技术领域
[0001] 本
发明涉及锦鲤育苗技术领域，尤其涉及一种建立锦鲤体色繁殖家系的方法。
背景技术
[0002] 锦鲤在我国已有三十多年的养殖历史，形成了具有文化、休闲、观光旅游及促进城乡渔业经济增长功能的特色产业。随着产业的发展，苗种成为限制其快速发展的
瓶颈，优质锦鲤苗种呈现供不应求的局面。由本项目批量育成的优质锦鲤苗种将会极大的缓解产业发展对优质锦鲤的需求；同时，由本项目形成的优质锦鲤培育技术与体系将通过企业合作方式在全省多家大型锦鲤养殖公司推广，整体提升我省锦鲤育种技术和苗种品质，目标是形成我省锦鲤的自主品牌，促进锦鲤养殖产业升级。
[0003] 建立锦鲤体色繁殖家系，培育专
门化品系，目前还有待进一步研究开发。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种建立锦鲤体色繁殖家系的方法，以解决上述技术问题。
[0005] 本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：
[0006] 一种建立锦鲤体色繁殖家系的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0007] (1)选择优质纯色锦鲤进行20组杂交，探明锦鲤体色遗传规律；
[0008] (2)应用F1代纯色锦鲤进行反交，获得F2代纯色纯合体；
[0009] (3)选择纯色纯合体F2建立锦鲤体色育种家系
基础群。
[0010] 进一步的优选，步骤(1)包括：
[0011] 育种鲤遗传背景分析：取纯色锦鲤各30尾，雌雄各半，分别采集每尾的尾鳍，冲洗干净后，取0.1g，液氮
研磨，DNA提取
试剂盒提取DNA，
电泳检测提取DNA
质量，并将产物4℃保存；根据Genbank
数据库上已登记的锦鲤DNA序列，设计引物，合成后，进行PCR扩增，凝胶电泳分离，
生物公司测序，LabImage
软件分析，确定基因型，并计算各等位基因大小，应用POPGEN32软件计算平均等位基因数、平均杂合度、平均期望杂合度及微卫星位点的多态信息含量及Hardy-Weinberg偏离指数，并计算各育种群体的遗传距离。
[0012] 进一步的优选，步骤(2)包括：
[0013] 反交育种：应用4×4双列杂交技术纯色锦鲤F2代分别进行杂交，构建16组杂交组合；分析各组F1代在体重、体长、体高、体宽和色素形成率，应用分子遗传和数量遗传微卫星标记和数量遗传方法，分析上述各F1中生长性状的
杂种优势与色素形成优势；明确在杂交F1代锦鲤中具有明显的生长和体色优势的杂交组合，为后期建立锦鲤生长和色素形成的基础群奠定基础。
[0014] 进一步的优选，步骤(3)包括：
[0015] 锦鲤生长和色素性状的初期组建：以反交育种的子代为基础群，根据对体长、体高、体宽和色素形成比率的测量与统计处理的基础上，挑选并组建以体长、体高、体宽及三色、双色及单色为指标的初始群；各群体内部实行封闭式交配繁殖并孵化饲养，对F1代特征性状检测分析和SSR标记，采用最佳线性无偏预测法及SSR标记，遵循世代精选少留原则；在各品系F1中代挑选80尾雌体与20尾雄体进行性状测量，并进行独立饲养繁殖；经过3-4代的选留，纯化目的性状并可稳定遗传。
[0016] 本发明的有益效果是：
[0017] 本发明改变传统的大群体杂交育种的方式，根据单色显隐遗传规律，通过反交方式获得单色纯和体，应用定向杂交方式获得目的群体，极大缩短了传统杂交育种的年限，同时极大减少了育种亲本数量。
[0018] 目前已获得四个纯色锦鲤基础群，并经过定向杂交验证，为锦鲤体色定向杂交育种提供了专门化品系。
[0019] 通过建立的锦鲤家系，应用定向杂交技术，获得新型体色表现优质锦鲤，扩展市场品种，扩大销售份额，增加企业收入。
具体实施方式
[0020] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体
实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0021] 实施例
[0022] 一种建立锦鲤体色繁殖家系的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0023] (1)选择优质纯色锦鲤进行20组杂交，探明锦鲤体色遗传规律；
[0024] 育种鲤遗传背景分析：取纯色锦鲤各30尾，雌雄各半，分别采集每尾的尾鳍，冲洗干净后，取0.1g，液氮研磨，DNA提取试剂盒提取DNA，电泳检测提取DNA质量，并将产物4℃保存；根据Genbank数据库上已登记的锦鲤DNA序列，设计引物，合成后，进行PCR扩增，凝胶电泳分离，生物公司测序，LabImage软件分析，确定基因型，并计算各等位基因大小，应用POPGEN32软件计算平均等位基因数、平均杂合度、平均期望杂合度及微卫星位点的多态信息含量及Hardy-Weinberg偏离指数，并计算各育种群体的遗传距离；
[0025] (2)应用F1代纯色锦鲤进行反交，获得F2代纯色纯合体；
[0026] 反交育种：应用4×4双列杂交技术纯色锦鲤F2代分别进行杂交，构建16组杂交组合；分析各组F1代在体重、体长、体高、体宽和色素形成率，应用分子遗传和数量遗传微卫星标记和数量遗传方法，分析上述各F1中生长性状的杂种优势与色素形成优势；明确在杂交F1代锦鲤中具有明显的生长和体色优势的杂交组合，为后期建立锦鲤生长和色素形成的基础群奠定基础。
[0027] (3)选择纯色纯合体F2建立锦鲤体色育种家系基础群。
[0028] 锦鲤生长和色素性状的初期组建：以反交育种的子代为基础群，根据对体长、体高、体宽和色素形成比率的测量与统计处理的基础上，挑选并组建以体长、体高、体宽及三色、双色及单色为指标的初始群；各群体内部实行封闭式交配繁殖并孵化饲养，对F1代特征性状检测分析和SSR标记，采用最佳线性无偏预测法及SSR标记，遵循世代精选少留原则；在各品系F1中代挑选80尾雌体与20尾雄体进行性状测量，并进行独立饲养繁殖；经过3-4代的选留，纯化目的性状并可稳定遗传。
[0029] 单色锦鲤卫星标记的筛选
[0030] 采集8尾(每组两尾，雌、雄各一尾)单色锦鲤繁殖亲本背鳍条样本，用无
水乙醇浸泡于4℃
冰箱保存备用。采用经典的酚氯法提取单色锦鲤基因组DNA，生物素
磁珠富集法FIASCO(Fast Isolationby ALFP of Sequences Containing repeats)进行单色锦鲤微卫星富集文库的构建，用软件Chromas观察测序峰图，去除pMD18-T载体及MseI接头序列，用软件SSRHunter查找重复单元序列，并人工校对，记录重复次数较多、测序峰图好且重复区域两翼具有足够长的序列。使用软件Primer Premier设计引物，引物长度在18-25bp之间，GC含量(GC％)在50-70％之间，
退火温度在45-68℃之间，扩增
片段长度在150-500bp之间,引物序列送至上海生工公司合成。筛选引物PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，最适复性温度下复性45sec，72℃延伸1min，共30个循环；之后72℃延伸10min，4℃保存,选择最佳扩增结果，即在琼脂糖电泳时产生与预计大小相符的清晰条带且没有杂带或杂带相对较少的引物。将筛选出的扩增效率高、特异性好的单色锦鲤微卫星多态引物进一步对其多态性进行筛选，随机选择30个单色锦鲤的DNA样本作为模板，利用初筛的多态性引物进行扩增，在1％的琼脂糖凝胶电泳检测后进行8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。用凝胶成像分析系统对聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)图进行拍照，并用自带的软件JUNYI Gel-Analysis，读取PAGE胶图条带片段大小，判断条带的基因型，并辅以人为校正基因型。利用软件Popgen 32计算等位基因数(Na)、期望杂合度(He)和观测杂合度(Ho)以及Hardy-Weinberg equilibrium平衡偏离指数D＝(Ho-He)/He等参数，利用软件PIC-CALC 6.0计算多态信息含量(PIC)。
[0031] 表1.微卫星标记主要多态性参数
[0032]
[0033]
[0034] 注：NS表示未显著偏离H-W平衡(P>0.05)；*表示显著偏离H-W平衡(P<0.05)[0035] 由表1可见，9个微卫星标记分析检测得到109个等位基因。其中等位基因数最少的为座位Mas23和Mas11,均只有5个等位基因；最多的为座位M46,检测到21个等位基因。其观测杂合度为0.519-0.874(平均值为0.519),期望杂合度0.469-0.894(平均值为0.745),多态性信息含量为0.392-0.822(平均值为0.703)。
[0036] 2.F1代单色锦鲤亲子关系鉴定
[0037] 对6尾回捕单色锦鲤进行取样，然后利用软件Cervus 2.0分析各个基因座上的等位基因
频率、观测杂合度Ho和期望杂合度He、多态信息含量PIC、非亲权排除率(NEP)和累计非亲权排除率(CEP),检测微卫星位点是否符合Hardy-Weinberg平衡及各位点无效等位基因频率,再以父母本双盲建模(simulation)模拟运行10 000次得到Delta分布值,以每个候选父母的LOD(the nature log of the overall Likelihood atio)值进行亲权鉴定分析。
[0038] 表2.单色锦鲤微卫星亲子鉴定参数
[0039]
[0040]
[0041] 表3. 6尾单色锦鲤亲子鉴定结果
[0042]
[0043] 通过对F1代6尾单色锦鲤与采集的8尾候选亲本进行亲子关系分析,表2和表3的鉴定结果显示,9个微卫
星座位累计非亲权排除率为99.998 3％。这6尾子代个体与第一候选亲本9个基因座均没有错配座位,因此,可以确定6尾子代单色锦鲤均来自8尾候选亲本,占总采集样本的100％。因此,本研究利用微卫星标记依据单色锦鲤亲子鉴定技术判定亲缘关系,从而估算单色锦鲤体色遗传规律及在子代体色形成中的贡献率。
[0044] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和
说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的
权利要求书及其等效物界定。
