一株防治棉花苗期根腐病的莫海威芽孢杆菌及其应用
阅读：515发布：2020-05-08
专利汇可以提供一株防治棉花苗期根腐病的莫海威芽孢杆菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株防治 棉 花苗期根腐病的莫海威芽孢杆菌及其应用，属于农业 生物 防治技术领域。本发明公开的莫海威芽孢杆菌HWt34，为防治棉花苗期根腐病提供了一个新型高效的 微生物 ；本发明莫海威芽孢杆菌 可湿性粉剂 和生物肥对棉花根腐病的药效高，平均防效在78.43％以上，且具有广谱性；利用本发明防治棉花苗期根腐病持效期长，且不易产生抗药性，对棉花生长有明显的促进作用。，下面是一株防治棉花苗期根腐病的莫海威芽孢杆菌及其应用专利的具体信息内容。
1.莫海威芽孢杆菌Bacillus mojavensis HWt34，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.18941。
2.权利要求1所述的莫海威芽孢杆菌HWt34在防治棉花苗期根腐病中的应用。
3.利用权利要求1所述的莫海威芽孢杆菌HWt34制成的可湿性粉剂。
4.权利要求3所述的可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)挑取菌株HWt34单菌落在LB斜面培养基上，在30℃下培养24小时，得活化的菌株；将活化的菌株接种到100ml LB液体培养基中，在30℃、摇床转速为150rpm条件下培养24小时，得种子液；
(2)按照体积比为1～3％的比例将种子液接入到蔗糖酵母浸粉培养基中，在温度为28℃、摇床转速为150rpm条件下发酵培养72h，得到发酵液；
(3)将发酵液进行过滤，喷雾干燥，得到莫海威芽孢杆菌原粉；
(4)按莫海威芽孢杆菌原粉占75％，填料硅藻土占10％，分散剂、润湿剂、稳定剂占15％制成可湿性粉剂。
5.权利要求3或4所述的可湿性粉剂用于对棉种进行拌种。
6.利用权利要求3或4所述的可湿性粉剂制成的生物肥，其特征在于，1kg莫海威芽孢杆菌可湿性粉剂与1吨羊粪混合制成生物肥。
7.权利要求3或4所述的可湿性粉剂在防治棉花苗期根腐病中的应用。
一株防治棉花苗期根腐病的莫海威芽孢杆菌及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 棉花苗期根腐类病害是包含立枯病(Rhizoctoni asolani Kuhn)、猝倒病[Pythium aphanidermatum(Eds.)Fitz]、炭疽病[Colletotrichum gossypii Southw.]、红腐病[Fusarium moniliforme(Var.)intermedium Neish et Leggett]、黑根腐病[Thilaviopsis basicola(Berk.et Br·)Ferravis]的综合类病害，由于常年连作、早春极端低温天气频发等因素导致新疆棉花立枯病发生日益严重。
[0003] 棉花苗期根腐病的防治主要通过化学农药喷施、包衣等措施来防治，但化学农药存在污染环境、产生抗药性等缺点，当前国家大力推行“化肥、农药”减量施用政策，因此利用生物农药进行防治顺应国家的需求，且生物农药具有对环境友好，不易产生抗药性等优点，急需大力发展推行。
[0004] 芽孢杆菌(Bacillius.sp)是一类应用最广泛的拮抗细菌。具有分布广、易培养、抗逆性强、耐贮藏等特点，是理想的生防微生物。
[0005] 目前，用于防治作物病害的芽孢杆菌的主要有枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等，经检索，没有发现本发明莫海威芽孢杆菌在防治棉花苗期根腐类病害方面的报道。
[0006] 因此，提供一株防治棉花苗期根腐病的莫海威芽孢杆菌及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
[0007] 有鉴于此，本发明提供了一株防治棉花苗期根腐病的莫海威芽孢杆菌及其应用，该菌株具有繁殖快、杀菌谱广等优点。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] 莫海威芽孢杆菌Bacillus mojavensis HWt34，保藏编号为CGMCC No.18941，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年11月12日，分类命名为莫海威芽孢杆菌Bacillus mojavensis。
[0010] 进一步，所述的莫海威芽孢杆菌HWt34在防治棉花苗期根腐病中的应用。
[0011] 进一步，利用所述的莫海威芽孢杆菌HWt34制成的可湿性粉剂。
[0012] 进一步，所述可湿性粉剂的制备方法，包括如下步骤：
[0013] (1)挑取菌株HWt34单菌落在LB斜面培养基上，在30℃下培养24小时，得活化的菌株；将活化的菌株接种到100ml LB液体培养基中，在30℃、摇床转速为150rpm条件下培养24小时，得种子液；
[0016] (3)将发酵液进行过滤，喷雾干燥，得到莫海威芽孢杆菌原粉；
[0018] 进一步，所述可湿性粉剂用于对棉种进行拌种。
[0020] 进一步，利用所述可湿性粉剂与羊粪制成的生物肥，1kg莫海威芽孢杆菌可湿性粉剂与1吨羊粪混合制成生物肥。利用所述生物肥作为基肥，按每亩2吨于整地前均匀撒施。
[0021] 进一步，所述可湿性粉剂在防治棉花苗期根腐病中的应用。
[0022] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株防治棉花苗期根腐病的莫海威芽孢杆菌及其应用，为防治棉花苗期根腐病提供了一个新型高效的微生物；本发明莫海威芽孢杆菌可湿性粉剂和生物肥对棉花根腐病的药效高，平均防效在78.43％以上，且具有广谱性；利用本发明防治棉花苗期根腐病持效期长，且不易产生抗药性，对棉花生长有明显的促进作用。
附图说明
附图说明
[0023] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0024] 图1附图为本发明根据16S r DNA序列获得的菌株HWt34的系统发育树图；
[0025] 图2附图为本发明根据gyrA基因序列获得的菌株HWt34的系统发育树图；
[0026] 图3附图为本发明实施例3平板对峙试验；
[0027] 其中，A、B为在距培养皿边缘2cm处用牙签接种莫海威芽孢杆菌HWt34的两个重复；C为空白对照。
具体实施方式
[0028] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0029] 实施例1莫海威芽孢杆菌HWt34的分离筛选
[0030] (1)菌株HWt34的分离
[0031] 菌株HWt34由新疆农业科学院植物保护研究所从石河子棉田土壤中分离得到。采集石河子棉田土样，带回实验室后利用土壤稀释法进行分离和纯化。并以棉花立枯病为靶标，通过平板对峙法、盆栽试验法和田间小区试验进行生防菌的筛选。从中筛选出一个对棉花立枯病具有明显防治效果的菌株，定名为HWt34。
[0032] (2)菌株HWt34的分类鉴定
[0033] ①利用16S r DNA序列鉴定分类
[0034] 以HWt34的基因组DNA为模板，以细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增，得PCR扩增产物，其中所述的引物序列为：
[0035] 27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；
[0036] 1492R：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2；
[0037] 其中，M代表A/C；Y代表C/T。
[0038] 反应体系为2×Taq Master Mix 25μL，27F(10ppm)和1492R(10ppm)各1μL，DNA模板1μL，补ddH2O 22μL。PCR扩增条件为预变性94℃5min；变性94℃30s，退火54℃30s延伸72℃1.5min，35cycles；延伸72℃10min。所得PCR产物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司进行序列测定，得HWt34菌株的16S r DNA序列(SEQ ID NO.3)。测得的序列经NCBI进行BLAST在线同源比对，选用同源性较高的标准菌株作为参照对象，结果显示菌株HWt34与芽孢杆菌属的16S r DNA同源性达到99％；构建系统发育树，结果见图1；HWt34与芽孢杆菌属聚合到一起，说明HWt34属于芽孢杆菌属(Bacillus)。
[0039] ②利用gyrA基因序列鉴定分类
[0040] 以HWt34基因组DNA为模板，以gyrA-42F和gyrA-1066R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的gyrA-F和gyrA-R引物的序列为：
[0041] gyrA-42F：5’-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3’；SEQ ID NO.4；
[0042] gyrA-1066R：5’-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3’；SEQ ID NO.5；
[0043] gyrA反应体系为2×Taq Master Mix 25μL，gyrA-42F(10μm)和gyrA-1066R(10μm)各1μL，DNA模板1μL，补dd H2O 22μL。PCR扩增条件为预变性94℃5min；变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃1.5min，35cycles；延伸72℃10min。所得PCR产物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司进行序列测定，得HWt34菌株的gyrA基因序列(SEQ ID NO.6)。将获得的HWt34菌株的gyrA基因序列在NCBI进行BLAST在线同源比对，同时利用MEGA软件构建系统发育树，结果见图2。结果发现HWt34与莫海威芽孢杆菌的gyrA基因序列同源性最高，HWt34菌株与莫海威芽孢杆菌聚合到一起，说明HWt34为莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)。
[0044] 综合16S rDNA和gyrA基因序列同源性对比分析的结果，可知菌株HWt34属于莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)。
[0045] 实施例2HWt34可湿性粉剂的制备
[0046] (1)菌种活化：将保存的菌株HWt34在LB平板培养基(其组成成分及其重量比为：酵母浸膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂粉15g，水1000ml，pH7.4～7.6)上，在30℃进行活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上在30℃下培养24小时，得到活化菌株；
[0047] (2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，水1000ml)，在250ml三角瓶中装入LB培养液100ml，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤(1)中一接种环上述活化好的菌株，在30℃、摇床转速150rpm的条件下进行振荡培养24小时，得到种子液；
[0048] (3)蔗糖酵母浸粉培养基的制备：按照重量百分比将蔗糖2.5％，酵母浸粉2.5％，磷酸氢二钾0.5％，加入水中，混合均匀，得到蔗糖酵母浸粉培养基；分装于500ml三角瓶中，每瓶装液体200ml；在121℃对蔗糖酵母浸粉培养基进行灭菌25分钟；
[0049] (4)按照体积比为1～3％的比例将种子液接入到蔗糖、酵母浸粉培养基中，在温度为28℃、摇床转速为150rpm条件下发酵培养72h，得到发酵液；
[0050] (5)将发酵液进行过滤，喷雾干燥得到莫海威芽孢杆菌原粉；
[0052] 实施例3莫海威芽孢杆菌HWt34对棉花立枯菌菌丝生长的抑制
[0053] 2019年3月在新疆农业科学院植物保护研究所植物病害实验室进行莫海威芽孢杆菌HWt34对棉花立枯菌菌丝生长的抑制试验。
[0054] 供试立枯丝核菌：立枯丝核菌菌株采自新疆棉田，经实验室分离纯化并鉴定为立枯丝核菌(Rhizoctoni asolani)，致病力测定表现为强致病力。
[0055] 平板对峙试验：
[0056] 将立枯丝核菌在PDA培养基活化，培养3天后在菌落边缘区域，用打孔器(O＝6mm)打孔制成菌饼，将菌饼采用十字交叉法接种到PDA培养基中央，再将实施例2步骤(1)中活化的莫海威芽孢杆菌HWt34在距培养皿边缘2cm处用牙签进行接种。设空白对照(不点接菌株HWt34)，28℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量棉花立枯菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种HWt34后的抑制生长半径)，计算抑菌率：
[0057] 抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100
[0058] 结果见表1、图3：莫海威芽孢杆菌对棉花立枯菌的抑制率达80％以上；透明的抑菌带宽8.5毫米；说明莫海威芽孢杆菌HWt34对立枯丝核菌具有明显的抑制作用。
[0059] 表1 HWt34菌株对棉花立枯菌的拮抗作用试验
[0060] 菌株名称 对照(mm) 处理(mm) 抑菌率(％)HWt34 45 7 84.44
[0061] 实施例4莫海威芽孢杆菌HWt34对其它两种棉花重要病害病原菌的抑制作用试验[0062] 试验于2019年3月在新疆农业科学院植物保护研究所植物病害实验室进行。
[0063] 供试病害病原真菌：大丽轮枝菌、尖孢镰刀菌均由新疆农业科学院植保所分离保存。
[0064] 平板测定试验：
[0065] 首先将供试的病原真菌在PDA平板上活化，培养3-7天后在菌落边缘区域，用打孔器(○＝6mm)打孔制成菌饼，将菌饼采用十字交叉法转接新的PDA培养基中央，再将实施例2步骤(1)中活化的莫海威芽孢杆菌HWt34在距培养皿边缘2cm处用牙签进行株接种。设空白对照。25℃恒温培养7-15天，待对照病原菌长至培养皿边缘时，观察并记录对照病原菌生长的半径，抑菌带宽度。用“+++”表示HWt34菌株抑菌作用很强，抑菌带宽度大于9.0mm；用“++”表示HWt34菌株抑菌作用为中等强度，抑菌带宽度为3.0-9.0mm；用“+”表示HWt34菌株抑菌活性较弱，抑菌带宽度小于3.0mm。结果见表2。
[0066] 表2 HWt34菌株对两种重要病原真菌的抑制作用
[0067]尖孢镰刀菌 大丽轮枝菌
++ ++
++ ++
[0068] 表2结果显示，莫海威芽孢杆菌HWt34对大丽轮枝菌、尖孢镰刀菌具有中等强度的抑制作用；说明莫海威芽孢杆菌HWt34具有防治棉花枯萎病的生防潜力。
[0069] 实施例5莫海威芽孢杆菌HWt34对棉花立枯病的防治效果
[0070] 微生物菌剂：实施例2制备的HWt34可湿性粉剂；用水稀释10倍。空白对照：清水。
[0071] 本试验在新疆库尔勒试验田进行，选择棉花立枯病害发病重的地块，棉花品种选用新陆中66号，播种前应用实施例2制备的HWt34可湿性粉剂50倍水稀释液浸种半小时；以清水浸种半小时作为空白对照，每个处理3次重复。每个小区面积20m2。在棉花苗期分别调查出苗率、发病率、病情指数和防治效果，结果见表3。
[0072] 表3莫海威芽孢杆菌HWt34对棉花立枯病防效
[0073] 处理 出苗率 发病率 病情指数 防治效果HWt34浸种 84.81％ 6.60％ 17.33 78.43％
空白对照 67.56％ 30.6％ 30.00 —
空白对照 67.56％ 30.6％ 30.00 —
[0074] 表3结果显示，当空白对照棉花立枯病病情指数为30时，莫海威芽孢杆菌HWt34浸种处理的病情指数为17.33，其防治棉花立枯病的效果可达78.43％。说明本发明莫海威芽孢杆菌HWt34及其可湿性粉剂对棉花立枯病具有很好的防治效果。
[0075] 实施例6莫海威芽孢杆菌可湿性粉剂和生物肥对棉花苗期根腐病的防治效果试验[0076] 本试验在新疆农科院植保所库尔勒试验田进行，选择棉花苗期根腐病病害发病重的地块，每亩地于整地前均匀撒施2吨生物肥(1kg莫海威芽孢杆菌可湿性粉剂与1吨羊粪混合制成生物肥)。棉花品种选用新陆中66号，播种前应用实施例2莫海威芽孢杆菌发酵液于播种前将棉花种子浸种一小时，晾干后用莫海威芽孢杆菌可湿性粉剂拌种，然后播种，试验田面积25亩。在棉花苗期采用10点取样法调查棉田发病率，计算防治效果，以相邻棉田为对照，结果见表4。
[0077] 表4莫海威芽孢杆菌生物肥对棉花根腐病防效
[0078] 处理 发病率 防治效果生物肥 3.4％ 81.72％
对照 18.6％ —
对照 18.6％ —
[0079] 表4结果显示，空白对照棉花根腐病发病率为18.6％，利用生物肥综合处理发病率为3.4％，生物肥防治棉花根腐病的效果可达81.72％。说明本发明莫海威芽孢杆菌HWt34可湿性粉剂及其生物肥对棉花根腐病具有很好的防治效果。
[0080] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种提高赤眼蜂后代雌性比例的方法及其应用 | 2020-05-11 | 136 |
| 一种高致病力生防菌爪哇虫草及其应用 | 2020-05-12 | 587 |
| 一种稻田天敌生物高效释放装置 | 2020-05-14 | 660 |
| 解淀粉芽孢杆菌在防治植物真菌病害中的应用 | 2020-05-14 | 144 |
| 一种飞蝗实验养殖笼 | 2020-05-12 | 864 |
| 一株诱变尖角突脐孢菌及其在防治稗草中的应用 | 2020-05-12 | 119 |
| 一种褐带卷蛾茧蜂的室内繁殖方法 | 2020-05-14 | 280 |
| 水产养殖和其他动物系统中病原菌生物控制的新系统 | 2020-05-13 | 813 |
| 一株防治棉花苗期根腐病的莫海威芽孢杆菌及其应用 | 2020-05-08 | 515 |
| 一种飞机施药静电控制器设备 | 2020-05-11 | 558 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
生物防治热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈