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线粒体通透性转换孔大小的数学模式测定法

阅读:1025发布:2020-10-13

专利汇可以提供线粒体通透性转换孔大小的数学模式测定法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及线粒体通透性转换孔大小测量,确切说是线粒体通透性转换孔大小的数学模式测定方法。本发明建立线粒体体积改变的数学模型,将实验室常用的仪器分光光度仪测定的吸光光度值代入数学模型,经过一系列计算得到模型参数t1/2,从而间接定量反映mPTP的大小。该方法能够简便、准确的测量出mPTP的大小。,下面是线粒体通透性转换孔大小的数学模式测定法专利的具体信息内容。

1.一种线粒体通透性转换孔大小的数学模式测定法,包括数学模型的建立、测试所用的封堵溶液和测试溶液液配方以及根据该数学模型建立的t1/2参数计算表,具体内容如下数学模型:
等式左边表示线粒体体积变化率,kp表示体积变化速率常数,VT表示线粒体膨胀所能达到的最大体积,Vt表示t时刻线粒体体积。方程①整体表示:线粒体体积变化率与线粒体体积变化能(VT-Vt)成正比。
封堵溶液及测试溶液配方表:
表1实验溶液配方表
溶液名称 成份
封堵溶液 0.25M Dextran6000、5mM Tris-Mops pH=7.4、0.2mM EGTA-Tris、10μM Rotenone
测 试 溶 液 0.25M Sucrose、5mM Tris-Mops pH =7.4、0.2mM EGTA-Tris、10μM Rotenone
t1/2参数计算表:
表2 t1/2计算表
注:AT=A30
2.按照权利要求1所建立的数学模型理论依据是:线粒体体积变化规律是线粒体体积变化率与线粒体体积变化能成正比,是根据线粒体体积变化推导mPTP大小。
3.按照权利要求1所述的封堵溶液配方是0.25M右旋糖酐6000、5mM Tris-Mops pH=
7.4、0.2mM EGTA-Tris、10μM鱼藤
4.按照权利要求1所述的测试溶液配方是0.25M蔗糖、5mM Tris-Mops pH=7.4、
0.2mMEGTA-Tris、10μM鱼藤酮。
5.按照权利要求1所述的计算t1/2基本测量数据是分光光度仪测得的OD值,OD值通过数学模型拟合,得到曲线方程,最后经过一系列计算才得到t1/2。

说明书全文

线粒体通透性转换孔大小的数学模式测定法

技术领域

[0001] 本发明涉及线粒体通透性转换孔大小测量,确切说是线粒体通透性转换孔大小的数学模式测定方法。

背景技术

[0002] 线粒体膜(特别是线粒体内膜)通常具有严格的紧闭性,仅限于质子等透过,对分子量大于1500Da的分子不具有通透性。在缺血、缺等应激条件下,线粒体膜通透性发生病理改变,形成的病理孔道,允许分子量大于1500Da的物质自由通过线粒体内外膜,进入线粒体内。该变化被称为线粒体通透性转换,内外膜之间形成的孔道被称为线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)。目前尚不清楚mPTP的具体结构和组成,现有的技术手段很难测量其大小,只是应用形态学及分子生物学的方法,使用分光光度仪分别测量应激处理前后的线粒体悬浮液的吸光度,通过比较两者的吸光度似否有统计学差异,从而判断mPTP似否形成。但是,该方法不能定量描述mPTP大小,揭示mPTP开放的具体情况,所以有必要深入研究和开发mPTP大小测量的方法和技术。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于:找到一种方法,使得采用目前实验室测量mPTP的分光光度仪就能够方便、准确,定量测量mPTP的大小,从而解决目前mPTP大小无法定量测量的问题。
[0004] 本发明解决mPTP定量测量的技术方案是:mPTP形成后,大分子物质进入线粒体内,由于渗透作用,液体进入线粒体,从而引起线粒体膨胀。线粒体膨胀后,透光度增加造成光密度下降,OD值降低。根据上述分析建立方程如下:
[0005]
[0006] 等式左边表示线粒体体积变化率,kp表示体积变化速率常数,VT表示线粒体膨胀所能达到的最大体积,Vt表示t时刻线粒体体积。方程①整体表示:线粒体体积变化率与线粒体体积变化能(VT-Vt)成正比。
[0007] 方程①解得:
[0008]
[0009] 式②中VT、Vt不能直接测量得到,但根据Andrew等的研究,存在以下关系:
[0010]
[0011] V表示线粒体体积;b是常数,由使用的机器决定;参数β,也称为修正吸光度,满足:
[0012]
[0013] 其中P表示测试液中的线粒体含量、Ps表示测试液中线粒体的单位浓度,A表示吸光光度值,即OD值,a是由测试用分光光度仪决定的常数。
[0014] 将③、④式代入式②,得:
[0015]
[0016] 这样,就可以通过分光光度仪测量所得线粒体的OD值得到线粒体悬浮液的动态变化规律。t1/2表示线粒体体积膨胀至所能膨胀到的最大体积一半所需要的时间,满足:
[0017]
[0018] 将式⑥代入式②,得:
[0019]
[0020] 因此,如果使处理后的线粒体悬浮在具有相同溶质分子的溶液内(溶质分子量小于1500Da),该溶质分子就可以通过mPTP进入线粒体内,由于渗透作用,使线粒体体积扩大。也就可以用线粒体体积膨胀到所能膨胀到的最大体积一半所需要的时间(t1/2)定量描述mPTP。mPTP越大,溶质分子进入线粒体内的速率越快,t1/2越小;mPTP越小,t1/2越大,溶质分子进入线粒体内的速率越快,t1/2越小,所以,t1/2间接反映mPTP的大小。
[0021] 这样就可以用分光光度仪在不同时间点测量得到的OD值,计算出t1/2,从而定量刻画出mPTP的大小。

具体实施方式

[0022] 1.从处理过的标本中(确保有mPTP形成)提取线粒体;
[0023] 2.将提取出的线粒体按5mg线粒体蛋白/0.5ml封堵液(参见表1)的比例在室温下孵育30分钟;
[0024] 3.将孵育后的线粒体悬浮液按照0.3mg线粒体蛋白/2ml测试液(参见表1)比例加入mPTP测试液中,其间用磁搅拌器连续搅拌
[0025] 4.按照表2时间点分别测量混合溶液的At值(OD值),并记录
[0026] 5.根据式⑤计算出相应时间点的值
[0027] 6.根据式⑤,拟合得到kp值
[0028] 7.将得到的kp值代入式⑦中,解得t1/2
[0029] 表1实验溶液配方表
[0030] [0031] 溶液名称 成份
[0032] [0033] 封堵溶液 0.25M Dextran6000、5mM Tris-Mops pH=7.4、0.2mM EGTA-Tris、10μM Rotenone
[0034] 测试溶液 0.25M Sucrose、5mM Tris-Mops pH=7.4、0.2mM EGTA-Tris、10μM Rotenone
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