可以由任何已知的方法确定，包括生长速率增加、饲 料利用率增加、最终增重、清理后(dressed)增重和脂肪含量降低。本领域技 术人员可以进一步认识到，动物生长性能的改善可以是免疫增强、抗寄生 虫或抗微生物效果、抗炎效果或应激降低导致的。更优选，免疫增强可以 由TH1/TH2免疫反应、抗体同种型转换、血细胞生成、免疫功能改善、粘 膜免疫、对体内平衡过程如食欲、内分泌或神经-内分泌过程的有益效果导 致。
本领域技术人员可以认识到，这里公开的方法和组合物可以用于任何 期望改善生长性能的动物。但是，本发明特别用于食用动物，即通常在农 场饲养以进行肉类生产的动物。优选，动物为高等偶蹄动物(Artiodactyl)或 鸟类。偶蹄动物包括牛、猪、羊、骆驼、山羊和马。鸟类包括小鸡、火鸡、 鹅和鸭。更优选，本发明涉及选自牛、猪、羊、骆驼、山羊、马和小鸡的 动物。最优选动物为牛、猪或羊。
在第三方面，抗炎剂作为编码该抗炎剂的核酸分子施用，因而该核酸 分子在动物中表达时产生生长促进量的抗炎剂。因此，本发明提供一种改 善动物的生长性能的方法，所述方法包括给需要的动物施用编码一或多种 抗炎剂的核酸分子的步骤，其中该核酸分子的表达产生有效的生长促进量 的一或多种抗炎剂。
该核酸分子可以是DNA、cDNA、RNA或它们的杂合分子。可以清楚 地理解，术语核酸分子包括全长分子或其生物活性片段。
优选该核酸分子为编码可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、 细胞因子抑制因子或其生物活性片段的DNA分子。最优选，该DNA编码 选自TNFα受体、IL-6受体、IL-1受体、IL-4受体和IL-8受体或其组合的 细胞因子受体或者选自IL-1ra、IL-6ra和TNF-αra的细胞因子受体拮抗剂。
该核酸分子可整合至动物基因组，或可作为染色体外元件存在。
该核酸分子可以通过已知的方法施用；但是，优选皮下、静脉内或肌 内注射或者作为气溶胶施用。
核酸的施用量取决于给药途径和部位以及由该核酸分子编码的具体细 胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段。 如这里所述，引入200μg的编码细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细 胞因子抑制因子或其生物活性片段的核酸分子足以改善动物的生长性能。 因此，优选将约200μg-1,000μg的编码细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、 细胞因子抑制因子或其生物活性片段的核酸分子引入动物。
该核酸分子还可以在载体，例如猪腺病毒载体中递送。还可以作为裸 DNA递送。
因此，在第四方面，本发明提供一种用于体内递送有效量的细胞因子 受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段的构建 体，所述构建体包含：
a)一种编码细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子 或其生物活性片段的核苷酸序列；
b)一种包含调控序列的载体，其中该调控序列能调控a)的核苷酸序列 的表达，从而产生细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因 子或其生物活性片段，进而改善动物的生长性能。
修饰和变体形式的构建体可以通过化学或酶处理在体外产生，或者通 过重组DNA技术在体内产生。这些构建体可以不同于公开的构建体，例如 区别在于一或多种核苷酸取代、缺失或插入，但基本上保持本发明构建体 或核酸分子的生物活性。
本发明还提供试剂盒。因此，在第五方面，本发明提供一种用于改善 动物的生长性能的试剂盒，所述试剂盒包含：
a).一或多种抗炎剂；
b).递送该抗炎剂的装置；和
c).本发明方法的使用说明。
适宜的缓冲剂和离子盐也可以包括在试剂盒中。
附图说明
图1表示在饲料内含或不含抗生素的情况下，用IL-1ra或盐水处理的 猪在断奶期的最初4周的增重速率(柱表示组平均值+SEM)。
图2表示在饲料内含或不含抗生素的情况下，用IL-1ra或盐水处理的 猪在断奶期第5或6周的增重速率(柱表示组平均值+SEM)。
图3表示在饲料内含或不含抗生素的情况下，用IL-1ra或盐水处理的 猪在断奶期(D7-D42)和生长期(D79和D93)的增重速率(柱表示组平均值 +SEM)。
图4表示在饲料内含或不含抗生素的情况下，用IL-1ra或盐水处理的 猪在结束期(finisher phase)的增重速率。
图5表示在断奶期在存在或不存在饲料内药物的情况下，用盐水或 IL-1ra处理的猪屠宰时的平均重量。
图6表示在断奶期在存在或不存在饲料内药物的情况下，用IL-1ra或 盐水处理的猪的平均清理后重量(温尸体重量)。
图7表示在断奶期在存在或不存在饲料内药物的情况下，用盐水或 IL-1ra处理的猪的饲料转化率。计算的是结束期(第93天-第133天)的饲料 转化率。
图8表示用IL-1ra或盐水处理并被供给0、低水平和正常水平的抗生素 药物的猪在断奶期结束时的平均重量。
图9表示用IL-1ra或盐水处理并被供给0、低水平和正常水平的抗生素 药物的猪在断奶期间有关体重损失发生率和死亡率的产量损失。
图10表示用IL-1ra或盐水处理并被供给0、低水平和正常水平的抗生 素药物的猪在断奶期结束时的总组重。
图11表示用IL-1ra或盐水处理并被供给0、低水平和正常水平的抗生 素药物的猪在生长期结束时的平均重量。
图12表示用IL-1ra或盐水处理并被供给0、低水平和正常水平的抗生 素药物的猪在结束期结束时的平均重量。
图13表示用IL-1ra或盐水处理并被供给0、低水平和正常水平的抗生 素药物的猪在屠宰时的平均P2背膘(backfat)测量。
图14表示在最初用大肠杆菌攻击后从用盐水、IL-1ra或安普霉素 (Apralan)处理5天的猪收集的粪便中培养的大肠杆菌。数据点表示组平均值 和标准误差。
图15表示用IL-1ra或安普霉素处理的猪与盐水对照组相比，在大肠杆 菌攻击后5天的总粪便培养物得分减小的百分率。
图16表示被大肠杆菌攻击并经IL-1ra、盐水或安普霉素处理的猪在5 天中的腹泻和湿粪便记录。柱表示各组的总记录；任何组的最大记录为40。
图17表示与盐水对照组相比，用IL-1ra或安普霉素处理的猪中大肠杆 菌感染的临床症状(粪便状况)的降低百分率。
图18表示用IL-1ra、盐水或安普霉素处理的猪在死后沿胃肠道不同区 域所得样品的大肠杆菌培养物得分。SI指小肠。柱表示组平均值和标准误 差。
图19表示与盐水处理的对照组相比，用IL-1ra或安普霉素处理的猪在 死后的大肠杆菌培养物得分的减小百分率。
图20表示用IL-1ra、盐水或安普霉素处理的猪在死后胃肠道的所有区 域的总大肠杆菌培养物得分。柱表示组平均值和标准误差。
图21表示与盐水处理的对照组相比，用IL-1ra或安普霉素处理的猪在 死后肠中存在的总大肠杆菌水平的减小百分率。
图22表示用IL-1ra、盐水或安普霉素处理的猪在死后前肠和后肠中的 大肠杆菌培养物得分。柱表示组平均值和标准误差。
图23表示与盐水对照组相比，用IL-1ra或安普霉素处理的猪在死后前 肠和后肠区域中得到的大肠杆菌培养物得分的减小百分率。
图24表示用IL-1ra或盐水处理的猪在死后沿胃肠道不同区域所取样品 的螺旋体(spirochaete)培养得分。柱表示组平均值。
图25表示与盐水对照组相比用IL-1ra处理的猪在死后的螺旋菌培养物 得分的减小百分率。
图26表示用盐水或IL-1ra处理并受猪痢疾攻击的猪在死后的粪便状 况。
图27表示用IL-1ra或盐水处理并受猪痢疾攻击的猪的外周血液中促炎 细胞因子TNFα的mRNA的表达。
图28表示用IL-1ra或盐水处理并受猪痢疾攻击的猪的外周血液中促炎 细胞因子IL-8的mRNA的表达。
图29表示用IL-1ra或盐水处理并受猪痢疾攻击的猪的外周血液中促炎 细胞因子IL-1的mRNA的表达。
图30表示用重组IL-1ra、质粒IL-1ra、NSAID氟尼辛、质粒对照或盐 水对照处理，然后用App攻击的猪在2周中的平均重量增量。柱表示组平 均值和标准误差。
图31表示用盐水、氟尼辛、重组IL-1ra、质粒对照或质粒IL-1ra处理 的猪在用App攻击的14天期间增加的总重。柱表示组平均值和标准误差。
图32表示用盐水、氟尼辛、重组IL-1ra、质粒对照或质粒IL-1ra处理 的猪在用App攻击的14天期间的日增加速率。柱表示组平均值和标准误差。
图33表示与盐水对照组相比，用氟尼辛或IL-1ra处理后用App攻击 14天的猪的增重变化百分率。
图34表示与盐水对照组和质粒对照组相比，用IL-1ra质粒处理后用 App攻击14天的猪的增重变化百分率。
图35表示用盐水、氟尼辛、重组IL-1ra、质粒IL-1ra或质粒对照处理 后用App攻击的猪的血清中TNFα蛋白的水平。柱表示组平均值和标准误 差。
图36表示用盐水、氟尼辛、重组IL-1ra、质粒对照或质粒IL-1ra处理 并用App攻击的猪的外周血液中促炎细胞因子IL-6的mRNA的表达。NS 指该时间点无样品。柱表示组平均值和标准误差。
图37表示用盐水、氟尼辛、重组IL-1ra、质粒对照或质粒IL-1ra处理 并用App攻击的猪在攻击的第一周的30次观察中，App疾病的临床症状得 分。柱表示组平均值和标准误差。最大可能得分是240。
图38表示与相关的对照组相比，用氟尼辛、重组IL-1ra或质粒IL-1ra 处理并用App攻击的猪的疾病临床症状的降低百分率。
图39表示用盐水、氟尼辛、重组IL-1ra、质粒对照或质粒IL-1ra处理 并用App攻击的猪在验尸时以胸膜炎得分(0-5)表示的胸膜炎程度。柱表示 组平均值和标准误差。
图40表示与相关的对照组相比，用氟尼辛、重组IL-1ra或质粒IL-1ra 处理并用App攻击的猪的胸膜炎减少百分率。
图41表示用盐水、氟尼辛、重组IL-1ra、质粒对照或质粒IL-1ra处理 并用App攻击的猪在验尸时以受染肺的重量百分率表示的胸膜肺炎程度。 柱表示组平均值和标准误差。
图42表示与相关的对照组相比，用氟尼辛、重组IL-1ra或质粒IL-1ra 处理并用App攻击的猪的受影响的肺质量的减小百分率。
图43表示用盐水、低或高剂量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)处理的猪在 App攻击的最初10天期间的日增重速率。柱表示组平均值和标准误差。
图44表示用盐水、低或高剂量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)处理的猪在 App攻击的第二个10天期间的日增重速率。柱表示组平均值和标准误差。
图45表示用盐水、低或高剂量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)处理的猪在 App攻击的总共21天期间总共增加的重量。柱表示组平均值和标准误差。
图46表示与盐水处理的对照组相比，用低和高剂量的IL-1ra或 IL-1ra+IL-4(syn)预防性处理的猪在App攻击21天期间增重的改善百分率。
图47表示用盐水、低或高剂量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)处理的猪在 App攻击的总共21天期间以总肺重百分率表示的受App损害影响的肺的数 量。柱表示组平均值和标准误差。
图48表示用盐水、低或高剂量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)处理的猪在 App攻击的总共21天期间的肺的胸膜炎得分。柱表示组平均值和标准误差。
图49表示用盐水、低或高剂量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)处理的猪在 App攻击的总共21天期间在死亡后所取的肺组织中促炎细胞因子，IL-8的 mRNA的表达。柱表示组平均值和标准误差。
图50表示用盐水、低或高剂量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)处理的猪在 App攻击的总共21天期间在死亡后所取的肺组织中促炎细胞因子TNFα的 mRNA的表达。柱表示组平均值和标准误差。
图51表示用App攻击后，用高或低剂量的IL-1ra、用盐水或用速解灵 (excenel)处理的猪在攻击后第2周的增重。柱表示组平均值和标准误差。
图52表示用App攻击后，用高或低剂量的IL-1ra、用盐水或用速解灵 处理的猪的饲料摄入。柱表示组平均值和标准误差。
图53表示用App攻击后，用高或低剂量的IL-1ra、用盐水或用速解灵 处理的猪的饲料转化率。柱表示组平均值和标准误差。
图54表示用App攻击后，用高或低剂量的IL-1ra、用盐水或用速解灵 处理的猪对被杀死的App的刺激发生的反应中淋巴细胞的增殖能力。柱表 示组平均值和标准误差。
图55表示用App攻击后，用高或低剂量的IL-1ra、用盐水或用速解灵 处理的猪在死后在肺中发现的促炎细胞因子IL-8的mRNA水平。柱表示组 平均值和标准误差。
发明详述
除非另外指出，本发明的实施利用本技术领域内的常规的分子生物学、 细胞生物学和重组DNA技术。这些技术对本领域技术人员来说是已知的， 并在文献中作了充分说明。例如参见Sambrook和Russell“Molecular Cloning： A Laboratory Manual”(2001)(Green Publishing，New York)；Cloning：A Practical Approach，″Volumes I and II(D.N.Glover，ed.，1985)(Green Publishing，New York)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait，ed.，1984)； ″Nucleic Acid Hybridisation″(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1985)； “Antibodies：A Laboratory Manual”(Harlow & Lane，eds.，1988)；″Transcription and Translation″(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1984)；″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney，ed.，1986)；″Immobilised Cell and Enzymes″(IRL Press， 1986)；B.Perbal，″A Practical Guide to Molecular Cloning″(1984)，and Sambrook等，″Molecular Cloning：a Laboratory Manual″(1989).Ausubel，F 等，1989-1999，“Current Protocols in Molecular Biology”(Green Publishing， New York)。
在描述本发明的方法和组合物之前，应理解本发明不限于所述的特定 材料和方法，因为这些是可以变化的。还应理解，这里所用的技术仅用于 描述具体实施方案，而不意在限定本发明的范围，该范围仅由所附的权利 要求限定。必须注意到这里和所附的权利要求中所用的单数形式“一种”和 “该”包括复数含义，除非上下文清楚地表明其它情况。因此，例如“可溶性 细胞因子受体”包括多种这类细胞因子受体，而“抗生素”指一或多种抗生素 和本领域技术人员已知的其等同物等等。除非另外定义，这里所用的所有 的技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员常规理解的含义相同 的含义。虽然与这里所述的材料和方法类似或等同的任何材料和方法可以 用于实施和试验本发明，但现在描述优选的材料和方法。
这里提及的所有出版物被引用以描述和公开该出版物中报道的并可以 用于本发明的方案、试剂和载体。不应该将此理解为由于先前的发明而认 为本发明不被赋予先于这些内容的权利。
应该理解，本发明的方法和组合物用于改善动物的“生长性能”。术语“生 长性能”在本领域已知指动物的生长速率和饲料利用率的标准，还指动物的 最终重量，和动物的清理后重量与尸体的脂肪含量。动物的“生长速率”是 动物活体的单位增重速率，而“饲料利用率”是动物活体每单位增重所需的饲 料量。动物的“最终重量”是在指定年龄屠宰的动物的重量，而“清理后重量” 是已除去内脏、脚、猪脚或蹄的尸体的重量。“脂肪含量”是整理后尸体的 脂肪量。生长速率、饲料利用率、最终重量和清理后重量以及尸体脂肪含 量的标准的测定方法是本领域已知的。例如参见Manipulating Pig Production VI，VII & VIII.1997，1999 & 2001，Ed.P.D.Cranwell，Australian Pig Science Association，Werribee，Victoria，Australia。随时间连续测定活体重量得到生长 速率。随时间连续测定饲料消失和活体重量得到饲料利用率。尸体脂肪含 量一般通过测定在P2位置的以毫米为单位的背膘厚度来推定。因此，在本 发明中术语“生长性能”意指动物的生长速率、饲料利用率、最终或清理后重 量和尸体的脂肪含量中的一或多种标准的改善。
这里所用的术语“动物”意指任何需要增强生长性能的动物。例如， 哺乳动物偶蹄目或鸟类鸟纲所包括的动物。
偶蹄动物包括约150种活物种，分成9个科：猪(Suidae)、美洲野猪 (Tayassuidae)、河马(hippopotamidae)、骆驼(Camelidae)、鼷鹿(Tragulidae)、 长颈鹿和霍加皮(Giraffidae)、鹿(Cervidae)、叉角羚(Antilocapridae)和牛、羊、 山羊与羚羊(Bovidae)。许多这些动物在许多国家用作食用动物。更重要的 是，关于本发明，许多经济上重要的动物如山羊、羊、牛和猪具有非常类 似的生物学，并共享高度基因组同源性。更重要的是，已知一些动物如山 羊和羊与马和驴可以进行种间交配。
这里所用的术语“鸟”和“鸟类”意指包括所有的鸟类，包括但不限 于小鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉鸡，它们可以工业化饲养用于产蛋或肉。 此术语还包括雄性和雌性的任何鸟类物种。因此，术语“鸟”和“鸟类” 具体包括小鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉鸡的母鸡、公鸡和公鸭(drake)。优 选小鸡和火鸡。
所有偶蹄动物具有类似的包括细胞因子系统的炎性系统，因为它们具 有例如白介素，GM-CSF、干扰素α、β和γ以及它们各自的受体。在大部分 的物种中，编码这些细胞因子的基团定位在一些染色体的特定区域。例如， 在人当中，白介素5基因定位在染色体5q23-31的与编码GM-CSF、M-CSF、 IL-3和IL-4的基因相同的区域。更重要的是，许多细胞因子和它们的受体 在不同的物种之间具有高度氨基酸序列同源性。例如，本领域已知猪与牛、 绵羊(ovine)和马等动物的白介素5共享多达90％的氨基酸(例如见Sylvin等 (2000)，Immunogenetics，51：59-64)。实际上，即使象小鼠和人这样有明显区 别的物种也共享多达70％的氨基酸序列同一性(例如参见Dictionary of Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim)。且已知人 IL-10与牛、鼠和绵羊IL-10具有明显程度的序列同源性(Dutia等，(1994) Gene；149：393-4)。
本领域还已知许多细胞因子具有物种交叉反应性。例如，IL-4具有一 定的交叉物种反应性，而IL-5具有高水平的交叉物种反应性，Dictionary of Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim。但是，应该指 出现有技术文献中所述的交叉反应性涉及体外试验和一些体内实验，但不 涉及生长性能。
还已知细胞因子以刺激或抑制方式调节细胞因子受体的表达，借此通 过其它细胞因子来调控细胞因子的生物活性。一些细胞因子共享共同的可 能具有调控效果的受体亚基。例如，GM-CSF受体表现出与其它造血生长因 子的受体(包括IL-2-β、IL-3、IL-6、IL-7、Epo和催乳素受体)的显著同源性 (例如见Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia- www.copewithCytokines. de)。还已知IL-3能上调小鼠巨噬细胞的GM-CSF受体表达，IL-3也上调 节人和小鼠骨髓细胞的IL-1受体表达，IL-4上调IL-11型受体表达并下调 IL-2受体表达。IL-7上调IL-4受体表达，而TNFα上调IL-3和GM-CSF受 体表达(Dictionary of Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers， Weinheim)。
与偶蹄动物类似，鸟类也具有共同的细胞因子系统，包括白介素。因 此，这里所用的术语“鸟类细胞因子受体”或“鸟细胞因子受体”意指与鸟类物 种产生的细胞因子相对应的任何细胞因子受体。
由于许多食用动物具有共同的祖先和生物学水平，许多物种如牛、羊、 山羊和猪的细胞因子的高度氨基酸序列同源性和其它炎性过程，以及细胞 因子的交叉物种反应水平，本领域技术人员将认识到这里公开的组合物和 方法可用于所有食用动物和所有细胞因子受体。
本领域技术人员将进一步认识到这里公开的组合物和方法可以直接外 推至包括本发明的其它方面。例如，提供特定细胞因子受体拮抗剂的数据； 但是不应将这些理解为限定本发明。实际上，所公开的细胞因子受体拮抗 剂是特别选出以例示本发明范围的。例如，许多细胞因子共享受体或受体 亚基。例如，IL-3、IL-5和GM-CSF共享受体亚基(Dictionary of Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim)。IL-4共享IL-2 和IL-7的共同亚基(Dictionary of Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim)。一些细胞因子具有类似的基因结构，并群集至一个 染色体上，例如人和小鼠的IL-3、IL-4、IL-5、GM-CSF和IL-13(Dictionary of Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim)。
以上描述只为举例说明本发明在所涉动物类型方面的范围。但是，还 容易地看到术语“细胞因子受体”或“细胞因子受体拮抗剂”还应被广义理解， 且不限于所公开的实验数据。例如，术语“细胞因子受体”包括一或多种IL-1 受体、IL-6受体、TGF-β受体、IL-11受体、IL-18受体、IL-12受体、IL-17 受体、LIF受体、IFN-γ受体、IL-8受体、TNF-α受体和GM-CSF受体，为 可溶形式。术语“受体拮抗剂”包括IL-1ra、IL-4ra、IL-8ra、GM-CSFra、IL-6ra 或TNF-αra。
在一个特别优选的实施方案中，本发明方法的最初步骤包括给动物施 用生长促进量的一或多种抗炎剂。
这里所用的术语“抗炎剂”指能降低炎症的任何化合物或组合物。例如， 可以使用具有抗炎效果的可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细 胞因子抑制因子或其生物活性片段。或者，可以使用抗炎剂如双氯酚酸、 二氟尼柳、依托度酸、氟尼辛、非诺洛芬、夫洛非宁、氟比洛芬、布洛芬、 吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普 生、奥沙普嗪、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸或托美 汀。还已知皮质类固醇药物是强抗炎剂，它们广泛用于抑制免疫反应的有 害效果。因此，在一个实施方案中可以使用皮质类固醇药物。
在另一个实施方案中，术语“抗炎剂”包括增加促炎细胞因子的可溶性 受体量的任何化合物或组合物。
如上述，生长性能是可以测定的；但是，生长性能增加的原因是略复 杂的问题。无意受任何具体理论或假设限制，本申请人认为施用抗炎剂以 多种补充方式起作用，从而导致改善生长性能。例如，本申请人已发现通 过增强食用动物的免疫力，避免了原料损失(stock loss)并改善随后的生长性 能。因此，本发明提供降低动物对感染的易感性的方法。所述方法用于降 低对由细菌、病毒或寄生虫导致的感染的易感性。
本申请人还已发现，将一或多种抗炎剂和一或多种抗生素一起施用也 可改善动物的生长性能，并减少抗生素的总用量。据信抗生素将动物的微 生物载量限制在阈值水平，从而使施用的抗炎剂能发挥对生长性能的效果。
因此，本申请人认为抗炎剂并非自身用作生长促进剂(虽然这是可能 的)，可以理解施用抗炎剂可以通过激活能被抗炎剂激活的免疫反应的体液 和细胞武器而导致改善生长性能。
这里所用的术语“生长促进量”意指有效导致上述的生长性能增加的本 发明抗炎剂的量。例如，增加生长速率、饲料利用率、增加最终体重、增 加尸体清理后重量或降低脂肪含量。
这里所用术语“给药”指本发明组合物的递送方式。该术语还指组合 物的剂量。根据抗炎剂的活性和动物的年龄与体重、可以改变抗炎剂的给 药方式和剂量。可以理解，任何特定动物的特定剂量水平取决于多种因素， 包括所用的特定抗炎剂的活性、年龄、体重、总体健康水平、性别、饮食、 给药时间、给药途径、排泄速率和抗炎剂或抗生素组合。但是，通常优选 的给药途径选自口服、局部给药和肠胃外给药。
肠胃外给药包括皮下注射、气溶胶、静脉内、肌肉内、鞘内注射或输 液技术和被囊化细胞。
这里所用的术语“上调”指引起蛋白或肽的生产、分泌或利用率增加(因 此增加浓度)。因此动物或鸟类的内源性抗炎剂的上调方法指与未处理的动 物或鸟类相比，使动物或鸟类的抗炎剂的产量、分泌或利用率增加的方法。
术语“内源性”意指在被研究的受试者、细胞或系统内产生。因此， 增加抗炎剂的内源性水平意指给动物施用一或多种化合物以使动物中抗炎 剂的总量高于正常存在量。增加抗炎剂的内源性水平意指给动物施用一或 多种化合物，其中该化合物增加动物细胞或组织的抗炎剂生产，从而有效 地增加动物的抗炎剂总量。抗炎剂的内源性水平还可以通过降低抗炎剂的 转化率来得以有效地增加。例如，本发明的一或多种化合物在施用于动物 时可以通过抑制蛋白水解酶的效果来降低内源性抗炎剂的蛋白水解率。
许多物质能刺激内源性抗炎剂(例如细胞因子受体、IL-4和IL-16或细 胞因子受体拮抗剂)的上调。例如，WO93/18783中提示IL-10上调IL-1受 体拮抗剂的表达。而且，化合物如1，8-萘磺内酰胺取代的化合物或喹喔啉化 合物已知上调细胞因子受体拮抗剂如IL-8。例如参见国际专利申请 WO99/36070和WO99/42461，它们在此被引用作为参考。
降低或改善促炎细胞因子如IL-1的效果的备选方法是从循环中除去这 些物质。例如，已知存在能与配体结合从而防止它们与其受体结合的因子。 例如已知上文讨论的TNF阻断因子和TNF-α抑制剂与TNF结合。
术语“生物活性片段”指抗炎剂的片段，其对动物的生物或生理效果 基本上类似于衍生它的完整抗炎剂。例如，IL-1受体拮抗剂的生物活性片 段可以是IL-1受体拮抗剂的具有约5个以上氨基酸残基的任何部分，它包 含生物活性部位或者保留IL-1受体拮抗剂活性。例如，当IL-1受体拮抗剂 部分保留与上述IL-1受体结合的能力时，此部分是IL-1受体拮抗剂的“生 物活性片段”。通常，这种IL-1受体拮抗剂的片段是能竞争性抑制IL-1与 IL-1受体结合的片段。
由此可见，可以在该方法中施用足以提供一些或全部IL-1ra功能的 IL-1ra的片段，或者足以提供一些或全部IL-1ra功能的任何其它分子，而不 是施用IL-1ra。例如，这种片段或分子能提供一些或全部IL-1ra功能，包括 阻断IL-6和IL-8生产。典型地，这种片段或分子能竞争性抑制IL-1ra和/ 或IL-1与IL-1受体结合。因此，在一个实施方案中，本发明包括施用足以 提供一些或全部IL-1ra功能的IL-1ra片段，或者足以提供一些或全部IL-1ra 功能的分子。
本发明还涉及可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子 抑制因子或其生物活性片段的氨基酸序列变体。例如，可将一个或多个氨 基酸残基加到上述可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子 抑制因子或其生物活性的片段序列或其片段的N-或C末端或者内部。上述 可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子序列或它 们的片段的氨基酸序列变体，其中该序列或其片段的一个或多个氨基酸残 基缺失，并任选被一个或多个氨基酸残基取代；和以上可溶性细胞因子受 体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段的衍生物， 其中氨基酸残基已被共价修饰，因而所得的产物为非天然存在的氨基酸。 而且术语“生物活性片段”包括可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗 剂、细胞因子抑制因子或其生物活性片段的所有这些变体，只要该变体保 留衍生它的完整可溶性细胞因子受体、细胞因子受体拮抗剂、细胞因子抑 制因子或其生物活性片段的生物活性。
本文中“可药用载体、助剂或赋形剂”是用于将抗炎剂和/或抗生素递送 至动物的可药用溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体，并根据 计划的给药方式进行选择。
术语“基本上同源”可以核酸和/或氨基酸序列，它意指具体受试序列， 例如突变体序列，由参照序列经一或多种取代、缺失或加入而演变，其最 终效果不导致参照和受试序列之间的不利的功能差异。为本发明的目的， 认为具有等同生物活性和等同表达特征的序列基本上是同源的。认为具有 较小程度的同一性、相当的生物活性和等同表达特征的序列是等同的。
“微生物的”指由细菌、真菌(例如酵母)、病毒(例如杆状病毒)或植物表 达系统制备的重组蛋白。作为一种产物，“重组微生物的”定义一种基本上 不含天然内源性物质且不伴有相关的天然糖基化作用的动物蛋白。大部细 菌培养物，例如大肠杆菌中表达的蛋白没有发生糖基化修饰；在酵母和昆 虫细胞中表达的蛋白具有不同于哺乳动物细胞中表达的糖基化模式。
“核酸分子”或“多核酸分子”指所有形式的脱氧核糖核酸和核糖核酸，即 单链和双链DNA、cDNA、mRNA等。
“双链DNA分子”指在其正常、双链螺旋中的聚合形式的脱氧核苷酸(腺 嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)，该术语仅指该分子的一级和二级结构， 并不限制它的任何三级结构。因此此术语包括可见于线性DNA分子(例如 限制性片段)、病毒、质粒和染色体中的双链DNA。在讨论具体双链DNA 分子的结构时，本文对序列的描述可以按一般规律，仅提供沿非转录DNA 链(即与mRNA具有序列同源性结构的链)的5′-3′方向的序列。
如果一种DNA序列根据遗传密码进行翻译产生一种氨基酸序列(即该 DNA序列“编码”该氨基酸序列)，则该DNA序列“对应”于该氨基酸序列。
如果二种DNA序列编码相同的氨基酸序列，则一种DNA序列“对应” 于另一种DNA序列。
当至少约85％，优选至少约90％，最优选至少约95％的核苷酸与确定 长度的DNA序列匹配时，两种DNA序列“基本上相似”。基本上类似的序 列可以用Southern杂交实验，在例如与具体系统有关的严谨条件下来鉴定。 适宜杂交条件的确定在本领域技术范围内。例如参见Sambrook等，DNA Cloning，vols.I，II and III.Nucleic Acid Hybridization。但是，通常核酸分子 的杂交或退火的“严谨条件”是这样的条件：
(1)利用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M NaCl/0.0015M柠檬 酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，在50℃进行洗涤，或者
(2)在杂交期间使用变性试剂如甲酰胺(例如50％(vol/vol)甲酰胺)以及 0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液， pH6.5，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，42℃的条件。
另一个实例是使用50％甲酰胺、5X SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸 钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5 XDenhardt溶液、超声处理 的鲑精DNA(50μg/mL)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，42℃的条件，并在 42℃用0.2X SSC和0.1％SDS洗涤。
DNA构建体的“异源”区或结构域是较大分子中在其天然状态下不与 其结合的可鉴定的DNA片段。因此，当异源区编码哺乳动物基团时，该基 因侧翼一般具有在来源生物基因组中并非位于所述哺乳动物基因组DNA侧 翼的DNA。异源区的另一实例是一种构建体，其中编码序列本身不在自然 中发现(例如一种cDNA，其中基因组编码序列包含具有不同于天然基因的 密码子的内含子或合成序列)。等位基因变异或天然存在的突变事件不产生 这里定义的DNA的异源区。
“编码序列”是符合读框(in-frame)的密码子序列，它对应于或编码蛋白或 肽序列。两种编码序列或它们的互补序列编码相同的氨基酸序列时，这两 种编码序列彼此对应。与适宜的调控序列结合的编码序列可以在体内转录 和翻译成多肽。多腺苷酸化信号和转录终止序列一般位于编码序列的3′端。
“启动子序列”是一种能与细胞中的RNA聚合酶结合并引起下游(3′向) 编码序列转录的DNA调控区。当结合启动子序列的RNA聚合酶将编码序 列转录成mRNA，而mRNA进而转录成由该编码序列编码的蛋白时，编码 序列“受控于”细胞内的启动子序列。
为本发明的目的，启动子序列3′末端被编码序列的翻译起始密码子结 合，并向上游延伸，以便包括引起超过背景的可检测水平的转录所需的最 少量碱基或元件。在启动子序列内可以发现转录起始位点(可方便地用核酸 酶S1作图来限定)以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合域(共有序列)。真 核生物启动子一般，但不总是包含“TATA”盒和“CAT”盒；原核生物启动子 除了-10和-35共有序列之外还包含Shine-Delgarno序列。
当将外源DNA引入细胞壁内侧时，称细胞被这些外源DNA“转化”。 外源DNA可以整合或不整合(共价连接)至组成细胞基因组的染色体DNA。 例如在原核生物和酵母中，外源DNA可以保留在附加元件如质粒上。关于 真核细胞，稳定转化的细胞是通过染色体复制而将异源DNA遗传给子细胞 的那些细胞。这种稳定性通过真核细胞建立由包含异源DNA的子细胞群组 成的细胞系或克隆的能力来证明。
DNA的“整合”可以利用微量注射法、基因枪法(boilistics)、电穿孔法或 脂质转染法将DNA传至细胞，然后利用非同源重组来实现。本发明还包括 备选方法如异源重组，和/或限制酶介导的整合(REMI)或转座子，并可以认 为它们是改进的整合方法。
“克隆”是通过有丝分裂由单一细胞或共同祖先衍生的细胞群。
因此“细胞”、“宿主细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且所 有这些术语应被理解为包括子代。“细胞系”是能在体外稳定生长许多代的原 代细胞的克隆。因此，术语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细 胞和由其衍生的培养物，而与该培养物传代的次数无关。还应该理解，由 于有意或无意的突变，所有子代的DNA含量可能不完全相同。
载体用于将外源物质，例如DNA、RNA或蛋白引入生物体。典型的载 体包括重组病毒(用于DNA)和脂质体(用于蛋白)。“DNA克隆载体”是自主 复制的DNA分子，例如质粒、噬菌体或粘粒。通常，DNA克隆载体包含 一个或少数限制性核酸内切酶识别位点，在这些位点可以以可测定的方式 切割这种DNA序列而不损失载体的基本生物功能，并可以将DNA片段剪 接到所述位点以使其复制和克隆。克隆载体还可以包含适于在鉴定该克隆 载体转化的细胞时用到的标记。
“表达载体”类似于DNA克隆载体，但包含能指导适宜宿主细胞进行蛋 白合成的调控序列。这一般是指与RNA聚合酶结合，并引起mRNA转录的 启动子，以及指导mRNA翻译成多肽的核糖体结合位点和起始信号。将DNA 序列掺入表达载体的适宜位点和正确读框中，然后用该载体转化适宜宿主 细胞，能产生对应于该DNA序列的mRNA，并通常产生由该DNA序列编 码的蛋白。
为本发明的目的，启动子序列3′末端被编码序列的翻译起始密码子结 合，并向上游延伸，以便包括引起超过背景的可检测水平的转录所需的最 少量碱基或元件。在启动子序列内可以发现转录起始位点(可方便地用核酸 酶S1作图来限定)以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合域(共有序列)。
“异源”元件是相对宿主细胞而言外来的元件，或者与宿主细胞同源但在 宿主细胞中处于并非该元件通常可见的位置的元件。
DNA的“消化”是指利用仅作用于DNA的一些部位的酶催化裂解DNA。 这些酶称为限制酶或限制核酸内切酶，而这种酶裂解的DNA内的位点称为 限制位点。如果DNA内存在多个限制位点，则消化将产生两个或更多个线 性DNA片段(限制性片段)。这里所用的多种限制酶是可商购的，并使用由 酶制造商确定的它们的反应条件、辅助因子和其它要求。限制酶一般由缩 写来指定，它包括一个大写字母，其后是代表获得每种限制酶的原始微生 物的其它字母，然后是指示具体酶的数字。一般地，约1μg的DNA用在约 20μl缓冲液中的约1-2单位的酶消化。关于具体限制酶的适宜缓冲液和底物 量由制造商特别指明，和/或在本领域已知。
指定DNA片段经限制性消化后的“回收”或“分离”通过以下方法来完 成：在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上进行电泳来分离称为“限制性片段”的 消化产物，根据相对于已知分子量的标记DNA片段的迁移来鉴定目标片段， 切割包含目标片段的凝胶部分，并从凝胶中分离DNA，例如电洗脱分离。
“连接”指在双链DNA片段之间形成磷酸二酯键的过程。除非另外特别 说明，连接使用已知的缓冲液和条件，采用10单位T4 DNA连接酶每0.5μg 约等摩尔量的待连接DNA片段来完成。
“寡核苷酸”是通过已知方法(包括例如三酯、亚磷酰胺或膦酸酯化学)， 例如Engels等，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.28：716-734(1989)所述方法合成 的短长度、单链或双链聚脱氧核苷酸。然后通过，例如聚丙烯酰胺凝胶电 泳纯化。
本文中“聚合酶链反应”或“PCR”一般指目标核苷酸序列的体外扩增方 法，可参见美国专利4,683,195。一般地，PCR法包括使用两种能优先与模 板核酸杂交的寡核苷酸引物进行引物延伸合成的反复循环。通常用于PCR 法的引物与模板内待扩增核苷酸序列的末端或侧翼的核苷酸序列互补，也 可以使用与待扩增的核苷酸序列互补的引物。Wang等，PCR Protocols， pp.70-75(Academic Press，1990)；Ochman等，PCR Protocols，pp.219-227； Triglia等，Nucl.Acids Res.16：8186(1988)。
“PCR克隆”指采用PCR法扩增相应细胞或组织的核酸中的具体目标核 苷酸序列，包括总基因组DNA和由细胞总RNA转录的cDNA。Frohman 等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：8998-9002(1988)；Saiki等，Science 239：487 -492(1988)；Mullis等，Meth.Enzymol.155：335-350(1987)。
“载体”或“构建体”指质粒或病毒或基因组整合体，其包含具有以下成分 的转录单元：(1)在基因表达中具有调控作用的一或多种遗传元件，例如启 动子或增强子，(2)转录成mRNA并翻译成蛋白的结构或编码序列，和(3) 适宜的转录起始和终止序列。欲用于酵母或真核表达系统的结构单元包括 前导序列，其使宿主细胞将翻译的蛋白分泌到细胞外。或者，当重组蛋白 在无前导序列或转运序列的情况下表达时，它可以包括N-末端蛋氨酸残基。 该残基随后从表达的重组蛋白切出或不切出而得到最终产物。一般地，重 组表达载体包括允许转化宿主细胞的复制起点和可选择的标记和来自高表 达基团的启动子以引起下游结构序列的转录。异源结构序列在适宜的时期 与下列物质组装：翻译起始和终止序列，优选能指导翻译蛋白分泌至胞质 空间或细胞外介质的前导序列。可选地，异源序列可以编码融合蛋白，该 融合蛋白包括赋予目标特征(例如稳定或更简易纯化所表达的重组产物)的 N-末端识别肽。本发明优选的重组表达载体是病毒载体(例如猪腺病毒载 体)、哺乳动物细胞(例如猪细胞)、植物细胞和细菌细胞。
术语″免疫反应″意指脊椎动物受试者的免疫系统对抗原或抗原决定簇 的任何反应。例举性的免疫反应包括体液免疫反应(例如抗原特异性抗体的 产生)和细胞介导的免疫反应(例如淋巴细胞增殖)，见下文。
术语“系统性免疫反应”意指与淋巴结节、脾或肠相关的淋巴样组织 中的免疫反应，其中产生免疫系统的细胞，例如B淋巴细胞。例如，系统 性免疫反应可以包括产生血清IgG。而且，系统性免疫反应指在血流中循环 的抗原特异性抗体和在系统性隔室如脾和淋巴结的淋巴样组织中的抗原特 异性细胞。作为对照，与肠相关的淋巴样组织(GALT)是粘膜免疫系统的一 个组分，因为对肠抗原/病原体作出反应的抗原特异性细胞可在GALT中诱 导并检测。
由于细胞因子受体和细胞因子受体拮抗剂在所有食用动物物种中内源 性表达，且其中的许多具有高度交叉反应性，由此可见来自一个物种的细 胞因子受体和细胞因子受体拮抗剂可以施用于不同物种的动物，反之亦然。 例如当动物为猪时，可以将人细胞因子受体如IL-1受体用于所公开的方法。 并不要求具体细胞因子受体或细胞因子受体拮抗剂与在动物中内源性表达 的细胞因子受体或细胞因子受体拮抗剂完全相同。
在一个实施方案中，本发明的方法包括：
(1)在施用一或多种抗生素之前、同时或之后施用一或多种抗炎剂；或
(2)施用包含一或多种抗炎剂和一或多种抗生素的组合物。
(3)施用不含任何抗生素的一或多种抗炎剂。
本发明的抗炎剂或组合物可以通过口服、局部或肠胃外途径，以包含 无毒的常规可药用载体、助剂和赋形剂的单位剂量配制剂来给药。本文术 语肠胃外包括皮下注射、气溶胶、静脉内、肌肉内、鞘内、颅内注射或输 液技术。
本发明还提供适用于本发明改善生长性能的新方法的局部、口服和肠 胃外用药物配制剂。本发明的组合物可以作为片剂、水性或油性悬浮液、 锭剂、糖锭、散剂、颗粒剂、乳剂、胶囊、糖浆或酏剂口服给药。口服组 合物可以包含一或多种选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的试剂，以 产生药学上优质可口的制剂。片剂包含与适于配制片剂的无毒可药用载体、 助剂或赋形剂混合的活性成分。
这些载体、助剂或赋形剂可以是，例如(1)惰性稀释剂，例如碳酸钙、 乳糖、磷酸钙或磷酸钠；(2)造粒和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；(3)粘 合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和(4)润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸 或滑石。这些片剂可以无包衣或者由已知技术包衣以延迟在胃肠道中崩解 和吸收，借此提供较长时间的持续作用。例如可以使用延时材料如单硬脂 酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。还可以使用美国专利4,256,108、4,160,452和 4,265,874所述的技术进行包衣，以形成渗透性治疗片剂来进行控释。
用于本发明的方法的抗炎剂和抗生素可以通过在体内应用、肠胃外注 射或缓慢输液一段时间而单独或共同给药。给药可以是静脉内、动脉内、 腹膜内、肌内、皮下、腔内或透皮给药。
用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。 非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机 酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和 缓冲介质。肠胃外赋形剂包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化 钠，乳酸化林格氏静脉内赋形剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例 如基于林格氏右旋糖的补充剂)等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如 抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、生长因子和惰性气体等。
本发明包括用于改善生长性能的多种组合物。根据本发明一个实施方 案的组合物通过用载体、助剂、赋形剂或添加剂将一或多种抗炎剂(含有或 不含有一或多种抗生素)配制成适于对动物给药的剂型来制备。
适用于本发明的这个方面的抗生素是通常在动物饲养业中用作动物用 水和/或饲料的添加剂并用于限制动物的微生物载量的那些抗生素。这些抗 生素的实例包括林可霉素、壮观霉素和阿莫西林。在澳大利亚，将抗生素 用于食用动物的用途详见“The use of antibiotics in food-producing动物s： antibiotic-resistant bacteria in Animals and humans”。关于抗生素耐受性的联合 专家咨询委员会的报告(JETACAR)，澳大利亚共和国，1999。
抗生素可以施用于动物，其用量与常规施用于动物以减少动物的微生 物载量的量相同。抗生素的所述量是本领域已知的，可参见上述JETACAR。
常用的载体、助剂或赋形剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露糖醇 和其它糖、滑石、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动 物和植物油、聚乙二醇和溶剂，如无菌水、醇、甘油和多羟基醇。静脉内 赋形剂包括液体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合 剂和惰性气体。其它可药用载体包括水溶液、无毒赋形剂，包括盐、防腐 剂、缓冲剂等，例如见Remington′s Pharmaceutical Sciences，15th ed.Easton： Mack Publishing Co.，1405-1412，1461-1487(1975)和The National Formulary XIV.，14th ed.Washington：American Pharmaceutical Association(1975)，该文献 内容在此被引用作为参考。该药物组合物的多个组分的pH和精确浓度可以 根据本领域常识调节。参见Goodman and Gilman′s，The Pharmacological Basis for Therapeutics(7th ed.)。
根据本发明的药物组合物可以以生长促进量进行局部或系统给药。这 种应用的有效量当然取决于抗炎剂和动物的重量与一般状况。一般地，体 外使用的剂量可以为所述组合物原位给药的量提供有用的指导。许多考虑 在例如Langer，Science，249：1527，(1990)中作了描述。口服配制剂可以是硬 明胶胶囊的形式，其中将活性成分与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙 或高岭土)混合。它们还可以是软明胶胶囊的形式，其中活性成分与水或油 介质(如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
水悬浮液通常包含与适于制备水悬浮液的赋形剂混合的活性成分。这 类赋形剂可以是(1)助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素，羟丙基甲 基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯胶；(2)分散或润 湿剂，它可以是(a)天然存在的磷脂，例如卵磷脂；(b)烯化氧与脂肪酸的缩 合产物，例如聚环氧乙烷硬脂酸酯；(c)环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物， 例如十七碳乙烯氧基鲸蜡醇；(d)氧化乙烯与由脂肪酸与己糖醇衍生的部分 酯的缩合产物，例如聚环氧乙烷山梨醇一油酸酯或(e)环氧乙烷与由脂肪酸 和己糖醇酐衍生的部分酯的缩合产物，例如聚氧化乙烯脱水山梨醇一油酸 酯。
组合物可以是无菌注射用水性或油性悬液形式。这种悬液可以根据已 知方法，使用上述适宜的分散剂或润湿剂和助悬剂来制备。无菌注射制剂 还可以是在肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的无菌注射液，例如在1，3- 丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的赋形剂和溶剂为水、林格氏溶液和 等渗氯化钠溶液。此外，无菌、固化的油常用作溶剂或悬浮介质。为此目 的，可以使用任何温和的固化油，包括合成的甘油一酸酯或甘油二酸酯。 此外，脂肪酸，例如油酸可用于制备注射剂。
本发明的抗炎剂和组合物还可以脂质体递送系统的形式(例如小单层囊 泡、大单层囊泡和多层囊泡)给药。脂质体可以由不同的磷脂，例如胆固醇、 硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。
本发明的抗炎剂或组合物的剂量水平等级为约1微克至约50微克每千 克体重，优选的剂量范围为约5微克至约20微克每千克体重每次服药(可以 一次或多次服药)(约100微克至约500微克每只动物每次服药)。可以与载 体物质组合以制备单一剂量(single dose)的抗炎剂量将随动物和具体给药模 式而变。例如，欲用于对猪进行静脉内给药的制剂可以包含约20μg至1g 的抗炎剂和可以为全部组合物的约5-95％的适宜且方便量的载体物质。单位 剂量形式通常包含约5μg-500mg的抗炎剂。
但是可以理解，任何具体动物的具体剂量水平取决于多个因素，包括 所用的具体抗炎剂的活性、年龄、体重、总体健康水平、饮食、给药时间、 给药途径、排泄率和药物组合。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，一或多种抗炎剂在体内表达 而不是外源施用。例如，通过插入编码抗炎剂的结构DNA序列和适当的翻 译起始与终止信号，使其与功能性启动子处在可操作性阅读状态，可以产 生能在体内表达抗炎剂的表达载体。该载体包含一个或多个表型可选择的 标记和复制起点，以确保在宿主内扩增。适于转化的原核宿主包括大肠杆 菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属、链单胞菌属(Streptomonas)和葡萄球菌属的多个 物种，也可以选择其它物种。在将适宜的宿主菌株转化和表达之后，将细 胞再培养一段时间。细胞通常通过离心来收集，用物理或化学方法破裂， 并保留所得的粗提取物以作进一步纯化。多种哺乳动物细胞培养物系统还 可以用于表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的实例包括Gluzman，Cell 23：175(1981)所述的猴肾成纤维细胞的COS-7系和其它能表达相容载体的 细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系，当然还有猪细胞。 哺乳动物表达载体将包含复制起点、适宜的启动子和增强子，还包含任何 需要的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终 止序列和5′-侧翼非转录序列。由SV40病毒基因组衍生的DNA序列，例如， SV40起点、早期启动子、增强子、剪接位点和多腺苷酸化位点可以用来提 供所需的非转录性遗传元件。在细菌培养物中产生的重组蛋白一般通过以 下方法分离：首先从细胞碎片进行提取，然后进行一次或多次盐析、水溶 液离子交换或大小排阻层析处理步骤。必要时，用蛋白再折叠步骤实现成 熟蛋白构型。最后，可以将高效液相色谱法(HPLC)用于最终的纯化步骤。 用于蛋白表达的微生物细胞可以用任何适宜的方法破裂，包括冷冻-融化循 环、超声处理、机械破裂或利用细胞溶解试剂。表达纯化所用标签序列的 表达系统的应用将简化纯化。本文所述重组表达系统在诱导与DNA片段或 待表达的合成基团连接的调控元件时表达异源蛋白。不含细胞的翻译系统 也可以用于利用由本发明的DNA构建体衍生的RNA生产猪细胞因子。适 用于原核生物和真核生物宿主的克隆和表达载体见Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor，N.Y.，1985)，该文献的内 容在此被引用作为参考。
编码具体抗炎剂的核酸优选为质粒DNA或病毒载体形式(它是由腺病 毒、逆转录病毒、痘病毒，特别是痘苗病毒或MVA病毒、疱疹病毒、腺伴 随病毒等衍生的载体)的形式。编码具体抗炎剂的核酸通过感染性病毒颗粒 或者以合成载体(阳离子脂类、脂质体，阳离子聚合物等)，或经改造的细胞 (用该核酸转染或转导的细胞)或未经改造的细胞(它天然包含该核酸)的形式 转运。
根据另一优选的变体，目标核酸由有复制缺陷的腺病毒载体(不能在宿 主细胞中自主复制)携带。腺病毒的技术在现有技术中有描述(例如参见 Graham and Prevec in Methods in Molecular Biology，1991，vol 7，pp.109-128， ed E.J.Murey，The Human Press Inc)。有利地，本发明范围内所用的腺病毒 载体由腺病毒的基因组衍生，它包含至少ITR(反向末端重复)和壳体化序列， 并缺乏所有或部分E1腺病毒区。此外，它可以缺乏所有或部分E3腺病毒 区。但是，根据一个有利的实施方案，优先保留编码多肽，特别是糖蛋白 gp19 k的部分E3区(Gooding等，Critical Review of Immunology，1990，10： 53-71)，从而使其能逃避宿主的免疫系统。而且，该载体可以包括附加的缺 失和突变，它们尤其影响所有或部分的选自E2、E4、L1、L2、L3、L4和 L5区的一个或多个区域(例如参见WO 94/28152)。为了例示这一点，可以提 及影响E2A区的DBP(代表DNA结合蛋白)基因的温度敏感性突变(Ensinger 等，J.Virol.，1972，10：328-339)。另一变体或吸引人的组合是缺失E4区， 但编码开放读框(ORFs)6和7的序列除外(这些限制性缺陷不要求E4功能互 补；Ketner等，Nucleic Acids Res.，1989，17：3037-3048)。优选将目标基因插 入载体代替缺失的腺病毒区，特别是E1区。使用许多目标基因时，它们可 以插在病毒基因组的相同位点或不同位点，并可以处在相同的调控元件或 独立元件的控制之下，且如果合适的话，它们中的一些可以与其它的取向 相反，以便在其表达水平下的干扰现象最小化。重组腺病毒载体的基因组 可以通过分子生物学技术或通过同源重组(参见WO 96/17070)来制备。
在本发明的范围内使用的腺病毒载体在能反式提供缺陷功能的补充细 胞系中繁殖以产生形成感染性病毒颗粒所需的肽。例如，利用细胞系293 来补充E1功能(Graham等，J.Gen.Virol.，1977，36：59-72)或利用国际申请 WO 97/04119所述的细胞系来进行双互补。还可以使用适宜的细胞系和辅助 病毒以补充所有缺陷功能。从细胞培养物中回收产生的病毒颗粒，如果需 要的话，用本领域中的技术纯化(氯化铯梯度，色谱步骤等)。
本发明范围内所用的腺病毒载体可以由源自人、犬、鸟类、牛、鼠、 绵羊、猪或猴子的腺病毒的基因组衍生，或者由包含不同来源的腺病毒基 因组片段的杂合体衍生。更具体而言，可以提及来源于犬的CAV-1或CAV-2 腺病毒、来源于鸟类的DAV，或者来源于牛的III型Bad(Zakharchuk等， Arch.Virol.，1993，128：171-176；Spibey and Cavanagh，J.Gen.Virol.，1989，70： 165-172；Jouvenne等，Gene，1987，60：21-28；Mittal等，J.Gen.Virol.，1995，76： 93-102)。但是，优选研究对具体动物物种有特异性的腺病毒载体。
本发明的方法可以具体化为试剂盒的形式。
该试剂盒包括含有一或多种抗炎剂的第一容器，用于递送试剂的装置 和使用说明。
在适用于密集的动物生产的实施方案中，该试剂盒还可以包括含有一 或多种抗生素的第二容器。备选试剂盒包括含有一或多种编码抗炎剂的核 酸分子的第一容器(如果将它施用于动物，则在动物上表达该核酸分子时产 生生长促进量的抗炎剂)，用于递送试剂的装置和使用说明。
使用说明使农场主或其它动物饲养实践者能施用抗炎剂或核酸分子， 以提高该动物相对于未施用这种试剂或核酸分子的动物的生长促进作用。
在整个说明书中，词“包括(comprise)”和该词的变型，例如“包括 (comprising)”和“包括(comprises)”意指“包括但不限于”，并且不意在排除其 它添加剂、组分、整数或步骤。
仅通过参照以下非限制性实施例的方式进一步描述本发明。但应该理 解，以下的实施例仅是例示性的，不应以任何方式被认为是对上述本发明 的一般性的限制。例如，虽然主要的实施例与猪有关，但应理解本发明还 可以用于这里公开的其它动物，包括例如羊、牛和小鸡。
实施例1
重组IL-1RA作为生长促进剂以代替饲料内的抗生素
进行此实验以确定IL-1ra是否能够在工业化环境中改善断奶猪的生长 性能和健康。我们还希望研究IL-1ra作为饲料中的抗生素药物的替代物的 潜能。
实验设计
重组猪IL-1ra在大肠杆菌(E.coli)中表达，并用polyHis标记系统进行纯 化。在开始实验前在生物分析中测定IL-1ra的生物活性。
将雄性断奶猪(28天大)以每组20只分配到表1所述的处理组。各处理 组的平均重量相同，具有相同的方差。将猪以每组畜栏(group pen)20圈养， 其中2个监禁组提供含药物的水并按照目前的工业标准饲养，而另2个畜 栏给予不含药物的水并饲养。如表2所述，每周两次将体积为1ml的重组 IL-1ra或盐水(对照)注入猪，持续断奶期(42天)。
在断奶期开始(0天)和断奶期结束(第42天)时，猪通过静脉穿刺放血以 进行免疫分析。在整个断奶期(第0-42天)每周对猪称重，然后在第79天、 第93天和试验最后一天即第113天试验分别对猪称重，然后屠宰动物并测 定尸体特征。
表1 组 处理 药物 盐水+ 1ml盐水 有 IL-1ra+ 200μg IL-1ra，在1ml盐水中 有 盐水- 1ml盐水 无 IL-1ra- 200μg IL-1ra，在1ml盐水中 无
表2
第0天 对28天大的断奶猪进行称重和分组。
放血。对各组进行注射。
第1天
对各组进行注射。
第6天 称重
对各组进行注射。
第7天(第1周) 对各组进行注射。
第9天 称重
第13天 对各组进行注射。
对各组进行注射。
第14天(第2周) 称重
第16天 对各组进行注射。
第20天 对各组进行注射。
称重。
第21天(第3周) 对各组进行注射。
第23天 对各组进行注射。
第27天 称重
对各组进行注射。
第28天(第4周) 对各组进行注射。称重。最后一次放血。
第30天 移至生长畜圈。
第34天 生长期。所有的猪给予标准饲料，并保持在先前
的组中。
第35天(第5周) 在生长期期间(D73)和结束时(D93)称重。
第37天
第41天 结束期。将猪移至单一畜圈，并测定摄入饲料的
FCR(食物转化率)。所有的猪给予标准完工饲料。
第42天(第6周) 在结束期期间(实验天(D)114)和结束期结束时
(第42-93天) (屠宰D133)称重。测定最终重量，P2背膘，
(第93-133天) 尸体重量，％清理后(dressing)重量。
结果
关于最初4周的处理，用IL-1ra处理的猪在增重率方面与盐水对照组 表现一样好(图1)。但是，当实验和处理进行至断奶期的后几周，即第5和 第6周时，用IL-1ra处理的猪在加药物和不加药物的饲养方案中，其表现 均胜过盐水处理的猪(图2)。而且，用IL-1ra处理并喂饲不含抗生素的食物 的猪的表现与喂饲含药物食物的盐水处理猪的表现一样好(图2，IL-1ra对 盐水+)。用IL-1ra处理并喂饲含药物的食物的猪在断奶的最后2周中有最大 的增加率。
这些结果表明，对于促进工业化条件下猪的生长，IL-1ra处理与饲料内 抗生素应用同样有效。IL-1ra处理的猪在IL-1ra施用4周后的表现改善还意 味着IL-1ra的作用被延迟，或者需要数次处理以产生与饲料内的抗生素类 似的效果。
IL-1ra处理的猪的较高增重率的趋势在整个生长和结束期(分别为第 43-92天，和第93-134天)持续。在第6周停止注射后，用IL-1ra处理并不 提供饲料内药物的猪继续生长的速度与用盐水处理并提供饲料内药物的猪 一样快(图3)。而且，此结果意味着IL-1ra处理对于促进猪增长而言与抗生 素一样有效，这如在断奶期最后2周(图2)和生长期(图3、D79和D93)所示。 IL-1ra的效果似乎在第6周细胞因子处理结束后长久存在。
用IL-1ra处理并提供含药物食物的猪在生长期表现最高的增重率(图3、 D79和D93)，而用盐水处理并喂饲非药物食物的猪在所有处理组中具有最 低的增重率。
在结束期，在断奶期用IL-1ra处理且食物中不加药物的猪在所有的组 中表现最高的增加率(图4)。此结果进一步表明对施用至第6周的IL-1ra的 反应的延迟性，且IL-1ra与目前工业中所用的饲料内的抗生素一样是猪生 长的有效促进剂。
IL-1ra作为生长促进剂的积极效果也由屠宰的猪的平均重量(图5)及其 屠宰之后的温尸体重量(图6)表示。在断奶期在不存在饲料内的抗生素的情 况下用IL-1ra处理的猪在屠宰时比用盐水处理并提供饲料内的抗生素的猪 平均重0.7kg。IL-1ra处理导致的这种重量增长是在这两种处理之间在饲料 转化率方面不存在任何差异的情况下发生的(图7)。在断奶期提供饲料内抗 生素的猪在结束期间的饲料转化率为2.5，而且在不存在饲料内抗生素的存 在下，用IL-1ra处理的猪在结束期间的饲料转化率为2.49。在存在抗生素 的情况下，用IL-1ra处理的猪的温尸体重量大于盐水处理对照组的重量(图 6)。而且，在不存在抗生素的情况下，用IL-1ra处理的猪的温尸体重量等于 喂饲抗生素并用盐水处理的猪的温尸体重量。这些结果表明，IL-1ra处理的 猪比抗生素处理的猪增加更多的重量，这种增加与目前给猪喂养抗生素的 工业化实践一样有效。
结论
1).IL-1ra在不存在饲料内抗生素的情况下改善猪的生长。
2).由IL-1ra处理产生的生长改善等效于通过加入饲料内抗生素所见的 生长改善。
3).与盐水处理的对照组和盐水处理并喂饲抗生素补充食物的猪相比， IL-1ra在不存在饲料内抗生素的情况下改善断奶期最后2周的生长。
4).在断奶期施用IL-1ra对生长的作用被延迟并长时间持续，所述作用 在整个生长和结束期中持续。
5).在生长期，IL-1ra处理的猪与喂饲抗生素的猪生长同样好。
6).在结束期，IL-1ra处理的猪比喂饲抗生素的猪更快生长。
7).与用盐水处理并喂饲抗生素补充食物的猪相比，在断奶期施用 IL-1ra导致屠宰增重。
8).在结束期期间，在断奶期用IL-1ra处理的猪与在断奶期喂饲抗生素 补充食物的猪具有相同的饲料效率。
9).这些结果表明，与目前抗生素补充的猪饲料的工业实践相比，IL-1ra 产生更大的猪，并且不影响饲料转化效率。
实施例2
重组IL-1RA作为生长促进剂用于降低饲料内的抗生素水平
本实验通过比较断奶期、生长期和结束期至屠宰时，雄性和雌性断奶 猪的生长速率和健康而反复对IL-1ra改善猪的性能和/或免疫力进行评价。 此试验设计用于研究给药数个水平的IL-1ra的效果，即从目前用于猪生产 的抗生素给药正常水平至减少抗生素给药和不给药抗生素药物。此实验评 价在正常工业化猪饲养条件下，IL-1ra代替抗生素的能力，并确定在整个动 物生命中持续施用IL-1ra的效果。
实验设计
重组猪IL-1ra在大肠杆菌(E.coli)中表达，并用polyHis标记系统纯化。 在开始实验前，在生物实验中测定IL-1ra的生物活性。
该实验在工业化环境中进行，其中猪在28天大时断奶。所有的注射为 1ml。每种处理对16头猪进行，即每种处理8头雄性和8头雌性猪。处理 组的平均重量与实验开始时类似。
处理方案
组 处理 药物治疗
1 盐水 0
2 盐水 减少
3 盐水 正常
4 IL-1ra 0
5 IL-1ra 减少
6 IL-1ra 正常
所用的符号
-表示在整个试验中在饲料或水中没有补充抗生素。
-0.5表示用于整个试验的单一抗生素。
+表示用于整个试验的正常工业化抗生素方案。
处理
盐水注射，1ml IM颈肌。
100μg IL-1ra注射，1ml IM颈肌。
在断奶期每周两次施用注射剂，并在整个生长期和结束期每周一次施 用注射剂。
在实验开始时(D0，W0)将猪断奶并称重。在以下时期记录体重：整个 断奶期(W0-W6)、生长期期间(W9)、生长期末期(W13)、结束期期间(W16) 和结束期末屠宰前即W19。在实验开始时和在断奶期、生长期及结束期的 末期收集血样。进行血液学和免疫学分析。在屠宰时，记录尸体特征，包 括P2背膘测定值和清理后尸体重量。
结果
在断奶期末期，在所有3种药物水平下，用IL-1ra处理的猪比它们的 盐水对照更重(图8)。显然，用IL-1ra处理但不给药抗生素药物的断奶猪的 重量大于用盐水处理并提供正常水平抗生素的断奶猪的重量(Irap-vs盐水 +，图8)。如预期地，抗生素药物增强盐水处理猪的生长并改善用IL-1ra处 理猪的生长。
抗生素药物的存在对断奶期的猪的健康具有很大影响，这通过出现重 量损失或死亡的猪的数量来测定(图9)。在盐水处理的猪中，抗生素水平的 提高降低出现重量损失或死亡的猪的数量。但是，不管抗生素的水平如何， 用IL-1ra处理的猪表现最少的重量损失或死亡记录。在不存在抗生素的情 况下，用盐水处理的16只猪有一半以上在断奶期表现健康和产量降低。但 是，IL-1ra处理将这种数量降至16头猪中的2头(图9)。断奶期这种健康的 改善和死亡率的降低以及体重增加改善一起导致断奶期末总组重量的明显 差异(图10)。不进行药物治疗、减少药物治疗和完全药物治疗的盐水处理组 分别重292kg、324kg和406kg。IL-1ra处理的猪在断奶期末期的对应总组 重量为369kg、390kg和451kg。IL-1ra处理的这种组重量的增加在零、降 低的和正常的抗生素给药水平下分别反映为生产率增加26.4％、20.4％和 11.1％。
在断奶期，IL-1ra处理的导致的生产率的改善在整个生长和结束期继 续(图11和12)。在生长期末期，不管药物水平如何，用IL-1ra处理的猪比 所有盐水处理的猪都重(图11)。重要的是，与目前药物治疗的工业给药水平 相比，不存在抗生素的情况下，IL-1ra的递送导致生长期末期的重量更高。 盐水处理的猪的最终重量以依赖于剂量的方式受药物治疗影响(图12)，其中 增加药物治疗水平导致屠宰时增重。但是，这种模式不能在IL-1ra处理的 猪中重复。在不存在抗生素药物治疗的情况下，用IL-1ra处理的猪比盐水 处理的猪重16.7％。实际上，不进行药物治疗时，IL-1ra的施用在促进完工 猪的生长方面的表面超过目前工业水平的抗生素治疗(图12)。这些结果表 明，在整个生产期促进猪的生长方面IL-1ra比抗生素治疗更有效。虽然 IL-1ra处理导致屠宰时猪较大，这种重量的增加并不伴随P2背膘增加(图 13)。在不存在抗生素的情况下用IL-1ra处理的猪的P2背膘水平与用盐水处 理并提供完全抗生素药物治疗的猪相当(图13)。这两个结果表明施用IL-1ra 导致的活体重量提高可持续至终产物，产生较瘦的尸体。
结论
1).在饲料内不存在抗生素和具有降低的抗生素水平的情况下，IL-1ra 改善猪的生长。
2).通过IL-1ra处理产生的生长改善超过目前工业水平的抗生素药物治 疗所致的生长改善。
3).IL-1ra改善从断奶期至完工期的整个生产期(production phase)的生 长，导致屠宰时增重。
4).IL-1ra改善断奶猪的健康，这可以由与盐水处理组比较死亡率降低 和体重损失发生率减小看出。
5).施用IL-1ra所致的健康参数的改善大于由抗生素药物治疗导致的 健康参数的改善。
6).连续施用IL-1ra对猪无任何有害效果。
7).IL-1ra改善重量并且不损及尸体质量，这由屠宰时P2背膘值没有改 变看出。
实施例3
递送重组IL-1RA以改善出血性大肠杆菌(E.coli)感染的断奶猪的健康
本研究确定IL-1ra是否能够改善暴露于例如出血性大肠杆菌感染的猪 的健康。进一步的目的在于确定IL-1ra是否能够改善在断奶期被大肠杆菌 感染的猪的生长。它还设计为表明IL-1ra是否能够降低感染率并改善大肠 杆菌感染的猪的健康。最后希望该实验能够评价与目前抗生素处理相比 IL-1ra对断奶猪大肠杆菌感染的预防或治疗潜力。
实验设计
将平均重量为5.4kg的雄性断奶猪分配至包含8只动物的各个组，各组 间平均重量相等。将猪在包含来自每个处理组的复制品的组畜圈中饲养。 给猪无限制地提供丸状饲料和水。
用重组盐水、IL-1ra或抗生素安普霉素处理猪，并根据表3所列的方案 用大肠杆菌攻击。以1ml剂量肌内递送盐水或200μg IL-1ra。安普霉素根据 制造商的指示以12mg/kg的剂量口服递送。大肠杆菌攻击物以含有108 cfu/ml的8ml剂量口服递送。如表3所示，首次用大肠杆菌攻击第-2天、第 0天和第+6天通过静脉穿刺从猪中取血样。分析血液的免疫学参数，包括 白细胞数、分化细胞计数、淋巴细胞亚群计数、IgG水平和细胞因子产量。 在第-2天和第6天试验结束时对猪称重。
从攻击后的第2天至第6天的5天内，每天从每头猪取粪便样品；将 这些样品在羊血琼脂中培养以对大肠杆菌进行定量。绵羊血琼脂上的生长 记分为0-5(其中0为无生长，1表示原代接种体生长，2表示第一划线生长， 3表示第二划线生长，4表示第三划线生长，而5表示在最后的划线中大肠 杆菌生长)。粪便的状况记为正常、湿或腹泻，作为临床症状的指示。
在第7天实验结束时，使猪安乐死，并从胃肠道的不同区域取拭子， 所述区域包括小肠(沿小肠长度25％、50％和75％处)、盲肠和结肠，并取样 原位粪便。将这些死后所取的拭子在绵羊血琼脂中培养以对上述的大肠杆 菌负荷进行定量。
表3
用于检测IL-1RA作为猪大肠杆菌感染预防药的效力的实验方案 试验天 事件 -2 血样 IL-1ra注射 重量 -1 IL-1ra注射 安普霉素口服 0 大肠杆菌攻击 IL-1ra注射 安普霉素口服 血样 1 大肠杆菌攻击 IL-1ra注射 安普霉素口服 2 大肠杆菌攻击 IL-1ra注射 安普霉素口服 粪便拭子 3 大肠杆菌攻击 安普霉素口服 粪便拭子 4 粪便拭子 5 粪便拭子 6 血样 粪便拭子 重量 7 安乐死处死
来自肠和粪便的拭子
结果
与用盐水处理的对照猪相比，用IL-1ra或安普霉素处理的猪表现出粪 便中大肠杆菌排泄减少(图14)。用安普霉素处理的猪在攻击后的第2天至第 5天细菌排泄减少，而IL-1ra处理的猪在第2天至第4天细菌排泄减少。在 攻击后第6天，所有组的细菌排泄相同。对于安普霉素和IL-1ra处理，在 递送最后处理药剂后3天，粪便中大肠杆菌排泄恢复至盐水对照水平。总 之，安普霉素处理的组在所有处理中表现出最少的细菌排泄。
与盐水处理的对照猪相比，安普霉素处理的猪在整个攻击期每组的粪 便得分表现为粪便排泄减少80.9％，而IL-1ra处理的猪与盐水处理的对照猪 相比表现为细菌排泄减少37％(图15)。
在工业化情况下，感染猪的细菌排泄减少将进一步降低畜群或畜圈中 其它成员的交叉感染，从而改善断奶者的健康，并因此改善生长。提高断 奶猪的健康和生长将导致后期产率的改善，因为在断奶期的末期产率的主 要预测物是重量。
临床症状记录为粪便状况的改变，例如湿粪便或腹泻的存在，这在用 IL-1ra或安普霉素处理的猪减少(图16)。与盐水对照或安普霉素处理的猪相 比，用IL-1ra处理的猪具有较少湿粪便和腹泻病例的记录。用安普霉素处 理的猪与盐水对照相比具有较少湿粪便的记录，但还显示为在攻击后的时 间内腹泻流行少量增加。
如果将这些临床症状描述为与盐水对照相比的症状减少百分率，则 IL-1ra处理减少64％的临床症状，而安普霉素导致临床症状减少27％(图17)。
临床症状的结果表明IL-1ra和安普霉素都能减少大肠杆菌(E.coli)感染 的外表症状。在这个关于健康的测定中，IL-1ra的表现超过安普霉素这种目 前大肠杆菌感染的抗生素处理。
与盐水处理的对照相比，安普霉素和IL-1ra处理都导致胃肠道(GIT)所 有区域细菌负荷减少(图18)。用IL-1ra处理的猪显示其小肠和结肠的所有取 样区域的培养物得分最低。IL-1ra和安普霉素处理的猪中，取自盲肠和粪便 的样品的粪便培养物得分同样低。与盐水处理的对照相比，IL-1ra处理导致 小肠前部分中的大肠杆菌减少71％，中段小肠中大肠杆菌减少51％，后段 小肠中大肠杆菌减少47％，盲肠中大肠杆菌减少39％，结肠中大肠杆菌减 少44％，而原位粪便中大肠杆菌减少23％(图19)。
如果记录每头猪的所有培养物得分，并将其用于计算组平均总得分(图 20)，用IL-1ra处理的猪得分可能小于10/30，而盐水处理的猪的得分为17/30， 安普霉素处理的猪的得分为12/30。如果将此数据表示为相对于盐水对照大 肠杆菌培养物得分的减小百分率(图21)，则IL-1ra的预防应用导致胃肠道中 大肠杆菌量减少45％。安普霉素的处理仅能将肠中大肠杆菌集群减少33％。
这些结果表明用IL-1ra处理的猪的细菌负荷最低，这进一步强调这种 制剂对控制幼猪的出血性大肠杆菌的价值。
如果根据肠的位置分离大肠杆菌培养物的死后结果，则可以看到IL-1ra 和安普霉素的作用差异(图22)。小肠(前肠)的大肠杆菌细菌负荷与疾病的严 重程度有关，因为小肠是表现分泌性腹泻的部位。与盐水对照相比IL-1ra 处理将小肠细菌负荷降低55％，而安普霉素导致小肠细菌负荷降低32％(图 23)。与盐水对照相比，在后肠区(盲肠和结肠)记录的安普霉素和IL-1α 处理的细菌负荷类似，分别导致大肠杆菌减少37％和42％(图23)。
IL-1ra优选降低前肠细菌负荷的能力表明这种处理可以降低与出血性 大肠杆菌感染有关的疾病的严重性。实际上，这些结果支持那些关于疾病 临床症状的记录，其中与其它处理相比用IL-1ra处理的猪的腹泻发生率降 低(图16)。因此，IL-1ra可能是目前在养猪业中施用的抗生素的潜在替代物 或佐剂，以控制这种疾病对猪生产的有害作用。
IL-1ra和安普霉素对细菌排泄、临床症状和死后细菌负荷的效果的比 较性总结包括在表4中。
表4
IRAP(IL-1RA)和安普霉素控制断奶幼猪的出血性大肠杆菌感染的治疗 效果的比较总结 与盐水处理的对照相比的变化 安普霉素 IL-1ra 粪便中细菌性排泄物的存在 ↓4天 ↓3天 粪便细菌负荷的变化 ↓↓80.8％ ↓36.5％ 临床症状的变化 ↓27.3％ ↓↓63.6％ 死后的大肠杆菌 ↓32.9％ ↓↓44.6％
前肠的大肠杆 ↓32.1％ ↓↓55.4％ 后肠的大肠杆菌 ↓36.8％ ↓41.7％
结论
1).IL-1ra改善猪的健康，即它减少存在出血性大肠杆菌感染时的出血 性腹泻相关性粪便改变方面的临床病症。
2).由IL-1ra处理产生的健康改善等于，并在一些情况下强于抗生素安 普霉素处理的效果，后者是目前处理猪的出血性大肠杆菌的方法。
3).与盐水处理的对照组相比，IL-1ra处理导致感染期间粪便中细菌排 泄减少。用IL-1ra处理的猪在攻击后的3/5天的细菌排泄比盐水处理的对照 组明显更少。这些结果表明在工业化条件下，减少环境中的细菌负荷可以 降低感染率。
4).与盐水处理的对照组相比，施用IL-1ra的效果导致GIT所有区域的 细菌数减少。
5).明显地，IL-1ra导致在大肠杆菌感染期间小肠(前肠)的细菌负荷降 低55％，其中小肠为分泌性腹泻通常所在的部位。由于小肠细菌负荷与疾 病严重程度有关，因此IL-1ra可能对疾病的进展和病理有显著的治疗效果。
6).IL-1ra处理在减少临床病症、死后肠中存在的大肠杆菌水平以及小 肠重要部位存在的大肠杆菌方面优于目前工业用抗生素即安普霉素的处 理。
实施例4
递送重组IL-1RA以改善致猪痢疾性肠炎性病原体，即猪痢疾短螺旋体 (Serpulina)感染的断奶猪的健康和生产力
本实施例的目的在于确定IL-1ra能否改善导致被猪痢疾的肠炎性病原 体，猪痢疾短螺旋体(Brachyspira(Serpulina)hyodysenteriae)感染的猪的健康。 另一目的在于确定IL-4是否能够在猪痢疾攻击的条件下改善猪的生长速 率。
实验设计
将平均初始重量为6.5kg的雄猪分配到由8只猪组成的各处理组。将猪 在组畜圈中饲养，每个畜圈包含来自各处理组的一个复制品。将一组8只 猪在单独的室内圈养并不被感染，以用作未处理的对照。给猪无限制地提 供丸状饲料和水。
在猪痢疾攻击之前，通过肌内注射200μg重组IL-1ra或1ml盐水处理 猪。根据制造商的说明将盐酸林可霉素作为2ml肌内注射剂递送。在表5 所列的实验方案所述的时间间隔给药细胞因子、抗生素并进行攻击。在第0 天、第1天和第2天用猪痢疾短螺旋体感染猪，所述猪痢疾短螺旋体作为 120ml对数生长期螺旋体培养物的口服丸给予，其包含108个细胞。
在表5所述的时间间隔从每只猪取得粪便拭子和血样。培养粪便拭子 中存在的螺旋体。如以上实施例3所述分析血样的免疫学参数。在整个实 验中每周一次对猪称重，通过在最初攻击后的第19和20天对所述猪进行 安乐死来终止其生命。在死后，培养来自后肠各区域的拭子中存在的螺旋 菌，并记录胃肠组织的大体病理条件。
表5
用于评价IL-1RA作为猪痢疾感染预防性处理的效力的实验过程方案
天 重量 粪便拭 子 感染 流血 注射1ml IL-1ra，或 盐水 注射2ml 林可霉素 杀死 -7 × -6 -5 -4 -3 -2 × -1 × 0 × × × × × 1 × × × 2 × × × 3 × 4 5 × × × × 6 × 7 × × × × 8 × 9 × × × 10 11 12 × × × × 13 × 14 × × × × 15 × 16 × × × 17 18 × × 19 × × 20 × ×
猪死亡后从后肠取得的螺旋菌培养物表明与盐水对照组相比，用IL-1ra 处理猪减少了残留在肠中的螺旋菌的数量(图24)。与盐水处理的对照组相 比，IL-1ra能够降低前结肠、后结肠和粪便中螺旋菌培养物得分。如所预期 的，未受猪痢疾攻击的猪死后其后肠或粪便中没有螺旋菌(数据未显示)。
与盐水处理的猪相比，IL-1ra处理导致前结肠中螺旋菌减少15.8％，后 结肠中螺旋菌减少47.1％，粪便中螺旋菌减少42.1％(图25)。IL-1ra处理的 净效果是整个GIT中螺旋菌减少27％。
除了肠中螺旋菌数量减少之外，IL-1ra处理还减少由粪便状况指示的与 感染有关的临床症状。图26表明与盐水处理的对照组相比，IL-1ra处理的 猪表现较少的痢疾影响的粪便征(湿粘液样并带血)。
与盐水处理的对照组相比，IL-1ra处理能够降低促炎细胞因子TNF、IL-8 和IL-1的产生(图27、28和29)。重要的是，促炎细胞因子与动物的疾病表 现有关，并与在密集饲养的家畜中所见的生产力降低有关。IL-1ra的抗炎能 力可以表现为长期生长改善。实际上，这些结果在以上实施例1、2和3所 述。
而且，猪痢疾的临床症状是推测由炎性介质例如促炎细胞因子加剧的 慢性炎性病理状态。IL-1ra降低这些炎性介质产生的能力可在减少与猪痢疾 感染有关的病理中起一定作用。
这些结果证明，IL-1ra能够减少猪痢疾感染对猪健康的有害效果。已知 IL-1ra对免疫系统具有抗炎效果，因此与痢疾有关的肠炎性病理变化的减少 可有助于细胞因子的抗炎性能和螺旋菌负荷的降低(如图24可见)。
结论
1).与盐水处理相比，用IL-1ra处理猪减少死后后肠和粪便中存在的螺 旋菌的数量。
2).与盐水对照组相比，IL-1ra使通过粪便状况检测到的猪痢疾感染的 临床症状减少。
3).用IL-1ra处理猪导致与生长和生产力受损有关的促炎细胞因子的产 量降低。
4).IL-1ra在以下二种肠感染模型中改善猪的健康：溶血大肠杆菌(E.coli) 和猪痢疾短螺旋体(Serpulina)(猪痢疾)。二种模型中健康的改善均可由感染 期间临床症状减少来描述。在大肠杆菌模型中，健康的改善伴随与死后感 染有关的病理的减少。在猪痢疾模型中，还注意到促炎细胞因子水平降低。 IL-1ra进行预防性处理以改善暴露于大肠杆菌的猪的健康的能力与目前工 业标准抗生素效果相当。因此，IL-1ra具有作为抗生素处理的可替代的选择 或补充，或者预防猪大肠杆菌和猪痢疾的潜能。IL-1ra作为健康促进剂的潜 能可以进一步通过同时应用抗生素治疗剂来得到增强。
实施例5
递送质粒S和重组IL-1RA以改善胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)感染的猪的生长和健康
此实施例的目的在于确定IL-1ra是否可以改善炎性肺病原体，胸膜肺 炎放线杆菌(App)感染的猪的健康。而且，另一目的在于确定IL-1ra是否可 以改善App攻击条件下的猪的生长速率。此外，此实施例的目的是确定 IL-1ra的质粒DNA还是重组递送更为有效。
实验设计
将平均初始重量为52kg的雄性猪分配至表6所列的5个处理组。在组 畜圈中饲养猪，各畜圈包含来自各处理组的复制品。各处理组和各畜圈的 初始重量在开始试验前相等。给猪无限制地提供丸状饲料和水。
将重组IL-1ra和盐水以1ml剂量施用，在耳后皮下给予。质粒以1ml 剂量施用，在后腿经肌肉内给予。例如，氟尼辛以2ml剂量根据制造商的 说明施用，并在颈部肌肉内递送。施用的时间表如下表6所列。
表6
细胞因子实验中所应用的处理和剂量，所述实验用于评价IL-1RA作为 胸膜肺炎放线杆菌感染的预防性处理的效力 处理 处理剂量 盐水 2ml 氟尼辛 2.2mg/kg IL-1ra 100μg 质粒对照 100μg 质粒IL-1ra 100μg
在攻击前，如表7所述用重组细胞因子、氟尼辛或质粒处理猪。麻醉 猪，并在第0天用7.5×105pfu App进行气管内感染。
在攻击后第0、24小时和第4天通过静脉穿刺从猪取血样。如前述分 析血液的免疫参数。从质粒递送起以及攻击后两周内每周对猪称重一次。
表7
评价IL-4作为胸膜肺类放线杆菌感染预防性处理的效力的实验方案 事件 施用时间 质粒递送 -10天 重组递送 -2天和第0天 攻击 第0天 临床观察 攻击后30次
结果
在攻击的一周期间，与盐水处理的对照组相比，IL-1ra改善猪的生长(图 30)。用盐水、氟尼辛(非甾族抗炎药，NSAID)或对照质粒处理的猪表现重 量损失，而用IL-1ra或质粒IL-1ra处理的猪在攻击的一周期间表现出正生 长。在攻击后的一周中，所有组的猪增重，但同样重组IL-1ra处理的猪平 均起来比处理组的猪增加更多的重量。用盐水处理的猪在攻击后第二周明 显恢复，而用IL-1ra处理的猪继续增加重量。在所有组中，用质粒或氟尼 辛处理的猪在攻击第二周生长最为不良。
用App攻击之后的2周期间的增重表明，与盐水处理的对照组相比， 重组IL-1ra处理提高了增重，虽然这种结果在统计学上是不显著的。与盐 水处理的对照组相比，氟尼辛和质粒对照在生长方面表现最差。在攻击后2 周期间IL-1ra质粒在生长方面表现好于质粒对照组(图31)。注意到日增重 率具有类似的表现方式，其中与用盐水处理的对照猪每天增加433g相比， 用重组IL-1ra处理的猪平均每天增加667g。
用重组IL-1ra处理导致相对于盐水对照增重改善53.8％，而NSAID氟 尼辛处理导致增重减少84.6％(图33)。质粒处理与盐水对照相比一般具有 较小的增重，但是与质粒对照相比，IL-1ra质粒使增重改善100％(图34)。
App攻击后，数组中的促炎细胞因子TNFα和IL-6升高。
有趣的是，NSAID氟尼辛不能抑制TNFα的产生(图35)，这可能有助 于解释这组所见的不良生长。与攻击前水平相比，攻击后第13天重组IL-1ra、 质粒对照和IL-1ra质粒都具有降低的TNFα水平。与盐水处理和氟尼辛处 理猪相比，这3种处理在攻击后第13天还具有明显较低的TNFα产生水平 (p＜0.05)。
与盐水处理的对照组相比，所有的处理都降低攻击后24小时的IL-6的 产生(图36)，且这种趋势持续至攻击后第13天。不幸的是，由于取样错误， App攻击后的13天中，盐水处理组的IL-6数据无法补救。，攻击13天后， 与氟尼辛处理的猪相比，用作为质粒或重组体的IL1-ra处理的猪的促炎细 胞因子IL-6的水平降低。
虽然抗炎细胞因子处理可导致循环中促炎细胞因子水平降低，且在一 些情况下改善生长，但促炎细胞因子与生长受损之间的关系仍不清楚。通 常，其中猪的促炎细胞因子水平降低的组是在攻击后第一周还具有最小生 长抑制作用的组。需要进一步的工作来阐明在这种攻击模型下猪的重量损 失的机理。
除了改善猪的生长之外，我们发现细胞因子处理可以改善暴露于App 攻击的猪的健康。图37的数据表明在攻击第一周期间进行的30次观察的 平均临床得分。各头猪表现的症状严重程度，例如嗜睡、咳嗽和呼吸参数 得分为0-8，而死亡或安乐死的猪在后来各次观察中的得分规定为8。与盐 水处理的对照组相比，用重组IL-1ra处理的猪的临床病症显著减少(p＜0.05， 图37)。与盐水和质粒对照组相比，作为质粒递送的IL-1ra还导致临床症状 减少。在所有处理组中，用盐水或氟尼辛处理的猪表现出最多的App临床 病症。
与用盐水处理的猪相比，作为重组体递送的IL-1ra导致临床症状的存 在减少72％(图38)。与盐水处理的对照组相比，以质粒形式递送的IL-1ra 导致减少52％，且与质料处理的对照组相比减少31％(图38)。作为质粒或 重组体递送的IL-1ra比氟尼辛更有效地减少App感染的临床症状。
在试验结束时，使猪安乐死，并取出肺以进行死后检查。对肺的胸膜 炎评分为0-5(图39和40)，且胸膜肺炎程度的确定通过对受影响的肺进行 称重，并表示为总肺重的百分率(图41和42)。用氟尼辛和IL-1ra处理的猪 比盐水对照组具有较轻的胸膜炎(图39)。虽然用作为质粒递送的IL-1ra处理 的猪的胸膜炎比质粒处理的对照组轻，它们的胸膜炎水平相当于盐水处理 的对照组(图39)。与盐水处理的对照组相比，重组IL-1ra将胸膜炎水平降低 22％，而氟尼辛处理将胸膜炎减轻55.6％(图40)。作为质粒递送的IL-1ra 与盐水处理的对照组相比将胸膜炎减轻5.6％，与质粒对照组相比减轻 39.3％(图40)。
与盐水处理的对照组相比，用氟尼辛或重组IL-1ra处理的猪中，App 损伤影响的肺的百分率大大降低(图41)。盐水对照组和质粒对照组具有类似 水平的损伤影响的肺。与盐水和质粒对照组相比，IL-1ra质粒减少App损 伤影响的肺的百分率，但质粒IL-1ra损害App疾病病理的能力不如作为重 组体递送的IL-1ra或氟尼辛明显(图41)。这些结果反映，与盐水处理的对照 组相比，IL-1ra使受影响的肺质量减小73.9％，氟尼辛使之64.1％，质粒IL-1ra 使之36.7％(图42)。
结论
1).与盐水处理的对照组相比，在App攻击的第一周期间重组IL-1ra 能够大大增加猪的生长。攻击2周后，在实验结束时用IL-1ra处理的猪因 此比盐水处理的对照重4kg，这代表生长改善69％。用氟尼辛处理的猪在2 周的攻击期间具有最低的生长。
2).重组IL-1ra、质粒对照和质粒IL-1ra能够降低与不良生长性能有关 的促炎细胞因子TNFα和IL-6的产生。氟尼辛仅能降低IL-6的产生。
3).IL-1ra大大降低攻击期间临床病症的严重程度，作为质粒递送的 IL-1ra也如此。与盐水处理相比，重组IL-1ra将临床症状减少72％，而质粒 IL-1ra将临床症状减少52％。
4).氟尼辛能够降低死后所见的胸膜炎水平。与盐水处理相比，IL-1ra 将胸膜炎减少22％。
5).氟尼辛、IL-1ra和质粒IL-1ra都降低App损伤影响的肺的百分率。 用重组或质粒IL-1ra的处理分别导致App影响的肺的质量减小74％和37％。
6).用IL-1ra处理的猪改善暴露于App攻击的猪的健康和生产力。
7).重组IL-1ra的递送比质粒IL-1ra的递送更为有效。
实施例6
以低和高剂量并与IL-4联用来预防性递送重组IL-1RA的，用于改善被 胸膜肺炎放线杆菌感染的猪的健康和生长
此实施例的目的是确定在炎性肺病原体，胸膜肺炎放线杆菌(App)感染 的猪体内增加IL-1ra的剂量是否能够对改善生长和减轻病理产生更大的影 响。而且，另一目的是确定IL-1ra是否能够与另一种抗炎细胞因子IL-4协 同作用，以增强细胞因子处理对App感染的猪的生长和病理的有益效果。
实验设计
将平均初始重量为56kg的雄性猪分配到表8所述的5个处理组中。在 组畜圈中饲养猪，且每个畜圈包含来自每个处理组的动物；无限制地提供 丸状饲料和水。各处理组和畜圈的初始重量在开始试验前相同。
在耳后经皮下注射以2ml剂量施用重组IL-1ra、IL-4和盐水。因此，协 同组的猪接受1剂量的IL-1ra和1剂量的IL-4。在用App攻击前24小时、 攻击时和攻击后24小时用IL-1ra、IL-1ra+IL-4或盐水处理猪。在第0天麻 醉猪并用7.5×105pfu进行气管内感染。
在自攻击-24小时、+0小时、+24小时和+3周通过静脉穿刺从猪中取 血样。如前述分析血液的免疫学参数。在第-1天、第10天和第3周将猪称 重。
表8
细胞因子实验(N＝8)中所应用的处理和剂量所述实验用于评价不同剂量 的IL-1RA和IL-1RA+IL-4作为胸膜肺炎放线杆菌感染的预防性处理的效力 处理 处理剂量 盐水 2ml IL-1ra低 2μg/kg IL-1ra高 10/kg 协同低 2μg/kg IL-4+2μg/kg IL-1ra 协同高 10μg/kg IL-4+10μg/kg IL-1ra
结果
与实施例5不同的是，用盐水处理的动物在用App攻击的早期没有经 历重量损失(比较图30和图43)。尽管出现这种结果，在用高剂量IL-1ra处 理的猪中看到生长改善(图43)，相当于增重率增加到超过100g/天。共同应 用IL-1ra和IL-4以研究协同作用，这导致与盐水处理的猪相比在App攻击 的前10天期间生长反应受到抑制。组内差异是高的，因此在这种情况下误 差范围(bar)较大并缺少统计学显著性。但是，在实施例5中所见的IL-1ra 改善体重增加的趋势在此实验中可重复。
在攻击的最后10天，用低剂量的IL-1ra或或低剂量的IL 1ra+IL-4处理 的猪分别表现出最大的增重率(图44)，即分别为1250g/天和1306g/天，耳 盐水处理的对照组为1079g/天。用高剂量IL-1ra处理的猪增加1170g/天， 高于盐水处理组的增重率。该高协同剂量导致App攻击后期的增重较低。
用低或高剂量的IL-1ra和低剂量的IL-1ra+IL-4处理的猪显示比盐水处 理的对照组更高的增重(图45)。在攻击期的21天中，用低和高剂量的IL-1ra 处理的猪或低剂量的协同处理的猪分别增加17.9kg和17kg，而盐水处理的 对照组仅增加15.75kg(图45)。因此，与盐水处理的对照组相比，用IL-1ra 或低剂量的IL-1ra+IL-4进行的处理使生长分别改善13.5％和7.9％(图46)。
如实施例5看出，用重组IL-1ra处理猪导致疾病严重程度降低，如在 死后病理结果中记录的那样(图39、40、41和42)。在目前的实施例中，应 用高剂量的IL-1ra降低受App损害影响的肺的量(图47)。类似地，与盐水 处理相比，递送低剂量IL-1ra和IL-4组合物降低受影响的肺的重量。高剂 量的IL-1ra和高剂量的协同处理降低死后所见的胸膜炎的程度(图48)。
与其它处理相比，高剂量IL-1ra和IL-1ra+IL-4处理大大降低促炎细胞 因子IL-8的产量(图49)。IL-8将嗜中性粒细胞募集到肺，而随后的嗜中性 粒细胞脱粒被怀疑是App感染病理的主要因素。因此，肺组织中IL-8水平 降低可能导致暴露于App感染的猪的病理减轻和健康改善。类似地，通过 用高剂量的IL-1ra或低剂量的IL-1ra+IL-4处理，可抑制肺组织中的另一种 促炎细胞因子TNFα的产生(图50)。这些结果表明，App攻击条件下，抗 炎机理可能在这些处理对猪的生长和健康的有益效果中起作用。
结论
1).高剂量的IL-1ra改善攻击早期的生长，而低或高剂量的IL-1ra和低 剂量的IL-1ra+IL-4改善攻击后期的生长。
2).低或高剂量的IL-1ra以及低剂量的IL-1ra+IL-4导致整个攻击期的 体重增加提高。
3).高剂量IL-1ra和低剂量IL-1ra+IL-4减少App损害影响的肺的数量。 高剂量的IL-1ra和IL-1ra+IL-4降低胸膜炎得分。
4).高剂量的IL-1ra和IL-1ra+IL-4具有抗炎效果，这由肺组织中促炎细 胞因子产生减少显示。
5).高剂量的IL-1ra明显降低肺中与病理有关的IL-8的产生。
6).这些结果支持实施例5的结果，起发现在App感染之前或之时给予 IL-1ra治疗改善生长并减少病理。
实施例7
治疗性递送低和高剂量的重组IL-1RA，以改善胸膜肺炎放线杆菌感染 的猪的健康和生长
此实施例的目的在于确定胸膜肺炎放线杆菌(App)感染建立之后IL-1ra 的治疗递送是否能够消除感染并改善猪的生长。
实验设计
将平均初始重量为34.6kg的雄性猪分配至4个每组有9头猪的处理组。 处理为盐水、2μg/天的IL-1ra、10μg/天的IL-1ra和速解灵(Excenel)，目前 App感染的临床处理。将3头猪圈养在一个个畜栏中，且各畜圈有3个复 制品。给猪任意提供丸状饲料和水。各处理组和各畜圈的初始重量在开始 试验前相等。
将猪麻醉，并在第0天用7.5×105pfu进行气管内感染。将重组IL-1ra 和盐水以2ml的剂量，在耳后经皮下给予。根据制造商的说明将速解灵施 用于猪。在用App攻击后24小时、48小时和1周时用IL-1ra、盐水或速解 灵处理猪。
在感染后第0小时、24小时、48小时、1周和2周通过静脉穿刺从猪 中取血样。如前述分析血液的免疫学参数。在攻击前当天以及攻击后第6 天和第13天将猪称重。
结果
在App攻击后的第二周平均重量增加，如图51所示，这表明用低剂量 的IL-1ra处理的猪比其它处理组增加更多的重量。用低剂量IL-1ra处理的 猪在攻击的第2周平均增加5.7kg，相比之下盐水处理的对照组增重4.4kg， 而抗生素处理增加4.9kg(图51)。
而且，与盐水处理相比，IL-1ra处理和用抗生素速解灵处理均可降低日 饲料摄入(图52)。用低和高剂量IL-1ra处理的猪分别消耗1.7和1.8kg饲料 每天，用速解灵处理的猪消耗2kg，而用盐水处理的猪消耗2.2kg。
改善增重和降低饲料摄入的联合效果导致与盐水对照组相比，用低剂 量IL-1ra处理的猪其饲料转化率改善(FCR，饲料：增重)(图53)。IL-1ra处理 将FCR降低1.6，相比之下盐水处理的FCR为2.1。
在被杀死的App存在下，用低剂量IL-1ra处理的猪趋于增强淋巴细胞 的增殖反应(图54)。淋巴细胞扩增试验测定淋巴细胞对具体抗原反应的能 力。在这种情况下，抗原与感染物同源，因此体外高度增殖性反应表明体 内对App病原体的识别和抗御该病原体的动员(mobilization)增强。淋巴细胞 增殖反应所见的趋势与FCR一致——对杀死的App产生最强体外反应的猪 还具有最大的饲料效率，这由FCR减小可证明。因此，IL-1ra可以通过增 强特定的免疫反应性来改善饲料效率和增重。
与其它处理相比，对App感染的猪治疗性递送低剂量的IL-1ra还降低 肺组织中促炎细胞因子IL-8的产生(图55)。与盐水处理的对照组相比，低 剂量的IL-1ra和速解灵处理也降低尾纵隔淋巴结中IL-8的产生，所述淋巴 结引流肺(图56)。而且，这些结果表明IL-1ra调节保护性免疫反应和有害的 炎性反应，从而可以有助于改善App感染的猪的增重和饲料转化率。
结论
1).与抗生素或盐水处理相比，治疗性应用低剂量的IL-1ra改善App感 染的猪的重量增加。
2).与其它处理相比，治疗性施用IL-1ra降低饲料摄入。
3).IL-1ra的治疗性施用大大改善App感染的猪的饲料效率。
4).治疗性递送IL-1ra到App感染的猪中导致细胞免疫反应增强，同时 减轻炎性反应。
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