【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はスタフィロキナーゼ（以下、ＳＡＫと略記する）に対して特異性を示すモノクローナル抗体ならびにそのモノクローナル抗体を用いてスタフィロキナーゼを測定する方法に関する。 さらに詳しく言えば、本発明は、血栓溶解活性を有する黄色ブドウ球菌由来のＳＡＫ（大腸菌組換え体）に対するモノクローナル抗体を提供するものであり、ＳＡＫで免疫した動物からの抗体産生細胞と腫瘍細胞とを融合させた融合細胞いわゆるハイブリドーマのクローンを培養することにより、ＳＡＫに対するモノクローナル抗体を作製し、該モノクローナル抗体を用いて血中のＳＡＫを測定する方法に関する。

【０００２】

【背景技術】血栓溶解活性を示す組織性プラスミノーゲンアクチベータに対するモノクローナル抗体が、該組織性プラスミノーゲンアクチベータで免疫したマウスからの抗体産生細胞と骨髄腫細胞との間に形成されたハイブリドーマクローンを培養することにより得られたことは、すでに報告されている（Ｈｏｌｖｏｅｔ，Ｐ．ら、
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉ
ｓ、５４巻、６８４−６８７頁、１９８５年）。

【０００３】ＳＡＫは黄色ブドウ球菌の産生する血栓溶解物質であるが、β溶血連鎖球菌が産生する血栓溶解物質のストレプトキナーゼに比べてフィブリンに対する特異性が高いという特性を有する。 ＳＡＫ産生能を有する遺伝子を大腸菌に導入することにより、該大腸菌を用いて高収率でＳＡＫを生産することは、すでに提案されているが（特開昭５８−６７１８１号公報参照）、ＳＡＫ
を血栓溶解剤をはじめとして種々の用途に用いるという有用性を拡大するためには、ＳＡＫを高感度に測定し得るアッセイ系の確立が必須である。 すでにＳＡＫの測定については活性を指標としたフィブリンプレート法や、
合成基質による活性測定法が知られているが、ＳＡＫに対する抗体の作製および抗体を利用した免疫学的手法によるＳＡＫの測定法については未だ確立されていないという現状にある。

【０００４】

【発明の目的】本発明の目的は、ＳＡＫに対する新規なモノクローナル抗体を提供することにあり、さらに、そのモノクローナル抗体を製造する方法ならびにエピトープの異なる２種類以上のそのモノクローナル抗体を用いてＳＡＫを高感度に測定する方法を提供することにある。

【０００５】

【発明の開示】本発明は、第一に、スタフィロキナーゼを特異的に認識する新規なモノクローナル抗体を提供するものであり、第二に、その新規なモノクローナル抗体を用いて、スタフィロキナーゼを測定する方法を提供するものである。

【０００６】以下に、本発明を詳細に説明する。 本発明に係る新規なモノクローナル抗体は、以下のとおりにして製造される。 すなわち、動物をＳＡＫで免疫し、その動物から得られた抗体産生細胞と腫瘍細胞との間に融合細胞（ハイブリドーマ）を形成させ、次いで、該融合細胞を増殖し、その増殖した融合細胞の中からＳＡＫに対して特異性を示す抗体を産生する細胞を選択し、その抗体産生細胞を培養して抗ＳＡＫモノクローナル抗体を製造する。 本発明に係る抗ＳＡＫモノクローナル抗体は、
ＳＡＫを血栓溶解剤として使用した場合におけるそのＳ
ＡＫの体内動態を測定するための試薬として、あるいは、ＳＡＫの動物体内における作用機作を探索し、あるいは構造活性相関を調査、研究するための試薬として極めて有用なものである。

【０００７】上記の融合細胞いわゆるハイブリドーマは、ＳＡＫで免疫された動物から得られた該ＳＡＫに対する抗体を産生する細胞（以下、ＳＡＫ抗体産生細胞と略記する）と、腫瘍細胞である骨髄腫細胞とを融合させることによって形成される。 使用するＳＡＫ抗体産生細胞としてはＳＡＫで免疫された動物からの脾臓細胞が好ましい。 上記のＳＡＫ抗体産生細胞および骨髄腫細胞としてはこれらが融合可能な限りにおいて供給源である動物の種類は特定する必要はないが、融合効率や抗体産生の安定性から見るときは、同じ種族の動物由来のものを使用するのが好ましい。

【０００８】上記のハイブリドーマのうち、好ましいハイブリドーマは、ＳＡＫで免疫したマウスの脾臓細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合させて得られるものであり、その例としては、例えばあらかじめＳＡＫで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの抗ＳＡＫ抗体産生脾臓細胞と、
ＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄腫細胞との融合ハイブリドーマがあげられる。

【０００９】細胞融合後、ハイブリドーマをクローン化し、個々のクローンを培養し、そのクローン群からＳＡ
Ｋに対し特異性を示す抗体を産生するクローンを選別する。

【００１０】抗体の検出にはＶｏｌｌｅｒら（Ｂｕｌ
ｌ． ＷＨＯ． 、５３巻、５５−６５頁、１９７６）が報告している酵素免疫測定法が好ましく用いられる。

【００１１】さらに、具体的に説明すると、組織培養プレート例えば９６穴マイクロタイタープレートの穴壁に固定化したＳＡＫ抗原に、ハイブリドーマ培養液またはハイブリドーマを接種したマウスの腹水を加え、ついで、これに、ペルオキシダーゼを標識した抗マウスイムノグロブリン抗体を加えたのち、そのペルオキシダーゼ活性をオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）の発色で検定する。 このＯＰＤの発色は抗体の存在を指示する。 ハイブリドーマ培養液およびその濃縮液、あるいはハイブリドーマを接種したマウスの腹水の抗ＳＡＫ抗体の力価は、ＯＰＤの発色（吸光度４９２ｎｍにおける測定値）
が１．０を与える検体の最終希釈倍数で示される。 ＢＡ
ＬＢ／ｃマウスの骨髄腫細胞Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４
−１（以下、ＮＳ−１と略記する）の培養液並びに同細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに接種して得られる血清および腹水は、ＳＡＫに対する抗体活性を有していない。

【００１２】ＳＡＫに対するモノクローナル抗体の製造は、上記の抗体産生クローンを培地中において、または組織適合性動物もしくはヌードマウスの体内において維持生育させることにより行われる。 産生されたモノクローナル抗体は培地から、または動物の血清もしくは腹水から回収される〔回収方法に関しては、例えば、岩崎辰夫ら、単クローン抗体、８８−９４頁（１９８３）参照〕。

【００１３】本発明に係るモノクローナル抗体を用いてＳＡＫを測定する方法としては、具体的には酵素免疫測定法を例示することができる。 その中でもサンドイッチ法は好ましい方法である。 サンドイッチ法においては、
あらかじめ、抗体を支持体に結合させ、固相の状態（固相化抗体）にしておく。 この際の支持体としては、チューブそのものを使う場合もあり、また容易に取り出せる球形や、板状の固体を使う場合もある。 この固相化抗体を一次抗体と呼ぶ。 これに抗原であるＳＡＫを加える。
その結果抗原抗体反応が起こり、抗原は抗体に結合するので、そのあと上清を除く。 この段階は、いわば固相化抗体を用いて抗原を抽出するという段階である。 次に酵素で標識した抗体（これを二次抗体と呼ぶ）を加える。
その結果、再び抗原抗体反応が起こり、この酵素標識抗体は、先に固相化抗体についている抗原の上に結合する。 次いで、上清、すなわち抗原に結合しなかった酵素標識抗体を除き、その後、標識した酵素に対応する基質を加えて酵素反応を行わせる。 この酵素活性は、結合した酵素標識抗体の量によって決まるが、その酵素標識抗体量は固相化抗体に結合した抗原量に応じたものとなるので、結局は、これにより、始めに存在していた抗原量を測定することができる。 あらかじめ標準となる抗原と最終段階での酵素活性との関係を調べ、検量線を作っておき、測定しようとする検体も同様の操作により測定して、得られた結果をこの検量線から分析して測定しようとする検体の抗原量を求めることができる。

【００１４】サンドイッチ法の原理からみて明らかなように、抗原には少なくとも２つ以上の結合部位がなければならない。 従って使用する抗体は、異なる抗原決定基（エピトープ）を認識する２種類以上のものを組み合わせて測定に用いる必要がある〔サンドイッチ法についての詳細は、石川榮治ら、酵素免疫測定法、３０−４４
頁、（１９８２）参照〕。

【００１５】以下に、実験例により本発明を説明する。 実験例（１） ハイブリドーマの作製および腹水抗体の製造 ＳＡＫ １００μｇを０．２５ｍｌの日本薬局方生理食塩水（以下、生食と略称する）に溶解し、この溶液にフロイントの完全アジュバント０．２５ｍｌを加えて乳化させたのち、得られた乳化液０．５ｍｌをＢＡＬＢ／ｃ
マウスの腹腔内に注射し、１０日後にも同様に調製した乳化液０．５ｍｌを追加注射した。 追加注射の１ケ月後に、０．２ｍｌの生食に溶解したＳＡＫ２５μｇをマウスの尾静脈に注射し最終免疫とした。

【００１６】最終免疫後４日目にマウスを殺して脾臓を摘出し、その脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）に懸濁させた。 脾臓細胞浮遊液を塩化アンモニウムの０．８２％水溶液で室温で１０分間処理した後、無血清培地中で遠心分離（２５０×ｇ）により２回洗浄し、ついで無血清培地中に懸濁させた。

【００１７】一方、ＮＳ−１細胞を牛胎児血清を１５％
含むＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させたのち、無血清培地中で遠心分離（２５０×ｇ）により２回洗浄し、ついで無血清培地中に懸濁させた。 懸濁状態の脾臓細胞４．
０×１０ ^７個とＮＳ−１細胞１．０×１０ ^７個を混合したのち、遠心分離（２５０×ｇ）して沈査とし、これにポリエチレングリコール６０００を４５％含む無血清培地を１ｍｌ加え、６分間、３７℃で細胞を融合させた。
得られた細胞混合物を無血清培地での遠心分離（２５０
×ｇ）により洗浄したのち、牛胎児血清を１５％含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地中に１．０×１０ ^５脾臓細胞／ｍｌ
となるように浮遊させ、その０．１ｍｌを９６穴プラスチックマイクロタイタープレートに分注し、７％炭酸ガス存在下のインキュベーター中で培養した。

【００１８】培養開始後１日目にＨＡＴ培地を０．１ｍ
ｌ加え、以後２日目、４日目、７日目、１０日目には培養液の半分を吸引し、その代わりにＨＡＴ培地を追加した。 ９６穴プラスチックマイクロタイタープレートの６
０〜９０％の培養穴に、１穴当たり平均１〜２個のハイブリドーマの集落が生育した。 ハイブリドーマが十分増殖した時点（培養開始より約２週間後）で、培養上清のＳＡＫに対する抗体力価を酵素免疫測定法で検定した。
総計３８４穴中３２穴のハイブリドーマ培養上清にＳＡ
Ｋに対する抗体が認められた。 抗体を産生している各穴のハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニング操作を２回繰り返し行った。 かくして抗体を安定に産生するクローン４株を単離した。 これらのクローンを各々Ｂ３Ｅ６、ＡＳ０５、ＡＳ１７およびＡＳ２２と命名した。 このクローンＢ３Ｅ６は微工研菌寄第１３０８
７号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３０８７として寄託されており、クローンＡＳ２２は微工研菌寄第１３０８８号：Ｆ
ＥＲＭＰ−１３０８８として寄託されている。 これら４
クローンについて得られた培養液（濃縮液）および腹水のＳＡＫに対する抗体力価を酵素免疫測定法で調べ、その結果を表１に示した。 なお、これら４クローンのイソタイプはすべてＩｇＧｌであった。

【００１９】

【表１】

【００２０】実験例（２） エピトープの解析 前記実験例（１）で得られた抗ＳＡＫモノクローナル抗体ＡＳ２２にビオチンを標識した。 抗体のビオチン標識は、アマシャム社製ビオチン化キットを使用した。

【００２１】ＳＡＫ抗原を固定化した９６穴マイクロタイタープレートに該ビオチン標識化ＡＳ２２を段階希釈して加えたのち、ＳＡＫ抗原に結合したビオチン標識化ＡＳ２２をペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ザイメット社製）にて検出した。 そして吸光度の測定値が１．０〜１．５となるように希釈したビオチン標識化ＡＳ２２と各ハイブリドーマクローンの産生する未標識モノクローナル抗体をそれぞれ混合したのち、該混合物をＳＡＫ抗原を固定化した９６穴マイクロタイタープレートに加えて、ビオチン標識化ＡＳ２２のＳＡＫ抗原への結合が混合した未標識モノクローナル抗体により阻害されるか否か調べた。 その結果を図１に示した。 未標識モノクローナル抗体ＡＳ０５、ＡＳ１７、ＡＳ２２はビオチン標識化ＡＳ２２のＳＡＫ抗原への結合を阻害したが、未標識モノクローナル抗体Ｂ３Ｅ６はビオチン標識化ＡＳ２２のＳＡＫ抗原への結合を阻害しなかった。

【００２２】モノクローナル抗体の認識する抗原結合部位（エピトープ）は単一であるため、上記の試験においてビオチン標識化ＡＳ２２のＳＡＫ抗原への結合を阻害した未標識モノクローナル抗体のエピトープは、ＡＳ２
２のエピトープと同一であるか、または近傍に存在すると考えられた。 反対にビオチン標識化ＡＳ２２のＳＡＫ
抗原への結合を阻害しなかった未標識モノクローナル抗体のエピトープは、ＡＳ２２のエピトープとは異なると考えられた。 従って、抗ＳＡＫモノクローナル抗体の中で、ＡＳ２２とＢ３Ｅ６はそれぞれＳＡＫ抗原上の異なるエピトープを認識していることが明らかとなった〔方法についての詳細は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、大沢利昭監訳、モノクローナル抗体、１９１−１９７頁、（１９８
９）、参照〕。

【００２３】実験例（３） サンドイッチ法によるＳＡ
Ｋの検出 ９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各穴に、一次抗体として抗ＳＡＫモノクローナル抗体ＡＳ２
２を、１０μｇ／ｍｌとなるように炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈して添加し、４℃で一晩反応させた。

【００２４】未吸着の一次抗体を洗浄除去したのち、１
％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
にて適宜希釈したＳＡＫを加えて、３７℃で１．５時間反応させた。

【００２５】充分に洗浄したプレートの各穴に、二次抗体としてビオチン標識化した抗ＳＡＫモノクローナル抗体Ｂ３Ｅ６を、１％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて２０００倍に希釈して添加し、３
７℃で１．５時間反応させた。

【００２６】未反応の二次抗体を洗浄除去したのち、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを、１％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて２０
００倍に希釈して添加し、３７℃で１時間反応させた。

【００２７】未反応のペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを洗浄除去したのち、基質である過酸化水素と、発色試薬であるオルトフェニレンジアミン溶液を加えて、３７℃で１０分間反応させた。 プレート各穴の吸光度はタイターテックマルチスキャン（フロー社製）を用いて測定した。

【００２８】測定系に添加したＳＡＫ濃度を横軸に、対応する測定値を縦軸にしてプロットしたものを図２に示した。 その結果、ＳＡＫ濃度が５〜１００ｐＭの間で、
測定値と添加した該ＳＡＫ濃度との間に直線関係が認められ、本発明によりＳＡＫを定量的に測定できることが示された。 また本発明によるＳＡＫの測定感度（検出限界）は、およそ１ｐＭと考えられた。

【００２９】実験例（４） サンドイッチ法によるＳＡ
Ｋ検出に及ぼすプラスミノーゲンの影響 ＳＡＫの血栓溶解活性は、ＳＡＫがプラスミノーゲンと結合して形成される複合体がプラスミノーゲンアクチベータとして作用することで発現されることがわかっている。 従ってＳＡＫの体内動態や作用機作の解明に、本発明のモノクローナル抗体によるＳＡＫ測定法を利用する際には、プラスミノーゲンの影響を調べておく必要がある。

【００３０】そこで前記実験例（３）の測定系において、生理濃度（１．４３μＭ）のヒトプラスミノーゲン（カビ社製）が存在した場合のＳＡＫ測定への影響を調べた。 その結果を図３に示した。 いずれのＳＡＫ濃度においても測定値はヒトプラスミノーゲンの存在にかかわらず一定であり、本発明におけるＳＡＫ測定法はプラスミノーゲンの影響を受けないと判断された。

【００３１】

【発明の効果】以上説明した通り、本発明は血栓溶解活性を有するＳＡＫに対して特異性を示す新規なモノクローナル抗体を提供するものであり、本発明により、ＳＡ
Ｋに対し特異性を示すモノクローナル抗体を製造することが提供され、そのモノクローナル抗体を用いて精度および感度の点において優れたＳＡＫの測定を行うことができる。

【００３２】本発明により、エピトープの異なる２種類の抗ＳＡＫモノクローナル抗体を使用したサンドイッチ法によってＳＡＫを測定することができ、その結果、高感度で、かつプラスミノーゲンの影響を受けることなく、ＳＡＫを測定することができるので、ＳＡＫの体内動態や作用機作の解明をはじめとして、各種のＳＡＫ関連研究用に極めて有用な手段が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】ビオチンで標識化された本発明に係るモノクローナル抗体の１実施例のＳＡＫに対する結合が、未標識モノクローナル抗体によりどの程度阻害されるか、競合試験で調べた結果を示す図である。

【図２】一次抗体として本発明に係る抗ＳＡＫモノクローナル抗体の１実施例ＡＳ２２を、二次抗体として、
同、抗ＳＡＫモノクローナル抗体Ｂ３Ｅ６を用いたサンドイッチ法の系に、種々の濃度のＳＡＫ（〇）、ストレプトキナーゼ（ＳＫ，▲）およびヒトプラスミノーゲン（×）を添加した場合の測定値（吸光度：４９２ｎｍ）
を図示したグラフである。

【図３】本発明に係る抗ＳＡＫモノクローナル抗体の１
実施例を使用したサンドイッチ法の系に種々の濃度のヒトプラスミノーゲンが存在した場合の、ＳＡＫ検出に及ぼす影響を調べた結果を図示したグラフである。

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