一种靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoyODNs的制备方法及其应用
阅读：81发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoyODNs的制备方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于医药技术领域，涉及一种靶向DNA纳米自组装体载NF‑κB decoy ODNs的制备方法及其应用。靶向DNA纳米自组装体载NF‑κB decoy ODNs由DNA四面体、NF‑κB decoy ODNs、VCAM‑1靶向多肽组成，其中NF‑κB decoy ODNs和VCAM‑1靶向多肽通过 碱 基互补 配对 原则连接到DNA纳米自组装体上。本发明的DNA纳米自组装体的平均粒径小于10nm。靶向多肽修饰的DNA纳米自组装体载NF‑κB decoy ODNs提高了基因药物的靶向性，提高了药物的体外抗炎效果，对细胞及组织基本无毒性。，下面是一种靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoyODNs的制备方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将四条单链直链DNA与组成NF-κB decoy ODNs的两条链NF- κB C、NF-κB D在体外缓冲盐溶液中，退火自组装形成TD-dODNs溶液；
（2）ssDNA-Peptide：低速搅拌向ssDNA中滴加交联剂，在pH7 9条件下，室温反应2h，透~
析24h除去未反应的多肽，得到ssDNA-SMCC，然后加入VCAM-1靶向多肽，pH6.5 7.5条件下，~
反应8 12h，透析24h除去未反应的多肽，得到ssDNA-Peptide；
~
（3）向步骤（1）中制备的TD-dODNs溶液中加入ssDNA-peptide，以2 min/℃的速度从40℃降至20℃，完成靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的制备；
所述步骤（1）中四条单链直链DNA为单链直链S1、S2-F、S3、S4或单链直链S1、S2-F、S3-P、S4或单链直链S1-P、S2-F、S3-P、S4-F或单链直链S1、S2、S3、S4；四条单链直链DNA与NF- κB C和NF-κB D反应的物质的量比为：1:1:1:1：（1 3）：（1 3）；
~ ~
所述单链直链S1的序列如SEQ ID NO：1所示，单链直链S1-P的序列如SEQ ID NO：3所示，单链直链S2的序列如SEQ ID NO：4所示，单链直链S2-F的序列如SEQ ID NO：5所示，单链直链S3的序列如SEQ ID NO：6所示，单链直链S3-P的序列如SEQ ID NO：7所示，单链直链S4的序列如SEQ ID NO：8所示，单链直链S4-F的序列如SEQ ID NO：9所示，NF-ΚB C序列如SEQ ID NO：10所示，NF-ΚB D序列如SEQ ID NO：11所示。
2.如权利要求1所述的靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中体外缓冲盐溶液为将MgCl2溶于浓度5~20mM的Tris·HCl溶液中，MgCl2的终浓度为5 20mM。
~
3.如权利要求1所述的靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中退火条件为95℃保持5min，10s内由95℃降温至4℃，4℃保持30s。
4.如权利要求1所述的靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，ssDNA序列如SEQ ID NO：12所示，其3’端C7经氨基修饰；交联剂为Sulfo-SMCC溶液；VCAM-1靶向多肽序列如SEQ ID NO：11所示；ssDNA：VCAM-1靶向多肽的物质的量比为20:1。
5.如权利要求1所述的靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，ssDNA-peptide：TD-dODNs的物质的量比为1：（1 2）。
~
6.如权利要求1所述的靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的制备方法，其特征在于：所述DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的平均粒径小于10nm。
7.权利要求1-6任一项所述的靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs作为制备抗类风湿性关节炎免疫治疗药物的应用。
一种靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的制备方法
及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及一种靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的制备方法及其应用。
背景技术
[0002] 核因子-κB/ Rel转录因子家族在协调参与免疫和炎症过程的几种基因的表达中起着中心作用，NF-κB 几乎在所有细胞的细胞质中都有表达，正常情况下，NF-κB通常是抑制性蛋白（IκB）与p50和p65亚基结合的异源二聚体，但在炎症介入的疾病的相关细胞中，细胞被多种因子激活，如促炎细胞因子，细菌脂多糖（LPS）和佛波酯等，NF-κB 被激活，NF-κB 的抑制剂IκB 会被磷酸化而被降解，并释放脱离了IκB 的P50/P65 复合体，P50/P65 复合体进入细胞，启动各种炎症基因的转录和表达。基因药物NF-κB decoy ODNs可以特异性地结合NF-κB 的P50/P65 复合体，与P50/P65 复合体特异性结合后可阻止NF-κB 进入细胞核，抑制炎症基因的转录，抑制炎症因子的产生，从而降低炎症反应。
[0003] NF-κB decoy ODNs与传统治疗方法相比，能特异性结合核因子-κB ，从根源上改善炎症的发生，从而达到治疗目的，与传统药物相比，具有高效低毒的优势。然而游离的NF-κB decoy ODNs由于细胞膜传递性差，在体内易受酶的降解，靶向性差而极大地限制了其发挥作用。DNA纳米自组装体本身具有良好的稳定性，良好的生物相容性，大小和形状的高度可
[0004] 控性等优点，DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs将显著提高NF-κB decoy ODNs 在体内外的稳定性和疗效，而且NF-κB decoy ODNs 纳米组装体通过高效阻止炎症反应，可有效控制疾病发展。
[0005] 血管内皮细胞黏附分子（Vascular cell adhesionmolecule-1, VCAM-1），是一个90K 110K 道尔顿的糖蛋白，其在炎症滑膜血管内皮细胞、炎症巨噬细胞和炎症成纤维样滑~
膜细胞表面均呈现高表达,主要与存在于白细胞和嗜酸性粒细胞表面的受体α4整合素家族的α4β1(又称very lateantigen 4,VLA-4)结合,介导并增强白细胞向血管内皮细胞和炎症成纤维样滑膜细胞的黏附，从而增强白细胞向滑膜关节腔的渗入和停留；参与淋巴细胞的活化、迁移和造血细胞的生长发育,并在肿瘤、炎症转移等病理过程中起重要作用。在DNA纳米自组装体体上修饰VCAM-1 靶向多肽，将使纳米组装体像白细胞一样易于向发炎滑膜聚集。由于滑模腔内的炎症细胞表面高表达VCAM-1，因此被VCAM-1靶向多肽修饰的NF-κB decoy ODNs 纳米组装体可主动靶向于滑模腔内的炎症细胞，提高整体的抗炎效果，达到高效低毒治疗类风湿性关节炎的目的。
膜细胞表面均呈现高表达,主要与存在于白细胞和嗜酸性粒细胞表面的受体α4整合素家族的α4β1(又称very lateantigen 4,VLA-4)结合,介导并增强白细胞向血管内皮细胞和炎症成纤维样滑膜细胞的黏附，从而增强白细胞向滑膜关节腔的渗入和停留；参与淋巴细胞的活化、迁移和造血细胞的生长发育,并在肿瘤、炎症转移等病理过程中起重要作用。在DNA纳米自组装体体上修饰VCAM-1 靶向多肽，将使纳米组装体像白细胞一样易于向发炎滑膜聚集。由于滑模腔内的炎症细胞表面高表达VCAM-1，因此被VCAM-1靶向多肽修饰的NF-κB decoy ODNs 纳米组装体可主动靶向于滑模腔内的炎症细胞，提高整体的抗炎效果，达到高效低毒治疗类风湿性关节炎的目的。
[0006] 目前，通过DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs并修饰VCAM-1靶向多肽形成的药物传递系统在治疗类风湿性关节炎的应用中尚未报道。
发明内容
[0007] 本发明为解决NF-κB decoy ODNs在治疗类风湿性关节炎中稳定性差、抗炎效果不佳、副作用大的技术难题，公开了一种靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的制备方法及其应用。
[0008] 为解决上述技术难题，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的制备方法，步骤如下：
[0010] （1）将四条单链直链DNA与组成NF-κB decoy ODNs的两条链NF- κB C、NF-κB D在体外缓冲盐溶液中，退火自组装形成TD-dODNs溶液；
[0011] （2）ssDNA-Peptide：低速搅拌向ssDNA中滴加交联剂，在pH7 9条件下，室温反应~2h，透析24h除去未反应的多肽，得到ssDNA-SMCC，然后加入VCAM-1靶向多肽，pH6.5 7.5条~
件下，反应8 12h，透析24h除去未反应的多肽，得到ssDNA-Peptide；
~
件下，反应8 12h，透析24h除去未反应的多肽，得到ssDNA-Peptide；
~
[0012] （3）向步骤（1）中制备的TD-dODNs溶液中加入ssDNA-peptide，以2 min/℃的速度从40℃降至20℃，完成靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的制备。
[0013] 所述步骤（1）中四条单链直链DNA为单链直链S1、S2-F、S3、S4或单链直链S1、S2-F、S3P、S4或单链直链S1-P、S2-F、S3-P、S4-F或单链直链S1-F、S2-F、S3-P、S4-F；四条单链直链DNA与NF- κB C和NF-κB D反应的物质的量比为：1:1:1:1：（1 3）：（1 3）。~ ~
[0014] 所述单链直链S1的序列如SEQ ID NO：1所示，单链直链S1-F的序列如SEQ ID NO：2所示，单链直链S1-P的序列如SEQ ID NO：3所示，单链直链S2的序列如SEQ ID NO：4所示，单链直链S2-F的序列如SEQ ID NO：5所示，单链直链S3的序列如SEQ ID NO：6所示，单链直链S3-P的序列如SEQ ID NO：7所示，单链直链S4的序列如SEQ ID NO：8所示，单链直链S4-F的序列如SEQ ID NO：9所示，NF-ΚB C序列如SEQ ID NO：10所示，NF-ΚB D序列如SEQ ID NO：11所示。
[0015] 所述步骤（1）中体外缓冲盐溶液为将MgCl2溶于浓度5~20mM的Tris·HCl溶液中，MgCl2的终浓度为5 20mM。~
[0016] 所述步骤（1）中退火条件为95℃保持5min，10s内由95℃降温至4℃，4℃保持30s。
[0017] 所述步骤（2）中，ssDNA序列如SEQ ID NO：11所示，其3’端C7经氨基修饰；交联剂为Sulfo-SMCC溶液；VCAM-1靶向多肽序列如SEQ ID NO：12所示；ssDNA：VCAM-1靶向多肽的物质的量比为20:1。
[0018] 所述步骤（3）中，ssDNA-peptide：TD-dODNs的物质的量比为1：（1 2）。~
[0019] 所述DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的平均粒径小于10nm。
[0020] 一种靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs作为抗类风湿性关节炎免疫治疗的应用。
[0021] 本发明的有益效果在于：
[0022] 1. 本发明采用DNA纳米自组装技术合成载体，制备方法简单，结构稳定，NF-κB decoy ODNs可与载体通过碱基互补配对连接，同时提高了药物的稳定性。选用VCAM-1靶向多肽修饰DNA纳米自组装体，提高NF-κB dODNs 纳米组装体对炎症部位和炎症细胞的靶向性，增强抗炎效果。
[0024] 图1为dODNs、TD、TD-dODNs、TD-1P-dODNs、TD-2P-2ODNs、TD-3P-dODNs、dODNs的琼脂糖凝胶电泳图。
[0025] 图2为ssDNA、ssDNA-peptide的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0026] 图3为DNA纳米自组装体的AFM图。
[0027] 图4为载体对巨噬细胞RAW264.7的毒性考察。
[0028] 图5为载体对脐静脉血管内皮细胞HUVEC的毒性考察。
[0029] 图6为TD、dODNs、TDSODNs、TD-dODNs、TD-1P-dODNs对巨噬细胞RAW264.7的抗炎作用。
具体实施方式
[0030] 现以合成靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs为例阐述具体实施方式。
[0031] 实施例1
[0032] （1）NF-κB decoy ODNs的合成：
[0033] 将合成NF-κB decoy ODNs的两条单链NF-κB D、NF-κB D’等摩尔比混合，用TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，从80 ℃降温到25 ℃，降温时间为2 h。NF-κB decoy ODNs合成，4 ℃保存。
[0034] （2）DNA纳米自组装体的合成:
[0035] 将合成DNA纳米自组装体的四条单链S1、S2、S3、S4等摩尔比混合，用5mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。DNA纳米自组装体合成，4 ℃保存。
[0036] （3）DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的合成：
[0037] 将S1、S2-F、S3、S4、NF-κB C、NF-κB D等摩尔比混合，用5mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。DNA纳米自组装体合成，4 ℃保存。
[0038] （4）ssDNA-peptide的合成：
[0039] 低速搅拌下向3' 端C7氨基修饰的单链直链DNA（ssDNA）中逐滴滴加Sulfo-SMCC溶液，物质的量比为ssDNA：Sulfo-SMCC=1:400，pH7 9，室温反应2h，透析24h除去未反应多肽，~得ssDNA-SMCC溶液；磁力搅拌下逐滴加入VCAM-1靶向多肽，物质的量比为VCAM-1靶向多肽：
ssDNA=1:20，pH6.5 7.5，反应过夜，透析24h除去未反应多肽，得到ssDNA-Peptide溶液，4 ~
℃保存。
ssDNA=1:20，pH6.5 7.5，反应过夜，透析24h除去未反应多肽，得到ssDNA-Peptide溶液，4 ~
℃保存。
[0040] （5）靶向四面体载NF-κB decoy ODNs前体的合成：
[0041] 将S1、S2-F、S3-P、S4、NF-κB C、NF-κB D等摩尔比混合，用5mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。靶向四面体载NF-κB decoy ODNs前体的合成，4 ℃保存。
[0042] （6）靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的合成：
[0043] 向已构建好的靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs前体中加入等摩尔量的ssDNA-peptide，从40 ℃开始，以2 min/℃的速度降温至20 ℃。靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs构建完成，4 ℃保存。
[0044] 实施例2
[0045] （1）NF-κB decoy ODNs的合成：
[0046] 将合成NF-κB decoy ODNs的两条单链NF-κB D、NF-κB D’等摩尔比混合，用TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，从80 ℃降温到25 ℃，降温时间为2 h。NF-κB decoy ODNs合成，4 ℃保存。
[0047] （2）DNA纳米自组装体的合成:
[0048] 将合成DNA纳米自组装体的四条单链S1、S2、S3、S4等摩尔比混合，用5mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。DNA纳米自组装体合成，4 ℃保存。
[0049] （3）DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的合成：
[0050] 将S1、S2F、S3、S4、NF-κB C、NF-κB D等摩尔比混合，用5mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。DNA纳米自组装体合成，4 ℃保存。
[0051] （4）ssDNA-peptide的合成：
[0052] 低速搅拌下向3' 端C7氨基修饰的单链直链DNA（ssDNA）中逐滴滴加Sulfo-SMCC溶液，物质的量比为ssDNA：Sulfo-SMCC=1:400，pH7 9，室温反应2h，透析24h除去未反应多肽，~得ssDNA-SMCC溶液；磁力搅拌下逐滴加入VCAM-1靶向多肽，物质的量比为VCAM-1靶向多肽：
ssDNA=1:20，pH6.5 7.5，反应过夜，透析24h除去未反应多肽，得到ssDNA-Peptide溶液，4 ~
℃保存。
ssDNA=1:20，pH6.5 7.5，反应过夜，透析24h除去未反应多肽，得到ssDNA-Peptide溶液，4 ~
℃保存。
[0053] （5）靶向四面体载NF-κB decoy ODNs前体的合成：
[0054] 将S1P、S2F、S3P、S4F、NF-κB C、NF-κB D以1:1:1:1:2:2的摩尔比混合，用5mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。靶向四面体载NF-κB decoy ODNs前体的合成，4 ℃保存。
[0055] （6）靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的合成：
[0056] 向已构建好的靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs前体中加入1:2摩尔比的ssDNA-peptide，从40 ℃开始，以2 min/℃的速度降温至20 ℃。靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs构建完成，4 ℃保存。
[0057] 实施例3
[0058] （1）NF-κB decoy ODNs的合成：
[0059] 将合成NF-κB decoy ODNs的两条单链NF-κB D、NF-κB D’等摩尔比混合，用TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，从80 ℃降温到25 ℃，降温时间为2 h。NF-κB decoy ODNs合成，4 ℃保存。
[0060] （2）DNA纳米自组装体的合成:
[0061] 将合成DNA纳米自组装体的四条单链S1、S2、S3、S4等摩尔比混合，用5mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。DNA纳米自组装体合成，4 ℃保存。
[0062] （3）DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的合成：
[0063] 将S1、S2F、S3、S4、NF-κB C、NF-κB D等摩尔比混合，用5mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。DNA纳米自组装体合成，4 ℃保存。
[0064] （4）ssDNA-peptide的合成：
[0065] 低速搅拌下向3' 端C7氨基修饰的单链直链DNA（ssDNA）中逐滴滴加Sulfo-SMCC溶液，物质的量比为ssDNA：Sulfo-SMCC=1:400，pH7 9，室温反应2h，透析24h除去未反应多肽，~得ssDNA-SMCC溶液；磁力搅拌下逐滴加入VCAM-1靶向多肽，物质的量比为VCAM-1靶向多肽：
ssDNA=1:20，pH6.5 7.5，反应过夜，透析24h除去未反应多肽，得到ssDNA-Peptide溶液，4 ~
℃保存。
ssDNA=1:20，pH6.5 7.5，反应过夜，透析24h除去未反应多肽，得到ssDNA-Peptide溶液，4 ~
℃保存。
[0066] （5）靶向四面体载NF-κB decoy ODNs前体的合成：
[0067] 将S1P、S2F、S3P、S4F、NF-κB C、NF-κB D以1:1:1:1:3:3的摩尔比混合，用5mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。靶向四面体载NF-κB decoy ODNs前体的合成，4 ℃保存。
[0068] （6）靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的合成：
[0069] 向已构建好的靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs前体中加入等摩尔比的ssDNA-peptide，从40 ℃开始，以2 min/℃的速度降温至20 ℃。靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs构建完成，4 ℃保存。
[0070] 实施例4
[0071] （1）NF-κB decoy ODNs的合成：
[0072] 将合成NF-κB decoy ODNs的两条单链NF-κB D、NF-κB D’等摩尔比混合，用TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，从80 ℃降温到25 ℃，降温时间为2 h。NF-κB decoy ODNs合成，4 ℃保存。
[0073] （2）DNA纳米自组装体的合成:
[0074] 将合成DNA纳米自组装体的四条单链S1、S2、S3、S4等摩尔比混合，用10mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。DNA纳米自组装体合成，4 ℃保存。
[0075] （3）DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的合成：
[0076] 将S1、S2-F、S3、S4、NF-κB C、NF-κB D等摩尔比混合，用10mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。DNA纳米自组装体合成，4 ℃保存。
[0077] （4）ssDNA-peptide的合成：
[0078] 低速搅拌下向3' 端C7氨基修饰的单链直链DNA（ssDNA）中逐滴滴加Sulfo-SMCC溶液，物质的量比为ssDNA：Sulfo-SMCC=1:400，pH7 9，室温反应2h，透析24h除去未反应多肽，~得ssDNA-SMCC溶液；磁力搅拌下逐滴加入VCAM-1靶向多肽，物质的量比为VCAM-1靶向多肽：
ssDNA=1:20，pH6.5 7.5，反应过夜，透析24h除去未反应多肽，得到ssDNA-Peptide溶液，4 ~
℃保存。
ssDNA=1:20，pH6.5 7.5，反应过夜，透析24h除去未反应多肽，得到ssDNA-Peptide溶液，4 ~
℃保存。
[0079] （5）靶向四面体载NF-κB decoy ODNs前体的合成：
[0080] 将S1、S2-F、S3-P、S4、NF-κB C、NF-κB D等摩尔比混合，用10mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。靶向四面体载NF-κB decoy ODNs前体的合成，4 ℃保存。
[0081] （6）靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的合成：
[0082] 向已构建好的靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs前体中加入等摩尔量的ssDNA-peptide，从40 ℃开始，以2 min/℃的速度降温至20 ℃。靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs构建完成，4 ℃保存。
[0083] 实施例5
[0084] （1）NF-κB decoy ODNs的合成：
[0085] 将合成NF-κB decoy ODNs的两条单链NF-κB D、NF-κB D’等摩尔比混合，用TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，从80 ℃降温到25 ℃，降温时间为2 h。NF-κB decoy ODNs合成，4 ℃保存。
[0086] （2）DNA纳米自组装体的合成:
[0087] 将合成DNA纳米自组装体的四条单链S1、S2、S3、S4等摩尔比混合，用10mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。DNA纳米自组装体合成，4 ℃保存。
[0088] （3）DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的合成：
[0089] 将S1、S2F、S3、S4、NF-κB C、NF-κB D等摩尔比混合，用10mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。DNA纳米自组装体合成，4 ℃保存。
[0090] （4）ssDNA-peptide的合成：
[0091] 低速搅拌下向3' 端C7氨基修饰的单链直链DNA（ssDNA）中逐滴滴加Sulfo-SMCC溶液，物质的量比为ssDNA：Sulfo-SMCC=1:400，pH7 9，室温反应2h，透析24h除去未反应多肽，~得ssDNA-SMCC溶液；磁力搅拌下逐滴加入VCAM-1靶向多肽，物质的量比为VCAM-1靶向多肽：
ssDNA=1:20，pH6.5 7.5，反应过夜，透析24h除去未反应多肽，得到ssDNA-Peptide溶液，4 ~
℃保存。
ssDNA=1:20，pH6.5 7.5，反应过夜，透析24h除去未反应多肽，得到ssDNA-Peptide溶液，4 ~
℃保存。
[0092] （5）靶向四面体载NF-κB decoy ODNs前体的合成：
[0093] 将S1P、S2F、S3P、S4F、NF-κB C、NF-κB D以1:1:1:1:2:2的摩尔比混合，用10mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。靶向四面体载NF-κB decoy ODNs前体的合成，4 ℃保存。
[0094] （6）靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的合成：
[0095] 向已构建好的靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs前体中加入1:2摩尔比的ssDNA-peptide，从40 ℃开始，以2 min/℃的速度降温至20 ℃。靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs构建完成，4 ℃保存。
[0096] 实施例6
[0097] （1）NF-κB decoy ODNs的合成：
[0098] 将合成NF-κB decoy ODNs的两条单链NF-κB D、NF-κB D’等摩尔比混合，用TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，从80 ℃降温到25 ℃，降温时间为2 h。NF-κB decoy ODNs合成，4 ℃保存。
[0099] （2）DNA纳米自组装体的合成:
[0100] 将合成DNA纳米自组装体的四条单链S1、S2、S3、S4等摩尔比混合，用10mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。DNA纳米自组装体合成，4 ℃保存。
[0101] （3）DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的合成：
[0102] 将S1、S2F、S3、S4、NF-κB C、NF-κB D等摩尔比混合，用10mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。DNA纳米自组装体合成，4 ℃保存。
[0103] （4）ssDNA-peptide的合成：
[0104] 低速搅拌下向3' 端C7氨基修饰的单链直链DNA（ssDNA）中逐滴滴加Sulfo-SMCC溶液，物质的量比为ssDNA：Sulfo-SMCC=1:400，pH7 9，室温反应2h，透析24h除去未反应多肽，~得ssDNA-SMCC溶液；磁力搅拌下逐滴加入VCAM-1靶向多肽，物质的量比为VCAM-1靶向多肽：
ssDNA=1:20，pH6.5 7.5，反应过夜，透析24h除去未反应多肽，得到ssDNA-Peptide溶液，4 ~
℃保存。
ssDNA=1:20，pH6.5 7.5，反应过夜，透析24h除去未反应多肽，得到ssDNA-Peptide溶液，4 ~
℃保存。
[0105] （5）靶向四面体载NF-κB decoy ODNs前体的合成：
[0106] 将S1P、S2F、S3P、S4F、NF-κB C、NF-κB D以1:1:1:1:3:3的摩尔比混合，用10mM TM（Tris∙HCl，pH8.0和MgCl2）缓冲液稀释至终浓度为0.5 μM，低速涡旋至混合均匀。在PCR仪中，95℃变性5 min后，迅速降温至4 ℃并保持30 s。靶向四面体载NF-κB decoy ODNs前体的合成，4 ℃保存。
[0107] （6）靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的合成：
[0108] 向已构建好的靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs前体中加入等摩尔比的ssDNA-peptide，从40 ℃开始，以2 min/℃的速度降温至20 ℃。靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs构建完成，4 ℃保存。
[0109] 效果实施例1：实施例1-3的琼脂糖凝胶电泳表征：
[0110] 精密称取0.60 g琼脂糖粉末，加到20 ml 1×TAE电泳液中，置于电炉上加热煮沸3 min，待温度冷却至70 ℃左右，加入1.2 μL溴化乙锭（EB）溶液，混合后将凝胶倒入模具中，室温冷却30-45 min，即制得3%琼脂糖凝胶。将制备好的凝胶放于装有1×TAE电泳液的电泳槽中，使电泳液液面高于凝胶2 mm左右，将各样品与6×loading buffer按1:0.2的比例进行混合，混合后加到凝胶加样孔中，冰浴条件，100 V的电压电泳50 min。电泳完成后，用凝胶成像仪分析。结果见图1。
[0111] 效果实施例2：本发明实施例1的 ssDNA-peptide的聚丙烯酰胺凝胶电泳：
[0112] 安装好电泳装置，检漏10 min, 制胶：向10 mLEP管中加入30%丙烯酰胺4 mL、5×TBE 1.6 mL、10%过硫酸铵0.056 mL、纯化水2.344 mL、混合均匀后，加入TEMED 5.2 μL,混匀后，将胶注入玻璃板间，插入梳子，聚合30 min,拔出梳子，用1×TBE电泳液充满电泳槽，将6×loading buffer与样品5:1充分混合，加入样品孔。110 V电泳90 min，将凝胶置于0.5%EB中染色15 min，用凝胶成像仪分析。结果见图2。
[0114] 将合成好的DNA纳米自组装体用TM buffer稀释至终浓度为125 nM。取10 µL样品，滴加到云母片上，通过正负电荷相互吸引，静止吸附5 min，使DNA纳米自组装体吸附到云母表面。再滴加TM buffer覆盖样品。用AFM在液相模式下进行扫描。结果见图3。可见三角形框架，大小约5.8 nm，由于云母片的吸附作用DNA四面体高度有所下降，约3.4 nm。
[0115] 效果实施例4：本发明实施例1的DNA纳米自组装体的细胞毒性考察：
[0116] 采用两种与炎症反应相关的细胞RAW264.7和 HUVEC对DNA纳米自组装体的细胞毒性进行研究，用CCK-8法考察细胞的增殖抑制情况。结果见图4。结果显示实验所用的DNA纳米自组装体浓度对细胞生长抑制率都小于10%，在LPS存在的情况下，DNA纳米自组装体对细胞抑制率也低于10%，说明本实验所用载体材料对RAW264.7和HUVEC细胞无明显毒性，可排除干扰。
[0117] 效果实施例5：本发明实施例1的靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的体外抗炎作用：
[0118] 采用两种与炎症反应相关的细胞RAW264.7和 HUVEC对靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的抗炎作用进行研究，用ELISA法检测细胞产生的炎症因子。结果见图4。药物NF-κB decoy ODNs对两种炎症细胞的抗炎作用随浓度的增加而增强，相同浓度下，TD-
1P-dODNs对细胞炎症因子产生的抑制作用最明显，其次是TD-dODNs，游离NF-κB decoy ODNs作用最弱。结果表明靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs增强了NF-κB decoy ODNs的抗炎作用。
1P-dODNs对细胞炎症因子产生的抑制作用最明显，其次是TD-dODNs，游离NF-κB decoy ODNs作用最弱。结果表明靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs增强了NF-κB decoy ODNs的抗炎作用。
[0119] 效果实施例6：本发明实施例1的RAW264.7和HUVEC对靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs的定量摄取：
[0120] RAW264.7和HUVEC对靶向DNA纳米自组装体载NF-κB decoy ODNs摄取2h和4h的荧光强度值见表1和表2，4h时细胞对药物NF-κB decoy ODNs的摄取量明显高于2h的摄取量，TD-1P-dODNs明显比TD-dODNs的摄取量多，两者摄取量都高于游离NF-κB decoy ODNs；4h时，RAW264.7对TD-1P-dODNs的摄取量是 TD-dODNs的1.05倍，是dODNs的2.81倍，HUVEC对TD-1P-dODNs的摄取量是 TD-dODNs的1.38倍，是dODNs的2.63倍。
[0121] 表1 药物在RAW264.7细胞摄取的荧光强度值
[0122] 。
[0123] 表2 药物在HUVEC细胞摄取的荧光强度值
[0124]
[0125] 结果表明，DNA纳米自组装体提高了细胞对药物摄取，修饰VCAM-1靶向多肽后，明显增加了细胞的摄取量。
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