【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、牛受精卵の体外胚発生方法、そのために使用する添加剤、及び該添加剤の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】牛受精卵の体外胚発生は牛の効果的な繁殖のための有用な手段である。 しかしながら、この方法においては、８細胞期から１６細胞期で発生が停止することが一般的に知られている（ Wright 及びBondioli :
J. Anim. Sci. 53 ; 702-729（1981))。 個体においては受精の起こる場所は卵管であることから、８細胞期から１６細胞期の停止を解除するために種々の動物の卵管組織を外科的に体外に取り出し、受精卵をそれら卵管内で培養する方法が開発された。 ウシ受精卵をウサギ卵管組織（Boland : Theriogenology 21 ; 126-137（1984))
やヒツジ卵管組織（Eyestoneら、: Theriogenology, 28
; 1-24 (1987)）と一時的に体外培養することにより桑実胚や胚盤胞までに発生させることに成功した。 しかしながらこの方法は、卵管組織を毎回外科的に取り出すため、手法が複雑で長時間かかり、そして卵管組織の個体差により胚発生効率が変動するという欠点を有する。

【０００３】より改善された方法として、種々の培養された体細胞と受精卵の共培養系が開発されてきた。 卵丘細胞や顆粒膜細胞とウシ受精卵の共培養により、受精卵の発生促進が報告されている（Kajiharaら: Jpn. J. An
im. Reprod. 33 , 173-180 (1987)，Gotoら: J.Reprod.
Fert. 83 , 753-758 (1988)., Fukuda ら． : Biol. Repr
od. 42 , 114-119 (1990)) 。 Heymanら（Theriogenology
: 27 , 59-68 (1987)) は、栄養芽細胞小胞（trophobl
astic vesicles）を用いて、またEyestoneら（Therioge
nology : 27 , 228 Abstr. (1987))は、卵管細胞との共培養においてウシ受精卵の桑実胚や胚盤胞への発生を報告している。 しかし、これらの共培養系はすべて血清培地中で行われている。

【０００４】さらにEystone 及びFirst （J. Reprod. F
ert : 85 , 715-720 (1989)) は、過排卵処理で得られた５〜８細胞の受精卵を血清添加培地で培養されたウシ卵管上皮細胞の培養上清中で体外培養を試みた。 培養上清液のみでも卵管上皮細胞との共培養系と同程度の良好な胚発生が認められた。 この結果から卵管上皮細胞は胚発生に必須の因子を合成しかつ培養液中に分泌していることが示唆された。

【０００５】しかしながら、上記の家畜胚の体外培養はいずれも動物の血清や牛血清アルブミンなどの血清画分を含有する培地中で行われている。 しかしながら、血清や血清アルブミンの化学的組成は不明であるばかりでなくロットにより、また血清画分の調整により胚発生におよぼす生物活性は大きく変動するなどの難点がある（Ka
ne及びHeadon : J. Reprod. Fert. 60 , 469-475 (1980)
; Fukui及びOno J. Reprod. Fert. 86 , 501-506 (198
9)) 。 また血清は非常に高価であること、またしばしば動物血清の中にはウィルスやマイコプラズマに汚染されているものもあり受精卵の発生に悪影響をもたらすこともある。

【０００６】最近、血清を用いない無血清培養系でも牛胚の発生が進むことがわかってきた。 すなわち、Elling
ton ら（Biol. Reprod. 43 , 97-104 (1990))は、牛卵管上皮細胞との共培養系でグルコースを添加せず、高濃度の牛血清アルブミン（５mg／ml）を添加した無血清培地（ＣＺＢ培地）で、過排卵処理によって得た牛受精卵の胚盤胞までの発生が起こることを報告している。

【０００７】卵管上皮細胞と胚の共培養系で、黄体ホルモン、卵胞刺激ホルモンそしてエストラジオールを添加した無血清培地では、受精率、胚の発生率ともに上昇することがわかった（Saeki ら : Biol. Reprod. 44 , 25
6-260, (1991))。 コラーゲン処理した培養シャーレに上皮成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン、トランスフェリン添加の無血清培地では、卵丘細胞の著しい増殖が見られ、卵丘細胞と胚の共培養系で胚の発生が有為に上昇することが報告されている（Takagiら : Theriogenology,
35 , 1197-1207,(1991)) 。

【０００８】Pinyopummintr and Bavister（Biol. Repr
od. 45 , 736-742 (1991)) は、体外成熟／体外受精で得られた牛胚の胚盤胞への発生が血清培地より低率ではあるが、成分既知物質よりなる無血清培地でも起こることを示した。 彼らはＴＣＭ１９９培地に１０％仔牛血清を添加した培地では胚盤胞形成率が２９．７％であるのに対して、ハムスター胚発生培地として開発した成分既知無血清培地（HECM; Schini and Bavister, Biol. Repro
d. 39 , 1183-1192,(1988)) でも、胚盤胞への発生率が９．７％と低い胚盤胞形成率であるが発生が起こることを示した。

【０００９】コラゲナーゼ、ストロメリシン、ゼラチナーゼなどいわゆるメタロプロテイナーゼは、細胞外マトリックスの消化に関係ある酵素で、これらの酵素は結合織の組織再構成に重要であることが知られている。 これらメタロプロテイナーゼのインヒビターとして血清中の主要なメタロプロテイナーゼインヒビターであるα ₂ −
マクログロブリンやそれより分子量の小さい Tissue in
hibitor of metallo proteinase （ＴＩＭＰ）などが知られている（Travis and Salvesen : Annu. Rev. Bioch
em. 52, 655-709,(1983); De Clerck ら：J. Biol. Che
m. 264 , 17445-17453, (1989))。 最近ＴＩＭＰが卵胞液中（Curry ら : Endocrinology, 123, 1611-1618 (198
8)), 顆粒膜細胞（Mannら： Endocrinology, 128, 1825
-1832, (1991)) に存在していることが判明し、排卵時の卵胞破裂に密接に関与する因子と考えられている。 しかしＴＩＭＰの胚に対する生理的役割についての報告はない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、無血清培地中で牛受精卵からの胚発生を行う手段を提供しようとするものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、顆粒膜細胞を無血清培地中で長期にわたって培養することに成功し、こうして得られた無血清培地由来の培養上清を含有する無血清培地中で牛受精卵を培養すれば胚発生を行うことができるという全く新しい知見を得た（特願平３−３４３８
４）。 本発明者は、さらに前記培養上清中の胚発生のための有効成分を探求した結果、それがメタロプロテイナーゼインヒビターであることを見出し、本発明を完成した。

【００１２】従って本発明は、組成が明らかな無血清培地中メタロプロテイナーゼインヒビターの存在下で牛受精卵を体外培養することを特徴とする胚発生方法を提供する。 本発明はまた、顆粒膜細胞を無血清培地中で培養し、そして培養上清からメタロプロテイナーゼインヒビターを採取することを特徴とする、メタロプロテイナーゼインヒビターの製造方法を提供する。 本発明はさらに、メタロプロテイナーゼインヒビターを含んで成る、
牛受精卵からの体外胚発生のための培地用添加剤を提供する。

【００１３】

【具体的な説明】本発明の方法に用いる牛受精卵は任意の常法に従って得ることができるが、屠殺された成牛卵巣から未成熟卵を得、これを体外で成熟させた後、体外で受精を行うのが便利である。

【００１４】未成熟卵の体外成熟法はすでによく知られており、例えばFukudaら（Biol, Reprod. 42 114-119
(1990))に記載されている。 このための培地としては、
ＴＣＭ１９９，１０％胎児牛血清等を使用することができ、一般に約３８〜３９℃、好ましくは３８．５℃、５
％炭酸ガス／９５％空気中で加湿環境中で行われる。 具体的な一例を実施例１に記載する。 体外受精の方法もよく知られており、例えばFukui (Mol. Reprod. Dev. 26
40-46 (1990))に記載されている。

【００１５】受精卵の培養、すなわち胚発生のための本発明の好ましい方法においては、受精卵／顆粒膜細胞を約１日間培養した後受精卵を裸化し、この裸化受精卵をメタロプロテイナーゼインヒビターを含有する培地中で培養する。 ２〜３日毎に培地を置換する。 上記の培養は通常３８℃〜３９℃、好ましくは３８．５℃にて、５％
炭酸ガス／９５％空気中で加湿環境で行なわれる。 通常７〜８日間の培養の後受精卵は胚盤胞に達する。

【００１６】本発明によれば、顆粒膜細胞の培養は無血清培地、特に組成が明らかな培地中で行われ、好ましくは基礎培地に成長因子を補充した培地が用いられる。 基礎培地としては市販の組織培養培地ＴＣＭ１９９（日水製薬）（Morganら、Proc. Soc. Exp. Biol. 73 , 1 (195
0)) 等が用いられる。 ５００ng／mlのアプロチニンを含有するＴＣＭ１９９をＩＦＰ１１０培地と称し、これが特に好ましい培地である。 培地はさらに、インシュリン、またはヘパリン結合細胞成長因子（ＨＢＧＦ−２）
を含有するのが、効力の高い培養上清を得るために好ましい。

【００１７】顆粒膜細胞培養上清を得るための好ましい培養方法においては、顆粒膜細胞をまず牛胎児血清を含有する培地、例えば牛胎児血清１０％を含有する市販のＤＭＥ：Ｆ１２（１：１）（ＤＭＥ／Ｆ１２と略す場合がある）中で培養して十分増殖させた後、単層状態に増殖した細胞を前記無血清培地で十分に洗浄し、次に新たな無血清培地を添加して培養する。 例えば４８時間毎に無血清培地を回収交換することにより培養上清を得ることができる。 こうして得られた培養上清から、実施例４
に記載する方法によりメタロプロテイナーゼインヒビターを回収、精製することができる。

【００１８】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 実施例１． 屠場未成熟卵の回収と成熟培養法屠殺後３時間以内に採取された成牛卵巣を、プラスチックバッグに入れ、まわりを３０℃−３４℃の温水で暖めて実験室に運び、実験に供した。 卵巣をＴＣＭ１９９液に２５mM HEPES，ポリビニールアルコール（１００μｇ
／ml）、１．２５mMピルビン酸ナトリウム、ヘパリン（１５μｇ／ml）及び抗生物質ゲンタマイシン（１０μ
ｇ／ml）を含む培地の入った直径１００mmシャーレの中に移した。

【００１９】外科用ハサミで２分された卵巣を、多刀の外科用ナイフで細かく切開し、顆粒膜細胞の付着した卵子を回収し実験に用いた。 採取された卵子／顆粒膜細胞複合体をＴＣＭ１９９液で２回洗浄し、各々約３０個の卵子／顆粒膜細胞複合体を３５０μｌの成熟培地（ＴＣ
Ｍ１９９液、重炭酸ナトリウム（２mg／ml）、１０％胎児牛血清）に入れ、それぞれの成熟培地のドロップをミネラルオイルでカバーした。 成熟培養は３８．５℃で５
％炭酸ガス／９５％空気の加湿したインキュベーター内で２０〜２２時間行なった。

【００２０】 実施例２． 体外受精市販の黒毛和牛凍結精液（０．５ml）を３５℃の温水中で融解し、遠心管にこの精液を入れ、５mMカフェイン及びヘパリン（１５μｇ／ml）を含み牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含まないＢＯ培地（６ml）（Brackett and
Oliphant ; Biol. Reprod. 12 : 260-274 (1975))を加えて混合した。 この混合液を７分間２，２００回転で遠心分離し、上澄み液を捨てた。 この精子洗浄操作をさらに１回同様に行なった。 その後血球計算盤を用いて精子の濃度を１０ ⁷個／mlに調整した。

【００２１】この精子液５０μｌを５mMカフェイン及び脂肪酸フリーのＢＳＡ（１０mg／ml）を含むＢＯ培地５
０μｌ中に加えた。 ２１〜２３時間成熟培養した卵を、
上記の培地で３回洗浄後、精子浮遊液中に入れ、３８．
５℃で５％炭酸ガス／９５％空気の加湿インキュベーター内で６時間培養することにより受精させた。 受精の時のＢＯ液中の濃度は、精子５×１０ ⁶個／ml、５mMカフェインン、ヘパリン（７．５μｇ／ml）、ＢＳＡ（５mg
／ml）であった。

【００２２】受精卵はＩＦＰ１１０の発生培地で２回洗浄した後、３５０μｌの発生培地の各スポットを作り、
受精卵をこの発生培地の中に移した。 シャーレは卵丘／
顆粒膜細胞の増殖を促進するためにタイプＩコラーゲンを最終濃度１５０μｇ／mlになるようにＴＣＭ１９９液で調整し、室温で１時間インキュベートしてから培養に用いた。 受精卵はそれぞれの発生培地中で２４時間培養後、毛細管様ピペットを用いて、受精卵の回りに付着している卵丘／顆粒膜細胞を裸化した。 得られた裸化受精卵を、３５０μｌのそれぞれの試験用発生培地に移し、
３８．５℃で５％炭酸ガス／９５％空気の加湿されたインキュベーター内で培養した。 試験用培地は、体外受精後３日目に培地交換を行ない、胚の発生状況は、１２日目まで毎日顕微鏡を用いて観察し調べた。

【００２３】 実施例３． 牛顆粒膜細胞の培養と培養上清の回収方法屠場で採取された成牛卵巣を生理的リン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ ^- ）の中に入れて実験室に持ち帰った。 卵巣を３回Ｐ
ＢＳ ^-液で洗浄した後、外科用ナイフを用いて卵胞を切開し、顆粒膜細胞の付着した卵をシャーレに回収した。
パスツールピペットを用いて顕微鏡下で観察しながら顆粒膜細胞の付着した卵子をよりわけた。 遠心管に顆粒膜細胞の付着した卵子を移し、ＰＢＳ ^-液中でピペッティングを行ない顆粒膜細胞浮遊液を調整した。 この浮遊液にＰＢＳ ^-液を加えて１，５００回転、５分間の遠心操作を３回行ない顆粒膜細胞を回収した。 ＤＭＥ：Ｆ１２
（１：１）（ＤＭＥ／Ｆ１２）の培地に１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）添加した血清培地で細胞浮遊液を作り、２
−３×１０ ⁵個の細胞を３５mmシャーレに移し、同じ培地で培養を行なった。

【００２４】顆粒膜細胞を単離する別法として、卵巣を外科用ナイフで切開し、卵胞より卵子／顆粒膜細胞の複合体を取り出し、この複合体をＴＣＭ１９９液の入った遠心管内に移し、１，５００rpm 、５分間の遠心操作を３回繰り返し洗浄した後、ＤＭＥ／Ｆ１２に１０％ＦＣ
Ｓの入った血清培地で細胞浮遊液を調整し、培養底面積２５cm ²の培養用フラスコに移し培養した。

【００２５】初代培養された顆粒膜細胞がフラスコ底に完全に単層状態に細胞増殖した時、トリプシン液（２５
０μｇ／mlトリプシン、２００μｇ／mlＥＤＴＡをＰＢ
Ｓ ^-液で溶かした溶液）を処理し分散した顆粒膜細胞は、培養底面積７５cm ²の培養用フラスコに移し完全に単層状態になるまで培養した。 この細胞はトリプシン液処理後、同じ７５cm ²培養フラスコに３分割（１：３スプリット）され継代培養を行なった。

【００２６】培養上清の回収は継代培養を２〜５回繰り返した顆粒膜細胞を用いた。 この継代培養された細胞が完全に単層状態になった後、血清培地を除き３回ＴＣＭ
１９９液で洗浄した後、成分既知無血清培地（ＩＦＰ１
１０培地にインシュリン５μｇ／mlを添加した培地）で２４時間培養し、血清の影響を完全に除いた。 古い培養上清を除いた後、それぞれの実験で示された成分既知無血清培地を添加し、４８時間毎に培地交換を行ない培養上清を回収した。 回収した培養上清液は、３，０００回転で１５分間遠心操作を行い、沈殿を除き、上清を−８
０℃で保存した。 この上清中のタンパク質含量は４２μ
ｇ／mlであった。

【００２７】 実施例４． 胚発生促進因子としてのＴＩＭＰの精製方法牛顆粒膜細胞の無血清培地で回収された培養上清液１ｌ
を、直径９０mmのＹＭ−１０限界濾過膜（アミコン社製：分子量カットオフ １０，０００）で約１００倍濃縮し、全タンパク質の５６％を回収した。 この濃縮液はＰＢＳ ^-液で透析した後遠心して上清を回収し、ゲル濾過高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ−Ｇ３０００Ｓ
ＷＸＬ，トーソー製）にかけ、ＰＢＳ ^-液で溶出した。
溶出液はＵＶ−２８０nmの吸収でモニターし、各画分のタンパク質濃度は、Bradford法（Bradford, Anal. Bioc
hem, 72 , 248-254 (1976)) により測定した。

【００２８】溶出液を検定用培地により１０〜２０倍に希釈した後に胚発生促進活性を測定した。 溶出の結果を図１に示す。 胚発生促進活性は、おおよそ３万と７．５
万の２つの分子量域にみられた。 分子量約３万の胚発生促進活性をembryogenin-1 (EG-1)、また分子量約７．５
万の胚発生促進活性をembryogenin-2 (EG-2)と名づけた。

【００２９】なお、胚発生促進活性は次のようにして測定した。 実施例２に記載したようにして裸化受精卵を得、これを、被検体を加えた無血清培地（ＴＣＭ１９９
培地成分からTween-80とパラアミノ安息香酸を除き、グルコース濃度を１０００μｇ／mlから２００μｇ／mlに減量し、５mg／mlの脂肪酸フリー牛血清アルブミンを加えた培地）中で３８．５℃にて培養しながら１２日間顕微鏡観察し、胚盤胞形成率を求めた。

【００３０】次に、胚発生促進活性画分ＥＧ−１を、２
０mMトリス塩酸緩衝液、pH７．５で透析後、同じ緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑイオン交換高速液体クロマトカラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社）にのせ、このカラムに結合させた。 ０〜５００mM塩化ナトリウムの直線的濃度勾配法により溶出を行った。 このカラムによって溶出された成分を、ＰＢＳ ^-液で透析後、
胚発生促進活性を検討した。 この結果を図２に示す。 胚発生促進活性は塩化ナトリウム濃度１００mM〜１３０mM
にて溶出した。 このＭｏｎｏ−Ｑ高速液体クロマトカラムにより精製された活性の画分を、０．１％トリクロロフルオロ酢酸液で平衡化された後Ｖｙｄａｃ Ｃ−４逆相高速液体クロマトグラフィーカラム（The Separation
groups社）にのせ、アセトニトリル（２５％−４５
％）の直線的濃度勾配で溶出された。 溶出画分はすぐに真空乾燥した後、培地に溶かして胚発生促進活性を調べた。 図３に示すごとく、活性を単一ピークとして得ることができた。

【００３１】Ｃ ₄ −逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製された５００pMの分子量３．１万のＥＧ−１
画分を自動プロティンシークエンサーにかけ、アミノ酸配列を調べた。 胚発生促進活性は、単鎖ポリペプチド構造をもつタンパク質により与えられ、該蛋白質のＮ末端から２９番目までのアミノ酸配列が決定された。 この２
９個のアミノ酸配列をEuropean Molecular Biology Lab
oratory (Swiss-PROT)のデータベースより解析したところ、未同定の部分のシスティン（用いた自動プロティンシークエンサーではシスティン残基は解読できない）を含めて牛由来Tissue inhibitor of metalloproteinase
(TIMP)とアミノ酸配列の順序において、９３％の相同性が認められた（図４）。

【００３２】図１で示したゲル濾過高速液体クロマトグラフィーによって分画された溶出画分を、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、抗ＴＩＭ
Ｐモノクローナル抗体で検出した。 図５の分画番号は、
図１の保持時間１１分後から分取を開始し、１分ごとに分画を行った。 図５で示すように、分画番号１１（図１
の保持時間２１−２２分）と１２（図１の保持時間２２
−２３分）の分子量３．１万のＥＧ−１だけがこの抗体と免疫交差反応がおこった。 しかし、分子量７．５万のＥＧ−２（分画番号７）は、抗ＴＩＭＰモノクローナル抗体と免疫交差反応はおこらなかった。 この結果は、分子量３．１万のＥＧ−１が免疫学的にＴＩＭＰと同一の性質をもった物質と考えられる。

【００３３】顆粒膜細胞培養上清液中にＴＩＭＰが存在するのか、その上清液から精製されたＥＧ−１がＴＩＭ
Ｐと免疫学的に同一のものであるかどうか検討した。 Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動実験は、ｌａｎ
ｅＭは分子量マーカーを示し、ｌａｎｅ１は濃縮培養上清液とプロティン−Ｇファーストフローゲルを混合して得た沈殿分画、ｌａｎｅ２はその上清分画、３は培養上清液のＴＩＭＰモノクローナル抗体で処理した後プロティン−Ｇファーストフローゲルを混合して得た沈殿分画、ｌａｎｅ４はその上清分画、ｌａｎｅ５は精製されたＥＧ−１を示す。

【００３４】この図より精製されたＥＧ−１は分子量３．１万であることがわかった。 この電気泳動ゲルをニトロセルロース膜に転写してイミュノブロット実験を行った。 精製されたＥＧ−１はＴＩＭＰ抗体ときれいに交差反応をおこした（ｌａｎｅ５）。 同じく顆粒膜細胞培養上清液とＴＩＭＰモノクローナル抗体処理して凝集沈殿した分画（ｌａｎｅ３）に強い免疫交差反応がみられ、残りの上清分画（ｌａｎｅ４）中には反応がみられなかった。 また培養上清中の交差反応する物質は、ＥＧ
−１と同じ３．１万の物質のみであった。 ｌａｎｅ２はＴＩＭＰ抗体を処理しないコントロール分画で、イミュノブロット実験により交差反応を示した。

【００３５】濃縮顆粒膜細胞培養上清液をＴＩＭＰモノクローナル抗体で処理し、ＴＩＭＰの除去された濃縮培養上清液による胚発生促進活性を調べた（図７）。 ＴＩ
ＭＰ抗体処理または無処理の濃縮培養上清液を５％及び１０％の濃度になるように発生培地に加えたところ、抗体処理した培養上清液の胚発生促進活性は、無処理培養上清液にくらべて明らかに低下した。 この結果は、培養上清の胚発生促進活性は、抗ＴＩＭＰ抗体と中和反応を起こし、生物活性が抑制されることを示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、濃縮牛顆粒膜細胞の培養上清液をゲル濾過高速液体クロマトグラィーにより精製する場合の溶出の状態を示す。

【図２】図２は、図１で得られた分子量約３万のＥＧ−
１をＭｏｎｏ−Ｑイオン交換高速液体クロマトグラィーにより精製する場合の溶出の状態を示す。

【図３】図３は、図２で得られた活性画分をＣ ₄ −逆相高速液体クロマトグラィーにより精製する場合の溶出の状態を示す。

【図４】図４は、図３において完全精製されたＥＧ−１
とｂｏｖｉｎｅＴＩＭＰのアミノ酸配列の相同性を示す。

【図５】図５は、図１で精製されたＥＧ−１と抗ＴＩＭ
Ｐモノクローナル抗体によるイミュノブロット実験による免疫交差性を示す電気泳動図である。

【図６】図６は、顆粒膜細胞培養上清中にＴＩＭＰの存在、ＥＧ−１とＴＩＭＰの同一性についてのイミュノブロット実験による確認の結果を示す電気泳動図である。

【図７】図７は、濃縮顆粒膜細胞上清液を抗ＴＩＭＰモノクローナル抗体により処理した後の胚発生促進活性の変化を示すグラフである。