技术领域
[0001] 本
发明属于人工诱变育种技术领域，尤其涉及一种sgRNA及转基因表达载体、表达品系、筛选方法，具体为let-7microRNA complex/cluster的sgRNA及其转基因表达载体、let-7complex/cluster的敲除品系筛选方法。
背景技术
[0002] 常用的传统育种方法包括人工诱变和杂交育种。人工诱变育种是指利用化学诱变或物理诱变的手段对
生物进行处理，诱使生物遗传性状发生变异，并筛选出有价值的突变体。虽然人工诱变提高了遗传性状变异的
频率，但诱发突变是不定向的，有利变异少，育种过程需要处理大量突变品种或材料，工作量大。而杂交育种是指种内不同品种间、或亲缘关系较近的不同物种间进行杂交以获得
杂种优势的育种方法。杂交育种能使不同品种间的优势性状在杂交品种中不断累积，但杂交和筛选均需耗费大量时间，获得的相关性状在杂交后代中不稳定。家蚕是一种重要的经济昆虫，具有快速、大量合成丝蛋白的能
力。丝腺是家蚕合成与分泌丝蛋白的重要器官，在家蚕五龄幼虫期间快速长大并大量合成丝蛋白。家蚕基因组
框架图和精细图谱问世后，人们就期望通过操控丝腺发育和丝蛋白合成的关键基因，以获得吐丝量高的家蚕品种。随着分子生物学和基因工程技术的发展，有望利用基因编辑手段对这些基因进行操控以改良家蚕经济性状。
[0003] CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期进化程中获得的一种防御机制，以抵抗病毒或外源DNA入侵。外源DNA通过局部序列互补
配对与CRISPR整合，CRISPR便转录形成pre-crRNA，后者再剪切成crRNA，crRNA与trans-actingcrRNA(tracrRNA)形成的复合物可以引导Cas9蛋白对与crRNA互补配对的外源DNA双链进行剪切。基于此原理，用人工合成的sgRNA替代crRNA/tracrRNA复合物以引导Cas9核酸内切酶对外源DNA进行定点切割。在生物体内的非同源性末端修复机制的修复下，切割开的双链DNA重新连接，但会出现
碱基缺失、插入和置换等。对于编码基因，这些变化会大概率导致基因的移码突变，从而达到基因敲除的目的。由于sgRNA设计简单、合成快速，与Cas9结合效率高等优势，CRISPR/Cas9已经被广泛应用在基因功能研究和品种改良。
[0004] CRISPR/Cas9基因编辑系统由两个部分组成：sgRNA和核酸内切酶Cas9。sgRNA中的
支架序列(sgRNA scaffold)是相对保守的一段序列，可与Cas9结合。CRISPR/Cas9的位点特异性敲除取决于sgRNA中长约20nt的sgRNA spacer序列，它是与基因组上目标位点互补配对的特异序列。设计基因组特
定位点的sgRNA spacer，就能实现CRISPR/Cas9对特定位点的特异性敲除。sgRNA spacer需要满足G(N19)NGG的序列格式。借助在线
软件，就可以找到目的序列中满足条件的sgRNA spacer。设计好的sgRNA序列可以通过转录合成，再与商业化的Cas9蛋白混合注射，便可实现特异基因敲除。
[0005] 解决上述技术问题的难度：
[0006] 能否找到调控丝腺发育和丝蛋白合成的重要基因是通过基因工程创新家蚕品种、改进蚕丝性能和提高蚕丝产量的前提。家蚕基因组中有上万个蛋白编码基因，还有种类繁多、数量庞大的非编码RNA。要从这些庞大基因和非编码RNA群体中找到能促进丝腺发育和丝蛋白合成的关键或重要因子需要进行大量的实验研究。
[0007] microRNA是一类长约22nt的非编码RNA，参与调控各项生命活动，它们通过与靶基因mRNA3’UTR反向互补配对来促进靶mRNA降解或抑制靶基因翻译。如果能解除microRNA在丝腺中的负调控作用，将很有可能促进丝腺的发育和丝蛋白的表达。然而，microRNA与蛋白编码基因不同，没有三联体遗传密码，不能产生移码突变，单碱基的丢失或突变很可能不足以影响microRNA的产生，对其敲除最好是在基因组上删除整个microRNA成熟体序列。
[0008] microRNA在基因组上存在形式有两种：单个microRNA和microRNA cluster(簇)。前者是指基因组上10kb以内的同一位点(locus)只产生单个microRNA；后者是指在基因组上10kb以内的同一位点产生两个以上的microRNA，这些microRNA往往有共同表达模式和类似的生物学功能。在基因组上敲除microRNA cluster(簇)，需要位于基因组上microRNA cluster前体
位置的多对sgRNA同时发挥作用，引导Cas9蛋白将基因组上cluster两端microRNA之间的序列切掉才能达到敲除microRNA cluster的目的。
[0009] 解决上述技术问题的意义：
[0010] 本发明技术的意义在于：在家蚕中部丝腺和后部丝腺实现了let-7microRNA complex/cluster(let-7C)整体敲除。该方法并没有对编码基因进行修饰，也并未引入新的外源基因，只是利用CRISPR/Cas9技术在家蚕丝腺细胞中删除了let-7CmiRNAs，解除了它们对丝腺发育和丝蛋白合成的负调控作用，实现了家蚕丝腺长度的增加和吐丝量的提高。具体地看，敲除中部丝腺的let-7C后，中部丝腺的中段和后段膨大，但表面均呈凹凸不平的齿状，中部丝腺DNA含量增加了120％；敲除家蚕后部丝腺的let-7C后，后部丝腺细胞中DNA的量增加了120％，后部丝腺的长度增加了60％，重量增加了150％，吐完丝后称重发现蚕丝增加了10％。
发明内容
[0011] 针对
现有技术存在的问题，本发明提供了一种sgRNA及转基因表达载体、表达品系、筛选方法。
[0012] 本发明是这样实现的，一种sgRNA，所述sgRNA的序列为：SEQ ID NO：5。
[0013] 本发明的另一目的在于提供一种由所述sgRNA构建的转基因表达载体。
[0014] 本发明的另一目的在于提供一种所述转基因表达载体的构建方法，所述转基因表达载体的构建方法包括：
[0015] (1)在let-7C所在基因组上找到合适的sgRNA靶定位点，符合G(N20)GG结构；
[0016] (2)sgRNA表达载体用U6启动子同时表达两个sgRNA，筛选标记选用在眼睛和神经特异表达的启动子3XP3启动绿色
荧光EGFP，转基因载体以鳞翅目昆虫转座子piggyBac为转基因基本骨架。
[0017] 进一步，所述sgRNA转基因表达载体的构建方法具体包括：
[0018] 1)利用在线预测
网站CCtop预测敲除let-7C所需的sgRNA spacer，输入let-7C所在的基因组序列，以G(N20)GG的结构找寻序列中的gRNA spacer，避免脱靶率较高的序列；在sgRNA spacer序列的5’末端加入相应的碱基，TGCA和AAAC用于AarI酶切后的连接，TCCG和AAAC用于BbaI酶切后的连接；
[0019] 2)以下列条件让引物
退火形成双链：95℃变性5min，95℃梯度降温到25℃，每秒下降0.1℃，共700个循环；
[0020] 3)配制以下体系，37℃酶切过夜后回收pUC57[U6-2gRNA]载体骨架：
[0021] 4)将sgRNA1-spacer退火形成的双链连接到pUC57[U6-2gRNA]载体骨架上，构建成pUC57[U6-sgRNA1]质粒；
[0022] 5)配制以下体系，37℃酶切4h后，回收pUC57[U6-sgRNA1]载体骨架：
[0023] 6)将sgRNA2-spacer退火形成的双链连接到pUC57[U6-sgRNA1]载体骨架上，构建成pUC57[U6，let-7C-2gRNA]质粒；
[0024] 7)配制以下体系，37℃酶切4h后，回收[U6，let-7C-2gRNA]
片段：
[0025] 8)将回收的let-7C敲除双sgRNA表达片段[U6，let-7C-2gRNA]连接到piggyBac[3xP3-EGFP]载体上，构建成let-7C敲除双gRNA转基因表达载体：pBac[3xp3-EGFP，let-7C-2gRNA]。
[0026] 本发明的另一目的在于提供一种基于所述sgRNA构建的转基因表达载体的sgRNA表达品系筛选方法。所述sgRNA表达品系筛选方法利用CRISPR/Cas9系统，首先建立一个表达let-7C敲除所用sgRNA的品系，将该品系与特定Cas9表达品系进行杂交，实现let-7C在家蚕丝腺中的敲除；具体是将sgRNA表达品系与中部丝腺、后部丝腺Cas9表达品系分别进行了杂交，获得了let-7C在中部丝腺特异敲除的品系[Δlet-7C-MSG]和let-7C后部丝腺特异敲除品系[Δlet-7C-PSG]。
[0027] 进一步，所述sgRNA表达品系筛选方法具体包括：
[0028] 第一步，双gRNA转基因载体注射及阳性个体筛选。将sgRNA转基因表达质粒通过显微注射的方法注射到刚产下的蚕卵中，将能成功孵化的幼虫用新鲜桑叶进行饲养得到G0代成虫，G0代成虫交配得到G1代蚕卵。蚕卵催青至5-6天时进行绿色荧光筛选；A、A#表示G1代筛到的眼睛发绿光的阳性蚕卵；B、B#表示G1代阳性成虫；
[0029] 第二步，sgRNA表达品系与Cas9表达品系进行杂交，筛选let-7C敲除品系；
[0030] (1)A.[let-7C-2gRNA]个体；B.[Cas9-MSG]个体；C.同时表达绿光和红光的个体为杂交个体，即为let-7C中部丝腺敲除个体[Δlet-7C-MSG]；
[0031] (2)A.[let-7C-2gRNA]个体；B.[Cas9-PSG]个体；C.同时表达绿光和红光的个体为杂交个体，即为let-7C后部丝腺敲除个体[Δlet-7C-PSG]；
[0032] 第三步，测序验证基因组上序列变化，证明let-7C被敲除；在let-7C上、下游设计引物，扩增出这段序列，通过测序的方法，鉴定家蚕丝腺细胞基因组DNA发生的变化；与正常序列比较，两个不同的sgRNA靶点出都发生了不同形式的碱基缺失，缺失2-83个碱基不等。
[0033] 进一步，所述第一步具体包括：
[0034] (1)提取pBac[3xp3-EGFP，let-7C-2gRNA]超纯质粒，与实验室保存的表达piggyBac转座酶的辅助载体pHA3PIG超纯质粒按摩尔比1:1混合；将混合后的质粒用显微注射仪注射到产卵后一小时以内的D9L蚕卵中，然后用无毒瞬干胶封闭注射孔；
[0035] (2)将注射后的蚕卵放入25℃，
相对湿度90％的生化
培养箱进行催青，9-10天后，用新鲜桑叶对家蚕幼虫进行饲养，此为G0代幼虫；
[0036] (3)将G0代幼虫饲养至成虫并自交，获得G1代产卵，催青至第5-6天，用宏观电动荧光
显微镜进行转基因阳性个体筛选；采用EGFP荧光蛋白为报告基因，所以G1代中胚胎眼睛发绿光的为阳性个体，命名为[let-7C-2gRNA]；
[0037] (4)G1代饲养至成虫，对成虫复眼再次进行绿色荧光筛选，筛选到的阳性个体用于后续的杂交实验。
[0038] 进一步，所述第二步具体包括：
[0039] 1)将[let-7C-2gRNA]品系分别与中部丝腺Cas9表达品系[Cas9-MSG]和后部丝腺Cas9表达品系[Cas9-PSG]进行杂交；
[0040] 2)杂交得到的F1代蚕卵放入25℃、相对湿度90％的生化培养箱中进行催青，催青至5-6天时，用宏观电动荧光显微镜进行报告基因筛选；F1代胚胎眼睛同时发绿光和红光的即为let-7C中部丝腺敲除个体[Δlet-7C-MSG]和let-7后部丝腺敲除个体[Δlet-7C-PSG]。
[0041] 进一步，所述第三步具体包括：
[0042] (1)将筛选到的[Δlet-7C-MSG]和[Δlet-7C-PSG]幼虫用新鲜桑叶饲养至五龄，解剖获得丝腺材料；
[0043] (2)利用组织DNA提取
试剂盒，提取丝腺细胞总DNA；
[0044] (3)设计引物对靶位点序列进行扩增，并连接到pMD-19-Tsimple载体上进行测序；
[0045] (4)用BioEidt软件对序列进行比对分析，鉴定碱基缺失数目。
[0046] 本发明的另一目的在于提供一种所述sgRNA表达品系筛选方法在提高家蚕丝腺发育和吐丝量中的应用，获得let-7C在中部丝腺特异敲除的品系[Δlet-7C-MSG]和let-7C后部丝腺特异敲除品系[Δlet-7C-PSG]。
[0047] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：人们一直期望能通过基因工程对家蚕的丝腺进行改造以提高蚕丝产量、改良家蚕品种，然而却苦于没有理想的分子靶标和科学的基因工程手段。本发明首次实现了let-7Cluster miRNAs(let-7、miR-100和miR-2795)在丝腺不同部位(中部丝腺和后部丝腺)的整体敲除。该方法并没有对任何
蛋白质编码基因进行过修饰或改变，也并未引入新的外源基因，而是利用CRISPR/Cas9技术在家蚕丝腺细胞中删除了let-7Cluster的全部miRNAs，解除了let-7C对丝腺发育和丝蛋白合成的负调控作用，实现了家蚕产丝量的提高。由于丝腺在家蚕完成吐丝后会随即完成组织消解，直到完全消失，所以丝腺中的let-7C miRNAs敲除并不会遗传给后代，也不会因为物种间的基因交流，对其他物种产生影响。所以，此技术在生产上安全、可靠，更具优势。
附图说明
[0048] 图1是本发明
实施例提供的sgRNA表达品系筛选方法
流程图。
[0049] 图2是本发明实施例提供的sgRNA转基因表达载体构建示意图。
[0050] 图3是本发明实施例提供的sgRNA表达品系筛选方法流程图。
[0051] 图4是本发明实施例提供的let-7C敲除品系筛选方法示意图。
[0052] 图5是本发明实施例提供的敲除形式鉴定示意图。
[0053] 图6是本发明实施例提供的let-7C敲除后，丝腺表型观察示意图。
[0054] 图7是本发明实施例提供的对丝腺长度、重量和茧重进行统计分析示意图。
具体实施方式
[0055] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施实例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0056] 本发明利用CRISPR/Cas9系统，首先建立一个表达let-7C敲除所用sgRNA的品系，将该品系与特定Cas9表达品系进行杂交，实现let-7C在家蚕丝腺中的敲除；具体是将sgRNA表达品系与中部丝腺、后部丝腺Cas9表达品系分别进行了杂交，获得了let-7C在中部丝腺特异敲除的品系[Δlet-7C-MSG]和let-7C后部丝腺特异敲除品系[Δlet-7C-PSG]；这些品系的家蚕，丝腺发育和吐丝量都发生了变化。
[0057] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0058] 如图1所示，本发明实施例提供的sgRNA表达品系筛选方法包括以下步骤：
[0059] S101：sgRNA设计及转基因表达载体构建；
[0060] S102：双gRNA转基因载体注射及阳性个体筛选；
[0061] S103：sgRNA表达品系与Cas9表达品系进行杂交，筛选let-7C敲除品系；
[0062] S104：测序验证基因组上序列变化，证明let-7C被敲除；
[0063] S105：在幼虫五龄期时，解剖丝腺，观察表型并拍照；
[0064] S106：对五龄第5-6天丝腺进行长度和重量检测；家蚕上蔟之后，对茧重进行统计。
[0065] 下面结合附图对本发明的应用原理作进一步的描述。
[0066] 本发明实施例提供的sgRNA表达品系筛选方法包括以下步骤：
[0067] 第一步：sgRNA设计及转基因表达载体构建(如图2所示)：
[0068] (1)在let-7C所在基因组上找到合适的sgRNA靶定位点，符合G(N20)GG结构；
[0069] (2)sgRNA表达载体用U6启动子同时表达两个sgRNA，筛选标记选用在眼睛和神经特异表达的启动子3XP3启动绿色荧光EGFP，转基因载体以鳞翅目昆虫转座子piggyBac为转基因基本骨架；
[0070] 具体包括：
[0071] 1)利用在线预测网站CCtop(https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/)预测敲除let-7C所需的sgRNA spacer。输入let-7C所在的基因组序列(约3000bp)，以G(N20)GG的结构找寻序列中的gRNA spacer，避免脱靶率较高的序列；在sgRNA spacer序列的5’末端加入相应的碱基(TGCA和AAAC用于AarI酶切后的连接，TCCG和AAAC用于BbaI酶切后的连接)，送华大基因合成引物：
[0072]
[0073] 2)以下列条件让引物退火形成双链：95℃变性5min，95℃梯度降温到25℃，每秒下降0.1℃，共700个循环；
[0074] 3)配制以下体系，37℃酶切过夜后回收pUC57[U6-2gRNA](此载体为双gRNA表达载体)载体骨架：
[0075]
[0076] 4)将sgRNA1-spacer退火形成的双链连接到pUC57[U6-2gRNA]载体骨架上，构建成pUC57[U6-sgRNA1]质粒；
[0077] 5)配制以下体系，37℃酶切4h后，回收pUC57[U6-sgRNA1]载体骨架：
[0078]
[0079] 6)将sgRNA2-spacer退火形成的双链连接到pUC57[U6-sgRNA1]载体骨架上，构建成pUC57[U6，let-7C-2gRNA]质粒；
[0080] 7)配制以下体系，37℃酶切4h后，回收[U6，let-7C-2gRNA]片段：
[0081]
[0082] 8)将回收的let-7C敲除双sgRNA表达片段[U6，let-7C-2gRNA]连接到piggyBac[3xP3-EGFP]载体上，构建成let-7C敲除双gRNA转基因表达载体：pBac[3xp3-EGFP，let-7C-2gRNA]。
[0083] 第二步：双gRNA转基因载体注射及阳性个体筛选(如图3所示)：
[0084] 将sgRNA转基因表达质粒通过显微注射的方法注射到刚产下的蚕卵中，将能成功孵化的幼虫用新鲜桑叶进行饲养得到G0代成虫，G0代成虫交配得到G1代蚕卵。蚕卵催青至5-6天时进行绿色荧光筛选。A、A#表示G1代筛到的眼睛发绿光的阳性蚕卵。B、B#表示G1代阳性成虫；具体包括：
[0085] (1)提取pBac[3xp3-EGFP，let-7C-2gRNA]超纯质粒，与实验室保存的表达piggyBac转座酶的辅助载体pHA3PIG超纯质粒按摩尔比1:1混合；将混合后的质粒用显微注射仪注射到产卵后一小时以内的D9L蚕卵中，然后用无毒瞬干胶封闭注射孔；
[0086] (2)将注射后的蚕卵放入25℃，相对湿度90％的生化培养箱进行催青，9-10天后，用新鲜桑叶对家蚕幼虫进行饲养，此为G0代幼虫；
[0087] (3)将G0代幼虫饲养至成虫并自交，获得G1代产卵，催青至第5-6天，用宏观电动荧光显微镜(Olympus MVX10)进行转基因阳性个体筛选。因为采用EGFP荧光蛋白为报告基因，所以G1代中胚胎眼睛发绿光的为阳性个体，命名为[let-7C-2gRNA]；
[0088] (4)G1代饲养至成虫，对成虫复眼再次进行绿色荧光筛选，筛选到的阳性个体用于后续的杂交实验。
[0089] 第三步：sgRNA表达品系与Cas9表达品系进行杂交，筛选let-7C敲除品系(如图4所示)：
[0090] (1)[let-7C-2gRNA]个体；B.[Cas9-MSG]个体；C.同时表达绿光和红光的个体为杂交个体，即为let-7C中部丝腺敲除个体[Δlet-7C-MSG]；
[0091] (2)[let-7C-2gRNA]个体；B.[Cas9-PSG]个体；C.同时表达绿光和红光的个体为杂交个体，即为let-7C后部丝腺敲除个体[Δlet-7C-PSG]；
[0092] 具体包括：
[0093] 1)将[let-7C-2gRNA]品系分别与中部丝腺Cas9表达品系[Cas9-MSG]和后部丝腺Cas9表达品系[Cas9-PSG]进行杂交；
[0094] 2)杂交得到的F1代蚕卵放入25℃、相对湿度90％的生化培养箱中进行催青，催青至5-6天时，用宏观电动荧光显微镜(Olympus MVX10)进行报告基因筛选。F1代胚胎眼睛同时发绿光和红光的即为let-7C中部丝腺敲除个体[Δlet-7C-MSG]和let-7后部丝腺敲除个体[Δlet-7C-PSG]。
[0095] 第四步：测序验证基因组上序列变化，证明let-7C被敲除(如图5所示)。
[0096] 在let-7C上下游设计引物，扩增出这段序列，通过测序的方法，鉴定家蚕丝腺细胞基因组DNA发生的变化。与正常序列比较，两个不同的sgRNA靶点出都发生了不同形式的碱基缺失，缺失2-83个碱基不等；
[0097] 具体包括：
[0098] (1)将筛选到的[Δlet-7C-MSG]和[Δlet-7C-PSG]幼虫用新鲜桑叶饲养至五龄，解剖获得丝腺材料；
[0099] (2)利用组织DNA提取试剂盒(Omega，D3396-02)，提取丝腺细胞总DNA；
[0100] (3)设计引物对靶位点序列进行扩增，并连接到pMD-19-Tsimple载体上进行测序。SEQIDNO：3：>let-7C-KO-F：GTCAACGCGCCTAAAGAA；SEQ ID NO：4>let-7C-KO-R：
TTTAGTGGTCTTGTGAGGAATG；
[0101] (4)用BioEidt软件对序列进行比对分析，鉴定碱基缺失数目。
[0102] 第五步：在幼虫五龄期时，解剖丝腺，观察表型并拍照(如图6所示)：
[0103] (1)[let-7C-2gRNA]个体与[Cas9-MSG]个体杂交后，出现四种不同的发光形式，对它们的中部丝腺比较发现：[Δlet-7C-MSG]个体中部丝腺中部和后部明显膨大，表明呈锯齿状凸起；
[0104] (2)[let-7C-2gRNA]个体与[Cas9-PSG]个体杂交后，出现四种不同的发光形式，对它们的后部丝腺比较发现：[Δlet-7C-PSG]个体后部丝腺明显变长、增粗，表明呈锯齿状凸起，卷曲程度升高；
[0105] 具体包括：
[0106] 1)将筛选到的[Δlet-7C-MSG]和[Δlet-7C-PSG]幼虫用新鲜桑叶饲养至五龄第5-6天到第六天；
[0107] 2)解剖丝腺观察表型并用相机拍照。
[0108] 第六步：对五龄第5-6天丝腺进行长度和重量检测；家蚕上蔟之后，对茧重进行统计(如图7所示)：
[0109] (1)[Δlet-7C-PSG]个体后部丝腺长度增加了60％；B.[Δlet-7C-PSG]个体后部丝腺重量增加了100％；
[0110] (2)[Δlet-7-PSG]个体蚕茧重量增加了12％；D.[Δlet-7C-MSG]个体蚕茧重量减少了15％；
[0111] 具体包括：
[0112] 1)将筛选到的[Δlet-7C-MSG]和[Δlet-7C-PSG]幼虫用新鲜桑叶饲养至五龄第5-6天到第六天；
[0113] 2)解剖后部丝腺对其长度、重量进行测量；
[0114] 3)继续将筛选到的[Δlet-7C-MSG]和[Δlet-7C-PSG]幼虫饲养至吐丝结茧；幼虫
化蛹，结束吐丝后对蚕茧重量进行称重和比较。
[0115] 证明部分(具体实施例/实验/仿真/药理学分析/能够证明本发明创造性的
正面实验数据、证据材料、鉴定报告、商业数据、研发证据、商业合作证据等)[0116] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
