化学农药已经应用了半个多世纪，给农业带来了巨大的经济效益。然而，在农作物 种植中滥用化学农药，普遍存在农药物残留，威胁人类的健康，同时引起的有害昆虫的 抗药性日益增强，使农药防治各种害虫的效果明显下降，给农作物种植带来危害。由此 可见绿色农药或生物农药是未来农药发展的必然趋势，也是农业可持续发展的一项基本 保证。它的特点是：1)有很高的生物活性，药效高，单位面积使用量少；2)选择性强， 对益虫和非靶标生物无毒或毒性极小；3)对农作物无害；4)使用后在农作物体内外、 农产品以及土壤、大气、水体无残留或即使有微量残留也可在短期内降解，生成无害的 无毒天然物质而完全融入大自然。
多杀菌素是野生型菌株放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)在培养介 质中经有氧发酵而得的次级代谢产物。从结构上看，这些化合物属大环内酯类，是两种 活性组分Spinosad A和D的混合物。它的作用机理被认为是烟酸乙酰胆碱受体的作用体， 同时也作用于γ-氨基丁酸受体，可使害虫迅速麻痹、瘫痪，最后导致死亡，其杀虫速度 可与化学农药相媲美，安全性高，且与目前常用杀虫剂无交互抗性，被美国环保组织确 定为低毒、高效、低残留的生物杀虫剂，既有高效的杀虫性能，又有对益虫和哺乳动物 安全的特性，最适合无公害农作物的生产应用。但是S.Spinosa生长周期长达二至三星 期，它的生长缓慢限制了Spinosad的生产应用。由于其生产价格的昂贵，目前在西方国 家只使用在蔬菜和水果的种植上。因此，缩短S.Spinosa生长周期，提高Spinosad的生 产量是一个很有前景的科研项目。
苏云金芽孢杆菌是对鳞翅目(Lepidopteran)、双翅目(dipteran)和鞘翅目 (coleopteran)等多种害虫具有毒杀作用的微生物，Bt的杀虫活性主要来自伴孢晶体， 杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)由cry基因和cyt基因编码。 该种晶体毒蛋白进入昆虫消化道后，经特定蛋白酶水解，释放出毒性肽，并与昆虫消化 道缘膜囊泡上的受体高亲和性结合，快速而不可逆地插入细胞质膜，形成孔或病灶，引 起细胞膜非极性化，破坏细胞渗透平衡，从而导致细胞裂解。同时，Bt在昆虫的血腔中 迅速增殖引起昆虫的败血症。目前普遍认为，该种晶体毒蛋白先与昆虫中肠膜上的受体 结合，然后插入膜并形成孔，引起害虫死亡。苏云金芽孢杆菌不杀死害虫天敌，以其高 效安全、对目标害虫的特异性而倍受人们青睐，并已逐渐成为研究最深入、应用最广泛 的生物杀虫剂，但是Bt基因在应用中也存在一些问题，Bt晶体蛋白杀虫谱较窄，害虫易 对杀虫晶体蛋白产生耐受性，如蔬菜害虫小菜蛾在苏云金杆菌选择压力下抗性增强，因 此提高Bt杀虫毒力已成为科学研究者研究的目标。通过多杀菌素基因与Cry基因重组构 建工程菌解决二者各自存在的问题是值得探索的课题。

本发明旨在采用Red/ET同源重组技术，将从S.Spinosa分离Spinosad的全基因与 Bt菌株Cry 1 Ac基因重组以缩短S.Spinosa的生长周期和解决Bt杀虫剂杀虫谱窄等问 题。
实现本发明的技术方案为：
多杀菌素基因重组的工程菌由多杀菌素的基因簇基因SpnA、SpnB、SpnC、SpnD、SpnE、 SpnF、SpnG、SpnH、SpnI、SpnJ、SpnK、SpnL、SpnM、SpnN、SpnO、SpnQ、SpnR、SpnS 和Bt菌株的Cry 1 Ac基因经Red/ET同源重组技术重组的工程菌。
多杀菌素基因重组的工程菌的构建方法为：
1)将从刺糖多孢菌(S.Spinosa)分离出的基因簇克隆入BAC文库获得重组质 粒PBeloBAC11-Spn；
2)将位于刺糖多孢菌染色体不同位置的鼠李糖基因gtt、epi、gdh和kre加 入到Spinosad基因簇中获得重组质粒pTps-BAC-Spn；
3)从Bt 4.0718菌组分离得到的Cry 1 Ac全基因插入经修饰的Spinoad基因 簇中，构建pTps-BAC-Spn-cry1Ac重组载体；
4)对pTps-BAC-Spn-cry1Ac重组质粒作修饰，插入oriT，Tn5，IR，Tpase，转染、 转座抗性装置相关基因和抗性基因tetR、Km，得到pTps-BAC-Spn-cry1Ac-T 重组载体；
5)将上述重组质粒整合到F因子上，导入外源异质体；
6)通过重组质粒Tn5转座子把重组基因整合到外源异质体的染色体中，在异质 宿主中高效表达。
下面结合附图进一步详述本发明。
本发明的刺糖多孢菌、发光杆菌已于2006年9月4日送交中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)保藏，保藏编号分别为206084、206085。

图1：工程菌构建流程图；
图2：Spinosad家簇基因示意图；
图3：cry1Ac基因示意图；
图4：Spinosad全基因80kb的BAC文库其修饰；
图5：pTps-BAC-Spn-cry1Ac重组示意图；
图6：pTps-BAC-Spn-T修饰示意图；
图7：pTps-BAC-Spn-cry1Ac-T重组修饰示意图；
图8：pTps-BAC-Spn-cry1Ac-T通过F因子导入不同的异质宿主并整合到异质宿主的 染色体示意图；
图9：工程菌菌剂的发酵工艺流程图。
本研究从S.Spinosa分离Spinosad全基因，此基因大于80kb，用一般的分子生物学方 法很难达到对其全基因进行修饰及插入功能组件，本发明中，我们采用了Red/ET同源重 组技术[Improved RecT or RecET cloning and subcloning method，EP：01117529.6； Methods for heterologous expressio ofsecondary metabolites，：PCT/IB2005/003650； Recombination method，EP：0103276.2]，Red/ET同源重组技术是分子生物学领域一个 较大突破，是一种全新的核苷酸大分子操纵技术。应用这项技术，无论DNA片段有多大， 结构如何，都可以克隆和精确修饰。在目标DNA分子中，对于任何选定位置，都可以进行 位点突变、片段插入或缺失的操作，无需受到限制性酶切位点的限制。在进行DNA克隆时， Red/ET重组技术优于任何传统DNA扩增技术。本发明将Spinosad全基因簇克隆进BAC文库， 通过Red/ET同源重组技术对全基因进行修饰及插入功能性组件，同时将Spinosad全基因 与Bt菌株cry1Ac基因重组，分别以发光杆菌(P.luminescens)和苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)菌株为异质宿主进行表达，构建出新型高效、安全的杀虫 工程菌。
在异质表达体系建立之后，拟通过重组合化合物物库(Recombinatorial compound library)的建立，应用高通量筛选系统(High Thruoghput Screen)进行微型化活体试 验，可同时或短时间内完成大量化合物的筛选，从而节省3～5倍的工程量，因而大大提 高了筛选效率，获得新的更有效的杀虫生物农药。
通过建立Spinosad与Bt菌株cry1Ac基因重组的异质表达体系，提高Spinosad的 生产水平、降低成本，同时高水平表达Cry 1 Ac晶体杀虫蛋白，使生物农药能大面积 使用造福于人类.同时研制新型的具有更理想的抗虫谱、抗虫活性高的Spinosad衍生物。 在国际上率先应用基因工程技术致力于实现Spinosad在工程菌中的高效表达，实现廉价 生产。
工程菌生物杀虫剂的制备，包括多杀菌素异质表达工程菌的构建与多杀菌素异质表 达工程菌剂的发酵生产两部分：
1、Spinosad与cry1Ac重组异质表达工程菌的构建(图1)：
(1).spinosad基因簇的分离和BAC载体的修饰
将从S.spinosa(菌种保藏号：CCTCCNO：M206084)中提取的染色体DNA，用Sau3A I 消化后进行脉冲电泳，回收100kb左右片段。用BamHI(Sau3A I的同尾酶)酶切BAC，去 磷酸化后与回收的DNA片段连接，1500V 25μF 200Ω电转化E.coliYZ2005(Introducing Recombination：DNA Engineering for the 21st Century Gene Cloning & Expression Technologies)，经设计两对引物
F1：CCGTCGAGCCTACCGCTGATTCATA    R1--：GCGGCATCTCGGAGGATTTCAGCAAC
F2：CAGGCGGCGGACACCGCGCTC        R2--：TCAGCGTTGCCGAGCGGTGCGCTG
PCR扩增Spinosad基因簇两端的基因，挑选出含Spinosad基因簇(基因序列号： AY007564)(图2)的阳性转化子，获得重组质粒PBeloBAC11-Spn。PCR扩增位于S.spinosa 染色体不同位置鼠李糖基因gtt[gi：15077644]、epi[gi：15077642]、gdh[gi：15077646] 和kre[gi：15077646]，并将鼠李糖(gtt、gdh、epi和kre)基因通过Red/ET同源重组加 入到Spinosad基因簇中，其PCR的引物分别是：
Fepi：TGCCTCAGCCGGAGCCTTCGCAACTTCCTGGAGGGAAACGCCACGGGATCAACAACAACTTCACCAG
Repi：CCACGAGCGCACGCCGCAAGTACTCCCGGAGCTTCTCTTCATTCGACATTGGAGGTGGATGTGAAATCCCTCGGGC
      GC
Fgtt：CCAACCGCCGCCAGGGCCAGCGCCCGAGGGATTTCACATCCACCTCCAAAGGCCACCGGCAAGGTCGTGC
      AGGG
Rgtt：CCACGAGCGCACGCCGCAAGTACTCCCGGAGCTTCTCTTCATTCGACATGCACCCGCCGATGGCCGACCGC
Fgdh/kre：GGCCGGCCATGCCCTCCAGGCGGCGAATGCGGTCGGCCATCGGCGGGTGCGGATCCTGCTTCGTAGCTCGGTGTG
Rgdh/kre：CACGAGCGCACGCCGCAAGTACTCCCGGAGCTTCTCTTCATTCGACATGGATCCGCTTCCCCCACGGCGACCCG
这四个基因在Spinosad合成中起修饰的作用，获得重组质粒pTps-BAC-Spn。(图4)
(2).与cry1Ac基因的重组
提取Bt4.0718菌株的总DNA，方法参考文献[Diversity of locations for Bacillus thuringiensis crystal protein genes.J Bacteriol.1983 Apr；154(1)：419-28.]， 以Bt4.0718菌株的总DNA为模板，采用PCR技术从Bt4.0718菌株中分离得到4.2kb的 cry1Ac全基因(图3)，含有启动子(promoter)、阅读框(CDS)和终止子(terminator) 设计引物：
F1AC：CCAGATCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAATGGATAACAATCCGAACATCAATG
R1AC：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGAGATTCCTCCATAAGGAGTAATTC
并利用Red/ET同源重组技术将之与含有Spinosad全基因BAC文库进行重组，使 cry1Ac全基因插入Spinosad全基因簇之后，构建pTps-BAC-Spn-cry1Ac重组载体(图5)。 通过上面的引物PCR鉴定阳性转化子。
(3).重组表达质粒pTps-BAC-Spn和pTps-BAC-Spn-cry1Ac在异质宿主菌中的表达及 重组合化合物库的建立
以本项目组选育的发光杆菌(菌种保藏号：CCTCC NO：M206085)、苏云金杆菌 Bt4.0718(菌种保藏号：CCTCC NO：M200016)及Bt无晶体突变株(苏云金芽孢杆菌伴 孢晶体20KbDNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究生物工程学报Vol 30 No.5 September 2004 656-661)为异质宿主，通过转染及Red/ET技术将融合基因整合 于宿主菌染色体上，这个操作有下面三个实验步骤组成：首先：对重组表达质粒进行进 一步修饰，插入oriT，Tn5，IR，Tpase转染、转座抗性装置相关基因和抗性基因tetR、Km， (图6和图7)其方法参照上面鼠李糖(gtt、gdh、epi和kre)基因的插入，利用 Red/ET同源重组技术插入其载体中。其次，由于修饰后的pTps-BAC-Spn-cry1Ac-T重组 载体有90多Kb，一般的电转是无法将这么大的质粒转入外源异质体中，我们将重组质粒 pTps-BAC-Spn-cry1Ac-T整合到F因子上，通过F因子的介导重组质粒 pTps-BAC-Spn-cry1Ac-T导向外源异质体中。最后一步是通过在重组质粒 pTps-BAC-Spn-cry1Ac-T的Tn5转座子把重组基因整合到外源异质体中(图8).按照同 样的方式修饰重组质粒pTps-BAC-Spn构成重组表达质粒pTps-BAC-Spn-T，重组表达质粒 pTps-BAC-Spn-T在苏云金杆菌Bt4.0718中直接表达，因为在苏云金杆菌Bt4.0718的染 色体中含有Cry 1 Ac基因，通过本技术采用相似的反应条件，一次性同步合成成千上万 (甚至上百万、亿)种结构不同的分子，构建重组合化合物物库(Recombinatorial compound library)，通过化合物库来进行高效率的筛选。重组合化合物物库中每个化合 物的花费则为传统的1/600。组合化学是基于药物开发研究而发展起来的一种新的合成技 术，它加快了新药先导化合物的出现和优化速度。
(4).高效杀虫工程菌的筛选
将重组质粒转入异源表达宿主菌后，主要应用高通量定向筛选生物毒力高的转化子， 从同一个平板上挑选3-5个转化子接种到同一个摇瓶中培养(S.Spinosa 30℃ P.Iuminescens 37℃ Bacillus thuringiensis 30℃)，同时接种多个这样的摇瓶。用 摇瓶培养的培养液进行生物毒力测定，从中筛选生物毒力高的培养液。这样比单独的单 个转化子进行生物毒力测定筛选的效率要高上3-5倍。
2、Spinosad与cry1Ac重组异质表达工程菌剂的发酵生产(图9)：
通过优化发酵培养基配方、筛选最佳发酵条件生产工程菌菌剂
(1)、工程菌菌剂发酵生产工艺条件概述：
①.菌种活化
将保藏的高效广谱杀虫工程菌划线接种于固体种子培养基斜面上，接种前将装有培 养基的扁瓶在121℃条件下灭菌30分钟，接种后在28～35℃条件下培养30～48h，配成 孢子液，以5％的接种量用于种子罐接种。
②.灭菌及培养条件
上述灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.3-0.5kg/cm2条件下灭菌30min
③.种子罐发酵
先将一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将孢子液接入培养液中， 通入无菌空气培养，可得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121℃下灭菌30min，装 入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按5％～8％接种量接入二级种子罐， 通入无菌空气和搅拌进行培养，可得二级种子罐发酵菌液。
④.生产发酵罐
培养先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至25℃～30℃，按5％～8％的 接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通过无菌空气。
⑤.浓缩
发酵罐中发酵结束后，将菌液通过超滤进行浓缩、补加增效添加剂、随后装瓶。各 种工程菌在总的发酵基础条件，还有各自在培养基及工艺条件上的差异：
(2)、工程菌发酵工艺条件
①.S.Spinosa的发酵生产工艺条件
S.Spinosa培养基：
MM培养基：KNO30.1％NaCl 0.05％K2HPO3·3H2O 0.05％
FeSO40.001％MgSO4·7H2O 0.05％葡萄糖2％琼脂1.2％～2％pH 6.8
10L发酵罐培养基：把MM培养基中的琼脂和NaCl去掉，加酵母膏，蛋白胨各0.4％pH 6.5～7.0 S.Spinosa的培养温度为24～33℃，而合成Spinosad的最适宜的温度28～31。 发酵时用通气量和搅拌速率来维持溶氧在65％以上。罐压为0.034Mpa
②.P.luminescens工艺发酵条件：
P.luminescens培养基：
可溶性淀粉1％酵母膏1％蛋白胨1％NaCl 0.5％K2HPO40.05％pH7.0固体培养 基在原有的培养基的基础上加琼脂1.2％～2％摇瓶培养的温度在37℃。发酵罐的温度在 33-37℃，通气量0.8～2.5Vols/vol/min，氧气含量40～50％。
③.Bacillus thuringiensis工艺发酵条件
Bacillus thuringiensis培养基：牛肉膏0.3～0.8％，蛋白胨0.7～1.2％，葡萄糖0.1～ 0.6％，NaCl 0.1～0.6％，MgSO4·7H2O 0.01～0.06％，K2HPO40.01％～0.06％，MnSO40.02％～ 0.08％，pH6.8～7.2。固体培养基在原有的培养基的基础上加琼脂1.2％～2％。通气量1～ 2Vols/vol/min，氧气含量30～40％。
通过实验证明：
单独的Spinosad在S.Spinosa发酵生产所需要的时间与Spinosad与cry1Ac重组异质表达 所需要的时间结果见表1：
表一、工程菌剂的发酵生产需要的时间比较：

从表1可以看出，工程菌剂发酵生产时间缩短了3/4。
杀虫功能验证
1.验证表达的正确性
通过HPLC纯化鉴定Spinosad。
2.ELISA检测毒素基因的表达产物
将已纯化的目标Cry 1 Ac晶体蛋白免疫兔子，获得抗体后与辣根过氧化物酶连接， 形成酶联抗体；将培养的细菌用超声波处理后，将总蛋白电泳后转膜、用抗体杂交，洗 脱、显色，确定是否有毒素表达。
3.室内杀虫试验确定工程菌株的杀虫效价。
表二不同杀虫剂的生物活性测定

从表二中我们可以看出，工程菌的生物毒力要比任何一个单价的毒素蛋白表达强。 工程菌含(spinosad+cry1Ac)比单独的spinosad要强上60％，而比单独的Bt(cry1Ac) 强近一倍。
本发明采用了一种全新的核酸大分子操作技术--Red/ET同源重组技术，对80kb的 Spinosad全基因家簇进行操作修饰。实现了基因重组，重组的工程菌剂与现有的生物农 药相比具有以下优点：
(1).杀虫效果好：Spinosad为低毒、高效、低残留的生物杀虫剂，Bt晶体蛋白也是苏 云金芽孢杆菌中杀虫效果具有突出效果的一种杀虫剂，本发明把两者结合起来，扬长避 短，充分发挥两种杀虫剂的优点，既能充分发挥Spinosad速杀效果，也能表现了Bt晶体 蛋白的高产高效、安全等优点。
(2).杀虫谱广：工程菌带有两种不同的高效杀虫毒素，Spinosad被认为是烟酸乙酰 胆碱受体的作用体，可使害虫迅速麻痹、瘫痪，最后导致死亡，其杀虫速度可与化学农 药相媲美。而Bt晶体蛋白与昆虫中肠膜上的受体结合，然后插入膜并形成孔，引起害虫 死亡。不同杀虫作用的两种杀虫剂重组在一起，使其可识别的范围增大，同时能对鳞翅 目、双翅目、鞘翅目等多类害虫有效，因此在使用上防治面很广，成本相对较低。
(3).经济效益高：Spinosad与Cry 1 Ac重组异质表达所需要的时间比原来单独的 Spinosad在S.Spinosa所需要的时间要缩短了近300小时，工程菌发酵周期仅为原 S.Spinosa的1/4时间，大大的降低了生产成本，经济效益显著提高。
(4).安全性更高：Spinosad与目前常用杀虫剂无交互抗性，既有高效的杀虫性能，又 有对有益虫和哺乳动物安全的特性，最适合无公害农作物的生产应用。同样，苏云金芽 孢杆菌晶体蛋白以其高效安全、对目标害虫的特异性早已被证实。因此，在生态环境保 护、出口创汇及促进人类健康等方面有极大的优势。
<110>湖南师范大学
<120>多杀菌素基因重组的工程菌菌剂
<160>2
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>PCR检测Spinosad基因引物1F
<220>
<400>1
     ccgtcgagcc taccgctgat tcata             25
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>PCR检测Spinosad基因引物1R
<220>
<400>1
     gcggcatctc ggaggatttc agcaac            26
<160>2
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>PCR检测Spinosad基因引物2F
<220>
<440>1
     caggcggcgg acaccgcgct c                 21
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>PCR检测Spinosad基因引物2R
<220>
<400>1
     tcagcgttgc cgagcggtgc gctg              24
<160>2
<210>1
<211>67
<212>DNA
<213>PCR扩增鼠李糖基因epi引物F
<220>
<440>1
     tgcctcagcc ggagccttcg caacttcctg gagggaaacg ccacgggatc aacaacaact    60
     tcaccag                                                              67
<210>2
<211>78
<212>DNA
<213>PCR扩增鼠李糖基因epi引物R
<220>
<400>1
     ccacgagcgc acgccgcaag tactcccgga gcttctcttc attcgacatt ggaggtggat    60
     gtgaaatccc tcgggcgc                                                  78
<160>2
<210>1
<211>74
<212>DNA
<213>PCR扩增鼠李糖基因gtt引物F
<220>
<440>1
     ccaaccgccg ccagggccag cgcccgaggg atttcacatc cacctccaaa ggccaccggc    60
     aaggtcgtgc aggg                                                      74
<210>2
<211>71
<212>DNA
<213>PCR扩增鼠李糖基因gtt引物R
<220>
<400>1
     ccacgagcgc acgccgcaag tactcccgga gcttctcttc attcgacatg cacccgccga    60
     tggccgaccg c                                                         71
<160>2
<210>1
<211>75
<212>DNA
<213>PCR扩增鼠李糖基因gdh/kre引物F
<220>
<440>1
     ggccggccat gccctccagg cggcgaatgc ggtcggccat cggcgggtgc ggatcctgct    60
     tcgtagctcg gtgtg                                                     75
<210>2
<211>74
<212>DNA
<213>PCR扩增鼠李糖基因gdh/kre引物R
<220>
<400>1
     cacgagcgca cgccgcaagt actcccggag cttctcttca ttcgacatgg atccgcttcc    60
     cccacggcga cccg                                                      74
<160>2
<210>1
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<212>DNA
<213>PCR扩增cry1Ac全基因引物F
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<440>1
     ccagatcccg ggtaccgagc tcgaattcgc cctatagtga gtcgtattaa tggataacaa    60
     tccgaacatc aatg                                                      74
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<212>DNA
<213>PCR扩增cry1Ac全基因引物R
<220>
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     cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattg agattcctcc    60
     ataaggagta attc                                                      74