修饰的安卡拉牛痘病毒(MVA)突变体及其用途
阅读：570发布：2021-06-07
专利汇可以提供修饰的安卡拉牛痘病毒(MVA)突变体及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及MVA病毒突变体及其在免疫 治疗 和接种抵抗多种 疾病 中的用途，尤其是在 预防 和治疗癌症和感染性疾病中的用途。MVA IL1βR缺失突变体的构建允许在体外和体内分析MVA侵染引起的IL1βR合成的重要性。目前的资料显示IL1βR基因的失活对MVA 疫苗 的开发是有益的。，下面是修饰的安卡拉牛痘病毒(MVA)突变体及其用途专利的具体信息内容。
1.一种MVA突变体，其中IL1βR编码序列或其功能部分被失活，用于免疫治疗和/或接种，其中该MVA突变体进一步包括DNA序列，所述DNA序列编码来源于由治疗性多肽和病原体的多肽以及它们的功能部分所组成的组中的异源蛋白质。
2.根据权利要求1所述的MVA突变体，其中IL1βR编码序列或其功能部分通过缺失或突变被失活。
3.根据权利要求1所述的MVA突变体，其中所述治疗性多肽来源于由分泌蛋白质所组成的组中。
4.根据权利要求3所述的MVA突变体，其中所述分泌蛋白质选自抗体多肽、趋化因子、细胞因子或干扰素。
5.根据权利要求1所述的MVA突变体，其中所述病原体来源于由病毒、细菌、原生动物和寄生虫，以及肿瘤细胞或与肿瘤细胞相关的抗原和它们的功能部分所组成的组中。
6.根据权利要求5所述的MVA突变体，其中所述病毒选自由流感病毒、麻疹和呼吸道合胞体病毒、登革热病毒、人类免疫缺陷病毒、人类肝炎病毒、疱疹病毒和乳头状瘤病毒所组成的组中。
7.根据权利要求5所述的MVA突变体，其中所述原生动物是恶性疟原虫。
8.根据权利要求5所述的MVA突变体，其中所述细菌是引起结核病的分枝杆菌。
9.根据权利要求5所述的MVA突变体，其中与肿瘤细胞相关的抗原选自由与黑色素瘤相关的分化抗原、睾丸癌抗原和在肿瘤上过度表达的未突变的共享抗原所组成的组中。
10.根据权利要求9所述的MVA突变体，其中所述与黑色素瘤相关的分化抗原选自由酪氨酸酶、酪氨酸酶相关的蛋白质1和2所组成的组中。
11.根据权利要求9所述的MVA突变体，其中所述睾丸癌抗原选自由MAGE-1、-2、-3和BAGE所组成的组中。
12.根据权利要求9所述的MVA突变体，其中所述在肿瘤上过度表达的未突变的共享抗原选自由Her-2/neu、MUC-1和p53所组成的组中。
13.根据权利要求1-12中的任意一项所限定的MVA突变体作为活性成分在制备用于抗癌治疗或传染疾病的预防的药物组合物中的用途。
14.一种药物组合物，包括权利要求1-12中任意一项所述的MVA突变体和药学上可接受的载体。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，该组合物适合在体内用于哺乳动物。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述哺乳动物为人类。
17.一种产生突变体MVA的方法，包括以下步骤：
-用编码权利要求1-12中任意一项所述的MVA突变体的核酸侵染MVA的寄主细胞，-在所述寄主细胞中在适合的条件下表达所述核酸；和
-分离表达的突变体MVA。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述寄主细胞是CEF细胞、来源于鸡胚的LSCC-H32细胞、鸡DF-1细胞或其它鸟类的细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述其它鸟类的细胞选自由鹌鹑成纤维QT6或QT35细胞所组成的组中。
20.根据权利要求17-19中的任意一项所述的方法，其中突变体MVA是通过基于寄主范围选择方法的K1L基因而选择的。
21.一种产生药物组合物的方法，包括以下步骤：
-用编码权利要求1-12中任意一项所述的MVA突变体的核酸侵染MVA的寄主细胞，-在所述寄主细胞中在适合的条件下表达所述核酸，
-分离表达的突变体MVA；
-加入药学上可接受的载体和生产药物组合物的其它成分。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述寄主细胞是CEF细胞、来源于鸡胚的LSCC-H32细胞、鸡DF-1细胞或其它鸟类的细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述其它鸟类的细胞选自由鹌鹑成纤维QT6或QT35细胞组成的组中。
24.根据权利要求21-23中的任意一项所述的方法，其中突变体MVA是通过基于寄主范围选择方法的K1L基因而选择的。
25.权利要求1-12中的任意一项所限定的MVA突变体在制备用于免疫治疗和/或接种的药物中的用途。
26.根据权利要求25所述的用途，是在接种预防天花或由正痘病毒侵染引起的其他疾病中的用途。
修饰的安卡拉牛痘病毒(MVA)突变体及其用途
技术领域
背景技术
[0002] 牛痘病毒(VV)属于痘病毒科的正痘病毒(Orthopoxvirus)属。牛痘病毒的某些毒株被用作活疫苗以对天花产生免疫已有多年，例如英国Lister研究院的Elstree毒株。由于疫苗接种可能引起并发症( ，Zeitschr.für 18，41-44[1973])，并且1980年WHO宣布天花已被根除，因此现在只有高危人群材接种天花疫苗。
[0003] 牛痘病毒也被用作载体生产和输送外源抗原(Smith等，Biotechnologyand Genetic Engineering Reviews 2，383-407[1984])。这需要将编码外源抗原的DNA序列(基因)通过DNA重组技术导入牛痘病毒基因组。若基因整合到病毒DNA的一个位点上，而该位点不是病毒的生命周期所必须的，那么新产生的重组牛痘病毒可能具有侵染性，也就是说能够侵染外源细胞并能够表达该整合的基因(欧洲专利申请No.83,286和No.110,385)。这种方法得到的重组牛痘病毒一方面可以作为预防侵染的活疫苗，另一方面也可用于在真核细胞中生产异源蛋白。
[0004] 牛痘病毒是最具广阔价值的活载体之一，具有支持它作为重组疫苗用途的特殊性质：高度稳定、生产低廉、容易实施、还能容纳大量的外源DNA。它有诱导抗体和细胞毒性反应的优点，可以以一种更为自然的方式向免疫系统提供抗原，并在多种动物模型中它被成功的用作载体疫苗以免于感染性疾病。另外，牛痘载体是很有价值的研究工具，用于分析重组蛋白的结构-功能关系、确定体液和细胞介导的免疫反应的耙标、研究预防特定疾病所需要的免疫防御类型。
[0005] 然而牛痘病毒对人有侵染性，并且出于安全性的考虑和规章制度，牛痘病毒作为表达载体在实验室中的使用受到了影响。此外，重组牛痘病毒将来可能的应用，例如生产用于人类的新的治疗或预防方法的重组蛋白或重组病毒粒子，将由于重组牛痘病毒载体多产的复制而受到阻碍。文献中报道的大多数重组牛痘病毒都是基于牛痘病毒的西里瑟夫(Western Reserve，WR)毒株。然而该毒株的高度神经毒性是周知的，因而是不适合用于人和动物的(Morita等，Vaccine 5，65-70[1987])。
[0006] 标准牛痘病毒毒株安全性的考虑已经通过从高度弱化的病毒毒株开发的疫苗载体而提出，这些高度弱化毒株的特征在于，在体外有限的复制能力和在体内是无毒的。很久以来人们已经知道对病毒毒株进行特别的培养以避免负作用。这样通过长期的在鸡胚成纤维细胞上连续传代培养牛痘病毒的安卡拉毒株(CVA)可培养出一种修饰的安卡拉牛痘病毒(Modified vacciniavirus Ankara，MVA)毒株(参见Mayr，A.，Hochstein-Mintzel，V.和Stickl，H.(1975)Infection 3，6-14；瑞士专利No.568392)。该MVA病毒按照布达佩斯条约的要求于1987年12月15日在CNCM(法国国家微生物保藏中心，Institut Pasteur，Collectione Nationale de Cultures de Microorganisms，25，ruede Docteur Roux，75724Paris Cedex 15)进行保藏，保藏号为I-721。
[0007] 修饰的安卡拉牛痘病毒(MVA)是一株鸡细胞适应的牛痘病毒。由于它对动物接种后的无毒性，以及在大多数哺乳动物细胞中不能产生大量新的病毒后代的惊人的缺陷，所以原MVA可在生物安全水平一级的实验室条件下使用。由于MVA已经被测试用于为超过十万人接种疫苗预防天花而没有引起显著的负作用，因此MVA是具有高度安全性的表达重组基因的有效载体病毒(Sutter&Moss 1992)和候选重组疫苗，。几个MVA载体疫苗已进入临床评估(McConkey等2003，Cosma等2003)。最近，与传统的牛痘病毒毒株相比较，MVA被重新评估作为预防天花的候选第二代疫苗(Drexler等2003，Belyakov等2003)。
[0008] 如前所述，MVA是通过在鸡胚成纤维细胞上长期的连续传代培养而得到的，其结果是使大量的基因组遗传信息丢失，包括很多调节病毒-宿主关系的基因(Meyer等1991，Antoine等1998)。一些编码识别豆病毒免疫逃逸分子(请参见Moss&Shisler 2001，Alcam2003)的MVA异性基因被丢失或片段化，这些分子包括病毒干扰素I型和II型受体、白介素转化酶抑止剂SPI-2、牛痘补体结合蛋白、牛痘semaphorin、35kDa趋化因子结合蛋白或肿瘤坏死因子α受体。有趣的是在MVA基因组中一些具有免疫调节功能的基因被保留下来，这些基因与基于MVA疫苗应用的可能的关系还有待确定。其中一个例子是在MVA中高度保守的病毒白介素1β受体(IL 1βR)的编码序列被保留。白介素1是一种细胞因子，它在炎性过程的调节和寄主对侵染因子的原初免疫反应中起重要作用。与其细胞对应物不同，可溶的病毒IL 1βR只对IL 1β，主要的内原热原，(Alcami&Smith 1996)有特异亲合性(Alcami&Smith Cell 1992)。在牛痘病毒对小鼠的侵染过程中，IL 1βR显示出通过与IL 1β相互作用而防止发烧。另外，牛痘病毒中IL 1βR基因的缺失加速鼻内侵染小鼠病症的显现和死亡，说明牛痘病毒对IL 1β的阻断可减弱侵染引起的全身急性期反应，调节疾病的严重程度(Alcami&Smith1996)。
[0009] IL 1βR基因失活的MVA突变体已被Staib等在“遗传工程对MVA病毒的瞬时寄主范围选择”BioTechniques 28：1137-1148(June 2000)中报道。缺失的IL 1βR基因序列被称为并相当于开放性阅读框(ORF)184R。MVA的整个基因组被Antoine等在病毒杂志(1998)中公开，该文在此引入作为参考。然而关于该突变体可能在多种疾病的预防或治疗中显示其潜在作用的免疫原性或其它性质还没见报道。
[0010] 总之，在将MVA用作疫苗时，考虑到MVA的免疫原性和/或其保护作用，现存的MVA毒株还需改进。
[0011] 因此本发明的一个目的就是提供MVA突变体，它有较少的不希望的免疫反应，同时在对几种疾病长期处理时具有优异的免疫原性。
发明内容
[0013] 在本发明中，从MVA基因组中IL1βR基因缺失的作用被评估。MVA IL1βR基因缺失突变体的构建使我们能够在体外和体内分析在MVA引起的侵染中，IL1βR合成的重要性。现有资料显示IL1βR基因的失活得益于对MVA疫苗的开发。
[0014] 奇怪的是病毒白介素1β受体的失活增强了修饰的安卡拉牛痘病毒免疫引起的CD8+T细胞反应。
[0015] 进一步的，本文中显示，缺失IL1βR基因的MVA突变体不表现发烧和其他病症表现，即使用MVA-ΔIL1βR高剂量鼻内侵染的小鼠也不表现发烧和其他病症表现。这个事实是完全出乎意料的，因为在牛痘病毒中IL1βR基因的缺失(在上面已提到过)加速鼻内侵染小鼠病症的出现和死亡。
[0016] 白介素-1(IL1)是寄主抵御侵染的炎症反应和免疫反应的重要调节者。牛痘病毒编码一个病毒可溶的白介素-1β受体(vIL1βR)，它调节急性期寄主对侵染的反应(发烧的诱导)，并可能影响对病毒相关抗原的免疫反应的诱导。
[0017] 发明人通过瞬时插入能够精确缺失MVA基因组中vIL1βR编码序列的选择标记基因序列而得到vIL1βR缺陷的MVA突变体病毒。MVA突变体的分析显示vIL1βR基因的缺失不能消除在组织培养扩增中MVA后代的形成。用MVA-ΔIL1βR高剂量鼻内侵染小鼠后，动物不显示发烧或其它病症表现，说明MVA-ΔIL1βR仍然保持着无毒表型。用MVA-ΔIL1βR或非突变的MVA接种小鼠诱导产生相似水平的牛痘病毒特异的循环抗体。用MVA-ΔIL1βR接种小鼠产生稍高水平的牛痘病毒表位特异的T细胞。另外，使人吃惊的是接种后六个月检测记忆T细胞的反应发现MVA-ΔIL1βR有显著优异的免疫原性(p＝0.01)。进一步的，我们发现免疫三周后MVA-ΔIL1βR和野生型MVA具有相似的保护能力，而在六个月后MVA-ΔIL1βR能够更好(5/5＝100％，MVA3/5＝60％)地抵抗由毒性牛痘病毒毒株西里瑟夫引起的致死呼吸道侵染挑战。因此在此的数据显示vIL1βR基因序列的缺失可以被认为是获得用于开发具有均匀改善了免疫原性的疫苗遗传学优化的MVA病毒的第一步。
[0018] 本发明具体指以下的方面和实施方式：
[0019] 本发明涉及MVA突变体，该突变体的IL1βR编码序列或功能部分优选通过缺失或突变而失活，该突变体可被用于免疫治疗和/或疫苗接种。
[0020] 在这里所用的术语“其功能部分”被理解为IL1βR序列的任何部分，其丢失导致如本文所述IL1βR功能的失活。失活优选通过突变或缺失而完成。正如上面提到的，功能的丢失可在抵御病毒相关的抗原的免疫反应的诱导中看到。因此对一个专业技术人员而言只需进行常规的实验就可确定是否有缺失或突变。具体地，增强CD8+T细胞反应的免疫作用采用例如实施例中所指出的方法进行评估(具体请参看图1)，这些实施例采用了Tatsis N，Sinnathamby G，Eisenlohr LC在Methods Mol.Biol.2004；269：267-288中描述的方法。
[0021] 具体地，ORF184的任何缺失或突变将被认为是充分的，将引起CD8+细胞的记忆反应，该反应与非修饰的，如野生型的MVA比较可增强至少10％，优选至少20％，更优选至少30％或40％和最优选大于50％。
[0022] 一般地，IL1βR基因或其功能部分可被从病毒基因组中缺失而失活。或者，IL1βR序列功能缺陷的重组MVA也可通过序列诱突如插入诱突而产生，从而引起IL1βR失活。
[0023] 本发明的MVA突变体可另外包括外源DNA序列，它可以是编码治疗多肽的基因，所述多肽例如分泌蛋白，例如抗体多肽、趋化因子、细胞因子或干扰素，或来源于可以优选被用于接种目的或治疗生产的病原物的多肽或具有科研价值的多肽。病原物被理解为病毒、细菌和引起疾病的寄生虫，或在机体中不受限制的增生并可引起病态生长的肿瘤细胞。这样的病原物例子被Davis，B.D.等，(Microbiology，第三版，Harper International出版)描述。优选的病原物基因是流感病毒的基因、麻疹和呼吸合胞体病毒的基因、登革热病毒的基因、人免疫缺陷型病毒如HIV I和HIV II的基因、人肝炎病毒如HCV和HBV的基因、疱疹病毒的基因、乳头瘤病毒的基因、疟疾寄生虫恶性疟原虫的基因和引起结核病的分枝杆菌的基因。
[0024] 另外，本发明的MVA突变体可用作疫苗接种以预防天花或正痘病毒感染引起的其他疾病。
[0025] 优选编码肿瘤相关抗原的基因是黑色素瘤相关的分化抗原例如酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和2的基因，睾丸癌抗原例如MAGE-1、-2、-3和BAGE的基因，在肿瘤中过量表达的非突变的共享抗原例如Her-2/neu、MUC-1和p53的基因。
[0026] 为了使外源DNA序列或基因表达成为可能，在该DNA上必须有基因转录所需的调节序列。本领域的技术人员都知道这种调节序列(叫做启动子)，例如像牛痘11kDa基因的启动子的牛痘病毒特异的启动子在欧洲专利EP-A-198,328中被描述，以及7.5kDa基因的启动子(EP-A-110,385)或可使牛痘病毒特异转录的异源痘病毒启动子，或可使牛痘病毒特异转录的合成的启动子。
[0027] 本发明的各组分优选采用药物组合物的形式使用，其中各组分以一定剂量与适合的载体或赋形剂混合以治疗或减缓疾病。这样的组合物(除了组分和载体外)还包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其他本领域已知的物质。术语“药学上可接受的”的意思是不干扰有效成分生物学活性作用的无毒的物质。载体的特性根据给药途径而定。药物组合物还可包括能增强活性物质的活性或可在治疗中应用的其他试剂。这些另外的因子和/或试剂可以包含在药物组合物中产生协同作用或减少副作用。
[0028] 直接应用的化合物的剂型和给药技术可在宾夕法尼亚伊斯顿的Mack出版公司出版的新版“若明顿药剂科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)”中找到。只要该组合物被用于医药目的，它们将含有有疗效剂量的有效成分。有疗效的剂量进一步指诸如治疗、治愈、预防或这种情况的改善的能够改善症状的足够的化合物/组分的含量。
[0029] 为制备疫苗，根据本发明生产的MVA牛痘病毒转变为生理学上可接受的形式。这可根据多年来用于接种预防天花的疫苗的制备方法(Kaplan，Br.Med.Bull.25，6 7
131-135[1969])来进行。典型的情况是在安瓿，优选是在玻璃安瓿中将大约10-10 个重组MVA颗粒在含有2％蛋白胨和1％人血清的100ml磷酸盐缓冲溶液(PBS)中冻干。冻干物可含有扩展剂(如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮)或其他适合肠道外给药的助剂(如抗氧化剂、稳定剂等)。然后玻璃安瓿被密封储存，优选在低于-20℃下，可保存几个月。
131-135[1969])来进行。典型的情况是在安瓿，优选是在玻璃安瓿中将大约10-10 个重组MVA颗粒在含有2％蛋白胨和1％人血清的100ml磷酸盐缓冲溶液(PBS)中冻干。冻干物可含有扩展剂(如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮)或其他适合肠道外给药的助剂(如抗氧化剂、稳定剂等)。然后玻璃安瓿被密封储存，优选在低于-20℃下，可保存几个月。
[0030] 接种时，冻干物可溶于0.1至0.2ml水溶液中，最好是生理盐水，经非肠道如皮内接种给药。根据本发明的疫苗优选采用皮内注射。在注射部位可能会出现轻微红肿，有时也可能出现骚痒(Stickl等，supra)。给药模式、剂量和次数可由那些本领域的技术人员根据已知的方式优化。为了获得抵抗外源抗原的高水平的免疫反应，在一个长时期内适当进行多次疫苗接种给药是有利的。
[0031] 因此，本发明的MVA突变体可用于在需要免疫治疗和/或接种(如癌症和/或传染病)的病人的治疗方法中应用，其特征在于给该病人施加有疗效量的本发明的MVA突变体/疫苗。在任何时候医师将根据病人的情况决定最适于个体病患的精确剂量，并且该剂量将随特定病人的年龄、体重和反应而改变。当然，个别情况下更高或更低的剂量范围是有益的，这也包括在本发明的范围之内。
[0032] 优选，该药物组合物适于哺乳动物，特别是人在体内应用。
[0033] 根据另一方面，提供一种产生突变体MVA的方法，包括以下步骤：
[0034] -用编码如上面所定义的MVA突变体的核酸侵染MVA寄主细胞，
[0035] -在适合的条件下在所述寄主细胞中表达所述核酸；和
[0036] -分离表达的突变体MVA。
[0037] 进一步地，本发明提供一种产生药物组合物的方法，包括以下步骤：
[0038] -用编码如上面所定义的MVA突变体的核酸侵染MVA寄主细胞，
[0039] -在适合的条件下在所述寄主细胞中表达所述核酸；
[0040] -分离表达的突变体MVA；
[0041] -加入药学上可接受的载体和生产药物组合物的其它成分。
[0042] 根据优选的实施方式，寄主细胞是CEF细胞、鸡胚来源的LSCC-H32细胞、鸡DF-1细胞或其它鸟类的细胞，如鹌鹑成纤维细胞QT6或QT35细胞。
[0043] 甚至更优选，突变体MVA基于寄主范围的选择方法(Staib等，“遗传工程对MVA病毒的瞬时寄主范围选择(Transient Host Range Selection ForGenetic Engineering Of Modified Vaccinia Virus Ankara”，BioTechniqus28：1137-1148，2000年6月)通过KIL基因进行选择。
[0044] 与亲代毒株比，MVA缺失了原基因组的大约15％(30,000个碱基对)，包括KIL基因的大部分。只有长度为263bp的碱基片段仍然存在于MVA基因组中。MVA KIL基因序列在MVA基因组的nt 20685-20981的ORF 022L的前263bp，如Antoine，G.F.Scheiflinger，F.Domer和F.G.Falkner 1998所描述的。修饰的安卡拉牛痘病毒的完全基因组序列及它与其它正痘病毒的对比可在Virology 244：365-396中找到。
[0045] 在Staib等的文章中描述了一种简单高效的产生重组MVA的方法，该方法是基于牛痘病毒寄主范围基因KIL的瞬时表达而进行选择。该方法是基于通过用作为严谨标记的牛痘病毒KIL基因瞬时寄主范围基因表达选择重组的MVA，使MVA在兔肾RK-13细胞内生长。新的MVA载体质粒的结构和应用已被描述，该质粒载有作为瞬时可选择标记的牛痘病毒寄主范围基因KIL的表达框。这些质粒允许另外的重组基因稳定的插入MVA基因组中或精确的MVA基因组序列的靶向诱变。在非选择生长调节下KIL基因侧翼连接的重复DNA序列通过同源重组被用来去除病毒基因组中的标记基因。
[0046] 上面提到的Staib等的出版物在此被全文引入。
[0047] 另外，本发明提供如上面所定义的MVA突变体或药物组合物的用途，如上所述用于免疫治疗和/或接种的药物制造中。进一步地本发明提供一种治疗病人的方法，包括向需要治疗的个体提供包括有疗效剂量的突变体MVA或药物组合物。至于给药的方法和形式也请参见以上所述。本发明的MVA突变体可优选用作预防天花或正牛痘病毒感染引起的其他疾病的疫苗接种。
[0049] 本发明通过以下附图进行进一步说明：
[0050] 图1.IL1βR缺陷MVA的构建。上面为MVA基因组的示意图。在MVA基因组中限制性内切酶HindIII的位点被标出。184R ORF(IL1βR基因)的位置用箭标出。邻近IL1βR编码序列的MVA DNA序列(侧翼184R-I，侧翼184R-II)被克隆到质粒pΔK1L中，可通过同源重组在ORF 184R的位点将K1L基因瞬时插入，结果使该基因缺失。最后的突变体病毒MVA-ΔIL1βR可通过涉及合成的重复序列(rep)的第二步同源重组去掉K1L标记基因而得到。
[0051] 图2.MVA-ΔIL1βR的体外特性。(A)PCR分析病毒DNA。从MVA-ΔIL1βR(道1)或MVA(道2)侵染的细胞提取基因组DNA模板，并与184R基因位点邻近的寡聚核苷酸孵育以扩增特异的DNA片段。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离。M，分子量标记。(B)病毒DNA的Southern印迹分析。从MVA-ΔIL1βR(道1)或MVA(道2)侵染的细胞提取基因组DNA，用EcoRI酶切，然后用琼脂糖凝胶电泳分离，再转移到尼龙膜上。IL1βR基因位点特异的DNA片段被32P-dCTP标记的特异探针检出。(C)用MVA-ΔIL1βR(道1，4)，MVA(道2，5)或对照(道3，6)侵染并放射性标记的CEF细胞的裂解液中IL1βR蛋白的放射免疫沉淀反应。免疫沉淀用偶联到蛋白质A(Protein A，道1-3)上或没有偶联的琼脂糖(道4-6)的抗B15R的多克隆抗体进行。箭头指示IL1βR蛋白。(D，E)用高(D)或低(E)感染复数MVA-ΔIL1βR(■)或MVA(▲)侵染CEF细胞后病毒生长的分析。
[0052] 图3.在呼吸感染痘病毒小鼠模型上的病毒毒性分析。MVA，MVA-ΔIL1βR，CVA和8
WR侵染的特性。BALB/c小鼠(n＝10)用1×10IU MVA(◆)和MVA-ΔIL1βR(▲)，或
5 4
5×10PFU CVA(■)和3×10PFU WR(-)通过鼻内途径接种。每日监测体重(A)和体温(B)并用每组的平均值表示。
WR侵染的特性。BALB/c小鼠(n＝10)用1×10IU MVA(◆)和MVA-ΔIL1βR(▲)，或
5 4
5×10PFU CVA(■)和3×10PFU WR(-)通过鼻内途径接种。每日监测体重(A)和体温(B)并用每组的平均值表示。
[0053] 图4.疫苗诱导的CD8+T细胞的体外分析。用单剂量的MVA-ΔIL1βR，MVA或回复突变的病毒接种HHD小鼠。10天后脾细胞用HLA-A*0201限制的牛痘特异VP35#1(VP35#1)或流感M158-66(不相关对照)肽进行刺激。然后用EMA，PE-抗-CD8，APC-抗-CD62L和FITC-抗-IFNγ或-抗-NTFα或分别FITC标记的同型对照进行染色。细胞用流式细胞仪在VP35#1特异肽，激活(CD62Llow)CD8+T细胞的存在下进行分析。诱导的T细胞反应负 正的放大用在活的(EMA )和CD8 的细胞群中分泌细胞因子的CD8+T百分率表示。分别用MVA-ΔIL1βR( )，MVA(■)或MVA-ΔIL1βR-Rev(//)接种的每组12只小鼠用平均值表示，误差柱表示标准误差x1.96，p值(p＝0.07)用学生t检验确定。
[0054] 图5.在呼吸感染痘病毒小鼠模型上诱导的疫苗保护分析。BALB/c小鼠(n＝10)4 5 6 7
用10(▲)、10(-)、10(□)、10(△)IU的MVA-ΔIL1βR(A、C)或MVA(B、D)肌肉内免
6
疫。接种三周后的动物鼻内用1×10PFU WR进行侵染挑战。每日监测单个动物的体重(A、B)和病症表现(C、D)，并用每组平均值表示。被空白接种(◆)和空白侵染挑战(■)的小鼠作为对照。
用10(▲)、10(-)、10(□)、10(△)IU的MVA-ΔIL1βR(A、C)或MVA(B、D)肌肉内免
6
疫。接种三周后的动物鼻内用1×10PFU WR进行侵染挑战。每日监测单个动物的体重(A、B)和病症表现(C、D)，并用每组平均值表示。被空白接种(◆)和空白侵染挑战(■)的小鼠作为对照。
[0055] 图6.疫苗诱导的记忆CD8+T细胞体外分析和在HHD小鼠上疫苗诱导的长期保护8
作用分析。(A)小鼠被用10IU单剂量的MVA-ΔIL1βR或MVA进行腹膜内接种。六个月后，脾细胞用HLA-A*0201限制牛痘特异VP35#1肽刺激或用MVA侵染以确定牛痘特异的总CD8+或CD4+反应。细胞用EMA、PE-抗-CD8、APC-抗-CD62L和FITC-抗-IFNγ或分别FITC标low
记的同型对照进行染色。细胞用流式细胞仪在VP35#1肽或牛痘特异的激活的(CD62L )的CD8+T细胞或牛痘特异的CD4+T细胞的存在下进行分析。用MVA-ΔIL1βR( )或MVA(■)接种后，6只小鼠的平均值被描述，误差柱表示标准误差x1.96，p值(p＝0.01)用学生t
8
检验确定。(B)HHD小鼠(n＝5)用10IU的MVA-ΔIL1βR(△)或MVA(□)腹膜内免疫。
7
接种后的小鼠在6个月时用1×10PFU WR侵染挑战。每天监测存活状况，并用每组鼠的存活动物百分率表示。被空白接种(◆)和空白侵染(■)的小鼠作为对照。
作用分析。(A)小鼠被用10IU单剂量的MVA-ΔIL1βR或MVA进行腹膜内接种。六个月后，脾细胞用HLA-A*0201限制牛痘特异VP35#1肽刺激或用MVA侵染以确定牛痘特异的总CD8+或CD4+反应。细胞用EMA、PE-抗-CD8、APC-抗-CD62L和FITC-抗-IFNγ或分别FITC标low
记的同型对照进行染色。细胞用流式细胞仪在VP35#1肽或牛痘特异的激活的(CD62L )的CD8+T细胞或牛痘特异的CD4+T细胞的存在下进行分析。用MVA-ΔIL1βR( )或MVA(■)接种后，6只小鼠的平均值被描述，误差柱表示标准误差x1.96，p值(p＝0.01)用学生t
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检验确定。(B)HHD小鼠(n＝5)用10IU的MVA-ΔIL1βR(△)或MVA(□)腹膜内免疫。
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接种后的小鼠在6个月时用1×10PFU WR侵染挑战。每天监测存活状况，并用每组鼠的存活动物百分率表示。被空白接种(◆)和空白侵染(■)的小鼠作为对照。
[0056] 图7.疫苗诱导的记忆CD8+T细胞体外分析和在非转基因鼠中疫苗诱导的长期保8
护作用分析。(A)用10IU单剂量的MVA-ΔIL1βR或MVA腹膜内接种C57BL/6小鼠。6个月后用MVA侵染脾细胞以测定牛痘特异性的总CD8+或CD4+反应。细胞用EMA，PE-抗-CD8，APC-抗-CD62L和FITC-抗-IFNγ或分别FITC标记的同型对照进行染色。细胞通过流低
式细胞仪在牛痘特异的、激活的(CD62L )的CD8+T细胞或牛痘特异的CD4+T细胞存在下进行分析。在用MVA-ΔIL1βR(■)或MVA( )接种后，6只小鼠的平均值被描述，误差柱表示标准误差x1.96，p值(p＝0.01)用学生t检验确定。(B)BALB/c小鼠(n＝4)用
5 6
10(▲)、10(□)或107(△)IU的MVA-ΔIL1βR或MVA鼻内免疫。接种四个月后动物
7
鼻内用1×10PFU WR侵染挑战。每日监测单个动物的体重，用每组平均值表示。被空白接种(◆)和空白侵染(■)的小鼠作为对照。
护作用分析。(A)用10IU单剂量的MVA-ΔIL1βR或MVA腹膜内接种C57BL/6小鼠。6个月后用MVA侵染脾细胞以测定牛痘特异性的总CD8+或CD4+反应。细胞用EMA，PE-抗-CD8，APC-抗-CD62L和FITC-抗-IFNγ或分别FITC标记的同型对照进行染色。细胞通过流低
式细胞仪在牛痘特异的、激活的(CD62L )的CD8+T细胞或牛痘特异的CD4+T细胞存在下进行分析。在用MVA-ΔIL1βR(■)或MVA( )接种后，6只小鼠的平均值被描述，误差柱表示标准误差x1.96，p值(p＝0.01)用学生t检验确定。(B)BALB/c小鼠(n＝4)用
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10(▲)、10(□)或107(△)IU的MVA-ΔIL1βR或MVA鼻内免疫。接种四个月后动物
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鼻内用1×10PFU WR侵染挑战。每日监测单个动物的体重，用每组平均值表示。被空白接种(◆)和空白侵染(■)的小鼠作为对照。
具体实施方式
[0057] 下面的实施例是为了使本发明能被更好地理解。而不是给大家一个本发明只限于实施例的主题的印象。
[0058] 材料和方法
[0059] 病毒和细胞牛痘病毒菌株西里瑟夫、CVA和MVA(克隆的隔离群F6，在鸡成纤维细胞(CEF)中传代的第582代得到)被用于本研究。采用标准方法使病毒增殖和滴度测定。为生产疫苗制剂，将病毒通过蔗糖超速离心进行常规的纯化，然后重溶于pH9.0的1mM Tris溶液中。CEF和兔肾RK-13(ATCCCCL-37)细胞用含有10％胎牛血清(FCS)的最低必需培养基(MEM)在37℃、5％CO2的条件下生长。
[0060] 质粒转移质粒pΔK1L-184R带有两个DNA片段，代表MVA ORF 184R(核苷酸位置162021-163001，GenBank U94848)的两翼序列，并被插在质粒pΔK1L的多克隆位点1和
2(Staib等2000)。标注为侧翼184-1的片段由486-bp的MVA-DNA序列组成，该序列起始于ORF 184R的5’端，终止于用于ORF 184R翻译的起始密码子。另一个片段，侧翼184-2是MVA-DNA的544-bp的PCR片段，从184R的翻译终止密码子延伸到184R基因的3’端的基因间的区域。
2(Staib等2000)。标注为侧翼184-1的片段由486-bp的MVA-DNA序列组成，该序列起始于ORF 184R的5’端，终止于用于ORF 184R翻译的起始密码子。另一个片段，侧翼184-2是MVA-DNA的544-bp的PCR片段，从184R的翻译终止密码子延伸到184R基因的3’端的基因间的区域。
[0061] 牛痘病毒MVA的遗传修饰如前所述，突变体MVA是通过瞬时的基于K1L寄主范6
围选择方法而得到的(Staib等2000)。简言之，为了产生缺失突变病毒，1×10 长满的单层CEF细胞用每细胞0.01IU的感染复数(MOI)的MVA侵染细胞。侵染90分钟后，细胞用TM
1.5μg的质粒pΔK1L-184R DNA采用制造商所推荐FUGENE (Roche，德国曼海姆)进行转染。侵染48小时后，收获转染的细胞，铺在在单层RK-13细胞上面，进行生长选择。突变体病毒从RK-13细胞上通过克隆分离出来，然后在CEF细胞上传代以除去选择标记基因K1L。
围选择方法而得到的(Staib等2000)。简言之，为了产生缺失突变病毒，1×10 长满的单层CEF细胞用每细胞0.01IU的感染复数(MOI)的MVA侵染细胞。侵染90分钟后，细胞用TM
1.5μg的质粒pΔK1L-184R DNA采用制造商所推荐FUGENE (Roche，德国曼海姆)进行转染。侵染48小时后，收获转染的细胞，铺在在单层RK-13细胞上面，进行生长选择。突变体病毒从RK-13细胞上通过克隆分离出来，然后在CEF细胞上传代以除去选择标记基因K1L。
[0062] PCR和Southern印迹法分析病毒DNA从侵染的CEF细胞分离基因组病毒DNA，用寡聚核苷酸分别在侧翼区184-1和184-2(对1)或分别在侧翼184-1和184R编码区内(对2)退火进行PCR分析(Staib等，2000)。在退火温度为52℃(对1)或50℃(对2)下，进行30个PCR循环将特异DNA片段扩增。
[0063] 另外，从病毒侵染细胞分离的总DNA用EcoRI酶解，用含0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，并转到Hybond TM-N膜(Amersham，德国弗赖堡)上，并与由PCR片段构成的探针杂交，32
该片段来源于用[α- P]CTP标记的184R-侧翼1序列。预杂交和杂交根据Sambrook等(Southern 1975，Sambrook等，1989)的方法进行。印迹用柯达BioMax胶片曝光。
该片段来源于用[α- P]CTP标记的184R-侧翼1序列。预杂交和杂交根据Sambrook等(Southern 1975，Sambrook等，1989)的方法进行。印迹用柯达BioMax胶片曝光。
[0064] 病毒侵染细胞裂解液的放射性免疫沉淀长在6孔组织培养板中的CEF细胞用20复侵染单位的MVA侵染。侵染2小时后，病毒接种物被含5％透析过的胎牛血清和每毫升35
50μCi的[ S]甲硫氨酸的不含甲硫氨酸的最低必需培养基替换，并在37℃孵育过夜。细胞在含有0.15M NaCl，0.01M Tris-HCl(pH 7.4)，1％Triton X-100的RIPA缓冲液中裂解，用AcB15R兔多抗(Alcami&Smith，1992)孵育14小时，然后用50％蛋白A-琼脂糖悬浮。免疫复合物用RIPA缓冲液洗涤，重悬于Laemmli缓冲液中，然后蛋白用10％SDS凝胶电泳分离。
50μCi的[ S]甲硫氨酸的不含甲硫氨酸的最低必需培养基替换，并在37℃孵育过夜。细胞在含有0.15M NaCl，0.01M Tris-HCl(pH 7.4)，1％Triton X-100的RIPA缓冲液中裂解，用AcB15R兔多抗(Alcami&Smith，1992)孵育14小时，然后用50％蛋白A-琼脂糖悬浮。免疫复合物用RIPA缓冲液洗涤，重悬于Laemmli缓冲液中，然后蛋白用10％SDS凝胶电泳分离。
[0065] 病毒生长分析为了确定低或高的复性生长特性，长满的CEF细胞单层(在6孔板里生长)分别用0.05侵染单位或每细胞10IU MVA或突变体MVA侵染。在37℃病毒吸附60分钟后，接种物被除去。细胞用RPMI 1640洗两次，然后用含10％胎牛血清的新鲜RPMI
1640于37℃，5％CO2的培养箱中培养。在侵染后多个时间点，收获侵染的细胞，病毒通过冻融和短暂超声而释放。所得裂解液的连续稀释液被铺在生长在6孔板中的长满的CEF细胞单层上作为两个的重复。侵染后48小时，细胞单层用1∶1丙酮∶甲醇液简单固定，并用抗牛痘兔多抗(IgG fraction，Biogenesis Ltd，Poole，England，Cat.No.9503-2057，1∶1000稀释于含3％胎牛血清的PBS中)孵育60分钟。然后用偶联辣根过氧化酶的羊抗兔多抗(Dianova，德国汉堡，1∶1000稀释于含3％胎牛血清的PBS中)孵育45分钟。用PBS洗后，抗体标记的细胞用o-邻联二茴香胺(Sigma，德国的Taufkirchen)底物溶液染色，计数染色的细胞病灶，计算病毒滴度，记为IU/ml。
1640于37℃，5％CO2的培养箱中培养。在侵染后多个时间点，收获侵染的细胞，病毒通过冻融和短暂超声而释放。所得裂解液的连续稀释液被铺在生长在6孔板中的长满的CEF细胞单层上作为两个的重复。侵染后48小时，细胞单层用1∶1丙酮∶甲醇液简单固定，并用抗牛痘兔多抗(IgG fraction，Biogenesis Ltd，Poole，England，Cat.No.9503-2057，1∶1000稀释于含3％胎牛血清的PBS中)孵育60分钟。然后用偶联辣根过氧化酶的羊抗兔多抗(Dianova，德国汉堡，1∶1000稀释于含3％胎牛血清的PBS中)孵育45分钟。用PBS洗后，抗体标记的细胞用o-邻联二茴香胺(Sigma，德国的Taufkirchen)底物溶液染色，计数染色的细胞病灶，计算病毒滴度，记为IU/ml。
[0066] 体液牛痘病毒反应从被MVA、突变体MVA或牛痘病毒CVA免疫了的小鼠得到的血清样品通过ELISA和中和抗体实验对牛痘病毒蛋白的抗体进行评价。牛痘抗原特异附着的滴度用ELISA测定，其中用蔗糖梯度离心纯化的MVA(蛋白浓度为1μg/ml)包被Maxisorp板(Nunc，德国)，于37℃处理3小时，然后4℃过夜。板用含0.05％Tween 20和10％胎牛血清的PBS于37℃封闭60分钟。血清样品的系列稀释液于37℃孵育60分钟，用PBS洗5次，用碱性磷酸酶偶联的鼠抗(1∶1000稀释于PBS)孵育30分钟。接着洗涤5次，板用pNPP底物(Sigma，德国)于37℃孵育20分钟，光密度用ELISA读数仪于405nm波长处测定。
[0067] 用重组MVA-LZ通过空斑减数分析法(plaque reduction assay)测定牛痘病毒特异中和抗体。血清的两倍系列稀释液与200侵染单位的MVA-LZ混合于总体积为200μl的PBS中，37℃孵育2小时。然后，如前所述(Drexler等，1998)，一式两份的长满的CEF细胞单层(在24孔板上生长)被侵染，侵染48小时后，病毒侵染细胞的病灶用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-半乳吡喃糖苷底物(X-Gal，RocheMolecular Biochemicals，德国曼海姆)染色。对蓝色病灶进行计数，并将每个血清样品所得的数目与小鼠免疫前血清或培养基对照进行比较。抗体的滴度被计算为病灶数目减少50％的系列的两倍稀释度。
[0068] 细胞牛痘病毒反应为了监测肽特异的急性期和记忆期CD8+T细胞反应，制备-6来自牛痘病毒免疫的HHD小鼠的脾细胞，并与10 M结合A*0201肽混合孵育5小时。2TM
小时后，加入最终浓度为1μg/ml的布雷菲德菌素A(GolgiPlug ；PharMingen Becton Dickinson)。然后，细胞储存于4℃冰上或直接用PBS/1％BSA/1μg/ml溴乙啡啶单叠氮溴化物(EMA；Molecular Probes)活/死细胞染色，并用结合5μg/ml纯化的抗CD16/CD32(Fc TM
Block ；PharMingenBecton Dickinson)非特异的FcγIII和-II介导的受体封闭，4℃作用20分钟。用PE-抗-CD8(53-6.9)和APC-抗-CD62L(Mel-14)对细胞表面染色，4℃作TM
用30分钟。透化(Cytofix/Cytoperm Kit，PharMingen Becton Dickinson)细胞后，用FITC-抗-IFNγ(XMG1.2)或FITC-抗-TNFα(MP6-XT22)或分别FITC标记的IgG1同型对照(R3-34)(均为PharMingen Becton Dickinson出品)染胞内细胞因子，4℃作用30分钟。
TM
脾细胞用四色流式细胞仪(FACSCalibur )和CellQest软件(二者均为Becton Dickinson出品)进行分析。
小时后，加入最终浓度为1μg/ml的布雷菲德菌素A(GolgiPlug ；PharMingen Becton Dickinson)。然后，细胞储存于4℃冰上或直接用PBS/1％BSA/1μg/ml溴乙啡啶单叠氮溴化物(EMA；Molecular Probes)活/死细胞染色，并用结合5μg/ml纯化的抗CD16/CD32(Fc TM
Block ；PharMingenBecton Dickinson)非特异的FcγIII和-II介导的受体封闭，4℃作用20分钟。用PE-抗-CD8(53-6.9)和APC-抗-CD62L(Mel-14)对细胞表面染色，4℃作TM
用30分钟。透化(Cytofix/Cytoperm Kit，PharMingen Becton Dickinson)细胞后，用FITC-抗-IFNγ(XMG1.2)或FITC-抗-TNFα(MP6-XT22)或分别FITC标记的IgG1同型对照(R3-34)(均为PharMingen Becton Dickinson出品)染胞内细胞因子，4℃作用30分钟。
TM
脾细胞用四色流式细胞仪(FACSCalibur )和CellQest软件(二者均为Becton Dickinson出品)进行分析。
[0069] 动物模型接种实验采用6-8周雌性转基因HHD+/+β2m-/-Db-/-小鼠(HHD)(Pascolo等，1997)或6-8周雌性BALB/c或C57BL/6小鼠。用0.5ml病毒疫苗腹膜内接种HHD小鼠，免疫后10天或180天监测限制的HLA-A*0201T细胞反应。为进行保护分析实验，动物用0.1-0.5ml病毒疫苗经肌肉内或腹膜内接种。免疫后3周或6个月，麻醉动物，用30μl磷酸盐缓冲液稀释的西里瑟夫牛痘病毒鼻内侵染动物。然后，如前所述，每天测定个体体重、对病症表现记分以监测发病率和死亡率，至少监测3周。将有严重的全身性感染和30％体重下降的动物处死。将体重的平均变化计算为感染后每天每组动物平均体重的百分率。用电子实验动物监测系统(BioMedic Data Systems，Marywood，NJ)监测动物体温，该系统用皮下植入的微芯片无电池的发射机应答器和DAS-5004袖珍扫描仪采集数据。体温的平均变化通过从每个随后的时间点的体温减去感染前(-3到0)每组基础体温而得到。
[0070] 结果
[0071] 从MVA基因组缺失IL1βR编码序列为了分析在MVA侵染过程中IL1βR基因表达的可能作用，我们构建了缺失开放阅读框(ORF)184R(IL1βR)的MVA敲出突变体。在MVA基因组中病毒IL1βR的编码序列和它的假定启动子序列是MVA基因组中很保守的序列。等同于以前表征的牛痘病毒毒株西里瑟夫的IL1βR，预测的MVA多肽以99％的一致性水平含326个氨基酸(2、5、34)。用PCR方法，我们扩增了184R编码序列的上游和下游的DNA片段，并将这些片段插入到缺失载体pΔK1L中(图1)，该载体含有牛痘病毒K1L基因作为选择标记。用pΔK1L-184R转染MVA侵染的细胞，通过同源重组184R翼区允许K1L标记基因插入，和同时在MVA基因组中的IL1βR基因编码序列缺失。所得的病毒在RK-13细胞上选择，其中K1L的功能对于MVA的生长是必需的。克隆纯化的突变体病毒分离后，K1L标记框通过在CEF细胞上传代而除去，从而得到最后的突变体病毒MVA-ΔIL1βR(图1)。
[0072] 突变体病毒MVA-ΔIL1βR的分子特性和完全的体外复制性分离MVA缺失突变体后，我们首先希望确定在基因水平IL1βR编码序列被正确除去。我们用邻近IL1βR基因位点的MVA基因组序列特异的寡聚核苷酸引物通过PCR方法对被野生型或突变型MVA侵染的细胞抽提的病毒DANN进行分析。PCA从野生型MVA模板特异扩增2.1-kb DNA片段，而在从MVA-ΔIL1βR侵染的细胞分离的DNA扩增得到1.1-kb的PCA产物，这与缺失ORF 184R后期望的分子量降低是一致的(图2A)。进一步的，用限制性内切酶EcoRI酶解病毒DNA，用Southern印迹法分析揭示含有IL1βR基因位点的DNA片段。为了确定该PCR数据，我们在缺失突变体MVA-ΔIL1βR的基因组DNA中找出了一个约1.3kb较低分子量的EcoR I酶切片段(图2B)，再次确定了目标ORF 184R序列的正确缺失。在第二步中，我们希望证明在MVA侵染过程中IL1βR蛋白的产生，并证明产生的突变体不能合成该肽。因此，我们用被MVA或MVA-ΔIL1βR侵染的，代谢标记的CEF细胞裂解物，用IL1βR特异的多抗做免疫沉淀实验(图2C)。在用野生型MVA侵染的细胞裂解物中抗血清沉淀一个45kDz的特异蛋白，与牛痘病毒WR侵染的细胞中发现的IL1βR多肽的糖基化产品相当(2)然而该病毒没有在空侵染或MVA-16ΔIL1βR侵染的细胞中发现，说明所产生的缺失突变不能产生IL1βR产物。下一步我们希望评估与野生型MVA比突变体MVA-ΔIL1βR的复制能力。在侵染CEF细胞后，我们发现有相当的新病毒后代产生，一步(图2D)和多步(图2E)病毒生长动力学特性是一致的。这些数据清楚的表明MVA ORF184R的失活病毒在体外的繁殖。
[0073] MVA-ΔIL1βR高剂量呼吸侵染小鼠的无毒性一个重要的问题是不能生产病毒IL1βR蛋白是不是影响在体内MVA的侵染结果。以前用牛痘病毒WR毒株缺失突变体在小鼠上的研究工作显示，或者是鼻内侵染后呼吸疾病的增强(2)，或者是颅内侵染后降低毒力(34)。更严重的呼吸侵染显示与发烧反应的诱导和IL-1βR作为主要内源热源中和病毒IL-1β的功能性活性相关(3)。因此我们用小鼠鼻内侵染测试了突变体病毒MVA-ΔIL1βR。在这种小鼠模型上疾病的严重程度反应在体重的变化和疾病的特异症状的出现(3，12，28，29，43)。另外由于发热反应可能出现，所以我们希望监测体温的变化。我8
们将芯片发射机应答仪植于BALB/c小鼠皮下以便计算机读取数据，一周后用10IU MVA或
5 4
MVA-ΔIL1βR或5×10PFU复制完全的牛痘病毒CVA或3×10PFU西里瑟夫(WR)作为对照侵染动物，并且每天监测动物，持续3周(图3)。用MVA或突变体MVA-ΔIL1βR侵染没有引起任何显著病症表现。然而用复制完全的病毒CVA或WR侵染引起显著的体重降低(图
3A)和严重的病症表现，也反映在体温的降低(图3B)。用MVA侵染的动物在整个监测期体温保持稳定。以上这些数据显示MVA基因组中IL1βR基因的缺失保留了MVA减毒的表型。
们将芯片发射机应答仪植于BALB/c小鼠皮下以便计算机读取数据，一周后用10IU MVA或
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MVA-ΔIL1βR或5×10PFU复制完全的牛痘病毒CVA或3×10PFU西里瑟夫(WR)作为对照侵染动物，并且每天监测动物，持续3周(图3)。用MVA或突变体MVA-ΔIL1βR侵染没有引起任何显著病症表现。然而用复制完全的病毒CVA或WR侵染引起显著的体重降低(图
3A)和严重的病症表现，也反映在体温的降低(图3B)。用MVA侵染的动物在整个监测期体温保持稳定。以上这些数据显示MVA基因组中IL1βR基因的缺失保留了MVA减毒的表型。
[0074] 接种MVA-ΔIL1βR引起的早期免疫反应有特别的兴趣评估缺失免疫调节基因IL1βR在MVA免疫产生性方面会有哪些可能的影响。首先，我们用单剂量的MVA或缺失突变体接种HLA-A*0201转基因鼠并直接体外监测急性期免疫反应，用正痘病毒特异的LA-A*0201限制肽抗原决定部位VP35#1检测牛痘病毒特异的CD8+T细胞诱导反应(12)。用FACS分析从接种动物新鲜制备的脾细胞，我们能够测得在用MVA-ΔIL1βR免疫后
0.4-2.45％的激活的CD8+T细胞，而用MVA免疫的动物的IFNγ释放的CD8+T细胞的水平为0.16-0.82％。我们对每组12只鼠进行了VP35#1特异T细胞诱导分析，其中一组是用回复突变病毒MVA-IL1βRRev接种的。图4描述了这几组接种动物间的不同，虽然在统计没有显著地显示出MVA-ΔIL1βR能引起较高水平的T细胞免疫产生的趋势(p＝0.07)。重要的是用回复突变病毒MVA-IL1βRRev接种引起的T细胞反应与MVA野生型引起的反应相当。
0.4-2.45％的激活的CD8+T细胞，而用MVA免疫的动物的IFNγ释放的CD8+T细胞的水平为0.16-0.82％。我们对每组12只鼠进行了VP35#1特异T细胞诱导分析，其中一组是用回复突变病毒MVA-IL1βRRev接种的。图4描述了这几组接种动物间的不同，虽然在统计没有显著地显示出MVA-ΔIL1βR能引起较高水平的T细胞免疫产生的趋势(p＝0.07)。重要的是用回复突变病毒MVA-IL1βRRev接种引起的T细胞反应与MVA野生型引起的反应相当。
[0075] MVA-ΔIL1βR免疫的保护能力在发现MVA-ΔIL1βR突变体病毒能引起稍高水平的VP35#1特异肽CD8+T细胞反应后，我们希望确定MVA和MVA缺失突变体在保护能力方面可能的不同。为此，我们采用了最近建立的小鼠模型，用不同剂量的MVA疫苗肌肉内对每组小鼠接种，在免疫后3周用牛痘病毒WR进行致死的鼻内侵染挑战(图5)(12)。侵染后每天5
监测动物的体重(图5A、B)和症状(图5C、D)，持续3周。两种MVA疫苗在10 或更高剂量
4
下免疫时能完全保护所有小鼠，而在10 或更小剂量下所有动物死亡。此模型的优点是所用疫苗的施加剂量引起的接种保护作用可用不同组的平均体重变化来表示。这里我们得到用MVA或MVA-ΔIL1βR疫苗免疫的不同组小鼠具有非常相似的体重曲线(图5A、B)。当我们监测侵染后典型病症表现时(图5C、D)这些结果得到进一步证实，随着剂量的增加在相应的组中病症表现有相似的减弱。因此，在免疫接种后3周内MVA和MVA-ΔIL1βR显示相似的引起免疫保护反应的能力，与我们发现的急性阶段免疫反应相似的结果是一致的。
监测动物的体重(图5A、B)和症状(图5C、D)，持续3周。两种MVA疫苗在10 或更高剂量
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下免疫时能完全保护所有小鼠，而在10 或更小剂量下所有动物死亡。此模型的优点是所用疫苗的施加剂量引起的接种保护作用可用不同组的平均体重变化来表示。这里我们得到用MVA或MVA-ΔIL1βR疫苗免疫的不同组小鼠具有非常相似的体重曲线(图5A、B)。当我们监测侵染后典型病症表现时(图5C、D)这些结果得到进一步证实，随着剂量的增加在相应的组中病症表现有相似的减弱。因此，在免疫接种后3周内MVA和MVA-ΔIL1βR显示相似的引起免疫保护反应的能力，与我们发现的急性阶段免疫反应相似的结果是一致的。
[0076] MVA-ΔIL1βR接种改善T细胞记忆反应和长期保护能力对IL-1系统不同成分缺陷的小鼠研究显示，在体内炎症细胞因子IL1β的成熟形式具有多种功能(33)。IL1功能研究的一个热点领域是阐明在保护T细胞免疫方面细胞因子可能的重要作用，包括呈现细胞和记忆T细胞专用抗原的激活(16，17)。为了研究病毒IL1βR的失活是否影响记忆T细8
胞反应的形成，我们用10IUMVA-ΔIL1βR或MVA接种HLA-A*0201转基因(HHD)鼠，并在初免疫后监测其病毒特异T细胞6个月以上。免疫后的后几次用我们的ICS/FACS标准方法可以检测到较低水平(0.30-0.60％)的VP35#1特异记忆T细胞(11)。一种用刺激脾细胞的肽过夜孵育的改进的方法可以注意到在急性反应期更显著的抗原特异的CD8+T细胞数量，该数量常常超过用我们常规的方法检测到的激活T细胞量。这里，在用MVA-ΔIL1βR免疫的动物中，我们测得明显的较高水平(达5.8％)的反应的VP35#1以及IFN-γ释放脾脏CD8+T记忆细胞，而与之相比，在用非重组MVA免疫的动物中只达到1.6％抗原决定部位特异的分泌的IFN-γCD8+T细胞(图6A)。这种有利于MVA-ΔIL1βR的免疫的区别存在统计的显著差异(p＝0.01)，有趣的是来源于这组免疫动物的脾细胞也含有更多的牛痘特异的CD8+记忆T细胞，而源于MVA-ΔIL1βR和MVA接种的动物的CD4+T细胞的平均
8
水平是相当的。为了监测记忆T细胞反应的不同是否引起保护作用的改变，我们用10IU
7
MVA-ΔIL1βR或MVA单次腹膜内接种HHD小鼠，6个月后用10PFU牛痘病毒西里瑟夫毒株鼻内侵染(图B)。结果侵染8天内，空白免疫对照的动物出现呼吸道病症状、体重降低和死亡。用野生型MVA免疫的动物也出现呼吸道病症状和明显的体重降低。但这些动物被部分保护，因为有3/5的动物免于死亡。明显地，用MVA-ΔIL1βR免疫的动物都受到保护(5/5)，从较少的体重减少和较轻的病症表现也很好地反映了这一点(数据没有显示)。这些结果显示用MVA-ΔIL1βR进行免疫确实对保护免疫反应的持久性有影响。HHD小鼠模型使我们能够对抗原决定部位特异的限制的HLA-A*0201的CD8+T细胞反应进行方便的分析，然而，可能由于它们是鼠MHC类型I敲除表型，这些鼠产生相当低的总CD8+T细胞(但产生正常的CD4+T细胞水平)(11)。因为这种表型可能影响总的牛痘特异T细胞反应的分析，我们用MVA-ΔIL1βR或MVA接种正常的C57BL/6小鼠，并测定其诱导的总CD8+记忆T细胞(图7A)。再次地与常规MVA接种比较，我们在用MVA-ΔIL1βR免疫的动物中发现显著(p＝0.001)更多的牛痘特异CD8+T细胞。这些数据强烈显示MVA-ΔIL1βR能够更好的诱导或保持牛痘病毒特异CD8+T细胞记忆。为了更细致的研究MVA-ΔIL1βR免疫的长期有效性，我们决定再用已经很好建立的非转基因BALB/c小鼠的模型进行免疫测试(5，11)。
我们选用鼻内接种作为MVA免疫的途径，与肌肉内免疫或腹膜免疫比较，结果产生较低水平的循环病毒特异抗体，当我们分析T细胞免疫的潜在保护能力时这可能是一种优势。我
5 7 7
们用10 至10IU MVA-ΔIL1βR或MVA接种BALB/c鼠。免疫4个月后我们用10PFU的牛痘病毒西里瑟夫毒株呼吸侵染动物(图7B)。重要的是所有接受MVA-ΔIL1βR疫苗的动
7
物在用病毒侵染后均存活下来，并且接种10IU MVA-ΔIL1βR的这组动物体重平均降低小
5
于15％，病症表现也很轻(数据没有显示)。相反观察到用10IU MVA免疫的动物对严重的
6 7
疾病没有保护作用而全部死亡(Fisher精确检验p＝0.029)，用更高剂量(10，10IU)的MVA免疫时能可保护动物不死，但引起大于20％的体重降低和严重的病症表现(数据没有显示)。
胞反应的形成，我们用10IUMVA-ΔIL1βR或MVA接种HLA-A*0201转基因(HHD)鼠，并在初免疫后监测其病毒特异T细胞6个月以上。免疫后的后几次用我们的ICS/FACS标准方法可以检测到较低水平(0.30-0.60％)的VP35#1特异记忆T细胞(11)。一种用刺激脾细胞的肽过夜孵育的改进的方法可以注意到在急性反应期更显著的抗原特异的CD8+T细胞数量，该数量常常超过用我们常规的方法检测到的激活T细胞量。这里，在用MVA-ΔIL1βR免疫的动物中，我们测得明显的较高水平(达5.8％)的反应的VP35#1以及IFN-γ释放脾脏CD8+T记忆细胞，而与之相比，在用非重组MVA免疫的动物中只达到1.6％抗原决定部位特异的分泌的IFN-γCD8+T细胞(图6A)。这种有利于MVA-ΔIL1βR的免疫的区别存在统计的显著差异(p＝0.01)，有趣的是来源于这组免疫动物的脾细胞也含有更多的牛痘特异的CD8+记忆T细胞，而源于MVA-ΔIL1βR和MVA接种的动物的CD4+T细胞的平均
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MVA-ΔIL1βR或MVA单次腹膜内接种HHD小鼠，6个月后用10PFU牛痘病毒西里瑟夫毒株鼻内侵染(图B)。结果侵染8天内，空白免疫对照的动物出现呼吸道病症状、体重降低和死亡。用野生型MVA免疫的动物也出现呼吸道病症状和明显的体重降低。但这些动物被部分保护，因为有3/5的动物免于死亡。明显地，用MVA-ΔIL1βR免疫的动物都受到保护(5/5)，从较少的体重减少和较轻的病症表现也很好地反映了这一点(数据没有显示)。这些结果显示用MVA-ΔIL1βR进行免疫确实对保护免疫反应的持久性有影响。HHD小鼠模型使我们能够对抗原决定部位特异的限制的HLA-A*0201的CD8+T细胞反应进行方便的分析，然而，可能由于它们是鼠MHC类型I敲除表型，这些鼠产生相当低的总CD8+T细胞(但产生正常的CD4+T细胞水平)(11)。因为这种表型可能影响总的牛痘特异T细胞反应的分析，我们用MVA-ΔIL1βR或MVA接种正常的C57BL/6小鼠，并测定其诱导的总CD8+记忆T细胞(图7A)。再次地与常规MVA接种比较，我们在用MVA-ΔIL1βR免疫的动物中发现显著(p＝0.001)更多的牛痘特异CD8+T细胞。这些数据强烈显示MVA-ΔIL1βR能够更好的诱导或保持牛痘病毒特异CD8+T细胞记忆。为了更细致的研究MVA-ΔIL1βR免疫的长期有效性，我们决定再用已经很好建立的非转基因BALB/c小鼠的模型进行免疫测试(5，11)。
我们选用鼻内接种作为MVA免疫的途径，与肌肉内免疫或腹膜免疫比较，结果产生较低水平的循环病毒特异抗体，当我们分析T细胞免疫的潜在保护能力时这可能是一种优势。我
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们用10 至10IU MVA-ΔIL1βR或MVA接种BALB/c鼠。免疫4个月后我们用10PFU的牛痘病毒西里瑟夫毒株呼吸侵染动物(图7B)。重要的是所有接受MVA-ΔIL1βR疫苗的动
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物在用病毒侵染后均存活下来，并且接种10IU MVA-ΔIL1βR的这组动物体重平均降低小
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[0077] MVA ORF 184R编码一个牛痘病毒的可溶IL-1β的受体，该受体可能具有阻止侵染引起的发炎和热源寄主反应的功能。从病毒基因组中去除假定的免疫逃逸基因是一种可能的进一步阐述这些调节病毒蛋白在活体内病毒生活周期中的作用的方法(1)。此外，对诸如MVA的适合作用活体病毒疫苗的病毒研究的应用可能直接导致具有适合改进特性的第二代疫苗的产生。即使分子工程技术能够得到精确的突变(35，36)，但突变病毒的表型是不可预测的，MVAIL1βR基因的失活可作为进一步的例子。我们发现184R ORF的失活对MVA突变体病毒在体外的复制能力没有影响，这应该是相当不意外的，因为没有源于牛痘病毒WR的突变体生长缺陷型被报道过(2)。而高水平扩增的能力是病毒可能作为疫苗产品的最重要的特性。另外应该注意到在另一个表达病毒干扰素反应基因E3L缺陷的MVA突变体中，我们最近在适合MVA疫苗培养的CEF中发现一个非常不希望的寄主范围表型(15)。当然研究在体内MVA-ΔIL1βR的性质更有意思。用MVA-ΔIL1βR侵染引起IL1β的活性不被阻止可能引起更强的炎症反应和发热反应，结果使接种起到反作用。一个更乐观的方案中我们预测IL1β活性可能是局部受限的，并可能以辅助的方式影响MVA免疫的潜力。
用MVA-ΔIL1βR鼻内侵染BALB/c鼠，即使用高剂量，并且尽管该鼠模型系统显示出非常适合于评估病毒侵染引起的炎症反应潜在致病的结果，我们也没有检测到呼吸病症状(3，28，
30)。用MVA-ΔIL1βR侵染后我们没有检测到致病作用可能是其它牛痘病毒调节或免疫调节基因被片段化或缺失的特定MVA基因型的结果(5)。也可能是用牛痘病毒IL1βR缺失突变体免疫情况下所观察到的疾病的增强要求鼻内侵染后病毒的体内复制活性。正如最近的资料证实MVA不能在小鼠(27)或猕猴(39)中大量复制，我们的资料显示用MVA-ΔIL1βR瞬时一步侵染可能不足以由IL1β活性引起不利的全身发烧或炎症反应。在第一个免疫反应实验中我们发现在早期总的抗牛痘病毒抗体或T细胞反应方面MVA和MVA-ΔIL1βR具有相同的特性。数据很好地证实接种3周后用致死的牛痘病毒进行侵染挑战，两种病毒对动物具有几乎同样的保护能力。特别有趣的是当监测牛痘病毒抗原决定部位特异的T细胞反应时，我们证明了MVA-ΔIL1βR的免疫优势。H3L基因产品产生的抗原决定部位VP35#1是一个免疫支配的HLA-A*0201限制T细胞特征的靶标，并可用于在抗原决定部位特异方式中检测病毒特异的CD8+T细胞诱导(10，12)。相反，总的牛痘病毒特异反应的大量分析提供一幅基于大量不同T细胞特征的典型图画，但可能不能评价单个T细胞群活性的微秒变化。
猜测在T细胞激活方面的可能作用，我们也选择评估VP35#1特异T细胞记忆反应，该反应我们以前已经发现在HLA-A*0201转基因鼠接种6个月后仍然能够检测到(12)。确实，我们在MVA-ΔIL1βR接种后观察到一个更显著的VP35#1特异T细胞反应的增强(p＝0.01)。此外，我们进一步的发现显示MVA-ΔIL1βR免疫确实具有长期有益作用。在转基因HHD鼠中我们第一次注意到增加的总CD8+T细胞反应，更重要的是免疫非转基因C57BL/6鼠后我们观察到显著增强的总CD8+T细胞(p＝0.001)。另外，在HLA-A*0201转基因鼠和正常BALB/c鼠中我们发现了对抵抗牛痘病毒WR的致死呼吸侵染具有更高的保护能力。在IL1β功能的前后关系中怎样解释增强的免疫作用？有趣的是，两篇最近的研究Leishmania major侵染易感或抗性小鼠的研究结果显示，树突细胞(DC)分泌IL1α或IL1β的能力与保护的Th1免疫的诱导间特异相关(13，42)。另外最近的证据显示IL1β是诱导鼠科动物DC成熟的，Fas配体的主要调节者(14)。同一研究证明鼠科动物DC的成熟可被IL1β中和抗体的应用而完全消除，该中和抗体可能以与可溶牛痘病毒IL1βR分子相似的作用方式行使功能。
因此，用MVA-ΔIL1βR免疫使IL1β的中和能力失去可能导致改善的DC作为抗原呈现细胞的功能，这可能导致更好的T细胞记忆反应。相似的用IL1β刺激内皮细胞导致ICOS-L介导的记忆T细胞的激活(17)。IL1β的这种活性可能是我们发现的MVA-ΔIL1βR免疫出现广泛的改善记忆T细胞反应的功能基础。另外在免疫的早期，我们没有发现MVA野生型或突变型疫苗在体内保护能力方面的不同。这可能也表明在去除抗病毒记忆T细胞反应方面病毒IL1βR可能具有特别作用。不然我们可能不能在对可能的免疫诱导T细胞反应的峰值水平进行早期体外分析时测得病毒IL1βR在病毒特异T细胞免疫表达方面更普遍的作用，并且我们不能确定保护能力的不同可能是由于免疫后早期几周时高水平抗体介导的免疫的影响。在保护用有毒的牛痘病毒进行致死呼吸侵染挑战中病毒特异抗体的重要作用已被清楚地阐明(6)，在B细胞缺乏的小鼠中完全保护的MVA免疫表明T细胞免疫可能对免疫病毒特异抗体反应的缺乏有补偿作用(44)。病毒IL1βR能够显著特异地下调抗病毒CD8+T细胞记忆反应的能力在最近的一篇对人类(用常规的野生型牛痘病毒接种后)免疫病毒特异记忆T细胞的反应的数据中显得很诱人，在人类CD4+细胞较CD8+T细胞显现出更好的持久性(4)。总之，我们的分析使我们将病毒IL1βR基因的缺失作为开发新一代基于MVA的疫苗的第一步。在体外繁殖缺失突变体MVA-ΔIL1βR可能获得高病毒滴度，并且没有证据显示在体内侵染中高剂量的MVA-ΔIL1βR在耐受性方面比野生型病毒差。我们对于MVA-ΔIL1βR具有改善的疫苗特性的发现是特别有前途的，因为它为通过合理的基因工程技术获得更有效的MVA疫苗的可能性提供了第一证据。
用MVA-ΔIL1βR鼻内侵染BALB/c鼠，即使用高剂量，并且尽管该鼠模型系统显示出非常适合于评估病毒侵染引起的炎症反应潜在致病的结果，我们也没有检测到呼吸病症状(3，28，
30)。用MVA-ΔIL1βR侵染后我们没有检测到致病作用可能是其它牛痘病毒调节或免疫调节基因被片段化或缺失的特定MVA基因型的结果(5)。也可能是用牛痘病毒IL1βR缺失突变体免疫情况下所观察到的疾病的增强要求鼻内侵染后病毒的体内复制活性。正如最近的资料证实MVA不能在小鼠(27)或猕猴(39)中大量复制，我们的资料显示用MVA-ΔIL1βR瞬时一步侵染可能不足以由IL1β活性引起不利的全身发烧或炎症反应。在第一个免疫反应实验中我们发现在早期总的抗牛痘病毒抗体或T细胞反应方面MVA和MVA-ΔIL1βR具有相同的特性。数据很好地证实接种3周后用致死的牛痘病毒进行侵染挑战，两种病毒对动物具有几乎同样的保护能力。特别有趣的是当监测牛痘病毒抗原决定部位特异的T细胞反应时，我们证明了MVA-ΔIL1βR的免疫优势。H3L基因产品产生的抗原决定部位VP35#1是一个免疫支配的HLA-A*0201限制T细胞特征的靶标，并可用于在抗原决定部位特异方式中检测病毒特异的CD8+T细胞诱导(10，12)。相反，总的牛痘病毒特异反应的大量分析提供一幅基于大量不同T细胞特征的典型图画，但可能不能评价单个T细胞群活性的微秒变化。
猜测在T细胞激活方面的可能作用，我们也选择评估VP35#1特异T细胞记忆反应，该反应我们以前已经发现在HLA-A*0201转基因鼠接种6个月后仍然能够检测到(12)。确实，我们在MVA-ΔIL1βR接种后观察到一个更显著的VP35#1特异T细胞反应的增强(p＝0.01)。此外，我们进一步的发现显示MVA-ΔIL1βR免疫确实具有长期有益作用。在转基因HHD鼠中我们第一次注意到增加的总CD8+T细胞反应，更重要的是免疫非转基因C57BL/6鼠后我们观察到显著增强的总CD8+T细胞(p＝0.001)。另外，在HLA-A*0201转基因鼠和正常BALB/c鼠中我们发现了对抵抗牛痘病毒WR的致死呼吸侵染具有更高的保护能力。在IL1β功能的前后关系中怎样解释增强的免疫作用？有趣的是，两篇最近的研究Leishmania major侵染易感或抗性小鼠的研究结果显示，树突细胞(DC)分泌IL1α或IL1β的能力与保护的Th1免疫的诱导间特异相关(13，42)。另外最近的证据显示IL1β是诱导鼠科动物DC成熟的，Fas配体的主要调节者(14)。同一研究证明鼠科动物DC的成熟可被IL1β中和抗体的应用而完全消除，该中和抗体可能以与可溶牛痘病毒IL1βR分子相似的作用方式行使功能。
因此，用MVA-ΔIL1βR免疫使IL1β的中和能力失去可能导致改善的DC作为抗原呈现细胞的功能，这可能导致更好的T细胞记忆反应。相似的用IL1β刺激内皮细胞导致ICOS-L介导的记忆T细胞的激活(17)。IL1β的这种活性可能是我们发现的MVA-ΔIL1βR免疫出现广泛的改善记忆T细胞反应的功能基础。另外在免疫的早期，我们没有发现MVA野生型或突变型疫苗在体内保护能力方面的不同。这可能也表明在去除抗病毒记忆T细胞反应方面病毒IL1βR可能具有特别作用。不然我们可能不能在对可能的免疫诱导T细胞反应的峰值水平进行早期体外分析时测得病毒IL1βR在病毒特异T细胞免疫表达方面更普遍的作用，并且我们不能确定保护能力的不同可能是由于免疫后早期几周时高水平抗体介导的免疫的影响。在保护用有毒的牛痘病毒进行致死呼吸侵染挑战中病毒特异抗体的重要作用已被清楚地阐明(6)，在B细胞缺乏的小鼠中完全保护的MVA免疫表明T细胞免疫可能对免疫病毒特异抗体反应的缺乏有补偿作用(44)。病毒IL1βR能够显著特异地下调抗病毒CD8+T细胞记忆反应的能力在最近的一篇对人类(用常规的野生型牛痘病毒接种后)免疫病毒特异记忆T细胞的反应的数据中显得很诱人，在人类CD4+细胞较CD8+T细胞显现出更好的持久性(4)。总之，我们的分析使我们将病毒IL1βR基因的缺失作为开发新一代基于MVA的疫苗的第一步。在体外繁殖缺失突变体MVA-ΔIL1βR可能获得高病毒滴度，并且没有证据显示在体内侵染中高剂量的MVA-ΔIL1βR在耐受性方面比野生型病毒差。我们对于MVA-ΔIL1βR具有改善的疫苗特性的发现是特别有前途的，因为它为通过合理的基因工程技术获得更有效的MVA疫苗的可能性提供了第一证据。
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