一种通过基因组编辑提高小麦抗性淀粉含量的方法及其技术体系
阅读：217发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种通过基因组编辑提高小麦抗性淀粉含量的方法及其技术体系专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种通过基因组编辑提高小麦抗性 淀粉 含量的方法及其技术体系。本发明提供了一种通过基因编辑技术提高小麦 种子 中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量的方法，包括如下步骤：降低小麦中SBEIIa蛋白的丰度。所述“降低小麦中SBEIIa蛋白的丰度”具体可通过对SBEIIa基因进行基因编辑实现。本发明的 发明人 利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑小麦SBEIIa基因，通过造成移码突变，敲除了小麦SBEIIa基因，获得了直链淀粉、抗性淀粉以及总戊聚糖(健康 纤维 )含量明显提高的新一代小麦新种质。本发明对于小麦育种具有重大的应用推广价值。，下面是一种通过基因组编辑提高小麦抗性淀粉含量的方法及其技术体系专利的具体信息内容。
1.一种提高小麦种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量的方法，包括如下步骤：降低小麦中SBEIIa蛋白的丰度。
2.一种提高小麦种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量的方法，包括如下步骤：对SBEIIa基因进行基因编辑。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9系统实现的。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶标序列如下：tcctgagccgcgcggcctct。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶标序列如下：gggaaggtcctggtgcctga。
6.特异sgRNA或特异重组质粒；
所述特异sgRNA为sgRNA1或sgRNA2；
sgRNA1的靶标序列如下：tcctgagccgcgcggcctct；
sgRNA2的靶标序列如下：gggaaggtcctggtgcctga；
所述特异重组质粒为pCXUN-Cas9-gRNA1或pCXUN-Cas9-gRNA2；
pCXUN-Cas9-gRNA1含有Cas9蛋白的编码基因和所述sgRNA1的编码基因；
pCXUN-Cas9-gRNA2含有Cas9蛋白的编码基因和所述sgRNA2的编码基因。
7.一种制备转基因小麦的方法，包括如下步骤：将权利要求6所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因导入受体小麦，得到种子中抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量高于所述受体小麦的转基因小麦。
8.一种制备基因编辑小麦的方法，包括如下步骤：将权利要求6所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因导入受体小麦，得到转基因小麦；然后将转基因小麦自交，获得自交后代；然后从自交后代中筛选基因编辑小麦；所述基因编辑小麦种子中抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量高于所述受体小麦。
9.权利要求6所述特异sgRNA或权利要求6所述特异重组质粒在小麦育种中的应用；所述小麦育种的目的为提高小麦种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量。
10.一种提高小麦种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量的方法，包括如下步骤：抑制小麦中SBEIIa蛋白的活性。
一种通过基因组编辑提高小麦抗性淀粉含量的方法及其技术
体系
技术领域
背景技术
[0002] 糖尿病、肥胖症和结肠癌等疾病是严重危害人类健康的慢性非传染性疾病。糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种因部分或完全胰岛素缺失、或细胞胰岛素受体减少、或受体敏感性下降导致的疾病，是由遗传和环境因素共同作用而导致的一种慢性、全身性的代谢性疾病。糖尿病及其并发症已成为严重危害人类健康的世界性公共卫生问题，引起了世界各国的高度重视。据国家统计局2004年报告，我国糖尿病患病人数已超过2000万。另据世界卫生组织预测，到2030年时，我国的糖尿病患者人数有可能翻一倍，达到4230万。糖尿病已被列为全球继心血管病、肿瘤之后第3位威胁人类健康的慢性非传染性疾病。糖尿病引起的血糖的代谢异常往往又引起血脂的代谢紊乱，出现高血脂症。这两种因素可导致血液黏稠度升高、血流缓慢，而易形成血栓、动脉硬化，造成血管病变，引起多种严重的慢性系列并发症出现。流行病学证据强烈提示在血糖水平、动脉粥样硬化形成、心血管事件的发生以及发病率和死亡率增加之间的相关关系。
[0003] 抗性淀粉(resistant starch)又称抗酶解淀粉及难消化淀粉，主要存在于高直链、低支链淀粉籽粒或块茎中，其含量与高直链淀粉含量直线正相关。研究表明，抗性淀粉不能在小肠消化吸收和提供葡萄糖，可直接进人大肠被生理性细菌发酵，产生多种短链脂肪酸(丁酸等)和气体。此外，抗性淀粉还有刺激有益菌群生长、减少人体热量摄取、控制体重等功能。在小鼠和人类研究中，抗性淀粉可以预防大肠癌，提高大肠中短链脂肪酸含量。高直链淀粉(抗性淀粉)有助于防止非可逆性胰岛素抵抗的发展，降低血浆总脂、胆固醇和甘油三酯的浓度。Mantis等研究表明抗性淀粉可以促进餐后的脂质氧化，长时间食用则可以降低脂肪的累积，帮助控制体重。人体摄入高抗性淀粉食物，具有较少胰岛素反应，可延缓餐后血糖上升，有效控制糖尿病病情。丁玉琴等人对II型糖尿病大鼠血糖血脂水平与抗性淀粉的相关性进行研究，表明抗性淀粉能降低II型糖尿病大鼠血糖血脂和尿素氮，提示抗性淀粉具有减轻糖尿病症状的作用并可能有保护肾脏功能的作用。王竹等研究的抗性淀粉的代谢及对血糖的调节作用，证明抗性淀粉具有吸收慢的代谢特点，对调节血糖稳态，降低餐后胰岛素分泌，增强胰岛素敏感性有一定作用，并初步论述了抗性淀粉对餐后体内葡萄糖转运的影响，综合其他研究成果，预示抗性淀粉可能对预防慢性疾病的发生，减少餐后组织负荷有益。1992年，世界粮农组织(FAO)根据Englyst和欧洲抗性淀粉研究协作网(EURESTA)的建议，将抗性淀粉定义为：健康者小肠中不吸收的淀粉及其降解产物。此外，抗性淀粉具有低持水能力等加工特性，可以用于改善食品的加工工艺，增加食品的脆度、膨胀性及提高最终产品的质地。因此，可将其作为食品膳食纤维的功能成分，适量添加在食品中，制成不同特色的风味食品和功能食品。目前，国外已将抗性淀粉作为食品原配料或膳食纤维的强化剂应用到面类食品中，如面包、馒头、包子、通心面、饼干等。其中，值得一提的是抗性淀粉在面包中的应用。添加抗性淀粉的面包不仅膳食纤维成分得到了强化，而且在气孔结构、均匀性、体积和颜色等感官品质方面均比添加其他传统膳食纤维的营养强化面包好。抗性淀粉添加到通心粉和面条中可增加其耐煮性，有利于维持韧性结构，避免煮后出现粘连现象。因此，培育高抗性淀粉小麦，对人类健康和丰富膳食多样性具有重要意义。
[0004] 普通小麦(Triticum aestivum L.,AABBDD,2n＝6x＝42)是重要的粮食作物，在世界范围内超过40％的人口以小麦为主食。它是人类蛋白质主要摄取来源，同时富含维生素B、维生素E、纤维及镁、磷等物质。淀粉是小麦籽粒的主要组成部分，占小麦胚乳重量的80％以上。淀粉是由直链淀粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)以一定形式排列、堆积形成的具有结晶区和无定形区的颗粒，其中直链淀粉占胚乳淀粉的15％-25％，支链淀粉占75％-85％。根据形态大小，小麦淀粉又可分为A型、B型和C型淀粉三类。其中，A型淀粉一般为圆形，颗粒直径一般在10-35μm之间，B型淀粉一般为球形或多边形，颗粒直径一般在3-10μm之间，C型淀粉颗粒一般小于3μm。淀粉合成过程受到一系列酶的调控。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种通过基因组编辑提高小麦抗性淀粉含量的方法及其技术体系。
[0007] 所述“降低小麦中SBEIIa蛋白的丰度”具体可通过抑制SBEIIa基因表达实现。所述“降低小麦中SBEIIa蛋白的丰度”具体可通过敲除SBEIIa基因实现。所述敲除包括敲除整个基因，也包括敲除基因的部分区段。
[0008] 所述“降低小麦中SBEIIa蛋白的丰度”具体可通过沉默SBEIIa基因实现。
[0009] 所述“降低小麦中SBEIIa蛋白的丰度”具体可通过对SBEIIa基因进行基因编辑实现。
[0010] 本发明提供了一种提高小麦种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量的方法，包括如下步骤：对SBEIIa基因进行基因编辑。
[0011] 以上任一所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9系统实现的。
[0012] 所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA(sgRNA1)的靶标序列如下：tcctgagccgcgcggcctct。
[0013] 所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA(sgRNA2)的靶标序列如下：gggaaggtcctggtgcctga。
[0014] 所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有Cas9蛋白的编码基因和sgRNA1的编码基因的特异DNA分子实现的。所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有所述特异DNA分子的重组质粒实现的。
[0015] 所述基因编辑是通过在受体小麦中导入分别含有Cas9蛋白的编码基因的DNA分子和含有sgRNA1的编码基因的DNA分子实现的。
[0016] 所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有Cas9蛋白的编码基因和sgRNA2的编码基因的特异DNA分子实现的。所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有所述特异DNA分子的重组质粒实现的。
[0017] 所述基因编辑是通过在受体小麦中导入分别含有Cas9蛋白的编码基因的DNA分子和含有sgRNA2的编码基因的DNA分子实现的。
[0018] 本发明还保护特异sgRNA。所述特异sgRNA为sgRNA1或sgRNA2。
[0019] 本发明还保护特异重组质粒。所述特异重组质粒为pCXUN-Cas9-gRNA1或pCXUN-Cas9-gRNA2。
[0020] sgRNA1的靶标序列如下：tcctgagccgcgcggcctct。
[0021] sgRNA2的靶标序列如下：gggaaggtcctggtgcctga。
[0022] pCXUN-Cas9-gRNA1含有Cas9蛋白的编码基因和所述sgRNA1的编码基因。
[0023] pCXUN-Cas9-gRNA2含有Cas9蛋白的编码基因和所述sgRNA2的编码基因。
[0025] pCXUN-Cas9-gRNA1具体可如序列表的序列1所示。
[0026] 与pCXUN-Cas9-gRNA1相比，pCXUN-Cas9-gRNA2的差异仅在于，用“GGGAAGGTCCTGGTGCCTGA”取代了“AGAGGCCGCGCGGCTCAGGA”。
[0027] 本发明还保护一种制备转基因小麦的方法，包括如下步骤：将所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因导入受体小麦，得到种子中抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量高于所述受体小麦的转基因小麦。所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因具体通过所述重组质粒导入受体小麦。
[0028] 本发明还保护一种制备基因编辑小麦的方法，包括如下步骤：将所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因导入受体小麦，得到转基因小麦,从中鉴定发生基因编辑的小麦及其基因编辑类型(从转基因小麦中筛选发生基因编辑且SBEIIa基因表达被抑制的小麦)；然后将转基因基因编辑小麦自交，获得自交后代；然后从自交后代中筛选无转基因的基因编辑小麦，所述无转基因的基因编辑小麦种子中抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量高于所述受体小麦。所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因具体通过所述重组质粒导入受体小麦。
[0029] 所述基因编辑小麦为满足如下条件的小麦：A基因组、B基因组和D基因组均在靶区域发生突变，且均为纯合突变型。
[0030] 所述基因编辑小麦为满足如下条件的小麦：A基因组、B基因组和D基因组均在靶区域发生突变，且均为纯合突变型；不携带载体序列。
[0031] 所述基因编辑小麦具体可为：实施例3得到的T0代植株B041-S103自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d13纯合突变型且B基因组d10纯合突变型且D基因组d41纯合突变型”的T1代植株。
[0032] 所述基因编辑小麦具体可为：实施例3得到的T0代植株B041-S103自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d13纯合突变型且B基因组d10纯合突变型且D基因组d41纯合突变型且不携带载体序列”的T1代植株。
[0033] 将基因编辑小麦自交得到的后代，即为基因编辑株系。
[0034] 本发明还保护所述特异sgRNA或所述特异重组质粒在小麦育种中的应用；所述小麦育种的目的为提高小麦种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量。
[0035] 本发明还保护一种提高小麦种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量的方法，包括如下步骤：抑制小麦中SBEIIa蛋白的活性。
[0036] 所述SBEIIa蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：
[0037] (a1)由序列表中序列2或序列4或序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0038] (a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质；
[0039] (a3)来源于小麦且与(a1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
[0040] 所述SBEIIa基因为编码所述SBEIIa蛋白的核酸分子。
[0041] 所述SBEIIa基因为如下1)或2)或3)或4)或5)或6)或7)或8)的DNA分子：
[0042] 1)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；
[0043] 2)编码区如序列表中序列5所示的DNA分子；
[0044] 3)编码区如序列表中序列7所示的DNA分子；
[0045] 4)序列表中序列3所示的DNA分子；
[0046] 5)序列表中序列5所示的DNA分子；
[0047] 6)序列表中序列7所示的DNA分子；
[0048] 7)在严格条件下与1)至6)中任一限定的DNA序列杂交且编码所述SBEIIa蛋白的DNA分子；
[0049] 8)来源于小麦且与1)至6)中任一限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码所述SBEIIa蛋白的DNA分子。
[0050] 所述sgRNA1的编码基因如序列表的序列1中第6915-7017位核苷酸所示。
[0051] 与sgRNA1的编码基因相比，sgRNA2的编码基因的差异仅在于，用“GGGAAGGTCCTGGTGCCTGA”取代了“AGAGGCCGCGCGGCTCAGGA”。
[0052] 所述受体小麦具体可为小麦品种郑麦7698。
[0053] 本发明的发明人利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑小麦SBEIIa基因，通过造成移码突变，敲除了小麦SBEIIa基因，获得了直链淀粉、抗性淀粉以及总戊聚糖(健康纤维)含量明显提高的新一代小麦新种质。获得的SBEIIa基因的三个基因组均被定点敲除的编辑株系与野生型对照相比，种子直链淀粉、抗性淀粉以及总戊聚糖含量均明显增加，聚合度DP 9–12之间的支链淀粉减少，而聚合度DP>13的长链淀粉增加。RVA测定结果表明：其淀粉峰值粘度值和最终粘度值均明显下降。本发明对于小麦育种具有重大的应用推广价值。附图说明
[0054] 图1为实施例2中5株再生植株进行酶切后的电泳图
[0055] 图2为实施例2中5株再生植株进行测序后的结果
[0056] 图3为实施例2中部分T1代植株进行步骤(4)的鉴定结果
[0057] 图4为实施例3中2株再生植株进行酶切后的电泳图
[0058] 图5为实施例3中2株再生植株的部分测序结果
[0059] 图6为实施例3中部分T1代植株进行步骤(4)的鉴定结果
[0060] 图7为实施例4中淀粉颗粒性状分析的结果。
[0061] 图8为实施例4中直链淀粉及抗性淀粉含量测定的结果。
[0062] 图9为实施例4中淀粉RVA值的测定的结果。
[0063] 图10为实施例4中淀粉链长分布分析的结果。
[0064] 图11位实施例4中总戊聚糖含量测定的结果。
具体实施方式
[0065] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0066] 小麦品种郑麦7698。提及“郑麦7698”的文献(在文献中称为“Zhengmai7698”)：Guo G,Lei M,Wang Y,Song B,Yang J，et al.Accumulation of As,Cd,and Pb in sixteen wheat cultivars grown in contaminated soils and associated health risk assessment[J].Journal of Environmental Research and Public Health,2018,15(11):2601.。郑麦7698用WT表示，A基因组中的相应序列用WT-A表示，B基因组中的相应序列用WT-B表示，D基因组中的相应序列用WT-D表示。
[0067] 实施例1、制备重组质粒
[0068] 人工合成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1和重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1和重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2均为环形质粒。
[0069] 重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1如序列表的序列1所示。序列表的序列1中，第115-367位核苷酸与NOS终止子反向互补，第392-4522位核苷酸与Cas9蛋白的编码基因反向互补，第4544-6533位核苷酸与Ubi启动子反向互补，第6552-6914位核苷酸为U6启动子，第6915-
7017位核苷酸为sgRNA1的编码基因(其中第6915-6934位核苷酸为靶序列识别区)。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1表达sgRNA1，sgRNA1的靶序列位于小麦SBEIIa基因的第二外显子中。
7017位核苷酸为sgRNA1的编码基因(其中第6915-6934位核苷酸为靶序列识别区)。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1表达sgRNA1，sgRNA1的靶序列位于小麦SBEIIa基因的第二外显子中。
[0070] 与重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1相比，重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2的差异仅在于，用“GGGAAGGTCCTGGTGCCTGA”取代了“AGAGGCCGCGCGGCTCAGGA”。“GGGAAGGTCCTGGTGCCTGA”为sgRNA2的靶序列识别区。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2表达sgRNA2，sgRNA2的靶序列位于小麦SBEIIa基因的第二外显子中。
[0071] 小麦cDNA中：A基因组(对应A染色体组)中的SBEIIa基因的编码区如序列表的序列3所示(编码序列表的序列2所示的蛋白质)，序列3中第146-243位核苷酸为基因组DNA中该基因的第二外显子；B基因组(对应B染色体组)中的SBEIIa基因的编码区如序列表的序列5所示(编码序列表的序列4所示的蛋白质)，序列5中第143-243位核苷酸为基因组DNA中该基因的第二外显子；D基因组(对应D染色体组)中的SBEIIa基因的编码区如序列表的序列7所示(编码序列表的序列6所示的蛋白质)，序列7中第134-231位核苷酸为基因组DNA中该基因的第二外显子。
[0072] 实施例2、利用sgRNA1通过基因枪法获得基因编辑小麦
[0073] 一、基因枪介导的小麦遗传转化
[0074] 1、取授粉后14天左右的小麦品种郑麦7698的幼胚，作为外植体。将外植体接种于诱导培养基(MS+1mg/L VB1+150mg/L ASP+2mg/L 2,4-D)，22-25℃暗培养1-2天。
[0075] 2、以重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1作为待转化DNA，采用BIO-RAD公司的PDS-1000/He基因枪对完成步骤1的幼胚进行轰击(Psi900，27.5cm Hg柱)，轰击后的幼胚转移到新的诱导培养基上，22-25℃暗培养2-3周。
[0076] 3、取完成步骤2的外植体，依次进行再生、筛选和壮苗，得到T0代再生植株。
[0077] 二、定点编辑的检测
[0078] 1、对T0代再生植株的鉴定
[0079] 供试植株为：102株步骤一得到的T0代再生植株、郑麦7698(作为再生植株的参照植株)。
[0080] (1)提取供试植株的叶片的基因组DNA，分别采用三个特异引物对进行PCR扩增。三个特异引物对分别为：SBE-C2-AF1和SBE-C2-AR1组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列8所示，小麦A基因组中SBEIIa基因的第二外显子位于其中)、SBE-C2-BF1和SBE-C2-BR1组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列9所示，小麦B基因组中SBEIIa基因的第二外显子位于其中)、SBE-C2-DF1和SBE-C2-DR1组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列10所示，小麦D基因组中SBEIIa基因的第二外显子位于其中)。
[0081] SBE-C2-AF1：CGCTCCAATCTCCCCGTCCA；SBE-C2-AR1：GAAGATTTCCCGGCACGATG；
[0082] SBE-C2-BF1：TCTCCCCGTCTGTTTTTGGG；SBE-C2-BR1：GTTGCGCTGGAGTGGCCGCC；
[0083] SBE-C2-DF1：CTCGAATCTCCCCCGTCTGGC；SBE-C2-DR1：CCTGACGCATCCGTGGTTG。
[0084] (2)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，用限制性内切酶DdeI进行单酶切，然后进行电泳。
[0085] (3)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，进行测序。
[0086] 如果再生植株的PCR扩增产物只有一种，且与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列一致，该再生植株为野生型。如果再生植株的PCR扩增产物为两种，一种与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列一致，另一种与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该再生植株为杂合型。如果再生植株的PCR扩增产物为两种，均与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该再生植株为双等位突变型。如果再生植株的PCR扩增产物为一种，且与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该再生植株为纯合突变型。野生型的再生植株的酶切产物电泳显示两条带，杂合型的再生植株的酶切产物电泳显示三条带，双等位突变型的再生植株和纯合突变型的再生植株显示一条带。如果再生植株的PCR扩增产物为三种以上，该再生植株为嵌合型。杂合型、双等位突变型、纯合突变型、嵌合型的植株统称为编辑植株。
[0087] 102株再生植株中，5株为编辑植株(4.9％)，97株为野生型(94.1％)。
[0088] 5株再生植株进行酶切后的电泳图见图1。图1中：M：DL2000 Marker；1代表T0代植株B017-1、2代表T0代植株B13-C14、3代表T0代植株B62-16、4代表T0代植株B86-E8、5代表T0代植株B49-S70；Wild type代表郑麦7698，+代表酶切产物，-代表PCR扩增产物。
[0089] 5株再生植株进行测序后的结果见图2。图2中：CCG为PAM位点，带下划线序列为靶点序列，“-”表示碱基删除。
[0090] (4)提取供试植株的叶片的基因组DNA，采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对鉴定Cas9基因，采用TaU6F和gRNAR组成的引物对鉴定sgRNA基因；采用HptF和HptR组成的引物对鉴定hptII基因。
[0091] Cas9-F：5’-TCGACAAGAAGTACTCCATCGGC-3’；Cas9-R：5’-CAAGAGAGAGGGCGATCAGGTTG-3’。
[0092] TaU6F：5’-GCACTGCAGGAATTCGATATCAAGC-3’；gRNAR：5’-CCAATACGCAAACCGCCTCTC-3’。
[0093] HptF：5’-GAGGGCGTGGATATGTCCTG-3’；HptR：5’-ATTGACCGATTCCTTGCGGT-3’。
[0094] 5株再生植株基于靶序列ABD基因组的基因型、基于靶序列的突变类型、携带Cas9基因的情况、携带sgRNA1基因的情况和携带hptII基因的情况见表1。
[0095] 表1
[0096]
[0097]
[0098] 注：i代表插入，i1代表插入1个核苷酸，依次类推；d代表缺失，d1代表缺失1个核苷酸，依次类推；wt代表野生型；“/”的前和后分别代表两条染色体；例如，d15/d42代表对于A基因组中的靶序列来说，一条染色体为d15，另一条染色体为d42。例如，d5i3代表对于B基因组中的靶序列来说，两条染色体均为d5i3。Y代表鉴定结果为阳性，N代表鉴定结果为阴性。
[0099] 2、对T1代植株的鉴定
[0100] 取T0代植株B017-1、T0代植株B13-C14、T0代植株B62-16、T0代植株B86-E8、T0代植株B49-S70，分别进行自交并收获T1代种子，培育T1代种子获得T1代植株。
[0101] 按照步骤1的方法，对各个T1代植株进行鉴定。
[0102] 部分T1代植株进行步骤(4)的鉴定结果见图3(Actin为内参基因)。图3中，WT代表郑麦7698，1-23代表不同的T1代植株。
[0103] 各项鉴定的结果见表2。
[0104] 表2
[0105]
[0106] 注：相关符号的含义同表1；6d42/d15代表6株为d42/d15杂合双等位突变,16d5i3代表16株为d5i3纯合突变，以此类推。
[0107] 结果表明，T0代SBEIIa被定点突变的纯合株系可以稳定遗传T1代，对于定点编辑的SBEIIa的双等位突变株系通过严格的自交，T1分离情况符合孟德尔遗传规律，在T1代株系中没有发现新的变异类型。在T1代可获得靶区域发生突变且不携带载体序列的编辑株系。
[0108] 3、CRISPR/Cas9的脱靶分析
[0109] 根据网上预测软件(http://crispr.dbcls.jp/)，对SBEIIa基因的sgRNA1靶点可能存在的脱靶位点进行预测，并根据可能存在脱靶位点的侧翼序列设计引物：OFT1F1和OFT1R1组成的引物对，OFT1F2和OFT1R2组成的引物对，OFT1F3和OFT1R3组成的引物对。
[0110] OFT1F1：5’-AGCGCTTGCTTTACTAGGGT-3’；OFT1R1：5’-GTCATCGGCATGTGGCAAAG-3’。
[0111] OFT1F2：5’-AGGGGGTAAACCTTGTGCAG-3’；OFT1R2：5’-CGAAACTTTTCCACGCGCAG-3’。
[0112] OFT1F3：5’-GAAGACACGTTCCTGCTCCA-3；OFT1R3：5’-GCCCGGCGGAGAATAGATAC-3’。
[0113] (1)取102株步骤一得到的再生植株(即步骤1中的102株植株)，提取基因组DNA。
[0114] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用OFT1F1和OFT1R1组成的引物对、OFT1F2和OFT1R2组成的引物对、OFT1F3和OFT1R3组成的引物对进行PCR扩增。
[0115] (3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行测序。
[0116] 脱靶位点的信息见表3。
[0117] 表3
[0118]
[0119] 结果表明，对于上述3个预测的可能脱靶位点，102株植株均未检测到脱靶现象，即gRNA1并不存在脱靶情况。
[0120] 实施例3、利用sgRNA2通过基因枪法获得基因编辑小麦
[0121] 一、转基因植物的获得
[0122] 用重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2代替重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1，按照实施例2的步骤一进行操作。
[0123] 二、定点编辑的检测
[0124] 1、对T0代再生植株的鉴定
[0125] 供试植株为：62株步骤一得到的T0代再生植株、郑麦7698(作为再生植株的参照植株)。
[0126] (1)提取供试植株的叶片的基因组DNA，分别采用三个特异引物对进行PCR扩增。三个特异引物对分别为：SBE-C2-AF1和SBE-C2-AR1组成的引物对、SBE-C2-BF1和SBE-C2-BR1组成的引物对、SBE-C2-DF1和SBE-C2-DR1组成的引物对。
[0127] (2)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，将PCR扩增产物与郑麦7698的PCR产物等量混匀，然后依次进行加热变性和退火复性，然后采用T7 endonuclease I(T7EI)进行单酶切，然后进行电泳。T7EI能识别并切割不完全配对DNA。
[0128] (3)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，进行测序。
[0129] 62株再生植株中，2株为编辑植株(3.22％)，60株为野生型(96.78％)。
[0130] 2株再生植株进行酶切后的电泳图见图4。图4中：M：DL2000 Marker；1代表T0代植株B028-8、2代表T0代植株B041-S103；Wild type代表郑麦7698，+代表酶切产物，-代表PCR扩增产物。
[0131] 2株再生植株的部分测序结果见图5。图5中：CGG为PAM位点，带下划线序列为靶点序列，“-”表示碱基删除。
[0132] (4)提取供试植株的叶片的基因组DNA，采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对鉴定Cas9基因，采用TaU6F和gRNAR组成的引物对鉴定sgRNA基因；采用HptF和HptR组成的引物对鉴定hptII基因。
[0133] 2株再生植株基于靶序列ABD基因组的基因型、基于靶序列的突变类型、携带Cas9基因的情况、携带sgRNA2基因的情况和携带hptII基因的情况见表4。
[0134] 表4
[0135]
[0136] 注：相关符号的含义同表1和表2。
[0137] 2、对T1代植株的鉴定
[0138] 取T0代植株B028-8和B041-S103，分别进行自交并收获T1代种子，培育T1代种子获得T1代植株。
[0139] 按照步骤1的方法，对各个T1代植株进行鉴定。
[0140] 部分T1代植株进行步骤(4)的鉴定结果见图6(Actin为内参基因)。图6中，WT代表郑麦7698，1-12代表不同的T1代植株。
[0141] 各项鉴定的结果见表5。
[0142] 表5
[0143]
[0144] 注：相关符号的含义同表1和表2。
[0145] 结果表明，T0代SBEIIa被定点突变的纯合株系可以稳定遗传T1代，对于定点编辑的SBEIIa的双等位突变株系通过严格的自交，T1分离情况符合孟德尔遗传规律，在T1代株系中没有发现新的变异类型。在T1代可获得靶区域发生突变且不携带载体序列的编辑株系。
[0146] 3、CRISPR/Cas9的脱靶分析
[0147] 根据网上预测软件(http://crispr.dbcls.jp/)，对SBEIIa基因的sgRNA2靶点可能存在的脱靶位点进行预测，并根据可能存在脱靶位点的侧翼序列设计引物：OFT2F1和OFT2R1组成的引物对，OFT2F2和OFT2R2组成的引物对。
[0148] OFT2F1：5-CATCCGCTCGAACCTGCC-3’；OFT2R1：5-CGACGAGGACAAAACGGC-3’。
[0149] OFT2F2：5-CATGCATCGCTTTCGCTTGG-3’；OFT2R2：5-GTGCTATGTGCACCTTCACG-3’。
[0150] (1)取62株步骤一得到的再生植株(即步骤1中的62株植株)，提取基因组DNA。
[0151] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用OFT2F1和OFT2R1组成的引物对和OFT2F2和OFT2R2组成的引物对进行PCR扩增。
[0152] (3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行测序。
[0153] 脱靶位点的信息见表6。
[0154] 表6
[0155]
[0156] 结果表明，对于上述2个预测可能脱靶位点，62株植株均未存在脱靶现象，即gRNA2并不存在脱靶情况。
[0157] 实施例4、性状的检测
[0158] 一、淀粉颗粒性状分析
[0159] 供试编辑植株：实施例3得到的T0代植株B041-S103自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d13纯合突变型且B基因组d10纯合突变型且D基因组d41纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。郑麦7698作为供试编辑植株的野生型对照植株。供试编辑植株和对照植株均设置10-20株生物学重复。
[0160] 正常种植供试编辑植株，收获籽粒。
[0161] 籽粒中的淀粉颗粒的电镜扫描照片见图7A。与郑麦7698的淀粉粒相比，SBEIIa基因三个基因组均定点突变的植株的淀粉颗粒形状不规则，A型淀粉颗粒较多。
[0162] 籽粒发育过程中淀粉粒径观察照片见图7B。与郑麦7698的淀粉粒相比，SBEIIa基因三个基因组均定点突变的植株的淀粉颗粒明显表现出不规则形状。
[0163] 二、直链淀粉及抗性淀粉含量测定
[0164] 供试编辑植株：实施例3得到的T0代植株B041-S103自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d13纯合突变型且B基因组d10纯合突变型且D基因组d41纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。郑麦7698作为供试编辑植株的野生型对照植株。供试编辑植株和对照植株均设置10-20株生物学重复。
[0165] 正常培育供试编辑植株，收获籽粒，脱壳，磨粉，去皮，得到待测面粉。
[0166] 检测待测面粉中总淀粉的质量百分含量(采用Megazyme公司的Total Starch Assay Kit并按说明书进行检测，试剂盒货号K-TSTA)。结果见图8A。结果表明：与郑麦7698相比，SBEIIa基因ABD基因组均被定点敲除的编辑植株的种子制备的待测面粉中，总淀粉含量降低。
[0167] 检测待测面粉中直链淀粉和支链淀粉的质量百分含量(采用Megazyme公司的Amylose/Amylopectin Assay Kit并按说明书进行检测，试剂盒货号K-AMYL)，计算直链淀粉与支链淀粉的质量比。直链淀粉的质量百分含量见图8B。直链淀粉与支链淀粉的质量比见图8C。结果表明：SBEIIa基因的三个基因组均被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的直链淀粉含量达45％左右，极显著高于对照受体材料郑麦7698；SBEIIa基因的三个基因组均被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的直链淀粉与支链淀粉比值极显著高于对照受体材料郑麦7698。
[0168] 检测待测面粉中抗性淀粉的质量百分含量(采用Megazyme公司的Resistant Starch Assay Kit并按说明书进行检测，试剂盒货号K-RSTAR)。结果见图8D。郑麦7698种子制备的待测面粉的抗性淀粉含量小于0.5％0，SBEIIa基因的三个基因组均被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的抗性淀粉含量高达5％。
[0169] 结果表明，SBEIIa基因在小麦三个基因组中的敲除突变，可明显提高直链淀粉和抗性淀粉的含量。
[0170] 三、淀粉RVA值的测定
[0171] 供试编辑植株：实施例3得到的T0代植株B041-S103自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d13纯合突变型且B基因组d10纯合突变型且D基因组d41纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。郑麦7698作为供试编辑植株的野生型对照植株。供试编辑植株和对照植株均设置10-20株生物学重复。
[0172] 正常培育供试编辑植株，收获籽粒，脱壳，去皮，磨粉，得到待测面粉。采用配套软件为TCW(Thermal Cycle for Windows)的3D型黏度速测仪(澳大利亚NewportScientific仪器公司)检测待测面粉的淀粉黏滞性谱(RVA谱)。
[0173] 结果见图9。结果表明，SBEIIa基因ABD三个基因组均被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的淀粉峰值粘度值和最终粘度值显著低于郑麦7698。
[0174] 四、淀粉链长分布分析
[0175] 供试编辑植株：实施例3得到的T0代植株B041-S103自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d13纯合突变型且B基因组d10纯合突变型且D基因组d41纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。郑麦7698作为供试编辑植株的野生型对照植株。供试编辑植株和对照植株均设置10-20株生物学重复。
[0176] 正常培育供试编辑植株，收获籽粒，脱壳，去皮，磨粉，得到待测面粉。利用美国DionexCo公司生产的BioLC分析仪器检测待测面粉的支链淀粉链长聚合度平均值进行比较分析。
[0177] 相对链长分布＝转基因植株的种子制备的待测面粉中支链淀粉的链长分布-郑麦7698种子制备的待测面粉中支链淀粉的链长分布。
[0178] 链长分布的结果见图10A，相对链长分布的结果见图10B。结果表明：与郑麦7698相比，SBEIIa基因的三个基因组均被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉中，聚合度DP<9的支链淀粉增加，DP 9-12之间的支链淀粉减少，DP 13-19的支链淀粉增加，DP 20-33的支链淀粉减少，而聚合度DP>35的长链淀粉增加。
[0179] 五、总戊聚糖含量测定
[0180] 供试编辑植株1：实施例3得到的T0代植株B028-8自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组wt野生型且B基因组wt野生型且D基因组d7纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。
[0181] 供试编辑植株2：实施例2得到的T0代植株B86-E8自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d8纯合突变型且B基因组d1纯合突变型且D基因组wt野生型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。
[0182] 供试编辑植株3：实施例2得到的T0代植株B49-S70自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组i1纯合突变型且B基因组wt野生型且D基因组d1纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。
[0183] 供试编辑植株4：实施例2得到的T0代植株B13-C14自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d6纯合突变型且B基因组d7纯合突变型且D基因组i1纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。
[0184] 供试编辑植株5：实施例3得到的T0代植株B041-S103自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d13纯合突变型且B基因组d10纯合突变型且D基因组d41纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。
[0185] 郑麦7698作为供试编辑植株的野生型对照植株。
[0186] 每种供试编辑植株和对照植株均设置10-20株生物学重复。
[0187] 正常培育供试编辑植株，收获籽粒，脱壳，磨粉，去皮，得到待测面粉。检测待测面粉中的总戊聚糖含量。总戊聚糖含量的测定方法见文献：Butardo VM,Fitzgerald MA,Bird AR,Gidley MJ,Flanagan BM,Larroque O,Resurreccion AP,Laidlaw HK,Jobling SA,Morell MK,Rahman S，et al.Impact of down-regulation of starch branching enzyme IIb in rice by artificial microRNA-and hairpin RNA-mediated RNA Silencing[J]Journal of Experimental Botany,2011Oct；62(14):4927-41.。
[0188] 待测面粉中总戊聚糖的质量百分含量(％)见图11。结果表明：与郑麦7698相比，SBEIIa基因被敲除的不同基因型的植株的种子制备的待测面粉中戊聚糖的含量均有所提高，SBEIIa基因的三个基因组均被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的总戊聚糖含量最高。
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