一个芝麻花药特异表达启动子PSicwinv1及其应用
阅读：489发布：2020-05-17
专利汇可以提供一个芝麻花药特异表达启动子PSicwinv1及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 植物 基因工程技术领域，具体涉及一个芝麻花药特异表达启动子PSicwinv1及其应用。本发明分离的启动子的核苷酸序列如 序列表 SEQ ID NO：1所示。对该启动子进行 生物 功能验证，GUS 染色 检测表明，本发明克隆的特异启动子PSicwinv1驱动报告基因在拟南芥的根、茎、叶和荚果中均不表达，只在花药中特异表达，并且其表达量与花药的发育时期有关。原位杂交表明Sicwinv1在芝麻花药发育的四分体时期高量表达，且主要在绒毡层和四分体中表达。本发明公开了该启动子PSicwinv1为花药特异表达启动子，能用于芝麻雄性不育基因工程的研究以及 杂种优势 利用。，下面是一个芝麻花药特异表达启动子PSicwinv1及其应用专利的具体信息内容。
一个芝麻花药特异表达启动子PSicwinv1及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个芝麻花药特异表达启动子PSicwinv1及其应用。从芝麻中分离、鉴定得到一个特异表达的Sicwinv1基因的启动子，将其命名为PSicwinv1。该启动子只在花药中特异表达，在其他组织中均无表达。本发明克隆的启动子可在芝麻或其他植物花药发育和雄性不育基因工程以及品种改良中应用。
背景技术
[0002] 启动子是位于基因5’端上游、指导RNA聚合酶和转录因子特异结合，进而启动基因特异表达的一段特定DNA序列，是调控基因表达的重要顺式作用元件。启动子在植物基因工程中发挥着重要作用，是基因工程表达载体的重要组成元件，调控着外源基因的转录效率和时空表达模式。
[0003] 按照启动子的调控表达模式，可将启动子分为组成型启动子和特异型启动子。组成型启动子驱动外源基因在各个组织和发育阶段高效表达，不具有时空特异性。典型的应用于植物基因工程的组成型启动子有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、水稻肌动蛋白Act启动子及玉米泛素Ubi启动子(关丽英等，转基因植物中外源基因的有效表达及其安全评价.首都师范大学学报，2002，23(2)：52-56)。但是，组成型启动子的高效、非特异表达易造成细胞物质过度消耗，且目标基因不能受到特定的时空调控表达，导致一些负面效应产生。因而，特异型启动子近年来受到了越来越多的关注。特异型启动子包括组织特异型启动子和诱导型启动子。组织特异型启动子驱动目标基因在特定的组织或器官中表达，通常伴随有发育调节的特性。该类启动子一般存在一些与组织特异性相关的特异基序(贺红霞等，组织特异性启动子在作物基因工程中的研究进展.中国农学通报，2014，30(9)：225-231)。组织特异型启动子有效的避免了资源浪费及细胞毒害等负面效应，在转基因育种中具有重要的应用价值。
[0004] 近年来，一些组织特异型启动子被相继分离和鉴定，如绿色组织特异启动子、果实及种子特异启动子、根特异启动子、维管束特异启动子及花器官特异启动子，并应用到相关性状的遗传改良(Potenza et al.,2004,Targeting transgene expression in research,agricultural,and environmental applications:Promoters used in plant transformation.In Vitro Cell Dev Biol Plant,40:1-22)。利用花药或花粉特异表达启动子创制雄性不育系应用于杂交育种已取得了一定的进展。利用烟草花药绒毡层特异表达的启动子PTA29融合淀粉芽孢杆菌的核糖核酸水解酶基因barnase构建的载体遗传转化受体植株，创制了雄性不育系(Mariani et al.,1990,Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonuclease gene.Nature,347:737-741)。水稻RTS基因在减数分裂的花药绒毡层中表达，利用该基因的启动子融合barnase或者RTS的反义链并转化水稻、拟南芥均导致转基因植株雄性不育(Luo et al.,2006,RTS,a rice anther-specific gene is required for male fertility and its promoter sequence directs tissue-specific gene expression in different plant species.Plant Mol Biol,62:397-408)。
[0005] 芝麻具有较强的杂种优势，雄性不育是作物杂种优势利用的重要途径，利用雄性不育系创制杂交种对于芝麻遗传改良具有重要的意义。因而，挖掘芝麻花药特异表达启动子对于芝麻雄性不育相关基因功能验证和雄性不育系创制具有重要的应用价值。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一个从芝麻中分离克隆的花药特异表达启动子。本发明的启动子属于一种内源启动子，通过RT-PCR检测表明该启动子驱动的内源基因只在花药中表达，在其他组织中均无表达。通过检测报告基因GUS的表达特征表明启动子驱动的基因只在花药中表达，并且其表达量与花药的发育时期有关。原位杂交表明该启动子驱动的内源基因在芝麻花药发育的四分体时期表达量最高。本发明不仅丰富了芝麻花药特异表达启动子资源，同时预示着该启动子在雄性不育研究中具有相当广阔的应用前景。将该启动子运用于雄性不育相关基因的功能验证以及雄性不育系的创制，为杂种优势利用提供技术基础和遗传资源。
[0007] 实现本发明目的的技术方案如下所述：
[0008] 为了获得本发明，发明人比较了芝麻隐性细胞核雄性不育系95ms-5的可育株和不育株四分体时期花药转录组，从芝麻中分离得到一个显著差异表达的基因Sicwinv1，对该基因的组织表达分析验证表明，该基因只在芝麻的花药中特异表达，在根、茎、叶、花瓣、雌蕊、柱头中均不表达(图1)。通过PCR扩增得到该基因的启动子PSicwinv1，其核苷酸序列如序列表SEQ NO:1所示。
[0009] 本发明的启动子来源于芝麻，由1205个碱基组成。通过构建由该启动子调控的报告基因GUS的植物表达载体PCAMBIA1381Xb-ProSicwinv1(图2B)，并将该转化载体转化到哥伦比亚生态型拟南芥中，得到该启动子的转基因阳性拟南芥植株。通过GUS染色分析发现，该启动子只驱动GUS基因在花药中表达，在根、茎、叶、荚果、花瓣中均检测不到GUS基因的表达(图3)。并且在花药的不同发育时期，PSicwinv1驱动报告基因GUS的表达存在差异(图4)。通过原位杂交分析表明，PSicwinv1驱动内源基因在芝麻花药的四分体时期高量表达，并且主要在绒毡层和四分体中表达(图5)。这些研究表明，PSicwinv1是一个花药特异表达启动子，能够应用于植物雄性不育基因工程和植物杂种优势利用以及品种改良中。
[0010] 本发明的具体操作步骤如下：
[0011] (1)根据芝麻基因组序列设计Sicwinv1基因的启动子扩增引物，以申请人前期工作获得的芝麻隐性细胞核雄性不育系95ms-5(Zhao et al.,2013,Characterization and genetic mapping of a novel recessive genic male sterile gene in sesame(Sesamum indicum L.).Mol Breeding,32:901-908)的DNA为模板，扩增启动子序列，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012] 用于扩增Sicwinv1基因的引物序列如下：
[0013] PSicwinv1-F：5'-CCATATCATTTTCTGGCCTTTC-3'
[0014] PSicwinv1-R：5'-GGTTGAGGAAAACCTCATGG-3'
[0015] PSicwinv1-MF：5'-GAGAATTC(EcoRI)CTGGCCTTTCTATTAATTGA-3'
[0016] PSicwinv1-MR：5'-GCAAGCTT(HindIII)CTCCAAGATTGAGACTACAC-3'
[0017] (2)将步骤(1)扩增所获得的DNA片段以及PCAMBIA1381Xb质粒(图2A)，进行酶切连接反应，将该启动子连接到载体PCAMBIA1381Xb上，再通过热激转化大肠杆菌感受态细胞TOP10中，获得含有该启动子的重组载体，申请人将这个重组载体命名为植物重组载体PCAMBIA1381Xb-ProSicwinv1(图2B)。利用农杆菌介导的转基因方法，将所述的载体导入拟南芥中，获得转化植株。
[0018] (3)借助潮霉素筛选及分离比统计的方法获得转基因阳性植株，并通过GUS染色分析，检测启动子PSicwinv1的表达。
[0019] (4)通过原位杂交的方法，检测启动子PSicwinv1驱动内源基因在芝麻花药中的表达模式。
[0020] 本发明的优点在于：
[0021] 1.本发明克隆的启动子PSicwinv1为花药特异表达启动子，能驱动目标基因只在花药表达，而不在其他组织中表达，因此本发明能够有效克服组成型启动子造成的负面效应。
[0023] 序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆Sicwinv1基因的启动子PSicwinv1的核苷酸序列，序列长度为1205bp。
[0024] 图1：使用RT-PCR的方法检测Sicwinv1基因的组织表达模式分析。附图标记说明：图1中，左起第一个泳道为根(标注为Ro)，第二个泳道为茎(标注为St)，第三个泳道为叶(标注为Le)，第四个泳道为蒴果(标注为Ca)，第五个泳道为花蕾(标注为Bu)，第六个泳道为花冠(标注为Co)，第七个泳道为雌蕊(标注为Pi)，第八个泳道为雄蕊(标注为Sta)，SiUBQ6为芝麻泛素蛋白(登陆号为JP631638)，作为内参基因以检测上样量是否一致。
[0025] 图2：构建启动子表达载体所用的载体。附图标记说明：图2A为所使用的表达载体PCAMBIA1381Xb的图谱，图2B为本发明制备的植物重组载体PCAMBIA1381Xb-ProSicwinv1图谱。
[0026] 图3：一种PSicwinv1启动子驱动的GUS基因的组织化学染色结果示意图。附图标记说明：图3中的A图为转基因拟南芥的花蕾，图3中的B图为转基因拟南芥的花药，图3中的C图为转基因拟南芥的花序，图3中的D图为转基因拟南芥幼苗，图3中的E图为转基因拟南芥的荚果。GUS染色结果显示，只在拟南芥的花药中检测到蓝色，而在其他组织中均没有蓝色显示，表明启动子PSicwinv1驱动的GUS基因只在拟南芥花药中表达，而在根、茎、叶、荚果以及花瓣和花丝中均不表达。
[0027] 图4：启动子PSicwinv1驱动的GUS基因在拟南芥的不同发育时期的花药中的表达情况示意图。附图标记说明：图4中从左至右花蕾大小依次增大，表明启动子PSicwinv1驱动的GUS基因的表达量高低与花药发育时期有关。
[0028] 图5：原位杂交鉴定Sicwinv1基因在芝麻的不同发育时期的花药中的表达情况。附图标记说明：图5中的A-C图为Sicwinv1基因的mRNA反义探针在芝麻花药中的杂交结果，图5中的D-F图为正义链探针杂交后的阴性对照。图5中的A-C图分别为花粉母细胞时期、四分体时期和成熟花粉时期；图5中的的D-F图分别为花粉母细胞时期、四分体时期和成熟花粉时期。
具体实施方式
[0029] 以下实施例定义了本发明，根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。
[0030] 实施例1 Sicwinv1基因的启动子序列的分离克隆及表达模式分析
[0031] 本申请人在中国农业科学院油料作物研究所的前期工作中的芝麻隐性细胞核雄性不育系95ms-5(Zhao et al.,2013,Characterization and genetic mapping of a novel recessive genic male sterile gene in sesame(Sesamum indicum L.).Mol Breeding,32:901-908)的可育株和不育株四分体时期花药转录组中分离出一段EST序列，对这条序列在NCBI基因库中进行tBLASTx比对，发现这个序列可能是细胞壁转化酶基因。这条EST序列没有包含完整的开放读码框，申请人采用常规RACE(rapid-amplification of cDNA ends)法通过PCR进行cDNA末端快速克隆技术以得到这个基因完整的编码序列。将这条完整的编码序列与芝麻基因组比对，获得该基因的基因组序列，根据基因组序列设计引物，扩增启动子序列。
[0032] A.芝麻基因组DNA的提取
[0033] 采用常规CTAB法提取芝麻隐性细胞核雄性不育95ms-5的DNA(提取方法参照Uzun and Cagirgan,2009,Identification of molecular markers linked to determinate growth habit in sesame.Euphytica,166,379-384报道的方法)。
[0034] B.Sicwinv1基因启动子序列的获得
[0035] 根据Sicwinv1的基因组序列设计启动子扩增引物，引物如下：上游引物PSicwinv1-F5'-CCATATCATTTTCTGGCCTTTC-3'，下游引物PSicwinv1-R5'-GGTTGAGGAAAACCTCATGG-3'，以95ms-5B的DNA为模板，利用PCR扩增Sicwinv1的启动子序列。
PCR反应体系为：10×buffer 2μl；dNTP 0.4μl；上下游引物各0.2μM；Taq聚合酶0.2μl，加ddH2O补足至20μl体系。PCR条件为94℃预变性3min；94℃ 30sec，55℃ 30sec,72℃ 1min，
28个循环；72℃延伸7min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司，美国)，筛选阳性克隆并测序。
PCR反应体系为：10×buffer 2μl；dNTP 0.4μl；上下游引物各0.2μM；Taq聚合酶0.2μl，加ddH2O补足至20μl体系。PCR条件为94℃预变性3min；94℃ 30sec，55℃ 30sec,72℃ 1min，
28个循环；72℃延伸7min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司，美国)，筛选阳性克隆并测序。
[0036] C.芝麻不同组织的总RNA的提取及cDNA的获得以及Sicwinv1的表达模式分析[0037] RNA的提取采用Trizol试剂盒(购自Invitrogen公司，美国)，以芝麻95ms-5为材料，提取根、茎、叶、蒴果、花蕾、花冠、雌蕊以及雄蕊各组织样品的RNA，利用反转录酶SuperscriptⅢ(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，反应条件为：65℃ 5min，50℃ 60min，70℃ 10min。以上述反转录合成的cDNA为模板，采用RT-PCR检测Sicwinv1的表达模式，所用引物为：Sicwinv1-F：(5'-ATGGAGTTTCGGGCCAAGAG-3')和Sicwinv1-R：(5'-GATTAAGAGGTGCAGGCAGGGAC-3')。同时用引物SiUbiquitin6-F：(5'-CACCAAGCCGAAGAAGATCAAG-3')和SiUbiquitin6-R：(5'-CCTCAGCCTCTGCACCTTTC-3')对芝麻SiUbiquitin6(GenBank登陆号：JP631638)基因做特异扩增，作为内参对照进行相对定量分析。结果表明：本发明克隆的启动子驱动内源基因在花药中表达，在其他组织中不表达(见图1)。
[0038] 实施例2：含有Sicwinv1基因启动子PSicwinv1表达载体的构建
[0039] 根据得到的启动子PSicwinv1序列设计引物用于构建表达载体，方法是在引物两端分别加上酶切位点，所述的引物序列分别为PSicwinv1-MF(5'-GAGAATTC(EcoRI)CTGGCCTTTCTATTAATTGA-3')和PSicwinv1-MR(5'-GCAAGCTT(HindIII)CTCCAAGATTGAGACTACAC-3')，以T-Sicwinv1质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：10×buffer 2μl；dNTP 0.4μl；上下游引物各0.2μM；pfu聚合酶0.2μl，加ddH2O补足至20μl体系。
PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 1min，共28个循环；72℃延伸至7min，PCR产物通过凝胶电泳检测，并使用DNA凝胶回收试剂盒(购自Axygen公司，美国)回收目的PCR产物。回收后的PCR产物通过HindIII和EcoRI(购自宝生物工程大连有限公司)进行双酶切，酶切反应体系为：10×Fastdigest Buffer 2μl，DNA 1μg，HindIII和EcoRI各1μl，加ddH2O至20μl，充分混匀后，于37℃恒温箱中放置1h，随后将酶切产物通过PCR产物纯化试剂盒(购自Bioflux公司，罗马尼亚)进行纯化。同时将载体质粒通过HindIII和EcoRI进行双酶切，酶切反应体系同上，随后将酶切产物通过凝胶电泳检测，并使用DNA凝胶回收试剂盒(购自Axygen公司，美国)回收目的载体片段(目标片段为大片段)，后将回收后的目的载体片断与纯化的酶切PCR产物进行连接反应，连接反应体系为：按目的载体片段100ng，目标PCR片段50ng，加入10×T4连接酶Buffer 2μl，T4连接酶1μl(购自Thermo公司，美国)，无菌水补充至20μl混匀，22℃ 10min后，于4℃过夜连接反应。然后通过常规热激法转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，以Sicwinv1的特异引物PSicwinv1-MF(5'-GAGAATTC(EcoRI)CTGGCCTTTCTATTAATTGA-3')和PSicwinv1-MR(5'-GCAAGCTT(HindIII)
CTCCAAGATTGAGACTACAC-3')进行PCR检测来挑取阳性克隆，阳性克隆进行测序。PCR反应体系为：10×buffer 2μl；dNTP 0.4μl；上下游引物各0.2μM；Taq聚合酶0.2μl，加ddH2O补足至
20μl体系。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，25个循环；72℃延伸7min。确定为阳性的克隆即为获得了用于转化的重组载体PCAMBIA1381Xb-ProSicwinv1(图2B)。
PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 1min，共28个循环；72℃延伸至7min，PCR产物通过凝胶电泳检测，并使用DNA凝胶回收试剂盒(购自Axygen公司，美国)回收目的PCR产物。回收后的PCR产物通过HindIII和EcoRI(购自宝生物工程大连有限公司)进行双酶切，酶切反应体系为：10×Fastdigest Buffer 2μl，DNA 1μg，HindIII和EcoRI各1μl，加ddH2O至20μl，充分混匀后，于37℃恒温箱中放置1h，随后将酶切产物通过PCR产物纯化试剂盒(购自Bioflux公司，罗马尼亚)进行纯化。同时将载体质粒通过HindIII和EcoRI进行双酶切，酶切反应体系同上，随后将酶切产物通过凝胶电泳检测，并使用DNA凝胶回收试剂盒(购自Axygen公司，美国)回收目的载体片段(目标片段为大片段)，后将回收后的目的载体片断与纯化的酶切PCR产物进行连接反应，连接反应体系为：按目的载体片段100ng，目标PCR片段50ng，加入10×T4连接酶Buffer 2μl，T4连接酶1μl(购自Thermo公司，美国)，无菌水补充至20μl混匀，22℃ 10min后，于4℃过夜连接反应。然后通过常规热激法转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，以Sicwinv1的特异引物PSicwinv1-MF(5'-GAGAATTC(EcoRI)CTGGCCTTTCTATTAATTGA-3')和PSicwinv1-MR(5'-GCAAGCTT(HindIII)
CTCCAAGATTGAGACTACAC-3')进行PCR检测来挑取阳性克隆，阳性克隆进行测序。PCR反应体系为：10×buffer 2μl；dNTP 0.4μl；上下游引物各0.2μM；Taq聚合酶0.2μl，加ddH2O补足至
20μl体系。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，25个循环；72℃延伸7min。确定为阳性的克隆即为获得了用于转化的重组载体PCAMBIA1381Xb-ProSicwinv1(图2B)。
[0040] 将构建的PCAMBIA1381Xb-ProSicwinv1载体转化农杆菌菌株GV3101(Roger et al.,2000,A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.Trends in Plant Sci,5,1360-
1385)，挑取单菌落接于含50mg/L利福平和100mg/L潮霉素的LB液体培养基中于150rpm，28℃摇48h，按菌液和甘油体积比1：1加入1.5mL离心管混匀，-70℃保存。再通过农杆菌介导的转化方法转化拟南芥。
1385)，挑取单菌落接于含50mg/L利福平和100mg/L潮霉素的LB液体培养基中于150rpm，28℃摇48h，按菌液和甘油体积比1：1加入1.5mL离心管混匀，-70℃保存。再通过农杆菌介导的转化方法转化拟南芥。
[0041] 本说明书中涉及LB培养基配方为常规培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；灭菌前用5mM NaOH调培养基的pH＝7.2；用蒸馏水定容至1L；在121-125℃高压灭菌15-20min。LB的固体培养基为每升培养基中添加8g/L的琼脂。
[0042] 实施例3 遗传转化及筛选鉴定
[0043] A.拟南芥材料的准备
[0044] 供试材料为野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.Columbia ecotype)为本领域的常规材料。野生型拟南芥种子经过春化处理后点播于拟南芥种植常规营养土并放入人工培养室(16小时光照，22℃)等拟南芥长到4叶左右进行定苗，以控制拟南芥的生长密度。待拟南芥生长6周左右开始开花时即可进行转化，转化前一天给拟南芥浇足水。
[0045] B.农杆菌的活化
[0046] 从超低温冰箱内取出保存的含有目标启动子PSicwinv1(即本发明克隆的Sicwinv1基因启动子)的GV3101菌株的甘油管在冰上融化，后于含50mg/L利福平和100mg/L潮霉素的LB固体培养基上划线，28℃暗培养36-48h，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在加50mg/L利福平和100mg/L潮霉素的LB液体培养基中过夜培养(26.5℃，100rpm)，其OD600＝0.8-1.0时即可用于转化；
[0047] 将菌液转移到离心管中5000rpm离心5min，弃上清培养基。加入100ml浓度为5％(W/V)的蔗糖溶液，重悬农杆菌GV3101，在28℃摇床中复苏1-2h。加入表面活性剂0.05％(V/V)Silwet L-77，震荡摇混匀。
[0048] C.农杆菌介导的花序法转化拟南芥及转基因拟南芥的筛选
[0049] 农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥的方法和程序参照(Zhang et al.,2006,grobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.Nature Protocols,1,641-646)。具体步骤如下：
[0050] (1)将拟南芥花器浸入农杆菌悬液，并轻轻搅动约30s，用纸巾吸掉过多的菌液，并用黑色塑料袋将拟南芥植株包裹起来，保湿避光处理24h；
[0051] (2)之后将塑料袋逐渐揭开透气，正常培养；
[0052] (3)一周后重复上述(1)的操作；
[0053] (4)待种子成熟可以停止浇水并收获种子，即T1代种子；
[0054] (5)将收获的种子消毒：先用70％(V/V)乙醇浸泡1分钟，在上述处理时要不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次；
[0055] (6)处理后的种子用Top agar(0.1％(W/V)琼脂水溶液)均匀涂布在含潮霉素的拟南芥生长培养基(含有100mg/L潮霉素的常规1/2MS培养基)表面；
[0056] (7)在4℃冰箱中将转基因拟南芥种子春化3天，再移入培养室培养10天，共选取具有潮霉素抗性植株17株；
[0057] (8)将17株转基因T1代拟南芥植株移栽到土壤培养，待成熟后按单株收取种子，即为T2代种子；
[0058] (9)将收取的T2代种子按操作步骤(5)-(6)进行操作1次；
[0059] (10)在4℃冰箱中将转基因拟南芥种子春化3天，正常培养10天后计算具有潮霉素抗性植株与非抗性植株的分离比，并进行统计分析；
[0060] (11)符合抗性与非抗性植株的分离比为3:1的株系被认为是单拷贝株系，移栽土壤培养，待成熟后按单株收取种子，即T3代种子。
[0061] 实施例4：启动子表达载体PCAMBIA1381Xb-ProSicwinv1驱动GUS在拟南芥中表达[0062] 将T3代转基因拟南芥植株在常规1/2MS培养基上播种，在4℃冰箱中将转基因拟南芥种子春化后置于生长箱中萌发，出苗5-7天后一部分取苗进行GUS染色，另一部分移栽到土壤培养，待拟南芥开花后，取样进行GUS染色。GUS组织化学定位法参照Jefferson等(Gus fusions:β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J,1987,6:3901-3907)方法，将转化转基因植株的不同器官，组织放到GUS染色液溶液中，真空抽气5min，于37℃保温2h至过夜，经70％酒精脱色后，用蒸馏水漂洗数次，于体式显微镜(OLYMPUS SZX16)下拍照。GUS染液成分如下(100mL)：x-gluc 90mg、氯霉素10.0mg、0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)50mL、甲醇20％(v/v)，补足无菌水至100mL。
[0063] 植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的部位。通过检测不同时空下GUS基因的表达部位和表达强度来探索启动子PSicwinv1的时空表达模式。GUS染色结果表明：启动子PSicwinv1驱动GUS基因只在拟南芥花药中表达，在根、茎、叶、荚果以及花瓣、花丝中均不表达(图3)，并且PSicwinv1驱动GUS基因在花药中的表达与花药的发育时期有关，随着花药的发育，GUS基因的表达量降低(见图4)。
[0064] 实施例5：Sicwinv1基因的原位杂交
[0065] 取可育系95ms-5B花粉母细胞时期、四分体时期以及成熟花粉期的花蕾固定、包埋、切片后进行杂交，具体操作如下：
[0066] A.石蜡切片
[0067] (1)取材固定：取95ms-5B不同时期花蕾，加入FAA固定液，抽真空至组织沉至管底，固定24h以上。
[0068] (2)脱水：经70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇(含1％伊红)逐级脱水(可过夜)，每级1h。无水乙醇两次，每次1h。
[0069] (3)透明：经1/5，2/5，3/5，4/5，纯氯仿透明，每级1-1.5h。
[0070] (4)渗蜡：加碎蜡，37℃温箱中放2天，碎蜡：氯仿体积比＝1：2～3
[0071] (5)浸蜡和包埋：材料经各级蜡杯，50％蜡杯(45℃)～75％(52℃)各2h，A杯、B杯、C杯(100％蜡)(56～58℃)分别1h，随后包埋。
[0073] (7)展片、烘片：在KD-H烘片机上37℃展片后，在36℃恒温箱中烘2天以上。
[0074] B.原位杂交探针制备
[0075] (1)选取目标基因特异性序列，查找序列中的限制性内切酶酶切位点，避开含有酶切位点的序列设计引物，在引物两端加上限制性内切酶位点BamHI(GGATCC)和XhoI(CTCGAG)。引物序列如下：
[0076] Fp：5'-CGCGGATCCTCCTCAACCTTCAATCCCTGTCC-3'，
[0077] Rp：5'-CCGCTCGAGGAGCCTGACCAACAACCATACTG-3'；
[0078] (2)以95ms-5B的cDNA为模板，通过PCR扩增目标片段，通过酶切连接反应将目标片段构建到pBluescript II KS+载体上(购自Stratagene公司，美国)，并转化大肠杆菌，挑取阳性克隆并测序，并提取正确的阳性克隆的质粒。
[0079] (3)质粒线性化：选择BamHI和XhoI对质粒进行酶切，酶切后加入等体积水，产物用等体积的Tris-饱和酚和氯仿混合液(体积比为1：1)进行抽提，12000rpm/min离心10min，吸上清至干净的离心管中，加入氯仿纯化2次，12000rpm/min离心10min，吸上清至干净的离心管中，加入2倍体积预冷的酒精和0.1倍体积的乙酸钠沉淀，冷冻离心后，弃上清。用75％的酒精漂洗两次，干燥后加DEPC水溶解。
[0080] (4)探针转录：反应体系(10μl)如下：
[0081]
[0082] 37℃反应4小时，转录完成后向反应体系中加入DNase(RNase-free)和RNasin各0.5μl，37℃反应25min，加入50μl TE(PH8.0)、5μl licl和155μl无水乙醇，混匀后-20℃过夜至沉淀析出，12000rpm/min离心20min，弃上清，75％乙醇洗涤2次，干燥后加入10μl DEPC水溶解。取1μl点样检测，分光光度计测定产物浓度。
[0083] C.原位杂交
[0084] (1)将二甲苯脱腊两次，每次20min。分别用无水乙醇2次，95％乙醇，85％乙醇，70％乙醇，50％乙醇，30％乙醇，15％乙醇的梯度酒精复水，用常用的DEPC水洗涤2次复水，每次1min。
[0085] (2)37℃预热蛋白酶K液，蛋白酶K最终浓度为1μg/ml，杂交片子于37℃处理40min，1×PBS洗一次。
[0088] (5)依照探针浓度按比例与杂交缓冲液混合，每玻片上滴加杂交液50μl，盖上Para film封口膜，在湿盒中42℃杂交过夜。
[0089] (6)室温下将玻片于2×SSPE中揭掉Para film封口膜，2×SSPE缓冲液42℃洗2次，每次15min；然后在57℃条件下，0.2×SSPE缓冲液水浴50r/min洗2次，每次30min，洗脱剩余探针。
[0090] (7)室温(23℃)下，将玻片放置于1×Blocking buffer中40min，50r/min。封阻液需要现配。用BSA washing buffer按体积比为1：2500稀释anti-DIG-AP抗体，所用试剂盒为ROCHE显色试剂盒(CAT.NO.11745832910)，将切片于室温在抗体中振荡孵育2h，50r/min。
[0091] (8)免疫反应结束后，将玻片置于1×Blocking buffer中15min，室温(23℃)条件下50r/min洗脱，在BSA washing buffer中室温(23℃)下洗3次，每次15min，50r/min。
[0092] (9)显色反应：切片换入TNM-50室温3次，每次5min。在40ml TNM-50中加入0.5ml的NBT配成的显色液。将切片置于其中，湿盒中室温黑暗处显3h-5h。显色结束后用TE洗片3次，每次5min。
[0093] (10)材料经30％，70％，95％，100％乙醇、二甲苯:乙醇(体积比为1:1)、二甲苯、二甲苯系列脱水透明，显微观察摄影。
[0094] 由图5的原位杂交结果可见：Sicwinv1基因在芝麻花药的四分体时期表达量最高，且主要在绒毡层和四分体中表达。
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