一种固定水稻杂种优势的方法
阅读：959发布：2020-05-16
专利汇可以提供一种固定水稻杂种优势的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种固定 水 稻 杂种优势 的方法，将OsMADS13启动子与水稻BBM1基因编码序列连接，构建到表达载体中得到载体A；构建EAC1-like双靶点CRISPR/Cas9敲除的载体B；将载体A和载体B通过农杆菌介导法共转化到杂交水稻 种子 中得到T0代植株；T0代植株进行自交得到自交种子。本发明利用水稻珠心组织特异表达启动子，将水稻成胚关键基因在杂交水稻珠心组织中特异表达，诱导珠心组织 体细胞 形成不定胚；将在水稻卵细胞中特异表达，对卵细胞生长发育具有重要作用的基因敲除；使杂交水稻自交，形成能够固定水稻杂种优势的种子。这种方法可以消除杂交水稻繁制种 风 险。，下面是一种固定水稻杂种优势的方法专利的具体信息内容。
1.一种固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将OsMADS13启动子与水稻BBM1基因编码序列连接，构建到表达载体中得到载体A；
所述OsMADS13启动子的序列如SEQ ID NO.1所示；所述水稻BBM1基因编码序列如SEQ ID NO.4所示；构建EAC1-like双靶点CRISPR/Cas9敲除的载体B；
S2、将所述载体A和所述载体B通过农杆菌介导法共转化到杂交水稻种子中得到T0代植株；
S3、筛选EAC1-like基因双等位纯合敲除同时成功异位表达BBM1基因的T0代植株，进行自交得到自交种子。
2.根据权利要求1所述的固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，所述S1步骤中所述载体A的获得方法具体为：
S1-A1、根据OsMADS13基因的启动子序列设计引物seq1F和seq1R，以水稻基因组DNA为模板，进行PCR扩增得到扩增产物1；
S1-A2、根据BBM1基因编码区序列设计引物seq3F和seq3R，以水稻愈伤组织cDNA为模板，进行PCR扩增得到扩增产物2；
S1-A3、将所述扩增产物1和所述扩增产物2混合做为模板，利用所述引物seq1F和所述引物seq3R进行PCR扩增，得到扩增产物1和扩增产物2整合后的扩增产物3；
S1-A4、将所述扩增产物3连接至表达载体中得到载体A。
3.根据权利要求2所述的固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，所述引物seq1F的序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物seq1R的序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求2所述的固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，所述引物seq3F的序列如SEQ ID NO.5所示；所述引物seq3R的序列如SEQ ID NO.6所示。
5.根据权利要求1所述的固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，所述S1步骤中所述载体B的获得方法具体为：
S1-B1、根据EAC1-like基因编码区序列设计靶标序列；
S1-B2、构建含有所述靶标序列片段的CRISPR/Cas9重组载体B。
6.根据权利要求4所述的固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，所述S1-B1中所述靶标序列包括seq5和seq6，所述seq5的DNA序列如SEQ ID NO.8所示，所述seq6的DNA序列如SEQ ID NO.9所示。
7.根据权利要求1所述的固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，所述S3中筛选同时敲除EAC1-like基因与成功异位表达BBM1基因的T0代转基因植株的方法包括以下步骤：
S3-1、设计引物对seq8F和seq8R，所述Seq8F的序列如SEQ ID NO.10所示，所述Seq8R 的序列如SEQ ID NO.11所示；对T0代转基因植物进行扩增，筛选成功扩增了载体A的阳性转基因植株；
S3-2、设计引物对seq9F和seq9R，所述Seq9F的序列如SEQ ID NO.12所示，所述Seq9R的序列如SEQ ID NO.13所示；对所述成功扩增了载体A的阳性转基因植株进行PCR扩增，筛选EAC1-like基因双等位纯合突变株系。
一种固定水稻杂种优势的方法
技术领域
背景技术
[0002] 杂种优势是指两个亲本杂交产生的F1代在一种或多种性状上优于亲本的现象。杂种优势在植物中广泛存在。在水稻中，自杂交水稻大面积推广以来，其种植面积常年稳居我国水稻总面积的50％以上，已经累计推广超过80亿亩，增产稻谷超过6000亿公斤，为我国和世界粮食安全作出了重要贡献。然而，目前杂交水稻在生产上还存在一个大的问题：杂交水稻的杂种优势不能固定，自交后代会发生性状分离，必须年年专门生产杂交水稻种子，大大增加了杂交水稻生产成本。目前，生产上的杂交水稻包括：三系法杂交水稻，其种子生产依赖细胞核质互作雄性不育系；两系法杂交水稻，其种子生产依赖光温敏细胞核雄性不育系。三系法杂交水稻育性受恢保关系制约，恢复系很少，保持系更少，选到优良组合的机率较低；两系法不育系育性受气温高低的影响，制种遇异常低温或繁殖遇异常高温都会导致失败。因此，如果能够将杂交水稻的杂种优势固定下来，杂交水稻将迎来新的大发展。早在
1987年，袁隆平就提出杂交水稻育种方法分三个发展阶段的战略：从三系法到两系法再到固定杂种优势的一系法，朝着程序由繁到简而效率越来越高的方向发展。最近，袁隆平根据杂交水稻五十多年的发展历程，回顾过去，展望未来，又提出杂交水稻发展前后可分为五个世代，其中作为杂交水稻发展最高阶段的第五代杂交水稻也是能够固定杂种优势的杂交水稻。
1987年，袁隆平就提出杂交水稻育种方法分三个发展阶段的战略：从三系法到两系法再到固定杂种优势的一系法，朝着程序由繁到简而效率越来越高的方向发展。最近，袁隆平根据杂交水稻五十多年的发展历程，回顾过去，展望未来，又提出杂交水稻发展前后可分为五个世代，其中作为杂交水稻发展最高阶段的第五代杂交水稻也是能够固定杂种优势的杂交水稻。
[0003] 水稻杂种优势固定意义重大，而目前都是通过MiMe体系创制二倍体雌配子方式实现。MiMe体系可以将水稻生殖细胞减数分裂转化为有丝分裂，获得的雌雄配子全部都是和亲本基因型相同的二倍体，其主要涉及三个与减数分裂相关基因的同时突变：PAIR1基因突变能够抑制减数第一次分裂期同源染色体配对过程中的非姐妹染色单体交叉互换重组；REC8基因突变促使姐妹染色单体在减数第一次分裂后期就分离；OSD1基因突变导致跳过减数第二次分裂。由于MiMe体系中水稻的胚和胚乳形成仍依赖受精过程，而当MiMe自交后，其每一代的染色体都会加倍，因此要实现杂种优势固定，还必须诱导单倍体产生。该体系涉及三个基因的同时突变，操作比较复杂；通过自交后，很难保证二倍体配子不再次加倍，并且会影响水稻的结实率。
[0004] 因此，探索其它水稻杂种优势固定途径是非常必要的。已有研究发现，水稻中广泛存在不定胚生殖现象，它是通过珠心组织体细胞直接发育而成，基因型与亲本完全相同，只是由于发生频率不高并且卵细胞受精后也会发育成胚，因而通常是以双胚或多胚苗形式存在，在生产上不能用于杂种优势固定。
[0005] 综上，目前杂交水稻生产必须依靠不育系，三系法杂交水稻育性受恢保关系制约，恢复系很少，保持系更少，选到优良组合的机率较低；两系法不育系育性受气温高低的影响，制种遇异常低温或繁殖遇异常高温都会导致失败。急需寻求一种可以固定水稻的杂种优势，从而大大提高杂交水稻配组效率，消除杂交水稻繁制种风险的方法。
发明内容
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种固定水稻杂种优势的方法。这种方法可以固定水稻的杂种优势，从而大大提高杂交水稻配组效率，消除杂交水稻繁制种风险。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供了一种固定水稻杂种优势的方法，包括以下步骤：
[0008] S1、将OsMADS13启动子与水稻BBM1基因编码序列连接，构建到表达载体中得到载体A；所述OsMADS13启动子的序列如SEQ ID NO.1所示；所述水稻BBM1基因编码序列如SEQ ID NO.4所示；构建EAC1-like双靶点CRISPR/Cas9敲除的载体B；
[0009] S2、将所述载体A和所述载体B通过农杆菌介导法共转化到杂交水稻种子中得到T0代植株；
[0010] S3、筛选EAC1-like基因双等位纯合敲除同时成功异位表达BBM1基因的T0代植株，进行自交得到自交种子。
[0011] 上述的固定水稻杂种优势的方法，进一步的，所述S1步骤中所述载体A的获得方法具体为：
[0012] S1-A1、根据OsMADS13基因的启动子序列设计引物seq1F和seq1R，以水稻基因组DNA为模板，进行PCR扩增得到扩增产物1；
[0013] S1-A2、根据BBM1基因编码区序列设计引物seq3F和seq3R，以水稻愈伤组织cDNA为模板，进行PCR扩增得到扩增产物2；
[0014] S1-A3、将所述扩增产物1和所述扩增产物2混合做为模板，利用所述引物seq1F和所述引物seq3R进行PCR扩增，得到扩增产物1和扩增产物2整合后的扩增产物3；
[0015] S1-A4、将所述扩增产物3连接至表达载体中得到载体A。
[0016] 上述的固定水稻杂种优势的方法，进一步的，所述引物seq1F的序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物seq1R的序列如SEQ ID NO.3所示.
[0017] 上述的固定水稻杂种优势的方法，进一步的，所述引物seq3F的序列如SEQ ID NO.5所示；所述引物seq3R的序列如SEQ ID NO.6所示。
[0018] 上述的固定水稻杂种优势的方法，进一步的，所述S1步骤中所述载体B的获得方法具体为：
[0019] S1-B1、根据EAC1-like基因编码区序列设计靶标序列；
[0020] S1-B2、构建含有所述靶标序列片段的CRISPR/Cas9重组载体B。
[0021] 上述的固定水稻杂种优势的方法，进一步的，所述S1-B1中所述靶标序列包括seq5和seq6，所述seq5的DNA序列如SEQ ID NO.8所示，所述seq6的DNA序列如SEQ ID NO.9所示。
[0022] 上述的固定水稻杂种优势的方法，进一步的，所述S3中筛选同时敲除EAC1-like基因与成功异位表达BBM1基因的T0代转基因植株的方法包括以下步骤：
[0023] S3-1、设计引物对seq8F和seq8R，所述Seq8F的序列如SEQ ID NO.10所示，所述Seq8R的序列如SEQ ID NO.11所示；对T0代转基因植物进行扩增，筛选成功扩增了载体A的阳性转基因植株；
[0024] S3-2、设计引物对seq9F和seq9R，所述Seq9F的序列如SEQ ID NO.12所示，所述Seq9R的序列如SEQ ID NO.13所示；对所述成功扩增了载体A的阳性转基因植株进行PCR扩增，筛选EAC1-like基因双等位纯合突变株系。
[0025] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0026] (1)本发明提供了一种固定水稻杂种优势的方法，利用水稻珠心组织特异表达启动子，将水稻成胚关键基因在杂交水稻珠心组织中特异表达，诱导珠心组织体细胞形成不定胚；将在水稻卵细胞中特异表达，对卵细胞生长发育具有重要作用的基因敲除，使杂交水稻卵细胞丧失形成胚的能力；使杂交水稻自交，精子与极核结合形成胚乳，通过不定胚和胚乳协同生长，形成能够固定水稻杂种优势的种子。这种方法可以固定水稻的杂种优势，从而大大提高杂交水稻配组效率，消除杂交水稻繁制种风险。
[0027] (2)本发明提供了一种固定水稻杂种优势的方法，其中BBM1基因是卵细胞形成胚的开关，当其在卵细胞中异位表达时，发现即使不受精，卵细胞也能自发形成胚。BBM1等水稻成胚关键基因，不仅能够诱导卵细胞直接形成胚，在诱导体细胞成胚方面也起着重要作用，当BBM1基因在水稻植株组成型表达时，水稻叶片组织上也会产生体细胞胚。利用水稻珠心组织特异表达基因的启动子驱动成胚关键基因，使其在杂交水稻珠心组织特异表达，诱导珠心组织体细胞产生不定胚。OsMADS13基因只在水稻胚珠中特异表达。具体地，OsMADS13基因在胚珠的珠心组织和珠被中表达，而这两个位置也是不定胚形成的部位，因此利用类似OsMADS13基因的启动子，不仅能够促使BBM1基因在珠心组织中表达，还能避免BBM1基因在水稻其它组织表达引起的不确定效应。EAC1-like基因只在水稻卵细胞中特异表达，并且它在水稻卵细胞受精过程中起着重要作用，因此通过敲除这个基因可以使卵细胞丧失功能。通过杂交水稻自交，精子细胞与两个极核融合后形成胚乳，不定胚和胚乳协同发育形成基因型与母本完全相同的种子，从而实现水稻杂种优势固定。
具体实施方式
[0028] 以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
[0029] 实施例
[0030] 以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
[0031] 实施例1：
[0032] 一种通过不定胚固定水稻杂种优势的方法，包括以下步骤：
[0033] (1)构建水稻珠心特异表达BBM1基因的载体(载体A)：将OsMADS13启动子连接上水稻BBM1基因编码序列，构建到植物双元表达载体pCAMBIA1300中。具体的构建方法为：
[0034] 1.1、根据OsMADS13基因的启动子序列设计引物对。
[0035] OsMADS13基因的启动子seq2的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，具体序列为：
[0036] gatgtctaaatagctataaatgggtaagcaagatagcaaagaaggccagtggcctttgcagctaagctagctagctagcccttcttcctctctttcctgctttccctttgccttctcctattaatcctctgcacctcacacagcagcagaaaacccaccaactggagctctcctttcctactccaagaaacgaaggtagagaaagaaagatcagatcagcttcaggaccaattttagctaggttatatatctctttgcgtgctaatgtgttttagttatctgggtgtgtgtagagttctttgttaaggcactgattcagctgcagtttagattcaagtttgtatgttctctctttgaggaaaagaaacccttttcctgtgcttcgagttcttgcaaagagaaactgtgatgcttggcttccagtttgatgcttctttgttcagattggaaattcttcctagcttctttctctatttatgtagcaaggattctttccggcccagtgatcctggtttcttttggaaggtttcagttttttcgttctttcttgaaatttctcttcttgccttaggcagatctttgatcttgtgaggagacaggagaaaaggaagaagctagtttcctgcggccgacctcttgcttctcactttgtgatgagttttctttggtcaattcttagctagatatgttaagatagttagttaagcaaatcgaaattgctagcttttccatgctttcttaaacatgattcttcagatttggttggttcttttttttcctttttgtggagacgtgctgttcttgcatcttatccttcttgattcatctacccatctggttctttgagctttctttttcgcttcttcccttcattatttcgagcaatctctgcacatctgaaagttttgtttcttgagactacttttgctagatcttgtttactcgatcactctatacttgcatctaggctcctttctaaataggcgatgattgagctttgcttatgtcaaatgatgggatagatattgtcccagtctccaaatttgatccatatccgccaagtctttcatcatctttttctttcttttttatgagcaaaaatcatctttttctttcaaagttcagcttttttctcttgttttacccctctttagctatagctggtttcttattccttttggatttacatgtataaaacatgcttgaatttgttagatcgatcactttatacacatactatgtgaatcacgatctcagatctctcagtatagttgaattcattaatttcttagatcgatcagcgtgtgatgtagtactgtaaatcactactagatctttcatcagtctcttttctgcatctatcaatttctcatgcaagttttagttgtttctttaatccggtctctctctcttttttaatcagctgagagtttgtgctgttctttaatcattaccagatctttcatcagtactctctcttctgcatctatcaaacttctcatgcaatgtttttgctgttctttgatctgatctctggtctccttttttgttgatcagttgagagcaagaagac。
[0037] 上游引物seq1F(SEQ ID NO.2)：ggtaccgatgtctaaatagctataaatggg。
[0038] 下游引物seq1R(SEQ ID NO.3)：tgatggaggccatgtcttcttgctctcaactgatc。
[0039] 1.2、以水稻R900基因组DNA为模板，以步骤1.1设计的引物进行PCR扩增得到扩增产物1。
[0040] Fastpfu高保真酶20ul PCR反应体系：
[0041] 5×缓冲液：4μl；
[0042] 模板DNA：2μl；
[0043] dNTP(2.5mmol)：1μl；
[0044] 上下游引物(5mmol)：各1μl；
[0045] Fastpfu高保真酶：0.5μl；
[0046] 补水至20μl。
[0047] 保真酶PCR反应条件：
[0048] 94℃4分钟；94℃20秒，57℃20秒，72℃40秒，共30个循环；72℃5分钟。
[0049] 1.3、根据BBM1基因编码区序列设计引物对。
[0050] BBM1基因编码区序列seq4的DNA序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：
[0051] atggcctccatcaccaactggctcggcttctcctcctcctccttctccggcgccggcgccgaccccgtcctgccccacccgccgctgcaagagtgggggagcgcttatgagggcggcggcacggtggcggccgccggcggggaggagacggcggcgccgaagctggaggacttcctcggcatgcaggtgcagcaggagacggccgccgcggcggcggggcacggccgtggaggcagctcgtcggtcgttgggctgtccatgatcaagaactggctacgcagccagccgccgcccgcggtggttgggggagaagacgctatgatggcgctcgcggtgtcgacgtcggcgtcgccgccggtggacgcgacggtgccggcctgcatttcgccggatgggatggggtcgaaggcggccgacggcggcggcgcggccgaggcggcggcggcggcggcggcgcagaggatgaaggcggccatggacacgttcgggcagcggacgtccatctaccggggtgtcaccaagcacaggtggacaggaaggtatgaagcccatctttgggataacagctgcagaagagaaggtcagactcgcaaaggcagacaagtcaatgcaggaggatatgataaggaagaaaaagctgctagggcttatgatttggctgcccttaaatactggggcactacaacgacgacgaattttccggtaagcaactacgaaaaagagttggatgaaatgaagcacatgaataggcaggaatttgttgcatcccttagaagaaaaagcagtggattttcacgtggtgcttccatatatcgtggtgttacaagacaccatcagcatggaaggtggcaagcaaggataggacgggtggcaggaaacaaggatctgtatttgggcacatttggcacccaagaggaagctgcagaggcatatgatatcgctgcaatcaaattccgtggtctcaatgctgtgacaaactttgacatgagccggtacgatgtcaagagcatcattgaaagcagcaatctcccaattggtactggaaccacccggcgattgaaggactcctctgatcacactgataatgtcatggacatcaatgtcaataccgaacccaataatgtggtatcatcccacttcaccaatggggttggcaactatggttcgcagcattatggttacaatggatggtcgccaattagcatgcagccgatcccctcgcagtacgccaacggccagcccagggcatggttgaaacaagagcaggacagctctgtggttacagcggcgcagaacctgcacaatctacatcattttagttccttgggctacacccacaacttcttccagcaatctgatgttccagacgtcacaggtttcgttgatgcgccttcgaggtccagtgactcatactccttcaggtacaatggaacaaatggctttcatggtctcccgggtggaatcagctatgctatgccggttgcgacagcggtggaccaaggtcagggcatccatggctatggagaagatggtgtggcaggcattgacaccacacatgacctgtatggcagccgtaatgtgtactacctttccgagggttcgcttcttgccgatgtcgaaaaagaaggcgactatggccaatctgtggggggcaacagctgggttttgccgacaccgtag。
[0052] 上游引物seq3F(SEQ ID NO.5)：atggcctccatcaccaactggctc；
[0053] 下游引物seq3R(SEQ ID NO.6)：tctagactacggtgtcggcaaaacccagc。
[0054] 1.4、以水稻R900的愈伤组织cDNA为模板，以1.3设计的为引物，进行PCR扩增得到扩增产物2。
[0055] Fastpfu高保真酶20ul PCR反应体系：
[0056] 5×缓冲液：4μl；
[0057] 模板cDNA：2μl；
[0058] dNTP(2.5mmol)：1μl；
[0059] 上下游引物(5mmol)：各1μl；
[0060] Fastpfu高保真酶：0.5μl；
[0061] 补水至20μl。
[0062] Fastpfu高保真酶PCR反应条件：
[0063] 94℃4分钟；94℃20秒，57℃20秒，72℃1分钟，共30个循环；72℃5分钟。
[0064] 1.5、将扩增产物1和扩增产物2混合做为模板，利用引物seq1F和引物seq3R进行PCR扩增，得到扩增产物1和扩增产物2整合后的扩增产物3(在引物seq1R和引物seq3F中设计了反向互补序列(下划线序列)，因此扩增产物1和扩增产物2混合作为PCR模板时，能够通过反向互补序列组合成一条长序列即扩增产物3)。
[0065] 1.6、将扩增产物3通过同源重组连接到克隆载体peasy-TBlunt(全式金生物技术有限公司)中得到扩增产物3/peasy-TBlunt重组载体。
[0066] 1.7、采用限制性内切酶Kpn1和Xbal1对扩增产物3/peasy-TBlunt重组载体双酶切(引物seq1F和引物seq3R中下划线序列分别为Kpn1和Xbal1酶切识别位点)，将酶切后的扩增产物3片段连接到植物双元表达载体pCAMBIA1300中，完成载体A的构建。
[0067] (2)构建水稻卵细胞特异表达基因EAC1-like的敲除载体(载体B)：在EAC1-like基因编码区序列中，设计适合进行CRISPR/Cas9敲除的双片段序列seq5和seq6，对EAC1-like进行双靶点敲除。
[0068] EAC1-like基因编码序列seq7如SEQ ID NO.7所示，具体序列为：
[0069] atggcgtgctcgggcagtttcctaccgataatgctcctgccgctgctcctcgccggcgccgcggtggcgggcggcgccccgccggggcttgggctggcgcagcggctggccgacggcgtggggcagcagcagcagcagtgctgggaggttctgatggagatcaagtcgtgcacgggggagatcctcctcttcttcatcaacggcgaggcgtacctggggcccggctgctgccgcgccatccgcgtcatcgagcagagctgctgggccaccgacgccatgctgtccgtcatcgggttcaccccggaggagggggacatgctcaagggctactgcgacgccggcgacgagcacaagccgtcgccgccccccgcctcgccggccgtcggctacgtcgccgtcggagagaacgccgccgtaccggccggacggaagagcctggcgctgcagcaccgttag。
[0070] 具体步骤为：
[0071] 2.1、首先将seq5和seq6通过Bsa1酶切分别组装到pYLgRNA-U3和pYLgRNA-U6a两个gRNA载体中得到seq5/pYLgRNA-U3重组载体和seq6/pYLgRNA-U6a重组载体。
[0072] seq5(SEQ ID NO.8)：ctcctgccgctgctcctcgccgg；
[0073] seq6(SEQ ID NO.9)：gctgctcctcgccggcgccgcgg。
[0074] 2.2、根据标准操作流程将seq5和seq6同时组装到载体pYLCRISPR/Cas9-H表达载体上，完成EAC1-like基因的双靶点敲除载体B构建。
[0075] (3)将载体A和载体B通过电击转化法，分别转到农杆菌中。利用成功转入载体A和载体B的农杆菌同时侵染杂交水稻湘两优900(曾用名，超优千号)成熟种子产生的愈伤组织，通过潮霉素筛选得到阳性转化植株。
[0076] 具体转化步骤为：
[0077] 3.1、分别挑选杂交水稻湘两优900的健康籽粒剥去颖壳，置于37℃培养箱过夜。种子取出后放入灭菌的三角瓶中，先用体积分数为75％的乙醇表面灭菌5min，用无菌水冲洗1次，0.1％HgCl消毒12min，用无菌水冲洗5次，再放入次氯酸钠原液消毒40min，无菌水冲洗5次，于灭菌的滤纸上晾干。
[0078] 3.2、将种子接种到诱导培养基上(NB)，让胚的一半接触培养基。每皿20粒，置于25℃～26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。
[0079] 3.3、20天后，挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，去除谷粒和愈伤中的芽头转到继代培养基J3上，这时候谷粒中营养已经被吸收而变软，继代培养1～2次，每次20天。
[0080] 3.4、划LB板(以农杆菌EHA105为例，培养基为LB+Kan 50mg/L+CHL 34mg/L+RIF 50mg/L)活化农杆菌EHA105，两天后挑取单菌落划LB板(EHA105为LB+Kan50mg/L+CHL34mg/L+RIF 50mg/L)全皿，28℃培养48小时备用。
[0081] 3.5、将农杆菌洗到50ml液体的共培养基(NBM+As0.1mM)中，调OD600＝0.5。
[0082] 3.6、从没继代或继代1～2次的愈伤组织中挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，于无菌的滤纸上风干至表面发白。将愈伤组织转移至步骤3.5的菌液中浸泡30min，每隔5min摇晃一次。
[0083] 3.7、将愈伤组织去除，菌水冲洗5次至液体不浑浊，用灭菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤表面发白。然后转移到共培养基(NBM+As0.1mM)上，其上有用液体的共培养基浸湿的滤纸，注意一个培养皿中不能放太多的愈伤组织，保证愈伤组织充分与无菌滤纸接触，25～26℃下暗培养3天。
[0084] 3.8、3天后，将愈伤组织转入已灭菌的三角瓶中，用无菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L头胞霉素和400mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡30min，每隔5min摇晃一次。
[0085] 3.9、将愈伤组织取出，用无菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤组织表面发白，转移到筛选培养基J3S。筛选两次。
[0086] 3.10、结束两次筛选后将筛选培养基中长出抗性愈伤的愈伤组织整体转移到预分化培养基(Y+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)上，置于光照培养箱中，培养条件为：25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx。
[0087] 3.11、3～7天陆续有愈伤组织变绿；将预分化培养基中变绿的愈伤组织转移到分化培养基(DL+500mg/L头胞霉素+400mg/L羧苄青霉素)上，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养，每20天更换一次培养基。
[0088] 3.12、当分化出的绿苗高约5～8cm时，转移到生根培养基(R)上，促进根的生长，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养。
[0090] (4)筛选双等位纯合敲除同时成功异位表达BBM1基因的T0代转基因植株。
[0091] 4.1、设计引物对seq8F和seq8R：
[0092] 上游引物Seq8F(SEQ ID NO.10)：acatactatgtgaatcacga。
[0093] 下游引物Seq8R(SEQ ID NO.11)：acagcccaacgaccgacgag。
[0094] 通过引物对seq8F和seq8R对T0代转基因植物进行扩增，引物对seq8F和seq8R分别位于Osmads13启动子序列上和BBM1基因的编码区上，只有在成功转入了载体A的转基因植株中才能扩增出大小为598bp的条带。
[0095] 4.2、设计引物对seq9F和seq9R：
[0096] 上游引物Seq9F(SEQ ID NO.12)：gcacatctacacgatacccaagc。
[0097] 下游引物Seq9R(SEQ ID NO.13)：acctggacgtgatcacacgtggc。
[0098] 引物对seq9F和seq9R对在成功转入了载体A的转基因植株中的EAC1-like基因进行PCR扩增，并用seq9F进行PCR产物测序，以此筛选EAC1-like基因双等位纯合突变株系。
[0099] (5)筛选的T0代植株套袋自交结实，实现水稻杂种优势固定。
[0100] 将BBM1成功异位表达同时EAC1-like基因双等位纯合突变的转基因杂交水稻套袋自交，收获自交结实种子。将自交结实种子进行种植，通过观察植株表型是否发生分离来初步判断杂种优势固定是否成功；通过对各植株进行全基因组重测序，鉴定湘两优900中存在的杂合位点是否分离，以此准确判断杂种优势固定的频率。
[0101] 本实施例中，湘两优900自交共获得250粒自交种子，将这些种子种植在田间，发现表型存在一定分离现象。进一步对其中的25株进行了全基因组重测序，发现有6株植株完全保持了湘两优900中的杂合位点，而在其他19株中，这些杂合位点都发生了部分分离。该结果说明，通过本发明能够成功实现水稻杂种优势的固定，其优势固定频率为24％。
[0102] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
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