利用抑制性tRNA系统制备PTC稳定细胞系及应用
阅读：177发布：2020-05-13
专利汇可以提供利用抑制性tRNA系统制备PTC稳定细胞系及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 制药领域，具体涉及抑制性tRNA调控提前终止密码子(PTC)通读的稳定细胞系制备方法及应用。本发明主要涉及构筑20种对应三种终止密码子的抑制性tRNA，利用20种抑制性tRNA通读提前终止密码子(PTC，UAG/UAA/UGA)。本发明还涉及 串联 多拷贝 正交 tRNA的质粒载体的构建方法，以及借助线性化质粒、慢病毒或Tol2转座子系统将串联的抑制性tRNA基因稳定整合到细胞基因组的方法。本发明进一步涉及稳定细胞系的应用，如 包装 复制 缺陷 型(PTC)病毒 疫苗 。，下面是利用抑制性tRNA系统制备PTC稳定细胞系及应用专利的具体信息内容。
1.经改造的抑制性tRNA(stRNA)，其特征在于，所述stRNA来源于真核生物，所述stRNA识别提前终止密码子，所述stRNA能够携带天然氨基酸。
2.如权利要求1所述的stRNA，其中所述stRNA的基因选自SEQ ID NO:1-20所示的序列。
3.翻译系统，其包含氨酰tRNA合成酶和权利要求1或2所述的stRNA，其中氨酰tRNA合成酶和stRNA的基因位于同一载体上。
4.如权利要求3所述的翻译系统，其还包含真核细胞；在一个实施方案中，真核细胞选自293T、BHK-21、MDCK、RD、Vero或CHO细胞。
5.真核细胞，其包含氨酰tRNA合成酶和权利要求1或2所述的stRNA，其中氨酰tRNA合成酶和stRNA的基因以位于同一载体的方式导入所述真核细胞；在一个实施方案中，真核细胞选自293T、BHK-21、MDCK、RD、Vero或CHO细胞。
6.制备如权利要求5所述的真核细胞的方法，其包括:
(1)在载体上分别连接318种单拷贝抑制性tRNA并检测其通读效率，从中确定20种氨基酸分别对应的通读效率最高的抑制性tRNA；
(2)将(1)中确定的20种抑制性tRNA的序列，分别设计20种多拷贝串联抑制性tRNA片段，并将此片段和突变的荧光蛋白，获得20种同时含有报告基因、抗性基因以及高通读效率的多拷贝串联抑制性tRNA载体；
(3)将(2)中所述的抑制性tRNA载体，转导真核细胞，用抗生素筛选，挑取带有荧光的单克隆，并扩大培养，最终得到稳定细胞系，获得整合了突变型绿色荧光蛋白报告基因和多拷贝stRNA的稳定细胞系。
7.利用如权利要求5所述的真核细胞制备含有复制缺陷型(PTC)病毒疫苗方法，包括步骤:
(1)在病毒目的蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个氨基酸位点；
(2)在编码(1)所述的目的蛋白的核酸分子中将(1)中所选择的位点的氨基酸的密码子突变为终止密码子UAG、UAA或UGA；
(3)将(2)中得到的突变的核酸与合适的载体可操作地连接，得到核酸的表达载体；
(4)将(3)得到的突变的核酸的表达载体转染权利要求5所述的真核细胞，将转染成功后的宿主细胞在培养基中培养，在适当的时间收集病毒；
(5)检测病毒的包装滴度和活性。
8.使用如权利要求7所述的方法制备的含有定点突变的病毒。
9.含有有效量的权利要求8所述的定点突变的病毒的组合物。
10.含有有效量的权利要求8所述的定点突变的病毒的疫苗。
11.药物组合物，其中含有有效量的权利要求8所述的定点突变的病毒，以及药学上可以接受的赋形剂。
12.权利要求8所述的定点突变的病毒在制备减毒活疫苗、制备预防和治疗病毒感染相关药物中的用途。
13.权利要求8所述的定点突变的病毒在预防和治疗感染中的用途。
利用抑制性tRNA系统制备PTC稳定细胞系及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物制药领域，具体涉及抑制性tRNA调控提前终止密码子(Premature termination codons，PTC)通读的稳定细胞系制备方法及应用。本发明主要涉及构筑20种对应三种终止密码子的抑制性tRNA，利用20种抑制性tRNA通读提前终止密码子(PTC，UAG/UAA/UGA)。本发明还涉及串联多拷贝正交tRNA的质粒载体的构建方法，以及借助线性化质粒、慢病毒或Tol2转座子系统将串联的抑制性tRNA基因稳定整合到细胞基因组的方法。本发明进一步涉及稳定细胞系的应用，如包装复制缺陷型(PTC)病毒疫苗。
背景技术
[0002] 抑制性tRNA通读无义突变
[0003] 人类基因组中的61种密码子可以被tRNA识别，编码20种氨基酸，三种终止密码子(UAG、UAA、UGA)没有相应的tRNA识别，不编码氨基酸，进而终止翻译。但是有研究发现，存在可以识别终止密码子的tRNA，使终止密码子编码氨基酸，蛋白翻译正常进行。这种能够识别终止密码子的tRNA，即为无义突变抑制性tRNA。抑制性tRNA存在广泛，无论在植物细胞还是动物细胞中，都发现了抑制性tRNA。但由于抑制性tRNA在细胞中含量极少，因此抑制性tRNA不易被检测到。
[0004] 无义突变抑制性tRNA由正常编码氨基酸tRNA反密码子环碱基突变产生，突变后的tRNA能识别终止密码子并与终止密码子完全互补配对，同时仍能携带天然氨基酸，能够在提前终止密码子处插入特定氨基酸，通读无义突变。基于抑制性tRNA能够通读无义突变的特性，有文献报道应用抑制性tRNA通读原核和真核细胞中含有提前终止密码子的蛋白，恢复蛋白表达。另外，虽然抑制性tRNA能够恢复含无义突变蛋白表达，但不同抑制性tRNA通读效率有较大差异。因此，需找高效抑制性tRNA，构建多种稳定表达高效通读终止密码子的抑制性tRNA的细胞系，比较在哺乳动物细胞中通读效率差异尤为重要。
[0005] PTC技术及其应用瓶颈
[0006] 经过数年的研究，人们对原核生物核糖体的翻译机制已有较全面的理解，多种核糖体不同功能状态的晶体和电镜结构已得到解析，大多数氨酰tRNA合成酶的结构也已获得。基于这些研究成果，近年来发展起来了遗传密码子扩展的技术——在基因组中引入琥珀终止密码子(TAG)，利用外源非天然氨基酸生物正交翻译系统来编码多种非天然氨基酸，并在生物活体内将其定点插入。到目前为止，这一技术已经将数种非天然氨基酸(包括亲和标记和光致异构化的氨基酸、羰基氨基酸和糖基化氨基酸)成功地定点表达在活细胞的蛋白质当中，赋予了这些蛋白质新颖的物理、化学和生理性质(L.Wang等，2001，Science 292:498-500；J.W.Chin等，2002，Journal of the American Chemical Society 124:9026-
9027；J.W.Chin，&P.G.Schultz，2002，ChemBioChem 11:1135-1137)。这些研究表明，该技术可以有选择性将羰基、炔基和叠氮基团等特殊化学基团引入蛋白质中，实现蛋白质的定点特异修饰，改善蛋白质的性质。同时，该技术还可应用在活体生物体(如病毒、细菌等)的定点标记、定点修饰、复制的控制等方面(Si L等，2016，Science 354:1170-1173)。
9027；J.W.Chin，&P.G.Schultz，2002，ChemBioChem 11:1135-1137)。这些研究表明，该技术可以有选择性将羰基、炔基和叠氮基团等特殊化学基团引入蛋白质中，实现蛋白质的定点特异修饰，改善蛋白质的性质。同时，该技术还可应用在活体生物体(如病毒、细菌等)的定点标记、定点修饰、复制的控制等方面(Si L等，2016，Science 354:1170-1173)。
[0007] PTC技术即为在病毒基因组中引入提前终止密码子(Premature termination codons，PTC)，以控制病毒的复制、蛋白表达，使其依赖于外源非天然氨基酸的病毒疫苗开发技术。PTC技术真正应用于病毒疫苗的开发上，一个亟待解决的问题就是如何构建稳定整合且大量表达正交tRNA/氨酰tRNA合成酶/GFP报告基因的工程细胞。实现稳定整合正交tRNA/氨酰tRNA合成酶/GFP报告基因的工程细胞的构建，将大大促进PTC技术在病毒疫苗研发中的应用。但是目前的该工程细胞的构建技术仍存在以下难点：
[0008] 首先由于tRNA的转录和加工有异于蛋白质，因此如何在真核细胞中实现正交的原核tRNA的高效稳定表达依旧是个国际难题；其次，按照传统的方法，同时稳定表达三个不同的外源基因元件的工程细胞，需要先后经过三轮基因转染或病毒转导以及相应的三种不同抗生素的筛选过程，由于在多种抗生素压力下细胞状态不佳、难以成活，同时筛选所用抗生素价格昂贵，造成细胞系构建过程繁琐，成功率低且成本高昂；目前成功构建的稳定整合正交tRNA/氨酰tRNA合成酶/GFP报告基因的工程细胞其细胞来源为人胚肾HEK293T细胞，该细胞适应性较强，但在病毒疫苗的拯救和开发过程中的应用局限于艾滋病毒和流感病毒，多数病毒在这种细胞系中的拯救效率较低，难以得到广泛应用；另外，传统的基因密码子扩展技术多局限于琥珀终止密码子(TAG)，这是基于在研究基因密码子扩展技术的大肠杆菌模型中琥珀终止密码子(TAG)的使用频率最低而决定的，但是研究表明，某些病毒基因的密码子使用频率和宿主细胞不完全匹配，这也是PTC技术应用于研发病毒疫苗的又一局限。
[0009] 因此，构建多种稳定表达抑制性tRNA的细胞系，利用内源性天然氨基酸高效通读截短蛋白，从而实现PTC病毒疫苗的稳定高效包装，同时解决非天然氨基酸残留所带来的安全性问题，有效促进PTC技术在病毒疫苗研发中的应用。
[0010] Vero细胞在疫苗生产中的应用
[0011] 1963年，日本千叶大学的Y.Yasumura和Y.Kawakita两位学者研制出Vero细胞系，来源于非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)肾上皮细胞。1964年，Simizu博士将第93代的Vero细胞提供给英国的Tripical病毒实验室(NIAID，NIH)。1979年，第113代Vero细胞提供给美国标准菌种保藏中心(America Type Culture Collection，ATCC)，传代至第121代建立细胞库。Vero细胞为连续细胞系，可在体外连续传代，并对多种病毒敏感，包括SV-40、SV-5、麻疹病毒、虫媒病毒、逆转录病毒、风疹病毒、猴病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、牛痘病毒等多品种病毒。因此，Vero细胞制备后被就广泛应用实验室的相关生物学检测，如病毒扩增和空斑检测等。
[0012] Vero细胞用于疫苗研制发展是自二十世纪九十年代以来快速发展的，并得到世界卫生组织和我国生物制品规程批准认可。近十年，我国病毒性疫苗的研究也取得了快速发展，新型疫苗不断涌现。随着先进的细胞培养技术，如生物反应器、发酵罐细胞悬浮培养技术的推广应用，也使得更多的生产企业倾向选择Vero细胞进行病毒性疫苗的生产。
[0013] 与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比，Vero细胞具有以下特点：①来源方便，可连续传代，生长速度快；②对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高；③遗传性状稳定，恶性转化程度低，生物安全性较高；④培养条件要求不苛刻，易于在生物反应器实施大规模培养。
发明内容
[0014] 发明人经过对现有技术的思考和研究，为了提高病毒的包装效率，以及将来的工业化生产，通过对Transfer RNA database(http://trna.bioinf.uni-leipzig.de/DataOutput/)中所有的tRNA进行改造，改变tRNA反密码子环得到与提前终止密码子完全互补配对的抑制性tRNA，通过SOE PCR的方法构建抑制性tRNA，并在抑制性tRNA 5’端连接7sk启动子，得到318种单拷贝抑制性tRNA载体。然后在GFP报告基因模型和双荧光素酶报告基因模型中进行通读效率分析，得到20种通读效率最高的抑制性tRNA即为(SEQ ID NO:1-20)。通过全基
因合成的方法合成多拷贝串联的抑制性tRNA质粒载体，将其克隆至含有真核细胞筛选常用的抗性标记例如潮霉素、博来霉素、嘌呤霉素抗性基因(优选潮霉素抗性基因)的pcDNA3.1/Hygro(+)载体(SEQ ID NO:21)，同时将引入提前终止密码子的报告基因(例如以TAG为例，在Y39位引入提前终止密码子的报告基因GFP，SEQ ID NO:22)克隆至连有多拷贝抑制性tRNA的pcDNA3.1载体的CMV启动子之后，得到同时含有报告基因和多拷贝抑制性tRNA的pcDNA3.1载体。可在哺乳动物细胞中实现无义突变的完整蛋白的表达以及PTC病毒疫苗的拯救等。
因合成的方法合成多拷贝串联的抑制性tRNA质粒载体，将其克隆至含有真核细胞筛选常用的抗性标记例如潮霉素、博来霉素、嘌呤霉素抗性基因(优选潮霉素抗性基因)的pcDNA3.1/Hygro(+)载体(SEQ ID NO:21)，同时将引入提前终止密码子的报告基因(例如以TAG为例，在Y39位引入提前终止密码子的报告基因GFP，SEQ ID NO:22)克隆至连有多拷贝抑制性tRNA的pcDNA3.1载体的CMV启动子之后，得到同时含有报告基因和多拷贝抑制性tRNA的pcDNA3.1载体。可在哺乳动物细胞中实现无义突变的完整蛋白的表达以及PTC病毒疫苗的拯救等。
[0015] 相比于其它方法，本发明的优点可体现在如下中的一个或几个：
[0016] 1.获得了20种能够高效通读无义突变的抑制性
[0017] 2.实现任意一种同时含有报告基因、抗性基因以及高通读效率的多拷贝串联抑制性tRNA的构建；
[0018] 3.获得了20种携带高通效率的抑制性tRNA的稳定细胞系；
[0019] 4.利用该稳定细胞系，可以在目的蛋白的任意位点高效插入特定的天然氨基酸，实现无义突变蛋白的完整表达、PTC病毒疫苗的高效包装等。
[0020] 具体地，在本发明的一个具体的实施方案中，在宿主细胞Vero细胞中整合了高通读效率的多拷贝串联抑制性tRNA，主要通过以下步骤：(1)构建并通过实验检测318种单拷贝抑制性tRNA载体的通读效率，从中确定20种氨基酸分别对应的通读效率最高的抑制性tRNA；(2)根据步骤(1)中确定的20种抑制性tRNA的序列，设计合成并构建20种同时含有报告基因、抗性基因以及高通读效率的多拷贝串联抑制性tRNA载体；(3)将步骤(2)种获得的多拷贝串联抑制性tRNA载体质粒电转染Vero细胞，电转后48小时加入400μg/ml的潮霉素(Hygromycin)抗生素进行筛选，挑取带有绿色荧光的单克隆，并扩大培养，获得同时整合了多拷贝串联抑制性tRNA和突变型绿色荧光蛋白报告基因的稳定细胞系，最终得到稳定细胞系Vero-stRNA。
[0021] 抑制性tRNA通读无义突变的原理在于：(1)在细胞正常的翻译过程中，提前终止密码子被第一类肽链释放因子eRF1识别，而正常tRNA不能识别终止密码子，eRF3是一类依赖于核糖体和第一类肽链释放因子的GTPase，协同eRFl促进肽链从核糖体上释放，翻译过程终止(Zhouravleva,G.et al.EMBO J,1995,14,4065-72.)。而构建的抑制性tRNA为正常tRNA通过反密码子环改造而来，其反密码子环能够与终止密码子UAG、UAA、UGA完全互补配对，与eRF1竞争识别提前终止密码子，改变反密码子环的tRNA仍能携带对应的氨基酸，因此，抑制性tRNA在提前终止密码子位置插入氨基酸，使翻译过程继续进行，通读无义突变；(2)所构建的抑制性tRNA5’端连有7sk启动子，能够启动抑制性tRNA在哺乳动物细胞中大量表达，最终恢复蛋白表达。
[0022] 更为具体地，本发明提供了：
[0023] 1.含有7sk启动子序列的318种抑制性tRNA表达载体，可以实现任意一种抑制性TNRA在哺乳动物细胞中的过表达。
[0024] 2.20种能够高效通读无义突变的抑制性
[0025] 3.20种同时含有报告基因、抗性基因以及高通读效率的多拷贝串联抑制性tRNA载体质粒；
[0026] 4.稳定细胞系Vero-Ast，Vero-Rst，Vero-Nst，Vero-Dst，Vero-Cst，Vero-Qst，Vero-Est，Vero-Gst，Vero-Hst，Vero-Ist，Vero-Lst，Vero-Kst，Vero-Mst，Vero-Fst，Vero-Pst，Vero-Sst，Vero-Tst，Vero-Wst，Vero-Yst，Vero-Vst，该细胞系由1轮质粒稳定电转染获得，携带有多拷贝串联抑制性tRNA基因，利用该稳定细胞系，可以在目的病毒蛋白质任意位点引入特定的天然氨基酸，从而高效率拯救定点突变的PTC病毒疫苗，同时更好地保持病毒的免疫原性。
[0027] 5.利用含有提前终止密码子UAG的流感病毒包装质粒系统和高通读效率的多拷贝串联抑制性tRNA稳定细胞系高效包装PTC流感病毒疫苗。
[0028] 在一个方面，本发明提供一种携带有改造后的人抑制性tRNA(stRNA)基因的细胞系。
[0029] 在一个实施方案中，其中所述的stRNA是多个拷贝数的启动子-stRNA。
[0030] 在又一个实施方案中，其中所述的stRNA是6个拷贝数的type-3Pol III启动子启动的stRNA。
[0031] 在一个实施方案中，其中所述的stRNA的特征在于反密码子环为CUA，UUA或UCA。
[0032] 在又一个实施方案中，其中所述的改造后的人stRNA SEQ ID NO:1-20所示。
[0033] 在一个实施方案中，所述的细胞系是通过下述的步骤获得的:
[0034] (1)在如SEQ ID NO:24所示的Bjmu载体上分别连接318种单拷贝抑制性tRNA并检测其通读效率，从中确定20种氨基酸分别对应的通读效率最高的抑制性tRNA；
[0035] (2)将(1)中确定的20种抑制性tRNA的序列，分别设计20种多拷贝串联抑制性tRNA片段，并将此片段和突变的绿色荧光蛋白，获得20种同时含有报告基因、抗性基因以及高通读效率的多拷贝串联抑制性tRNA载体pcDNA3.1-6Gln-stRNA-*GFP-Hygro；
[0036] (3)将(2)中所述的抑制性tRNA载体pcDNA3.1-6Gln-stRNA-*GFP-Hygro，转导Vero细胞，用潮霉素筛选，挑取带有绿色荧光的单克隆，并扩大培养，最终得到稳定细胞系，获得整合了突变型绿色荧光蛋白报告基因和6个拷贝数stRNA的稳定细胞系；
[0037] 在又一个实施方案中，所述的稳定细胞系是Vero-Ast，Vero-Rst，Vero-Nst，Vero-Dst，Vero-Cst，Vero-Qst，Vero-Est，Vero-Gst，Vero-Hst，Vero-Ist，Vero-Lst，Vero-Kst，Vero-Mst，Vero-Fst，Vero-Pst，Vero-Sst，Vero-Tst，Vero-Wst，Vero-Yst，Vero-Vst。
[0038] 在又一个方面，本发明提供利用本发明的细胞系制备含有非天然氨基酸的复制缺陷型(PTC)病毒疫苗方法，包括步骤:
[0039] (1)在病毒目的蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个氨基酸位点；
[0040] (2)在编码(1)所述的目的蛋白的核酸分子中将(1)中所选择的位点的氨基酸的密码子突变为终止密码子UAG、UAA或UGA；
[0041] (3)将(2)中得到的突变的核酸与合适的载体可操作地连接，得到核酸的表达载体；
[0042] (4)将(3)得到的突变的核酸的表达载体转染本发明的细胞系，将转染成功后的宿主细胞在培养基中培养，在适当的时间收集病毒；
[0043] (5)检测病毒的包装滴度和活性。
[0044] 在另一方面，本发明提供编码本发明的突变蛋白或肽的核酸分子。
[0045] 在一个实施方案中，所述的突变病毒蛋白或肽的核酸分子特征在于编码非天然氨基酸的密码子为终止密码子UAG、UAA或UGA。
[0046] 在又一方面，本发明提供使用本发明的方法制备的含有定点突变的病毒。
[0047] 在另一方面，本发明提供含有有效量的本发明的定点突变的病毒的组合物。
[0048] 在又一方面，本发明提供含有有效量的本发明的定点突变的病毒的疫苗。
[0049] 在另一方面，本发明提供药物组合物，其中含有有效量的本发明的定点突变的病毒，以及药学上可以接受的赋形剂。
[0051] 在另一方面，本发明提供本发明的定点突变的病毒在预防和治疗感染中的用途。
[0052] 在一个方面，本发明提供经改造的抑制性tRNA(stRNA)，其特征在于，所述stRNA来源于真核生物，所述stRNA识别提前终止密码子，所述stRNA能够携带天然氨基酸。
[0053] 在一个实施方案中，所述stRNA的基因选自SEQ ID NO:1-20所示的序列。
[0054] 在另一方面，本发明提供翻译系统，其包含氨酰tRNA合成酶和本发明所述的stRNA，其中氨酰tRNA合成酶和stRNA的基因位于同一载体上。
[0055] 在一个实施方案中，所述翻译系统还包含真核细胞；在一个实施方案中，真核细胞选自293T、BHK-21、MDCK、RD、Vero或CHO细胞。
[0056] 在又一方面，本发明提供制备本发明的真核细胞的方法。
[0058] 本发明采用以下附图来举例说明本发明的有益效果。应当理解的是，这些仅用于说明本发明的具体实施方案，并不意图限制本发明的范围。
[0059] 图1：单拷贝抑制性tRNA的构建和通读效率筛选
[0060] A：正常tRNA改造反密码子环合成抑制性tRNA；
[0061] B：抑制性tRNA通读PTC示意图，携带氨基酸的抑制性tRNA反密码子环与提前终止密码子完全互补配对，通读PTC；
[0062] C：连有7sk-单拷贝抑制性tRNA的Bjmu载体质粒；
[0063] D：GFP报告基因模型和双荧光素酶报告基因模型中的通读效率分析。
[0064] 图2：高通读效率的多拷贝串联抑制性tRNA载体质粒构建
[0065] A：多拷贝串联抑制性tRNA片段；
[0066] B：用MfeI酶将多拷贝串联抑制性tRNA片段克隆至pcDNA3.1/Hygro(+)载体；
[0067] C：同时携带报告基因、抗性基因以及高通读效率多拷贝串联抑制性tRNA载体质粒；
[0068] 图3：筛选稳定细胞系的流程
[0069] 将获得的多拷贝串联抑制性tRNA载体质粒电转染Vero细胞，电转后48小时加入400μg/ml的潮霉素抗生素进行筛选，挑取带有绿色荧光的单克隆，继续用200μg/ml的潮霉素扩大培养，获得同时整合了多拷贝串联抑制性tRNA和突变型绿色荧光蛋白报告基因的稳定细胞系，最终得到稳定细胞系Vero-Ast，Vero-Rst，Vero-Nst，Vero-Dst，Vero-Cst，Vero-Qst，Vero-Est，Vero-Gst，Vero-Hst，Vero-Ist，Vero-Lst，Vero-Kst，Vero-Mst，Vero-Fst，Vero-Pst，Vero-Sst，Vero-Tst，Vero-Wst，Vero-Yst，Vero-Vst。
[0070] 图4：稳定细胞系的鉴定
[0071] A：tRNAPyl在Vero-PYL细胞中基因拷贝数标准曲线；
[0072] B：稳定细胞系的绿色荧光蛋白成像；
[0073] C：蛋白质印迹检测稳定细胞系全长绿色荧光蛋白的表达；
[0074] D：稳定细胞系体外高效拯救PTC流感病毒疫苗。
具体实施方式
[0075] 为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。何与本发明等价的变体或者实施方案都包括在本发明中。
[0076] 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0077] 除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验条件。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。
[0078] 下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
[0079] 实施例1：20种抑制性tRNA的确定和载体构建
[0080] (1)20种抑制性tRNA的确定
[0081] 通过对Transfer RNA database(http://trna.bioinf.uni-leipzig.de/DataOutput/)中所有的tRNA进行改造，改变tRNA反密码子环得到与提前终止密码子完全互补配对的抑制性tRNA，得到318种抑制性tRNA序列。改变识别这20种密码子的相应tRNA反密码子环碱基得到无义突变抑制性tRNA序列并交付北京擎科新业生物技术有限公司进行合成，序列合成后通过SOE PCR的方法在抑制性tRNA 5’端连接7sk启动子(SEQ ID NO:23)，克隆至pGEM-T Easy载体(A1360，Promega)得到318种单拷贝抑制性tRNA载体。在得到318种抑制性tRNA载体的基础上，用BamHI和Bgl II双酶切抑制性tRNA载体，BamHI单酶切Bjmu载体(SEQ ID NO:24)，将酶切产物连接，得到连有7sk-抑制性tRNA的Bjmu质粒，如图1C所示为的单拷贝抑制性tRNA载体质粒。
[0082] 表1.7sk启动子序列
[0083]
[0084] 表2.20种抑制性tRNA序列
[0085]
[0086]
[0087] (2)利用点突变的GFP报告基因和双荧光素报告基因检测20种抑制性tRNA通读效率
[0088] a.点突变的GFP报告基因验证抑制性tRNA通读效率
[0089] 将实施例1(1)中获得的318种单拷贝抑制性tRNA载体分别与pcDNA3.1-GFP39TAG(SEQ ID NO:25)以3:1比例混合，再与转染试剂megatran1.0(Origene，TT200004)按1:3比例混合，涡旋混匀后静置15分钟，共同加入293T细胞，6小时后换液，置细胞于37℃，5％CO2的孵箱中继续培养48小时，荧光显微镜观察绿色荧光。加入抑制性tRNA后，可以镜下观察到大量绿色荧光蛋白，并验证所选20种抑制性tRNA的高通读效率。
[0090] b.双荧光素酶报告基因验证抑制性tRNA通读效率
[0091] 发明人根据前期研究，将荧光素酶Renilla和Firefly报告基因以GGGGS接头相连，并在接头后分别连接含有提前终止密码子(PTC，UAG/UAA/UGA)的TMV leaky序列(以TAG为例CAATAGCAATTA)，构建了含有无义突变的双荧光素酶报告系统，即可通过测定该基因的Firely相对于Renila的荧光读值，反映通读效率差异。
[0092] 将实施例1(1)中获得的318种单拷贝抑制性tRNA载体分别与双荧光素报告基因pGL4-2luc-TAG(SEQ ID NO:26)以1:2比例混合，再与转染试剂megatran1.0按1:3比例混合，涡旋混匀后静置15分钟，共同加入293T细胞，6小时后换液，置细胞于37℃、5％CO2的孵箱中继续培养48小时后裂解细胞，细胞裂解液加入荧光素酶底物，检测荧光读值。结果如图1D所示。
[0093] 在上述GFP报告基因模型和双荧光素酶报基因模型中进行通读效率分析，得到20种通读效率最高的抑制性tRNA即为
[0094] (3)多拷贝抑制性tRNA质粒载体的构建和通读效率的验证
[0095] 根据已确定的抑制性tRNA序列和启动子序列进行设计拼接，选用的启动子分别为人源H1启动子(SEQ ID NO:27)，人源u6启动子(SEQ ID NO:28)，人源7sk启动子(SEQ ID NO:23)，通过基因全合成得到H1—stRNA—hu6—stRNA—7sk—stRNA—Cherry-F—hu6—stRNA—7sk—stRNA—H1—stRNA片段，其中Cherry-F为来源于荧光蛋白Cherry的一段序列，用于多拷贝串联tRNA的测序。
[0096] 表3.启动子序列
[0097]
[0098] 表4.内部测序引物序列
[0099]
[0100] 在得到多拷贝抑制性tRNA的基础上，用MfeI单酶切抑制性tRNA和pcDNA3.1/Hygro(+)载体(SEQ ID NO:21)，并对载体序列去磷酸化，将酶切产物连接，得到潮霉素抗性并连有多拷贝抑制性tRNA的pcDNA3.1载体，如图2B所示。然后用BamHⅠ和XhoⅠ将得到pcDNA3.1载体和引入相应酶切位点的EGFP39TAG片段双酶切，将GFP39TAG克隆至连有多拷贝抑制性tRNA的pcDNA3.1载体的CMV启动子之后，得到同时含有报告基因和多拷贝抑制性tRNA的pcDNA3.1载体，如图2C所示。
[0101] 然后在按照(2)所述方法在GFP报告基因模型和双荧光素酶报基因模型中验证得到的20种多拷贝抑制性tRNA的通读效率。
[0102] 实施例2：抑制性tRNA的稳定细胞系的筛选
[0103] (1)制备线性化质粒：
[0104] 将同时含有报告基因和多拷贝抑制性tRNA的pcDNA3.1载体质粒按照表5所示体系用Bgl II限制性内切酶(FD0083，Thermo)进行线性化，获得的线性化质粒经Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(A9285，Promega)回收定量。
[0105] 表5.质粒酶切体系
[0107] (2)多拷贝抑制性tRNA的电转染：
[0108] a.制备细胞悬液：Vero细胞用完全培养基(MEM，Gibco，11095080；10％胎牛血清，PAN，P30-3302；1％青/链霉素，Macgene，CC004)培养至汇合度为70％～80％时消化、收集细胞，用Opti-MEM(Gibco，31985070)洗三次，以洗去培养基中的抗生素和血清，然后用Opti-MEM重悬，上下吹打细胞使之无结团，取少量悬液进行细胞计数并算出总细胞数量。
[0109] b.制备细胞和质粒的混合液：将一定量的细胞与质粒DNA混合，充分混匀，使其最6
终浓度达到每管100μl混合液中含有1×10个细胞和10μg线性化质粒DNA，其中细胞体积为
90μl，质粒DNA体积为10μl。
终浓度达到每管100μl混合液中含有1×10个细胞和10μg线性化质粒DNA，其中细胞体积为
90μl，质粒DNA体积为10μl。
[0110] c.使用NEPA21高效基因转染系统(NEPA GENE，Japan)和EC-002S中号电转杯进行实验，电转仪参数如表6所示：
[0111] 表6.Vero细胞质粒电转染程序参数
[0112]
[0113] d.电转实验：将细胞/DNA混合液分装至电转杯中，100μl/杯，并做好标记；敲打电转杯，清除体系内的气泡后将电转杯放入电转杯腔；按下“Ω”键，测定并记录电阻值(测量得到的电阻值应处于30-50Ω之间)；按下“start”键，执行电转程序；电转程序结束后迅速去除电转杯，用配备的吸管，从预先准备好的10cm皿中吸取少量培养基(约200-300ul)加入电转杯中轻微吹打2-3下，然后将悬液全部吸出，加入到10cm皿中；一个10cm皿需要重复电转5-7次以达到筛选所需细胞量。
[0114] (3)电转后细胞的抗生素筛选：
[0115] 质粒电转48h后可以进行抗生素筛选，筛选浓度要根据具体细胞的杀伤曲线来决定，Vero细胞潮霉素筛选浓度为200μg/ml，抗生素筛选10天，直至电转野生型EGFP质粒的空白组全部死亡，电转多拷贝抑制性tRNA的实验组形成单克隆，经过多轮流式细胞分选分离纯化GFP阳性克隆，扩大培养得到稳定细胞系Vero-Ast，Vero-Rst，Vero-Nst，Vero-Dst，Vero-Cst，Vero-Qst，Vero-Est，Vero-Gst，Vero-Hst，Vero-Ist，Vero-Lst，Vero-Kst，Vero-Mst，Vero-Fst，Vero-Pst，Vero-Sst，Vero-Tst，Vero-Wst，Vero-Yst，Vero-Vst。
[0116] 实施例3：抑制性tRNA稳定细胞系的鉴定：
[0117] (1)抑制性tRNA在稳定细胞系中基因拷贝数的检测：
[0118] a.标准曲线的建立：
[0119] 将含有外源多拷贝抑制性tRNA载体与Vero细胞的基因组DNA混合，设置含有6个，12个，24个，48个及96个外源基因质粒拷贝数的标准品对照，方法如下：
[0120] ①假设Vero细胞的基因组DNA用量为x ng；
[0121] ②含有外源基因的质粒的大小为y bp；
[0122] ③Vero细胞的基因组DNA大小为2.97Gb；
[0123] ④每个多拷贝抑制性tRNA载体质粒中都有6个抑制性tRNA串联，外源基因片段完全随机的头尾相连的插入在一条染色体上，则
[0124] ⑤设计引物分别扩增转座载体质粒上的6-tRNA以及管家基因转铁蛋白受体(TERC)基因片段，应用 qPCR Master Mix(Promega,A6001)和Stratagene Mx3005PTM Real-Time PCR扩增仪进行实验，每个样品做三次重复，PCR反应体系如表所示，反应结果取平均C(t)，数值用Mean±SD表示。将C(t)6stRNA-C(t)TERC得到ΔC(t)，再对样品拷贝数除以6后以2为底的对数值即 作图，得到绝对定量标准曲
线，如图4A所示。
线，如图4A所示。
[0125] b.tRNA实时荧光定量PCR检测
[0126] 按照天根基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取待检测细胞基因组DNA，设计引物分别扩增外源基因6stRNA以及管家基因转铁蛋白受体(TERC)基因片段。应用 qPCR Master Mix(Promega,A6001)和Stratagene Mx3005PTM Real-Time PCR扩增仪进行实验，每个样品做三次重复，PCR反应体系如表7所示，反应结果取平均C(t)，数值用Mean±SD表示。得到的外源基因C(t)代入标准曲线中可计算得到外源基因tRNA的拷贝数。
[0127] 表7.外源基因6stRNA的检测实时荧光定量PCR反应体系
[0128]
[0129] (2)抑制性tRNA在稳定细胞系中转录水平的检测：
[0130] 使用TRIzol RNA提取试剂提取细胞总RNA，并用Promega Reverse Transcription System按照表7所示反应体系和条件逆转录成cDNA。设计引物分别扩增外源基因6stRNA以及管家基因转铁蛋白受体(TERC)基因片段。按照(1)所示方法应用 qPCR Master Mix(Promega,A6001)和Stratagene Mx3005PTM Real-Time PCR扩增仪进行实验，每个样品做三次重复，PCR反应体系如表所示，反应结果取平均C(t)，数值用Mean±SD表示。得到的外源基因C(t)代入标准曲线中可计算得到外源基因tRNA的拷贝数。
[0131] 实施例4：抑制性tRNA依赖的PTC流感病毒疫苗的拯救：
[0132] (1)拯救野生型流感病毒WSN的质粒的获得
[0133] 根据Pubmed公布的流感病毒A/WSN/1933的基因序列，经全基因合成，获得该流感病毒各个基因片段的基因。流感病毒各基因序列分别如SEQ ID NO:29-36所示。然后将其分别连接在pHH21、pCDNA 3(neo)、pCAGGS/MCS载体(均为常见市售载体)，获得拯救野生型流感病毒WSN的质粒。获得的质粒的命名及构成如表8所示。
[0134] 表8.野生型流感病毒WSN的质粒序列对照表
[0135]
[0136] (2)定点突变后的流感病毒的拯救
[0137] 发明人通过生物信息学工具Consurf对流感病毒各个蛋白的氨基酸的保守性进行分析，并根据已被解析的流感病毒蛋白的晶体结构(NP-PDB:2IQH；PA-PDB：4IUJ；PB1-PDB：3A1G、2ZNL；PB2-PDB：4ENF；NA-PDB：3TI6；HA-PDB：1RVT；M-PDB：4PUS、2RLF、3BKD；NS-PDB：
3L4Q)。从中选择保守、相对保守、相对不保守、不保守的氨基酸位点进行突变。
3L4Q)。从中选择保守、相对保守、相对不保守、不保守的氨基酸位点进行突变。
[0138] 按照正常的拯救流感病毒而方法，将表8所示拯救流感病毒所用的12个质粒共转染多拷贝串联抑制性tRNA稳定细胞系，只是用定点突变的质粒替换这12个质粒中相应的质粒(例如对于WSN PTC-3而言，即用定点突变的后的Ben 3质粒替换原有野生型Ben 3质粒)。对应于六孔板的每个孔，每种质粒加0.1μg。转染后，观察细胞的病变情况。结果如图4D所示，在普通细胞系中转染PTC流感病毒，不能观察到细胞病变，即没有病毒被包装并扩增；而在抑制性tRNA稳定细胞系中，在病毒拯救第5天开始，均可观察到明显的细胞病变效应，显示病毒得以成功拯救。
[0139] 虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。例如，本申请虽然以流感病毒为例对稳定细胞系的应用进行了说明，但是很显然，本发明不应当仅仅限于流感病毒，本发明适用于任何类型的目的PTC病毒的拯救。
[0141] 本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换系统及其方法 | 2020-05-12 | 132 |
| 利用抑制性tRNA系统制备PTC稳定细胞系及应用 | 2020-05-13 | 177 |
| 一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用 | 2020-05-13 | 303 |
| 一种通过基因组编辑提高小麦抗性淀粉含量的方法及其技术体系 | 2020-05-13 | 217 |
| 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途 | 2020-05-18 | 22 |
| 一种多丝量、抗血液型脓病家蚕的育种方法 | 2020-05-08 | 594 |
| 一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统 | 2020-05-12 | 473 |
| 用于改良真菌菌株的高通量基因组工程改造平台 | 2020-05-16 | 381 |
| 一种抗体进化方法及其应用 | 2020-05-11 | 282 |
| DNA大片段的克隆方法 | 2020-05-08 | 578 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
系统获得抗性热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈