[0001] 本发明涉及益生菌分子。更具体地，在一些方面，本发明涉及益生菌分子、含有益生菌分子的组合物以及益生菌分子的各种方法和用途。

[0002] 一种由乳酸杆菌属产生的小型生物肽被证实对抑制肠出血性大肠杆菌感染有效[等，2009]。它被证明能影响并下调参与定殖和群体感应的大肠杆菌基因的转录，并能够阻止大肠杆菌黏附宿主上皮细胞[ 等，2009]。已证明该生物肽
影响大肠杆菌III型分泌系统(T3SS)，能够干扰群体感应(QS)信号传导系统并且因此导致毒力基因的下调[ 等，2007， 和Griffiths，2009]。

[0003] 国际专利申请公开号WO2009/155711公开了源自乳酸杆菌属、乳球菌属、链球菌属或双歧杆菌属益生菌的分离和表征分子，其用于治疗和/或预防有害病原菌(如沙门氏菌或大肠杆菌)感染的组合物和方法。分离的分子还可以用于为哺乳动物的胃肠道提供益生菌的营养或医药食品中。

[0004] 国际专利申请公开号WO2015/021530公开了源自益生菌的分子，其被提供用于治疗和/或预防病原性病毒感染的组合物和方法。分离的分子还可以用于为哺乳动物的胃肠道提供益生菌的营养或医药食品中。

[0005] 需要替代疗法来克服或减轻现有技术的至少一些缺陷，和/或提供有用的替代方法。附图说明

[0006] 通过参考以下附图说明，将进一步理解本发明，其中：

[0007] 图1显示了乳酸脱氢酶细胞毒性试验，为无细胞上清液抑制细胞毒性的剂量效应曲线。误差棒表示标准差。

[0008] 图2显示了乳酸脱氢酶细胞毒性试验，为无细胞上清液抑制细胞毒性的剂量效应曲线。误差棒表示标准差。

[0009] 根据一个方面，提供了一种预防和/或治疗受试者非肠道感染和/或减少受试者非肠道感染毒力的肽，所述肽得自益生菌。

[0010] 在一个方面，所述益生菌选自乳酸杆菌、乳球菌、链球菌、双歧杆菌、片球菌和它们的组合。

[0011] 在一个方面，所述乳酸杆菌选自嗜酸乳酸杆菌(La-5)、发酵乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)和植物乳酸杆菌。

[0012] 在一个方面，所述乳酸杆菌是乳酸乳球菌。

[0013] 在一个方面，所述双歧杆菌选自长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和原乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium crudilactis)以及它们的混合物。

[0014] 在一个方面，所述链球菌是嗜热链球菌。

[0015] 在一个方面，所述肽对抑制感染有效，所述感染选自尿路感染、阴道感染、呼吸道感染、胃部感染、形成生物膜的感染、乳腺炎、皮肤感染和口腔感染。

[0016] 在一个方面，所述肽对抑制如下菌有效：大肠杆菌，UPEC，流感嗜血杆菌，化脓性链球菌，肺炎链球菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，幽门螺杆菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，牙龈卟啉单胞菌，中间普氏菌(Prevotella intermedia)，腐生链球菌，克雷比萨菌(Klebiessa)，肠杆菌，奇异变形杆菌(Proteus mirabillis)，肠球菌(Enterococci)，梭菌(Clostridium)，克雷伯氏菌(Klebsiella)或变形杆菌(Proteus)。

[0017] 在一个方面，所述肽对抑制生物膜有效。

[0018] 在一个方面，所述肽进一步与抗病毒剂，糖源，可食用食品，营养补充剂和可摄入液体中的一种或多种组合。

[0019] 在一个方面，所述肽浓缩自无细胞上清液或其级分。

[0020] 在一个方面，所述肽以干燥的培养物级分提供，如冻干或喷雾干燥。

[0021] 在一个方面，所述干燥培养物级分是无细胞上清液。

[0022] 在一个方面，所述肽包括选自如下的序列或由选自如下的序列构成：YPVEPF,YPPGGP,YPPG,NQPY和它们的组合。

[0023] 在一个方面，所述肽包括序列YPPGGP或由序列YPPGGP构成。

[0024] 根据一个方面，提供了一种含有本发明所述的肽的组合物。

[0025] 在一个方面，所述组合物是食品、饮品、保健品、药剂或营养补充剂。

[0026] 在一个方面，所述组合物含有产生所述肽的活益生菌。

[0027] 在一个方面，所述组合物含有除产生所述肽的细菌以外的活益生菌。

[0028] 在一个方面，组合物中的所述肽是纯化的。

[0029] 根据一个方面，提供了一种治疗和/或预防受试者非肠道感染和/或减少受试者非肠道感染毒力的方法，所述方法包括将本发明所述的肽或组合物施用于有需要的受试者。

[0030] 在一个方面，所述非肠道感染选自尿路感染、阴道感染、呼吸道感染、胃部感染、形成生物膜的感染、乳腺炎、皮肤感染和口腔感染。

[0031] 在一个方面，所述非肠道感染由选自如下的菌种引起：大肠杆菌，UPEC，流感嗜血杆菌，化脓性链球菌，肺炎链球菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，幽门螺杆菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，牙龈卟啉单胞菌，中间普氏菌，腐生链球菌，克雷比萨菌，肠杆菌，奇异变形杆菌，肠球菌，梭菌，克雷伯氏菌或变形杆菌。

[0032] 根据一个方面，本发明提供了一种减少抗生素耐药性的方法，包括将本发明所述的肽施用于有需要的受试者。

[0033] 在一个方面，所述方法用于减少MRS(耐甲氧西林葡萄球菌)的抗生素耐药性。

[0034] 根据一个方面，本发明提供了一种抑制耐甲氧西林葡萄球菌MRS的方法，包括将本发明所述的肽施用于有需要的受试者。

[0035] 根据一个方面，本发明提供了一种预防或干扰和/或穿透生物膜的方法，包括施用本发明所述的肽。

[0036] 根据一个方面，本发明提供了一种治疗伤口的方法，包括施用本发明所述的肽。

[0037] 根据一个方面，本发明提供了一种减少非肠道病原体对受试者组织黏附的方法，包括施用本发明所述的肽。

[0038] 根据一个方面，本发明提供了一种包含本发明所述肽的惰性物体。

[0039] 在一个方面，所述惰性物体是包含益生菌分子的支架、导管或伤口敷料，益生菌分子在一段时间里从物体中释放。

[0040] 通过以下的具体实施方式，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，仅以举例说明的方式给出了用于说明本发明实施方式的具体实施方式和具体实施例，根据具体实施方式，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对本领域技术人员将变得显而易见。

[0041] 已描述了将益生菌分子用于治疗胃肠道感染。不希望受到理论的束缚，相信国际专利申请公开号WO2009/155711和WO2015/021530公开的分子干扰III型分泌系统(T3SS)病原体的群体感应(QS)系统，并且先前的研究表明，益生菌分子可以下调多种肠道病原体的毒力基因。嗜酸乳杆菌菌株的无细胞提取物能够干扰艰难梭菌的群体感应，并且能够下调艰难梭菌毒力基因[Yun等，2014]。乳酸杆菌和双歧杆菌菌株的无细胞提取物抑制空肠弯曲杆菌的生长并下调flaA σ28启动子，并且能够下调空肠弯曲杆菌中ciaB和flaA基因的表达[Ding等，2005，Mundi等，2013]。还发现，乳酸杆菌产生的益生菌分子会影响沙门氏菌的毒力，并且显示出主要针对参与T3SS的毒力基因[Sharma 2014]。2015年进行的现场试验对断奶仔猪体内的益生菌分子进行了测试，结果发现益生菌分子对降低腹泻的严重程度和减少腹泻的病例具有显著作用[圭尔夫大学/MicroSintesis，2015]。

[0042] 现已发现，这种作用模式还有效下调了在其它类型病原体和感染中(而不仅仅是肠道病原体中)受群体感应调节的毒力基因的作用。此外，这些肽在一些方面能够至少部分克服耐药性，在其它方面能够降低耐药性，在其它方面，能够治疗和/或预防和/或减少由耐药细菌引起的感染的毒力，并且在其它方面，能够增强抗生素对细菌和/或耐药细菌的作用。

[0043] 定义

[0044] 除非另有定义，否则本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。例如，参考Singleton等，微生物学与分子生物学词典第二版，J.Wiley和Sons(纽约，纽约州，1994)；Sambrook等，分子克隆-实验室手册，冷泉港出版社(冷泉港，纽约州，1989)，它们中的每个通过引用并入本发明。为了本发明的目的，以下术语定义如下：

[0045] “来源于”是指益生菌分子由益生菌直接或间接产生。例如，益生菌可以将益生菌分子直接分泌到培养基中。在其它方面，所述分子可以在培养基中间接形成，例如，由更长的肽裂解得到。

[0046] 本发明中所述的序列的“变体”是指生物活性序列，其具有通过在亲本序列中一个或多个氨基酸的插入、缺失、修饰和/或取代，而不同于天然或野生型序列的肽序列。这些变体通常与天然序列具有小于100％的序列同一性。然而，通常，生物活性变体具有与相应天然存在的序列至少约70％序列同一性的氨基酸序列，通常至少约75％，更通常至少约80％的序列同一性，甚至更通常至少约85％的序列同一性，甚至更通常至少约90％，甚至更通常至少约95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。任何长度的变体核苷酸片段保留相应天然序列的生物学活性。变体还包括在天然序列的任一末端或内部添加一个或多个氨基酸的序列。变体还包括许多氨基酸被缺失并且任选地被一个或多个不同的氨基酸取代的序列。

[0047] “序列同一性百分比”在本文中被定义为在比对序列和引入空位(introducing gaps)(视需要获得最大的序列同一性百分比，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分)后，候选序列中与目标序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。候选序列中的5'，3'或内部延伸，缺失或插入均不得解释为影响序列同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是本领域众所周知的，例如，“BLAST”。

[0048] 出于本文目的，“活性的”或"活性"指的是天然的或天然存在的益生菌分子的生物学活性，其中“生物学”活性是指由天然或天然存在的益生菌分子引起的生物学功能(抑制或刺激)。

[0049] 因此，当与本发明所述的益生菌分子结合使用时，“生物学活性的”或“生物学活性”是指显示出或享有天然益生菌分子或序列的效应子功能的益生菌分子或氨基酸序列。例如，本发明所述的益生菌分子具有预防、抑制或治疗动物感染的生物学活性。

[0050] 当与变体序列结合使用时，“生物学活性的”或“生物学活性”是指变体序列显示出或享有亲本序列的效应子功能。与亲本序列相比，变体序列的生物学活性可以增加、降低或处于相同水平。

[0051] “分离的”是指已经从其来源纯化或通过重组或合成方法制备并纯化的分子。纯化的益生菌分子基本上不含其它氨基酸。

[0052] 本发明中的“基本上不含”是指其它来源氨基酸的污染小于约5％，通常小于约2％，更通常小于约1％，甚至更通常小于约0.5％，最通常小于约0.1％。"基本上纯的"益生菌分子组合物指的是基于组合物的总重量，包括至少约90重量％、通常至少约95重量％的益生菌分子的组合物，基于组合物的总重量，更通常包括至少约90重量％，甚至更通常至少约95重量％核苷酸，更通常至少约99重量％核苷酸。

[0053] 如本文所用，“治疗”或“疗法”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。为了本发明所述的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于症状缓解，疾病程度减轻，疾病状态稳定(例如不恶化)，疾病进展延迟或减慢，疾病状态的改善或减轻，以及缓解(无论是部分缓解还是全部缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。"治疗"或“疗法”也是指与未接受治疗或疗法的预期生存期相比，生存期延长。因此，"治疗"或“疗法”是为了改变疾病病理学而进行的干预。具体地，治疗或疗法可以直接预防，减慢或减轻疾病或病症(例如感染)的病理，或可以使感染更易于受其它治疗剂的治疗或疗法的影响。

[0054] 术语“治疗有效量”，“有效量”或“足够量”是指当施用于受试者(包括哺乳动物，例如人)时足以达到预期结果(例如，对治疗感染有效的量)的量，例如有效治疗感染的量。本发明所述的益生菌分子的有效量可能会根据受试者的疾病状态，年龄，性别和体重等因素而变化。如技术人员所理解的，可以调整剂量或治疗方案以提供最佳的治疗反应。

[0055] 此外，具有治疗有效量的受试者的治疗方案可以由单次给药组成，或替代地包括一系列应用。治疗周期的长短取决于多种因素，如疾病的严重程度和/或部位，受试者的年龄，药剂的浓度，患者对药剂的反应性或它们的组合。还应当理解，用于治疗的药剂的有效剂量可以在特定治疗方案的过程中增加或减少。通过本领域已知的标准诊断测定法可以使剂量变化产生并且变得明显。在一些方面，本发明所述的益生菌分子可以在针对有疑问的所述疾病或病症(例如感染)的常规疗法的治疗之前、期间或之后施用。

[0056] 本发明所用的术语“受试者”是指动物界的任何成员，包括鸟类，鱼类，无脊椎动物，两栖动物，哺乳动物和爬行动物。通常，受试者是人类或非人类脊椎动物。非人类脊椎动物包括家畜，伴侣动物和实验动物。非人类受试者还具体包括非人类灵长类动物以及啮齿动物。非人类受试者还具体包括但不限于家禽，鸡，马，牛，猪，山羊，狗，猫，豚鼠，仓鼠，貂，兔子，甲壳动物和软体动物。通常受试者是家禽或哺乳动物。术语“哺乳动物”是指被归类为哺乳动物的任何动物，包括人类，其它高等灵长类动物，家畜和农场动物，以及动物园动物、竞赛动物和宠物，如犬，猫，牛，马，绵羊，猪，山羊，兔子等。通常，哺乳动物是人类。

[0057] 与一种或多种其它治疗剂“组合”施用包括同时(并发)和以任何顺序连续施用。

[0058] 术语“药学上可接受的”是指该化合物或化合物的组合与药用制剂中的其余成分相容，并且根据既定的政府标准(包括美国食品药品管理局颁布的标准)，对人类给药通常是安全的。

[0059] 本发明所用的“载体”包括药学上可接受的载体，赋形剂或稳定剂，其在所采用的剂量和浓度下对暴露于其上的细胞或受试者无毒。药学上可接受的载体通常是pH缓冲水溶液。药学上可接受的载体的例子包括缓冲剂如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，双糖和其它碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖和糊精；螯合剂如EDT；糖醇如甘露糖醇和山梨糖醇；成盐反离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM，聚乙二醇(PEG)以及PLURONICSTM。

[0060] "脂质体"是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，其可用于将试剂，如本发明所述的益生菌分子输送给受试者例如哺乳动物。脂质体的组分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列方式。

[0061] 在理解本申请的范围时，冠词“一(a)”、“一(an)”、“该”、“所述”旨在表示存在一个或多个元件。另外本发明所用的术语“包含”及其派生词是开放式术语，其限定所述特征、元件、成分、群、组和/或步骤存在，但不排除存在其它未声明的特征、元件、成分、群、组和/或步骤。前述内容还适用于具有类似含义的词，例如术语“包括”、“具有”和它们的派生词。

[0062] 应当理解，被描述为“包含”某些成分的任何方面也可以为“由…组成”或“基本上由…组成”，其中“由…组成”具有封闭式或限制性含义，并且“基本上由…组成”是指包括指定的成分，但除了如下成分以外排除其它成分：以杂质存在的材料，作为用于提供成分的工艺的结果而不可避免存在的材料，以及为了实现本发明的技术效果以外的目的而添加的成分。例如，使用短语“基本上由...组成”定义的组合物包括任何已知的药学上可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载体等。通常，基本上由一组成分组成的组合物包括小于5重量％，通常小于3重量％，更通常小于1重量％的非特定成分。

[0063] 应当理解，可以通过附带条件或否定限制的方式将本文中定义为包括的任何组成部分明确地排除在要求保护的发明之外。例如，在一些方面，肠道感染，例如肠道细菌和/或肠道病毒感染，明确地从本发明所述的组合物和方法中排除。在其他方面，本发明所述的分子不是细菌素。

[0064] 此外，无论是否明确说明，本文给出的所有范围都包括范围的末端以及任何中间范围点。

[0065] 最后，本发明所用的程度术语如“基本上”、“大约”和“约”是指修饰词的合理偏离量，使得最终结果不会显著变化。这些术语的程度应解释为包括修饰词至少±5％的偏差(如果该偏差不会否定其修饰词的含义)。

[0066] 益生菌分子和包含益生菌分子的组合物

[0067] 本发明提供了从益生菌和细菌的其他培养物级分(例如无细胞上清液)中分离出的益生菌分子，该益生菌分子可以最小化抑制治疗和/或预防受试者的感染，通常是非肠道感染。特别地，所述分子可以得自一种或多种细菌菌种，所述细菌菌种选自气球菌属(the genera Aerococcus)，芽孢杆菌属，拟杆菌属，双歧杆菌属，梭状芽孢杆菌属，肠球菌属，镰刀菌属，乳酸杆菌属，乳球菌属，明串珠菌属，蜜蜂球菌属，微球菌属，片球菌属，消化链球菌属，丙酸杆菌属，葡萄球菌属，链球菌属和魏斯氏菌属(Weissella)。特定的益生菌活性的乳酸菌种包括粪肠球菌，屎肠球菌，嗜酸乳酸杆菌，食品乳酸杆菌，干酪乳酸杆菌代田株(Lactobacillus casei Shirota)，干酪乳酸杆菌副干酪亚种，干酪乳酸杆菌干酪亚种，干酪乳酸杆菌，卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)，弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus curvatus)，德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbruckii subsp.lactis)，德氏乳酸杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)，香肠乳酸杆菌(Lactobacillus farciminus)，发酵乳酸杆菌，格氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)，瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)，约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)，副干酪乳酸杆菌副干酪亚种，鼠李糖乳酸杆菌，植物乳酸杆菌，罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)，鼠李糖乳酸杆菌，清酒乳酸杆菌(Lactobacillus sake)，乳酸乳球菌，乳酸乳球菌乳脂亚种，肠链球菌，粪链球菌，唾液链球菌和嗜热链球菌。其他的实例包括具有益生菌活性的双歧杆菌菌种，包括婴儿双歧杆菌，青春双歧杆菌，两歧双歧杆菌，长双歧杆菌，乳双歧杆菌，动物双歧杆菌和短双歧杆菌。

[0068] 其它细菌菌种可以选自具有益生菌活性的灿烂类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)，凝结芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，变异微球菌(Micrococcus varians)，乳酸片球菌，戊糖片球菌，乳酸片球菌，嗜盐片球菌，肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌，以及欧洲专利公开号0576780公开的微生物菌株干酪乳酸杆菌鼠李糖亚种LC-705，DSM7061，美国专利公开号US 5908646公开的鼠李糖乳酸杆菌LC-705、DSM7061，其单独或与丙酸杆菌属的细菌或其它干酪乳酸杆菌菌株结合。

[0069] 在一些方面，可产生本发明所述分子的特定益生菌菌株选自如下菌株：动物双歧杆菌DSM15954株，长双歧杆菌婴儿亚种DSM15953株，长双歧杆菌长亚种DSM15955株，粪肠球菌DSM15958株，嗜酸乳酸杆菌DSM13241(La-5)株，德氏乳酸杆菌保加利亚亚种DSM15956株，瑞士乳酸杆菌DSM14998株，瑞士乳酸杆菌DSM14997株，乳酸乳球菌DSM14797株，嗜热链球菌DSM15957株，发酵乳酸杆菌ATCC55845株和鼠李糖乳酸杆菌ATCC55826株。

[0070] 在代表性的方面，所述分子得自嗜酸乳酸杆菌(La-5)，以及来自片球菌菌株，双歧杆菌菌株例如但不限于长双歧杆菌，两歧双歧杆菌，婴儿双歧杆菌和原乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium crudilactis)，并且也可以来自发酵乳酸杆菌，鼠李糖乳酸杆菌，瑞士乳酸杆菌，植物乳酸杆菌，乳酸乳球菌和嗜热链球菌。

[0071] 现已证明，所述益生菌分子对抑制非肠道病原体是有效的，并且已鉴定出可以有效对抗肠道和非肠道病原体的新型分子。本发明所述的益生菌分子包括国际专利申请公开号WO2009/155711和WO2015/021530中公开的分子，它们各自通过引用整体并入本文。

[0072] 在一些方面，所述益生菌分子为小分子，通常为蛋白质分子，具有耐热性(可以被加热，冷冻和解冻，并且仍表现出活性)，并在长时间冷冻下保持稳定(超过两年)，可以容易地大体积生产(例如约2mg/L)，并且可以通过冻干和/或喷雾干燥等方法进行干燥。通常，所述分子是肽。

[0073] 所述分子可以掺入到多种物质中，以施用给受试者例如任何种类的动物和人类。例如，所述分子可以掺入用于动物或人类消费的任何类型的食品、营养补充剂或饮料中。

[0074] 作为治疗，本发明所述的益生菌分子可以以某种方式施用于动物或人类，从而有效治疗感染。作为治疗或预防，所述治疗可以根据需要与其他疗法联合使用。在另一个实施方式中，除了使用全部益生菌(whole probiotic bacteria)，本发明所述的益生菌分子还可用于组合物和方法中。或者，整个益生菌可以单独使用，前提是要培养和/或使用细菌，使分子在培养基中产生，达到治疗有效量。

[0075] 在一些方面，所述益生菌分子来源于益生菌，例如来源于嗜酸乳酸杆菌(La-5)，其中所述分子包含以下一个或多个氨基酸序列：YPVEPF、YPPGGP、YPPG和NQPY。通常，所述分子含有以下氨基酸序列：YPPGGP。本领域技术人员应当理解，只要不显著降低分子的活性，可以通过缺失，替换或插入来改变这些序列。

[0076] 所述序列可以进一步插入，替换或缺失一个或多个氨基酸残基。此外，本发明所述的分子可以进一步被糖基化，去糖基化，有机和无机盐以及共价修饰改变。还包括被修饰(例如聚乙二醇化)以增加体内半衰期的分子。本发明所述分子的可能但非限制性的修饰包括如下修改：氨基酸替换与一个或多个氨基酸的缺失或一个或多个氨基酸的添加的组合。

[0077] 在广义的方面，本发明所述的分子可以以治疗有效量单独或在组合物中的形式提供，并且可以根据诸如感染状态/健康，接受者的年龄，性别和体重等因素而变化的量提供。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应，并且可以由主治医师或兽医决定。例如，可以每天或以周期性间隔施用数个分开的剂量，和/或可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少剂量。用于给药的所述分子的量将取决于给药途径，给药时间，并且可以根据个体受试者的反应而变化。合适的给药途径是，例如通过局部，口服，直肠或肠胃外(例如静脉内，皮下或肌内)途径。另外，可以将分子掺入允许持续释放的聚合物中，将聚合物植入需要输送的位置附近，例如，在感染部位，或者聚合物可以植入如皮下或肌肉内，或在静脉内或腹膜内输送，从而使本发明所述分子在全身输送。

[0078] 本发明所述的分子可以以，例如片剂，胶囊剂，菱形锭剂(lozenge)，扁囊剂，溶液剂，混悬剂，乳剂，粉剂，气雾剂，栓剂，喷雾剂，锭剂，软膏，乳膏，糊剂，泡沫，凝胶，棉塞，阴道栓，颗粒，大丸剂，漱口水或透皮贴剂的形式给药。所述分子可以作为无细胞的上清液施用，在某些方面，其是无细胞的上清液浓缩物。该浓缩物可以是液体或粉末形式。

[0079] 所述制剂包括适于口服，直肠，鼻腔，吸入，局部(包括皮肤，透皮，颊和舌下)，阴道，肠胃外(包括皮下，肌内，静脉内，真皮内，眼内，气管内和硬膜外)，乳房内或吸入给药的那些。该制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过常规制药技术制备。这样的技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后，根据需要，将产品成型来制得制剂。

[0080] 适于口服给药的制剂可以以离散单位存在，例如胶囊，扁囊剂或片剂，每个离散单位都包含预定量的活性成分；也可以作为粉末或颗粒存在；也可以作为在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液存在；或者作为水包油型液体乳液或油包水型乳液等存在。

[0081] 片剂可以通过压制或模制制成，任选地与一种或多种辅助成分一起制成。压制片剂可以通过如下方式制备：在合适的机器中压制自由流动形式例如粉末或颗粒形式的本发明所述的分子，该分子任选地与粘合剂，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，表面活性剂和/或分散剂混合。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且可以被配制成其中的活性成分缓慢或受控释放。

[0082] 适于口腔内局部给药的制剂包括菱形锭剂，所述菱形锭剂包含调味基料中的成分，通常为蔗糖和金合欢树或黄芪胶；锭剂，其在惰性基质中包含活性成分，例如明胶和甘油，或蔗糖和金合欢树；以及漱口水，其含有以合适的液体载体给药的药物成分。

[0083] 适于皮肤局部给药的制剂可以软膏剂，乳膏剂，凝胶剂或糊剂的形式存在，其包含以药学上可接受的载体施用的成分。在一个实施方式中，局部递送系统是含有待施用成分的透皮贴剂。

[0084] 适于直肠给药的制剂可以以具有合适基质的栓剂的形式存在，基质包括如可可脂或水杨酸酯。

[0085] 其中载体是固体的适于鼻内给药的制剂，包括具有例如20至500微米范围内的粒度的粗粉，其通过将粉末容器靠近鼻子，经鼻道快速吸入来给药。其中载体为液体的作为用于鼻喷雾剂或滴鼻剂的用于给药的合适制剂，包括活性成分的水性或油性溶液。

[0086] 适于阴道给药的制剂可以以阴道栓剂，卫生棉条剂，乳霜剂，凝胶剂，糊剂，泡沫剂或喷雾制剂的形式存在，除活性成分外，还包含本领域已知的适当成分例如载体。

[0087] 适于吸入的制剂可以以薄雾剂，粉尘剂，粉末剂或喷雾制剂的形式存在。除活性成分外，还包括本领域已知的适当成分例如载体。

[0088] 适于胃肠外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，它们可能含有使制剂与预期接受者的血液等渗的抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，它们可能包括悬浮剂和增稠剂。适于胃肠外给药的制剂包括抗血管生成剂的颗粒制剂，包括但不限于低微米或纳米尺寸的颗粒(例如平均截面小于2000纳米，通常小于1000纳米，最通常小于500纳米)，该颗粒由本发明所述的分子单独构成或由本发明所述的分子与辅助成分组合构成或由在聚合物中的本发明所述的分子构成，用于缓释。制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并可以保存在冷冻干燥(冻干)的条件下，只需在使用前立即添加无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可以由上述种类的无菌粉末，颗粒和片剂制备。

[0089] 含有本发明所述的分子的组合物可以含有按重量计约0.00001％至约99％及其之间的任何范围的活性物质。例如，代表性的剂量可以为每300mg剂量包含约0.1μg至约100μg本文所述的分子，例如每300mg剂量包含约0.5μg，约1μg，约2μg，约3μg，约4μg，约5μg，约6μg，约7μg，约8μg，约9μg，约10μg，约25μg，约50μg或约75μg本文所述的分子，例如每300mg剂量包含约0.1μg至约10μg，或约1μg至约5μg，或约1μg至约2μg本文所述的分子(以及所有相关的增量和重量百分比)。

[0090] 所述益生菌分子可以在数小时，数天，数周或数月的时间内给药，具体取决于多种因素，包括所治疗感染的严重程度，是否考虑到感染的复发或预防感染等。给药可以是恒定的，例如在数小时，数天，数周，数月等时间内恒定输注。或者，给药可以是间断的，例如，分子可以在几天的时间内每天一次，在数小时的时间内每小时一次，或在认为合适的任何其它时间表内施用。

[0091] 本文所述的组合物可以通过本身已知的方法制备，所述方法用于制备可施用于受试者的药学上可接受的组合物，从而将有效量的活性物质与药学上可接受的媒介物混合在一起。"药物添加剂手册"(Michael和IreneAsh著，高尔出版公司，奥尔德肖特，英格兰(1995))记载了合适的媒介物。在此基础上，所述组合物包括但不限于与一种或多种药学上可接受的媒介物或稀释剂结合的物质溶液，并且可以包含在具有适当pH值的缓冲溶液中和/或与生理流体等渗。在这方面，可以参考美国专利号5,843,456(其全部内容通过引用并入本文)。

[0092] 药学上可接受的载体是本领域技术人员众所周知的，包括例如无菌盐水，乳糖，蔗糖，磷酸钙，明胶，糊精，琼脂，果胶，花生油，橄榄油，香油和水。此外，药物组合物可以包括一种或多种稳定剂，例如碳水化合物(包括山梨糖醇，甘露糖醇，淀粉，蔗糖，糊精和葡萄糖)，蛋白质如白蛋白或酪蛋白，以及缓冲液如碱性磷酸盐。

[0093] 在另一个非限制性方面，益生菌分子的施用可以通过任何可能将所述分子引入消化道的方法得到实现，例如口服或直肠给药，之后益生菌分子进入血液。产生益生菌分子和/或分离的益生菌分子的细菌可以与载体混合并应用于液体或固体饲料或饮用水。载体材料应对动物无毒。产生益生菌分子和/或分离的益生菌分子的细菌也可以配置成组合物，组合物以接种糊剂的形式提供，直接注入动物口中。该制剂可以包括添加的成分以改善适口性，改善保质期，赋予营养益处等。如果需要可再现的测量剂量，可以通过瘤胃套管施用分子，如本文所述。从益生菌中分离出来的待施用分子的量取决于影响疗效的因素。通过监测施用来自益生菌的益生菌分子之前、期间和之后的感染情况，本领域技术人员可以容易地确定减少动物携带感染量所需的剂量水平。来自益生菌的一种或多种菌株的分子可以一起施用。菌株的组合可能是有利的，因为对于个体动物，，在给定个体中，具有最强持久力的菌株可能不同。

[0094] 不论是预防还是治疗，施用益生菌分子的方法基本相同。因此，消除了首先确定动物是否正在携带病原体感染的需要。通过对畜群中的所有动物常规施用有效剂量，可以通过预防和治疗的结合大大降低或消除病原体感染的风险。

[0095] 本领域技术人员应当理解，分离的分子和包含该分子的培养物级分可以与已知的疗法结合使用，用于预防和/或治疗受试者的感染。还应当理解的是，本发明所述益生菌分子的组合物(无论是分离的还是在培养物级分中或与其他益生菌结合)，还可以与糖源(如葡萄糖)结合(配制)使用，其量占组合物重量的约0.01％至约0.1％或更多。

[0096] 还应理解，尽管本文所述的组合物可以作为添加剂与食品一起直接摄入或使用，但是应当理解，它们可以掺入各种食品和饮料中，包括但不限于酸奶，冰淇淋，奶酪，诸如面包，饼干和蛋糕的烘焙产品，乳制品和乳制品替代食品，糖果产品，食用油组合物，涂抹食品，早餐谷物，果汁，肉类，农产品等。在术语“食品”的范围内，应特别包括可能被分类为功能性食品的食品，即“在外观上与常规食品相似并且旨在作为正常饮食的一部分食用，但除了提供简单的营养素外，还被修改为具有生理作用的食品”。类似地，本文所述的组合物可以以剂型存在，例如以胶囊或干燥和压制的片剂或直肠或阴道栓剂的形式存在，或以气雾剂或吸入剂的形式存在。同样，活性益生菌分子的量将取决于特定的食品或饮料而变化，并且可以包含高达占产品的约100％的任何量，特别是当配制成可摄入的胶囊/片剂时。

[0097] 本领域技术人员还应理解，本发明所述的分子，无论是分离的还是作为培养物级分提供，都可以与治疗方法或营养补充中使用的益生菌相结合。在特定方面，本发明所述的分子可以与产生该分子的物种的活益生菌组合。在其它方面，这些细菌物种可以从组合物中排除。在其它方面，本发明所述的分子可以与不产生该分子的物种的活益生菌组合。

[0098] 使用方法

[0099] 出乎意料的是，已经发现本发明所述的益生菌分子，在肠道或非肠道感染方面，无论是以分离形式还是以产生益生菌分子的细菌形式施用，均可用于治疗感染，这些将在下文中具体描述。

[0100] 在特定方面，本发明所述的分子彼此和/或与抗生素或其它抗感染剂协同相互作用，用来治疗和/或预防肠道或非常道感染，和/或降低肠道和/或非肠道感染的毒力，包括减少抗生素耐药性和/或增加特定病原微生物对常规治疗(如抗生素)的敏感性。

[0101] 尿路感染

[0102] 尿路感染(UTI)是人类最常见的获得性细菌感染之一，其中大肠杆菌占所有UTI的90％，估计每年影响1,130万妇女[Marrs等，2005]。乳酸杆菌菌株在健康女性的阴道中占主导地位，该菌株从直肠和会阴传播，并在阴道中形成屏障，阻止尿路致病菌进入。通过益生菌人工增加乳酸菌数量的概念早已被理论化，但直到最近才被证明是有效的[Reid和Bruce，2005]。各种研究表明，用于治疗UTI的乳酸杆菌益生菌菌株具有积极作用，特别是在预防复发性尿路感染UTI方面[Bruce等，1992；Chrisholm，2015；Delley等，2015；Stapleton等，2011]。针对复发性尿路感染，迫切需要找到一种安全有效的非抗菌疗法[Stapleton等，
2011]。

[0103] 最常见的UTI病原体是大肠杆菌，其毒力受到QS的调控，并且先前已经证实，肠道大肠杆菌用本发明所述的益生菌分子治疗时，毒力减弱[ 等，2007，和Griffiths，2009，通过引用整体并入本文]。尿路致病性大肠杆菌(UPEC)
具有许多与肠道大肠杆菌相同的毒力基因，并具有T3SS。因此，本发明所述的益生菌分子应有效降低UPEC菌株的毒力[Snyder等，2004]。Reid[2000]发现，嗜酸性乳酸杆菌菌株产生的化合物可显著抑制尿路致病性肠球菌黏附至尿路上皮细胞。引起UTI的体内主要基因是fim基因，它是黏附在尿路上皮细胞表面(这是发生感染所必需的)所需的菌毛蛋白基因[Snyder等，2004]。我们将测试当暴露于本发明所述的益生菌分子时，UEPC菌株中的这些基因的调控是否为下调，从而确保所述生物肽可以有效降低尿路致病性大肠杆菌菌株的毒力。

[0104] 在其它方面，本发明所述的益生菌分子可以用于治疗急性膀胱炎，例如由大肠杆菌或腐生链球菌引起的急性膀胱炎；用于治疗肾盂肾炎，例如由大肠杆菌，克雷伯氏菌，肠杆菌或奇异变形杆菌引起的肾盂肾炎；用于治疗复杂的UTI，例如由大肠杆菌，肠球菌，克雷伯氏菌，变形菌或铜绿假单胞菌引起的复杂的尿路感染；或用于治疗前列腺炎，例如由大肠杆菌，革兰阴性杆菌，葡萄球菌或肠球菌引起的前列腺炎。

[0105] 细菌性阴道病

[0106] 另一个常见的感染是细菌性阴道病(BV)，其特征是阴道菌群从保护性乳酸菌占主导地位向致病细菌转变，占妇科诊所就诊人数的25％[Barrons和Tassone，2008]。BV增加了HIV感染的风险，并增加了低出生体重婴儿和早产的风险[Reid和Burton，2002]。传统抗生素的BV治愈率低，高达50％的女性在六个月后感染复发[Barrons和Tassone，2008]。每日摄入乳酸杆菌菌株可以使患有无症状BV的患者的阴道菌群恢复正常[Reid和Burton，2002]。研究发现，单独使用乳酸杆菌菌株与BV治愈率相关，效果可与标准抗生素疗法相媲美[Barrons和Tassone，2008]。

[0107] 研究表明，使用益生菌的冻干栓剂可以使益生菌细胞更快地定殖到泌尿生殖道[Barrons和Tassone，2008；Reid和Bruce，2006]。由于本发明所述的益生菌分子对诸如冻干的干燥方法具有抵抗力，因此冻干栓剂是可行的输送方式。这将使益生菌分子更容易到达感染部位。

[0108] 呼吸道感染

[0109] 呼吸道感染包括多种感染(中耳炎，肺炎和咽炎)，以及病原体包括常见菌株如流感嗜血杆菌，化脓性链球菌，肺炎链球菌，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌[Nagalingam等，2013]。呼吸道感染非常严重，尤其是对于婴幼儿和老年人，这在全球范围内造成了显著的发病率和死亡率。替代疗法和预防措施将是有益的[VérasdeAraujo等，2015]。

[0110] 特别预期下呼吸道感染和上呼吸道感染均可用本发明所述的分子进行治疗。例如，可以用本发明所述的分子治疗链球菌性咽炎中的化脓性链球菌，A群链球菌(“链球菌咽喉炎”)和/或其它咽喉感染。

[0111] Nagalingam等提出鼻窦微生物菌群的组合物与疾病相关。与健康个体相比，慢性鼻窦炎患者的鼻窦微生物菌群显示出乳酸菌(LAB)菌群显著减少[Nagalingam等，2013]。他们进一步建议补充LAB可以保护呼吸道的黏膜表面免受感染，这与胃肠道GI和泌尿生殖道的情况相似[Nagalingam等，2013]。关于益生菌和上呼吸道感染的作用有大量研究。两个例子表明，在两个非常易感人群(婴幼儿和老人)中，与对照组相比，口服补充益生菌的那些人的上呼吸道感染(URI)更少[Maldonado等，2012；Guillmard等，2010]。

[0112] 大多数研究都通过口服摄入益生菌，但是鼻腔喷剂也非常有效[Skovberg等，2009]。这表明鼻腔喷剂是另一种输送方式。这将增加益生菌向感染部位的输送。

[0113] 幽门螺杆菌感染

[0114] 幽门螺杆菌引起慢性胃炎，导致消化性溃疡病的发展，并且被认为是造成诸如胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤和胃腺癌等胃恶性肿瘤发展的危险因素[Wang等，2004]。尽管现有的抗生素治疗是有效的，但仍存在对抗菌素耐药性的担忧。此外，这类药物可能会产生不良副作用，从而经常导致治疗中止。由于这些原因，有必要研究替代疗法[Wang等，2004]。Wang等人[2004]在他们的研究中发现，摄入含有乳酸杆菌和双歧杆菌菌株的益生菌酸奶能够抑制人的幽门螺杆菌感染[Wang等，2004]。在一项较早的研究中发现，嗜酸乳酸杆菌La1的上清液在体外抑制幽门螺杆菌的生长，并且显示出对人类幽门螺杆菌的抑制作用[Michetti等，1999]。Canducci等人的另一项研究还表明，嗜酸乳酸杆菌废培养物上清液能够大大降低幽门螺杆菌在体外和体内的生存能力[2000]。这有力地说明，无细胞废培养基中的乳酸杆菌菌株产生的益生菌生物活性物质对治疗幽门螺杆菌感染具有有益的作用。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染

[0115] 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)引起许多危及生命的感染，包括肺炎，败血症，骨髓炎和心内膜炎。通常情况下，MRSA会长期定殖在患者体内，一年后仍有50％的患者体内定殖有MRSA[Karska-Wysocki，等，2010]。MRSA是产产生物膜的病原体，能够黏附在许多表面上。这项研究表明，嗜酸乳酸杆菌孵育24小时后能够消除99％的MRSA细胞。该研究与乳酸菌产生抑制生物膜产生的生物活性肽的作用有关[Karska-Wysocki等，2010]。已经证明本发明所述的益生菌分子干扰调节生物膜产生的QS系统。这可以抑制生物膜，因此益生菌分子不仅可以有效治疗MRSA，还可以有效治疗其他耐抗生素病原体。

[0116] 口腔健康

[0117] 科学研究表明，益生菌可以有效维持口腔健康和预防口腔疾病。例如研究表明，益生菌可以增强共生菌群，预防病原体的定殖，预防牙龈发炎[Iniesta等，2012]。有一些研究评估了乳酸杆菌益生菌在口腔健康中的应用。结果表明，使用含罗伊氏乳酸杆菌的片剂可显著减少唾液中的中间普氏菌以及牙周病原体(例如牙龈卟啉单胞菌)的数量[Iniesta等，2012]。结果表明，口服罗伊氏乳酸杆菌锭剂可与慢性牙周炎中的龈下深刮和根部整治结合使用[Teughels等，2013]。

[0118] 牙龈卟啉单胞菌是导致牙周炎的常见病原体。益生菌乳酸杆菌菌株显著减少了牙龈卟啉单胞菌的数量[Matsuoka和Koga，2014]。这些例子说明，使用乳酸杆菌益生菌可以干扰病原体的黏附和定殖，给健康带来重大的益处。

[0119] 由上可见，本发明所述的益生菌分子显然可用于治疗多种病原体，包括细菌，病毒，酵母，真菌和寄生虫。在一些方面，病原体是肠道或非肠道的，和/或感染是在肠道或非肠道的部位。

[0120] 例如，本发明所述的益生菌分子可以用于治疗选自以下的属的细菌感染：营养缺陷菌属(Abiotrophia)、无色杆菌属(Achromobacter)、氨基酸球菌属、食酸菌属、不动杆菌属、放线杆菌属、放线棒菌属(Actinobaculum)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、放线菌属(Actinomyces)、气球菌属、气单胞菌属、阿菲波菌属(Afipia)、农杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、差异球菌属(Alloiococcus)、交替单胞菌属(Alteromonas)、无枝酸菌属(Amycolata)、拟无枝酸菌属、厌氧菌属、棍状厌氧菌属、"Anguillina"、蛛网菌属、隐秘杆菌属、弓形菌属、节杆菌属、奇异菌属(Atopobium)、金杆菌属、芽孢杆菌属、类杆菌属、巴氏杆菌属(Balneatrix)、巴尔通体属(Bartonella)、伯杰氏菌属(Bergeyella)、双歧杆菌属、、嗜胆菌属(Bilophila)、布拉汉氏菌属(Branhamella)、疏螺旋体属、博德特菌属(Bordetella)、短螺旋体属、短芽孢杆菌属、短杆菌属、短波单胞菌属(Brevundimonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、萼杆菌属(Calymmatobacterium)、弯曲杆菌属、噬菌体属、心杆菌属、卡氏菌属(Catonella)、西地西菌属(Cedecea)、纤维素单胞菌属、石胡荽属(Centipeda)、衣原体属、嗜衣原体属(Chlamydophila)、显色菌属、金黄杆菌属
(Chyseobacterium)、金色单胞菌属(Chryseomonas)、柠檬酸杆菌属、梭状杆菌属、柯林斯氏菌属(Collinsella)、丛毛单胞菌属、棒状杆菌属、柯克斯体属(Coxiella)、短小杆菌属(Cryptobacterium)、德尔菲亚氏菌属(Delfiia)、皮肤杆菌属、皮肤嗜血杆菌属、脱硫单胞菌属、脱硫弧菌属、小杆菌属、偶蹄形菌属(Dichelobacter)、狡诈球菌属(Dolosicoccus)、狡诈菌属(Dolosigranulum)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、埃格特氏菌属
(Eggerthella)、埃立克氏菌属(Ehrlichia)、埃肯氏菌属(Eikenella)、稳杆菌属(Empedobacter)、肠杆菌属、肠球菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、丹毒丝菌属
(Erysipelothrix)、大肠杆菌属、真细菌属、尤文氏菌属(Ewingella)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、费克蓝姆氏菌属(Facklamia)、产线菌属、黄色单胞菌属、黄杆菌属、Flexispira，弗朗西斯菌属(Francisella)、梭杆菌属、加德纳菌属(Gardnerella)、孪生球芽孢菌属(Gemella Globicatella)、戈尔多纳菌属(Gordona)、嗜血杆菌属、哈夫尼亚菌属(Hafnia)、幽门螺杆菌属、螺旋球菌属(Helococcus)、霍德曼菌属(Holdemania)、伊格纳病毒属(Ignavigranum)、约翰逊菌属(Johnsonella)、金氏菌属(Kingella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、库克菌属(Kocuria)、科泽氏菌属(Koserella)、库特氏菌属(Kurthia)、皮球菌属(Kytococcus)、乳酸杆菌属、乳球菌属、月托菌属(Lautropia)、莱克氏菌属(Leclercia)、军团菌属(Legionella)、莱米诺菌属(Leminorella)、钩端螺旋体属、纤毛菌属(Leptotrichia)、明串珠菌属(Leuconostoc)、李斯特菌属(Listeria)、利斯顿氏菌属(Listonella)、巨球菌属(Megasphaera)、甲基杆菌属、微杆菌属、微球菌属、光冈菌属(Mitsuokella)、动弯杆菌属(Mobiluncus)、穆勒氏菌属(Moellerella)、莫拉氏菌属(Moraxella)、摩根氏菌属(Morganella)、分枝杆菌属、支原体属、类香味菌属(Myroides)、奈瑟菌属(Neisseria)、诺卡氏菌属(Nocardia)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、苍白杆菌属((Ochrobactrum))、卵黄杆菌属(Oeskovia)、寡源杆菌(Oligella)、东方体属
(Orientia)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、泛菌属(Pantoea)、副衣原体属
(Parachlamydia)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、片球菌属、消化球菌属、消化链球菌属、光细菌属、光杆状菌属(Photorhabdus)、卟啉邻单胞菌属(Plesiomonas Porphyrimonas)、普氏杆菌属(Prevotella)、丙酸杆菌属、变形菌属(Proteus)、普罗维登氏菌属(Providencia)、假单胞菌属、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、假分枝杆菌属、冷杆菌属
(Pseudonocardia)、拉赫内拉菌属(Rahnella)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、红球菌属、立克次体属(Rickettsia)、罗卡利马体属(Rochalimaea)、玫瑰单胞菌属、罗斯氏菌属(Rothia)、瘤胃球菌属，沙门氏菌属(Salmonella)、硒单胞菌属、小蛇菌属(Serpulina)、沙雷氏菌属(Serratia)、舍维内拉菌属(Shewenella)、志贺氏菌属(Shigella)、Simkania、斯拉克菌属(Slackia)、鞘氨醇杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、螺菌属、葡萄球菌属、寡养食单胞菌属(Stenotrophomonas)、口腔球菌属(Stomatococcus)、链杆菌属、链球菌属、链霉菌属、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、萨特氏菌属(Sutterella)、萨顿氏菌属(Suttonella)、塔特姆菌属(Tatumella)、组织菌属(Tissierella)、特布尔西菌属(Trabulsiella)、密螺旋体属(treponema)、Tropheryma、卡氏镰刀菌属Tsákamurella)、Turicella、解脲支原体属、迷走神经球菌属、韦荣球菌属(veillonella)、弧菌属、威克斯菌属(Weeksella)、沃廉菌属(Wolinella)、黄单胞菌属、嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus)、耶尔森菌属(Yersinia)和约克氏菌属(Yokenella)。

[0121] 例如，所述细菌感染可以由选自以下的细菌引起：欧洲放线菌(Actimomyces europeus)、乔治亚放线菌(Actimomyces georgiae)、戈氏放线菌(Actimomyces gerencseriae)、格拉氏放线菌(Actimomyces graevenitzii)、以色列放线菌(Actimomyces israelii)、麦氏放线菌(Actimomyces meyeri)、纳氏放线菌(Actimomyces naeslundii)、纽氏放线菌纽氏亚种(Actimomyces neuii neuii)、纽氏放线菌无硝亚种(Actimomyces neuii anitratus)、溶齿放线菌(Actimomyces odontolyticus)、辐射放线菌(Actimomyces radingae)、土生放线菌(Actimomyces turicensis)、粘性放线菌(Actimomyces 
viscosus)、溶菌性节杆菌(Arthrobacter  creatinolyticus)、康明氏节杆菌
(Arthrobacter cumminsii)、沃尔乌氏节杆菌(Arthrobacter woluwensis)、炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、类香味芽孢杆菌(Bacillus myroides)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、枯草芽孢杆菌、苏云芽孢金杆菌(Bacillus thuringiensis)、阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、安氏疏螺旋体(Borrelia andersonii)、Borrelia bissettii、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)、日本疏螺旋体(Borrelia japonica)、卢西坦疏螺旋体(Borrelia lusitaniae)、坦尼基疏螺旋体(Borrelia tanukii)、特迪疏螺旋体(Borrelia turdi)、瓦莱伯氏疏螺旋体(Borrelia valaisiana)、高加索氏疏螺旋体(Borrelia caucasica)、广花疏螺旋体(Borrelia crocidurae)、轮叶疏螺旋体(Borrelia recurrentis)、杜氏疏螺旋体(Borrelia duttoni)、格氏疏螺旋体(Borrelia graingeri)、赫氏疏螺旋体(Borrelia hermsii)、西班牙疏螺旋体(Borrelia  hispanica)、疏叶疏螺旋体(Borrelia 
latyschewii)、，马氏疏螺旋体(Borrelia mazzottii)、，帕克氏包柔氏螺旋体(Borrelia parkeri)、波斯疏螺旋体(Borrelia persica)、回归热螺旋体(Borrelia recurrentis)、墨西哥包柔氏螺旋体(Borrelia turicatae)、委内瑞拉疏螺旋体(Borrelia venezuelensi)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、Bordetella hinzii、霍氏博代氏杆菌(Bordetella holmseii)、副百日咳博德特氏菌、百日咳杆菌博德特氏菌、创口博德特菌(Bordetella trematum)、撤丁岛梭菌(Clostridium absonum)、阿根廷梭菌(Clostridium argentinense)、巴氏梭菌(Clostridium baratii)、双发酵梭菌、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、丁酸梭菌、尸体梭菌、肉食梭菌、隐藏梭菌Clostridium celatum)、梭状梭菌(Clostridium clostridioforme)、匙形梭菌(Clostridium cochlearium)、耳蜗形梭菌(Clostridium cocleatum)、谲诈梭菌(Clostridium fallax)、戈氏梭菌(Clostridium ghonii)、乙醇酸梭菌(Clostridium glycolicum)、溶血梭菌、矛形梭菌(Clostridium hastiforme)、溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)、吲哚梭菌、无毒梭菌
(Clostridium  innocuum)、不规则梭菌(Clostridium irregulare)、柔嫩梭菌
((Clostridium leptum)、泥渣梭菌(Clostridium limosum)、雄性梭菌(Clostridium malenominatum)、诺维氏梭菌(Clostridium novyi)、乳清酸梭菌(Clostridium 
oroticum)、副产梭菌(Clostridium paraputriβcum)、毛状梭菌(Clostridium 
piliforme)、腐化梭菌(Clostridium putrefasciens)、产气荚膜梭菌、败血梭菌，索氏梭菌(Clostridium sordelii)、蝶形梭菌(Clostridium sphenoides)、产孢梭菌(Clostridium sporogenes)、终生梭菌(Clostridium subterminale)、共生梭菌(Clostridium 
symbiosum)、第三梭菌(Clostridium tertium)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、费格森埃希菌(Escherichia fergusonii)、赫尔曼埃希菌(Escherichia hermanii)、，伤口埃希菌(Escherichia vulneris)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、钻黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)、盲肠肠球菌、殊异肠球菌(Enterococcus dispar)、坚强肠球菌(Enterococcus durans)、粪肠球菌、屎肠球菌、黄色肠球菌(Enterococcus flavescens)、鹑鸡肠球菌、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)、病臭肠球菌、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、伪鸟肠球菌、棉子糖肠球菌(Enterococcus raffinosus)、孤立肠球菌(Enterococcus solitarius)、埃及嗜血杆菌(Haemophilus aegyptius)、嗜沫嗜血杆菌(Haemophilus aphrophilus)、嗜肺嗜血杆菌( par aphrophilus)、副流感嗜
血杆菌、惰性嗜血杆菌(Haemophilus segnis)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌、解鸟氨酸克雷伯氏菌(Klebsiella ornitholytica)、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌、臭氧克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)、土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)、伊氏李斯特菌(Lysteria ivanovii)、单核细胞增生李斯特菌、脓肿分枝杆菌、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、蜂房分枝杆菌(Mycobacterium alvei)，亚洲分枝杆菌(Mycobacterium asiaticum)、金色分枝杆菌(Mycobacterium aurum)、鸟型分支杆菌(Mycobacterium avium)、波希米亚分枝杆菌(Mycobacterium bohemicum)、牛分枝杆菌、布兰氏分枝杆菌(Mycobacterium branderi)、布鲁曼分枝杆菌(Mycobacterium brumae)、隐藏分枝杆菌(Mycobacterium celatum)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)、丘邦分枝杆菌(Mycobacterium chubense)、汇合分枝杆菌(Mycobacterium confluentis)、孔氏分枝杆菌(Mycobacterium conspicuum)、库克分枝杆菌(Mycobacterium cookii)、微黄分枝杆菌(Mycobacterium flavescens)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、加的斯分枝杆菌(Mycobacterium gadium)、胃分枝杆菌、生殖分枝杆菌(Mycobacterium genavense)、戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、古氏分枝杆菌(Mycobacterium goodii)、嗜血分枝杆菌、哈氏分枝杆菌(Mycobacterium hassicum)、细胞内分枝杆菌、穿插分枝杆菌、海德氏分枝杆菌(Mycobacterium 
heidelberense)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium  kansasii)、慢枝分枝杆菌
(Mycobacterium lentiflavum)、麻风分枝杆菌、马尔默蒙分枝杆菌(Mycobacterium malmoense)、海生分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、Mycobacterium microgenicum、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)、产粘液分支杆菌(Mycobacterium mucogenicum)、新金牛分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)、非生色分枝杆菌(Mycobacterium 
nonchromogenicum)、百日咳分枝杆菌、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)、施氏分枝杆菌(Mycobacterium shimoidei)、猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、斯氏分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、土分枝杆菌(Mycobacterium terrae)、耐热分枝杆菌(Mycobacterium thermoresistabile)、三分枝杆菌(Mycobacterium triplex)、次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)、结核分枝杆菌、托斯卡分枝杆菌(Mycobacterium tusciae)、溃疡分枝杆菌、母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)、沃尔宁斯基分枝杆菌(Mycobacterium wolinskyi)、异种分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、颊部支原体、咽支原体、发酵支原体、生殖支原体、人形支原体(Mycoplasma homigis)、亲脂性支原体、口头支原体(Mycoplasma orale)、穿透支原体(Mycoplasma penetrans)、梨支原体(Mycoplasma pirum)、肺炎支原体、基层支原体(Mycoplasma primatum)、唾液支原体、精原支原体、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、荧光假单胞菌、浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、栖麦假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)、穿孔假单胞菌(Pseudomonas pertocinogena)、假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudalcaligenes)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假单孢菌(Pseudomonas stutzeri)、非洲立克次体
(Rickettsia africae)、小蛛立克次体(Rickettsia akari)、澳大利亚立克次体
(Rickettsia australis)、康氏立克次体(Rickettsia conorii)、猫立克次体(Rickettsia felis)、本尼立克次体(Rickettsia honei)、日本立克次体(Rickettsia japonica)、蒙古立克次体(Rickettsia mongolotimonae)、Rickettsia prowazeldi、立克次体立克次体(Rickettsia rickettsiae)、西伯利亚立克次体(Rickettsia sibirica)、斯洛伐克立克次体(Rickettsia slovaca)、伤寒立克次体、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis choleraesuis)、阿里桑沙门氏菌(Salmonella choleraesuis arizonae)、邦戈沙门氏菌(Salmonella choleraesuis bongori)、重利桑沙门氏菌(Salmonella choleraesuis diarizonae)、胡特沙门氏菌(Salmonella choleraesuis houtenae)、印度霍乱沙门氏菌、萨拉马沙门氏菌(Salmonella choleraesuis salamae)、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、博伊氏迪志贺氏菌(Shigella boydii)、痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、索尼氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、头状葡萄球菌、解脲葡萄球菌(Staphylococcus c.ureolyticus)、山羊葡萄球菌(Staphylococcus caprae)、金黄色葡萄球菌、科氏葡萄球菌科氏亚种(Staphylococcus cohnii cohnii)、解脲葡萄球菌(Staphylococcus c.ureolyticus)、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)、鸡葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、人葡萄球菌、新生葡萄球菌(Staphylococcus h.novobiosepticius)、猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、中间葡萄球菌(Staphylococcus intermedius)、卢顿葡萄球菌(Staphylococcus 
lugdunensis)、巴斯德葡萄球菌(Staphylococcus  pasteuri)、解糖葡萄球菌
(Staphylococcus saccharolyticus)、腐生葡萄球菌、施莱费里葡萄球菌(Staphylococcus saccharolyticus)、凝固酶葡萄球菌(Staphylococcus s.coagulans)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)、模拟葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、华氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、木糖葡萄球菌、无乳链球菌、犬链球菌、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae dysgalactiae)、似停乳链球菌(Streptococcus 
dysgalactiae equisimilis)、马链球菌马亚种(Streptococcus equi equi)、马链球菌兽疫、海豚链球菌、豕链球菌(Streptococcus porcinus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、星座链球菌星座亚种
(Streptococcus constellatus constellatus)、星座链球菌咽炎亚种(Streptococcus constellatus pharyngidis)、中间链球菌、轻型链球菌(Streptococcus mitis)、口腔链球菌、血链球菌、嵴链球菌(Streptococcus cristatus)、戈登链球菌(Streptococcus gordonii)、副血链球菌(Streptococcus parasanguinis)、唾液链球菌、前庭链球菌、仓鼠链球菌(Streptococcus criceti)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、鼠链球菌、远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)、酸性链球菌、牛链球菌、马链球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、溶藻弧菌、鲨鱼弧菌(Vibrio  carchariae)、霍乱弧菌、辛辛那提弧菌
(C.cincinnatiensis)、海鱼弧菌(Vibrio damsela)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、弗尼斯弧菌(Vibrio  furnissii)、霍氏弧菌(Vibrio hollisae)、梅氏弧菌(Vibrio 
metschnikovii)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、副溶血弧菌(Vibrio par ahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificusi)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、阿尔氏耶尔森氏菌(Yersinia aldovae)、伯氏耶尔森菌(Yersinia bercovieri)、小肠结肠炎耶尔森菌、弗氏耶尔森菌(Yersinia frederiksenii)、中间耶尔森菌(Yersinia intermedia)、克氏耶尔森菌(Yersinia kristensenii)、莫氏耶尔森菌(Yersinia mollaretii)、假结核耶尔森菌和罗氏耶尔森菌(Yersinia rohdei)。

[0122] 或者，本发明所述的益生菌分子可以用于治疗选自以下的家族的病毒：星状病毒科(Astroviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、冠状病毒科(Caronaviridae)、副黏病毒科、正黏病毒科、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、呼肠孤病毒科、博尔纳病毒科(Bornaviridae)、逆转录病毒科、痘病毒科、疱疹病毒科、腺病毒科、乳多空病毒科(Papovaviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、嗜肝病毒科(例如选自如下的病毒：柯萨奇A-24病毒(a Coxsackie A-24virus)、腺病毒11型、腺病毒21型、柯萨奇B病毒、博尔纳病病毒(Borna Diease Virus)、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、加利福尼亚脑炎病毒(California encephalitis virus)、人乳头瘤病毒、水痘带状疱疹病毒、科罗拉多蜱媒热病毒(Colorado tick fever virus)、单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus)、牛痘病毒、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、登革热病毒、埃博拉病毒(Ebola virus)、细小病毒B19、柯萨奇A-16病毒、HSV-1型、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、柯萨奇B1-B5、甲型、乙型或丙型流感病毒、拉克罗斯病毒(LaCross virus)、拉沙病毒(Lassavirus)、风疹病毒、柯萨奇A或B病毒、埃可病毒(Echovirus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、HSV-2型、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr Virus)、脊髓灰质炎病毒肠病毒、狂犬病病毒、风疹病毒、天花病毒、WEE病毒、黄热病病毒和水痘带状疱疹病毒)。

[0123] 或者，本发明所述的益生菌分子可用于治疗酵母或真菌。例如，感染宿主的真菌或酵母选自曲霉属(Aspergillus sp.)，皮肤癣菌，皮炎芽生菌，假丝酵母菌，荚膜组织胞浆菌，申克氏孢子丝菌，荚膜组织胞浆菌和暗色真菌。

[0124] 本发明所用的术语"寄生虫"或"寄生虫感染"应理解为是指能够感染另一种生物体(例如人)的除了病毒，细菌，真菌或酵母菌以外的单细胞或多细胞生物体。这类寄生虫的例子包括例如选自以下的寄生虫：锡兰钩虫，十二指肠钩虫，似蚓蛔线虫，结肠小袋绦虫，人芽囊原虫，华支睾吸虫，圆孢子球虫，脆弱双核阿米巴，阔节裂头绦虫，犬复孔绦虫，肠脑炎微孢子虫，痢疾阿米巴，蛲虫(Enterobius vermicularis)，肝片吸虫，蛲虫(Enterobius vermicularis)，肝片吸虫，布氏姜片吸虫，肠贾第虫(syn.蓝氏贾第鞭毛虫)，异形吸虫，缩小膜壳绦虫，微小膜壳绦虫，贝氏等孢子球虫，横川后殖吸虫，美洲板口线虫，猫后皋吸虫，卫氏并殖吸虫，埃及血吸虫，间插血吸虫，日本血吸虫，曼氏血吸虫，牛带绦虫，毛首鞭形线虫，分歧巴贝虫，恶性疟原虫，三日疟原虫，卵形疟原虫，间日疟原虫，巴西利什曼原虫和杜氏利什曼原虫。

[0125] 在一些方面，所述益生菌分子通常可用于减少生物膜形成或干扰已形成的生物膜。所述益生菌分子还可用于下调毒力基因(通常与T3SS相关的基因)，并用于减少病原体对组织和/或表面的黏附。使用本发明所述的益生菌分子治疗伤口以及治疗和/或预防伤口感染也是可以预期的。

[0126] 在更一般的方面，益生菌分子可以用作常规抗生素疗法的替代方法或辅助方法，从而减少抗生素的使用并减轻抗生素耐药性的发展。

[0127] 在一些方面，本发明所述的益生菌分子可以例如通过肠胃外，静脉内，皮下，皮内，肌内，颅内，眶内，眼部，脑室内，囊内，脊柱内，脑池内，腹膜内，鼻内，直肠内，阴道内，气雾剂或口服给药。通常，本发明的组合物口服给药或直接施用于感染部位。

[0128] 在一些方面，本发明所述的益生菌分子可以与常规的感染治疗(如抗生素)结合、同时或依次施用。例如，在适当的情况下，本文所述的益生菌分子可与此类常规治疗一起配制。

[0129] 本发明所述的益生菌分子可以任何合适的量使用，但通常以如下剂量提供：约1至约10000ng/kg，例如约1至约1000ng/kg，约1至约500ng/kg，约10至约250ng/kg或约50至约100ng/kg，例如约1ng/kg，约10ng/kg，约25ng/kg，约50ng/kg，约75ng/kg，约100ng/kg，约
150ng/kg，约200ng/kg，约250ng/kg，约300ng/kg或约500ng/kg。

[0130] 以上公开内容总体上描述了本发明。通过参考以下具体实施例可以更全面地理解本发明。仅出于说明的目的描述了这些实施例，而无意限制本发明的范围。根据提示的情况或作为权宜之计，可以预期形式的改变和等同物的替代。尽管本文采用了特定术语，但是这些术语仅是描述性的，并非出于限制的目的。

[0131] 实施例

[0132] 实施例1：尿路致病性大肠杆菌和生物肽的鉴定目的：

[0133] 这些实验的目的是确定La-5中的无细胞上清液是否可以下调尿路致病性大肠杆菌(UPEC)中毒力基因的表达。

[0134] 材料与方法：

[0135] 用于这些实验的La-5无细胞上清液是批次D4。两株UPEC菌株分离自泌尿道感染的犬。它们由圭尔夫大学的病理学-生物学实验室提供。菌株1别名为UPEC99以及菌株2别名为UPEC804。所述菌株在LB琼脂上培养。用于测试的两种不同培养基是LB和人工尿液培养基。

[0136] 测试的引物对：

[0137]

[0138] 测试方法与Sharma(2014)所述的沙门氏菌测试方法相似。UPEC在无细胞上清液存在下生长4小时。收集细胞并提取RNA。使用DNA酶处理RNA，用于去除基因组DNA。将所述RNA作为模板，用于制备cDNA。通过qPCR测定cDNA，并将基因表达标准化为内参基因，并与无细胞培养基对照进行比较。

[0139] 结果：

[0140] 表1.1：LB和人工尿液培养基的基因表达比较。

[0141] 目的基因 菌株 培养基 内参基因 下调FliC 菌株1(E99) LB GapA 0.024
FliC 菌株1(E99) 人工尿液培养基 GapA 0.014
FliC 菌株2(E804) LB GapA 0.56
FliC 菌株2(E804) 人工尿液培养基 GapA 0.045
HylA 菌株1(E99) LB GapA 16.47
HylA 菌株1(E99) 人工尿液培养基 GapA 1.35
HylA 菌株2(E804) LB GapA 未表达
HylA 菌株2(E804) 人工尿液培养基 GapA 未表达
FimA 菌株1(E99) LB GapA 未表达
FimA 菌株1(E99) 人工尿液培养基 GapA 未表达
FimA 菌株2(E804) LB GapA 未表达
FimA 菌株2(E804) 人工尿液培养基 GapA 未表达

[0142] 表1.1中的数据表明无细胞上清液可有效下调HylA，但不能有效调控FliC。与人工尿液培养基相比，HylA在LB培养基中下调更多。仅用LB培养基进一步研究这些基因表达，因为LB培养基中具有更高的基因下调。该实验进行再次测定以确认该反应具有菌株特异性。

[0143] 表1.2：菌株特异性基因调控的比较。

[0144]

[0145] 表1.2中的数据表明，无细胞上清液可以下调HylA，但只能下调菌株1的HylA，因为HylA似乎在菌株2中不表达。无细胞上清液不影响FliC的下调。

[0146] 表1.3：批次D4和UPEC菌株1(E99)的剂量效应曲线

[0147]目的基因 剂量 内参基因 下调
HylA 4x GapA 40.46
HylA 2x GapA 19.86
HylA 1x GapA 24.69
HylA 0.5x GapA 4.90
HylA 0.25x GapA 2.79

[0148] 1x剂量等同于10mL的无细胞上清液(1x)。HylA的下调与被分析物质的量相关。这说明无细胞上清液与HylA的调控和潜在的下游机制具有特定的相互作用。

[0149] 表1.4：使用稳定批次(S1)的菌株1(E99)中HylA基因表达的汇总表

[0150]

[0151] 1x剂量等同于10mL的无细胞上清液(1x)。测定了第二批次材料，以确定另外独立生产的批次中的干燥无细胞上清液中是否也可以下调HylA表达。被测试的干燥无细胞上清液与HylA的下调存在剂量反应关系。

[0152] 实施例2：无细胞上清液中生物活性分子的鉴定

[0153] 目的：

[0154] 这些实验的目的是鉴定无细胞上清液的生物活性肽。

[0155] 材料与方法:

[0156] 使用Sephadex G75树脂分离无细胞上清液。将样品分离并收集各级分：级分1(>163000Da)、级分2(163000-14500Da)、级分3(14500-1300Da)，级分4(1300-110Da)、级分5(110-10Da)。收集样品并使用沙门氏菌肠型鼠伤寒DT104菌株通过qPCR进行分析。将HilA的小调与内参基因16S进行比较。

[0157] 引物：

[0158] HilA正向5’-3’-TGTCGGAAGATAAAGAGCAT

[0159] HilA反向5’-3’-AAGGAAGTATCGCCAATGTA

[0160] 16S正向5’-3’-CAAGTCATCATGGCCCTTAC

[0161] 16S反向5’-3’-CGGACTACGACGCACTTTAT

[0162] 使用反向色谱进一步分离从G75尺寸排除色谱得到的活性级分。得到的反相级分有：级分1(0-2min)、级分2(2-4min)、级分3(4-16min)、级分4(16-32min)、级分5(32-40min)、级分6(40-58min)。将级分干燥并中和，从而除去溶剂中的乙腈和三氟乙酸。使用与上述相同的qPCR测定条件测定干燥的各级分。在圭尔夫大学分析研究中心通过从头测序对这些组分进行分析。对6个批次的活性级分中的肽进行比较，并推导出这些批次中的常见肽。

[0163] 表2.1：尺寸排除级分的qPCR下调

[0164]

[0165] 尺寸排除级分3被进一步表征，因为其具有与投入物相似的活性，这表明该级分的活性是生物活性分子的主要组成部分

[0166] 表2.2：从尺寸排除组分3中纯化的反相(RP)级分的qPCR下调

[0167]

[0168] 选择RP级分3和级分5进行从头测序。结果来自级分5，因为该级分具有最大的活性。虽然在级分3中也发现了MALPPK，但是其它肽仅在级分5中被发现。

[0169] 表2.3：6个生产批次中RP级分5的生物活性肽的从头测序

[0170]

[0171] 使用从头测序鉴定引起毒力基因(如鼠伤寒沙门氏菌DT104中的HilA)下调的氨基酸序列。分析了六个独立的生产批次。使用尺寸排除色谱分离无细胞上清液(SephadexG75)。根据其分子量将样品分为5个级分。通过反向色谱进一步分析预测分子量范围为14.5-1.3kDa的第三级分，并通过从头测序对RP5级分进行了分析。对所有分析的生物肽进行比较后，确定了所有六个批次中共有的两个肽和至少四个批次中共有的两个其它肽。由于从头测序仅是定性分析，因此合成了所有这四种肽，以鉴定哪些肽引起鼠伤寒沙门氏菌DT104中HilA的下调。

[0172] 表2.4：稳定批次1(S1)的尺寸排除级分3中生物肽的半定量

[0173] 肽序列 肽浓度(ng/mL)MALPPK 2500
CVLPPK 低于检测限
HLLPLP 2.5-5
LKPTPEGD 25-50
YPVEPF 10-25
YPPGGP 100

[0174] 对从头测序中选择的生物肽和在国际专利申请公开号WO2009/155711中鉴定的两个其它肽使用多反应监测(MRM)模式对质谱进行分析，对稳定批次S1中存在的生物肽的量进行半定量分析。将每种肽的峰高与已知量的每种生物肽的稀释系列的峰高进行比较。这种半定量方法确定了MALPPK是所分析的6种肽中丰度最高的肽。

[0175] 表2.5：单个合成生物肽存在时HylA和HilA表达变化的qPCR分析

[0176]肽序列 目的基因 内参基因 下调倍数
MALPPK HylA GapA 9.06
CVLPPK HylA GapA 3.20
HLLPLP HylA GapA 2.64
LKPTPEGD HylA GapA 4.69
YPVEPF HylA GapA 1.03
YPPGGP HylA GapA 3.56
MALPPK HilA 16S 19.56
CVLPPK HilA 16S 3.75
HLLPLP HilA 16S 2.93
LKPTPEGD HilA 16S 11.08
YPVEPF HilA 16S 0.68
YPPGGP HilA 16S 2.93

[0177] 每次测定分析合成生物肽的量为50μg。qPCR分析表明，除YPVEPF外，所有肽均影响HylA的下调。肽MALPPK对HylA的下调具有最高的影响，其次是LKPTPEGD、YPPGGP、CVLPPK和HLLPLP。

[0178] 总结：

[0179] 表2.1-2.5中的数据表明，在La-5发酵培养基的无细胞上清液中发现的肽可以下调鼠伤寒沙门氏菌DT104中HilA和溶血素A(HylA)的表达。HylA是UPEC产生的一种成孔毒素，是参与感染的毒力因子之一。这种相互作用似乎是特异性的，因为在无细胞上清液存在下，鞭毛蛋白(FliC)的表达没有下调。两个独立的生产批次以剂量依赖方式证实HylA的特定下调。从尺寸排除级分3的从头测序中鉴定出4种肽。合成了这四种肽以及来自现有专利的两种另外的肽，并通过qPCR定量了它们对HylA基因表达的影响。除YPVEPF外，所有生物肽均具有活性，而MALPPK是所分析的6种肽中活性最高的肽。

[0180] 实施例3：尿路致病性大肠杆菌的细胞毒性试验

[0181] 目的：

[0182] 本实验的目的是使用生理学细胞毒性试验确定在嗜酸乳酸杆菌无细胞培养基存在时，尿路致病性大肠杆菌中产生的毒素是否减少。

[0183] 材料与方法:

[0184] 将干燥的无细胞上清液溶解于LB肉汤(14mg/mL)中，并使用0.1NNaOH将pH调节至7.2。用LB肉汤将溶液稀释至最终浓度。用50μL培养18小时的UPEC099菌株培养物接种至肉汤(5mL)。将样品在37℃、200rpm振摇下生长4小时。将培养物的1ml等分试样以10,000xg离心，去除大肠杆菌细胞。将上清液(100μL)添加到1mL的HT29哺乳细胞(1E6个细胞/mL)中，并在37℃、补充5％CO2的条件下培养1小时。孵育后，将混合物转移至1.5mL试管中，以250x g离心除去哺乳细胞。使用Pierce乳酸脱氢酶LDH细胞毒性测定法，检测上清液(50μL)的细胞毒性(Thermo Fisher Scientific)。根据生产商的说明制备用于测定的溶液。将50μL上清液与50μL测定反应混合物在96孔板中孵育。用箔纸覆盖测定物以保护其免受光照，并在室温下培养30分钟。添加反应终止混合物(50μL)，并在490nm和680nm处读取96孔板。吸光值用于计算细胞毒性，数据表示为抑制百分数。

[0185] 结果/讨论:

[0186] 图1和2中的数据说明无细胞上清液对UPEC产生毒素的抑制作用。这些数据为无细胞上清液能够以剂量依赖的方式降低毒素对HT29哺乳细胞的影响提供了生理学的支持。乳酸脱氢酶是细胞裂解的生理学标志物，终点测定中乳酸脱氢酶的抑制，说明只有很少的哺乳细胞被裂解，这表明无细胞上清液可以减少UPEC099产生的毒素量。

[0187] 实施例4:克服耐药性

[0188] 目的：

[0189] 本实验的目的是确定来自益生菌(例如嗜酸乳酸杆菌La-5)的无细胞上清液是否可以提高耐药菌对抗生素的敏感性，特别是耐甲氧西林葡萄球菌对头孢西丁的敏感性。

[0190] 材料与方法:

[0191] 从批次N9-N10和N13获得用于这些实验的La-5无细胞上清液。这些实验中使用三种耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)菌株：1)伪中间型葡萄球菌(菌株别名C26022-2011 dtqa)，一种来自皮肤感染的犬的临床分离株；2)金黄色葡萄球菌(菌株别名LA-414MSPAt034)，一种与牲畜相关的菌株，分离自在加拿大爱德华王子岛夏洛特顿的一家杂货店购买的牛肉；3)金黄色葡萄球菌(菌株别名81MSPAt008)，分离自在加拿大爱德华王子岛夏洛特顿的一家杂货店购买的禽肉。这三种MRS菌株均由爱德华王子岛大学的大西洋兽医学院(AVC)提供。这些菌株的耐甲氧西林耐药性已由AVC员工使用苯唑西林纸片扩散法确认。这些菌株最初在绵羊血琼脂斜面上培养，然后转接至溶菌性肉汤琼脂平板。将重悬于甲醇中的头孢西丁用TM于抗生素耐药性测试，并且在两种不同类型的培养基(标准溶菌性肉汤和标准BBL 阳离子调节的Mueller-Hinton培养基(BD公司))中测定生长。在存在和不存在无细胞上清液的情况下，确定每种菌株在每种培养基中对头孢西丁的最小抑菌浓度(MIC)。根据临床与实验室标准学会(CLSI)指南(用于葡萄球菌菌种的MIC测试)[CLSI，2015]以及欧洲临床微生物学和传染病学会[EUCAST，2003]的欧洲抗菌药物敏感试验委员会(EUCAST)进行测定。

[0192] MIC测试的实验方案如下。将无细胞上清液重悬于各自的培养基中，并通过孔径为0.22μM的滤器进行过滤灭菌。称取所需浓度的干燥无细胞上清液，并以0-60mg/mL的浓度添加。加入头孢西丁，终浓度为0-250μg/mL。将每种菌株的培养物在溶菌性肉汤或MuellerHinton中过夜培养，在有氧条件下，在37℃条件下以200rpm摇动培养16-20小时，使
600nm处的光密度值(OD600)达到1.2-1.6。将过夜培养物稀释1000倍并接种到各自的样品中；过夜培养物的稀释导致含量约为5x106CFU/mL的接种物。培养物(150μL)在96孔透明平底微量滴定板中生长。然后将微量滴定板用石蜡覆盖，并在35℃±2℃下孵育24小时。孵育后，使用酶标仪在600nm读取微孔板。MIC值是使OD600读数<0.1的抗生素的浓度。数据是来自两个生物学重复的两个技术重复的平均值。

[0193] β-内酰胺类如甲氧西林和头孢西丁抑制细菌细胞壁的生物合成。细菌已经进化出逃避这些抑制剂的机制，从而导致了抗生素耐药性。MecA是一种可以与β-内酰胺类结合，从而降低其活性的基因。获得MecA基因的葡萄球菌对甲氧西林耐药。MecA的表达受群体感应的调节，因此我们研究了无细胞上清液是否可以通过抑制群体感应提高耐甲氧西林葡萄球菌的敏感性。

[0194] 数据表明，无细胞上清液可以增加耐甲氧西林葡萄球菌对头孢西丁抗生素的敏感性；这反过来降低了阻止或防止耐甲氧西林葡萄球菌菌种繁殖所需的头孢西丁浓度。对于无细胞上清液的测试浓度(5mg/mL，30mg/mL和60mg/mL)，数据表明了剂量反应：随着无细胞上清液浓度的增加，与0mg/mL的对照相比，头孢西丁MIC值的降低程度更大。与单独使用头孢西丁相比，头孢西丁和无细胞上清液的组合可以使耐甲氧西林葡萄球菌的敏感性提高2.5-6.25倍(表3)。

[0195] 表3：耐甲氧西林葡萄球菌的头孢西丁MIC值的范围

[0196]

[0197] 对于尺寸排除色谱法，使用Sephadex G75树脂分离样品。将样品分离并收集各级分：级分1(>163000Da)、级分2(163000-14500Da)、级分3(14500-1300Da)、级分4(1300-110Da)、级分5(110-10Da)。与尺寸排除级分3共同孵育时，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌81M对头孢西丁的敏感性最高。该数据表明活性成分在尺寸排除级分3中(表4)，强烈说明产生这种作用的生物活性分子与本发明表述和和表征的那些相同。

[0198] 表4：无细胞上清液的尺寸排除级分对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌81M的头孢西丁MIC值的范围的影响

[0199]对照 抑制生长至读数<0.1的头孢西丁浓度范围(μg/mL)
未处理(0mg/mL) 60-75
无细胞上清液(30mg/mL) 20-30
尺寸排除级分编号  
级分1 60-75
级分2 75-100
级分3 30-40
级分4 60-75
级分5 40-50

[0200] 以上公开内容总体上描述了本发明。虽然本发明中使用了特定术语，但是这些术语仅是描述性的，并非出于限制的目的。

[0201] 上面引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用以其整体并入本发明，其程度等同于每个单独的出版物、专利或专利申请均被明确并单独地以引用的方式并入本发明。

[0202] 虽然在本发明中已经详细说明了本发明的优选实施方式，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下，可以对其做出改变。