一株高产细菌纤维素的耐酸菌株及其生产细菌纤维素的方法
阅读：830发布：2020-05-11
专利汇可以提供一株高产细菌纤维素的耐酸菌株及其生产细菌纤维素的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 微 生物 技术领域，具体涉及一株高产细菌 纤维 素的耐酸菌株及其生产细菌 纤维素 的方法。本发明提供一株产细菌纤维素的驹形杆菌(Komagataeibacter sp.)ATC301，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17875。该菌株能够耐受酸性条件，在酸性条件下生长并高效生产细菌纤维素，同时该菌株可利用廉价易得的 发酵 原料通过静态或动态培养高效生产细菌纤维素，能够有效提高细菌纤维素的生产效率，降低细菌纤维素的生产成本，可适用于工业化大规模制造细菌纤维素。，下面是一株高产细菌纤维素的耐酸菌株及其生产细菌纤维素的方法专利的具体信息内容。
1.一株产细菌纤维素的驹形杆菌(Komagataeibacter sp.)ATC301，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17875。
2.包含权利要求1所述的驹形杆菌ATC301的菌剂。
3.权利要求1所述驹形杆菌ATC301或权利要求2所述菌剂在细菌纤维素生产中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为通过培养所述驹形杆菌ATC301获得细菌纤维素；所述培养的条件为28～32℃，pH 4.0～7.0。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述培养的条件为29～31℃，pH4.5～5.5。
6.权利要求1所述驹形杆菌ATC301或权利要求2所述菌剂在构建细菌纤维素生产菌株中的应用。
7.一种细菌纤维素的生产方法，其特征在于，其为利用权利要求1所述的驹形杆菌ATC301生产细菌纤维素。
8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，以包含葡萄糖和/或蔗糖的培养基作为发酵原料，将驹形杆菌ATC301进行动态发酵或静态发酵，获得所述细菌纤维素。
9.根据权利要求7或8所述的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将所述驹形杆菌ATC301接种于活化平板或斜面上，于28～32℃培养2～4天；
(2)种子培养：将步骤(1)中活化的驹形杆菌ATC301接种于种子培养基中，于28～32℃，振荡或搅拌培养至种子成熟；
(3)发酵培养：将所述驹形杆菌ATC301的成熟种子接种于发酵培养基中，于28～32℃，振荡、搅拌或静置培养。
10.根据权利要求9所述的生产方法，其特征在于，所述发酵培养的培养基包括如下组分：20～40g/L糖源，10～25g/L玉米浆，0.5～1g/L七水硫酸镁，0.5～1g/L磷酸二氢钾，pH
5.0～5.5；所述糖源为选自葡萄糖、蔗糖中的一种或两种；
和/或，
所述种子培养的培养基包括如下组分：10～30g/L糖源，5～15g/L玉米浆，1～2g/L酵母粉，0.1～0.5g/L七水硫酸镁，0.1～0.5g/L磷酸二氢钾，pH 5.0～5.5；所述糖源为选自葡萄糖、蔗糖中的一种或两种。
一株高产细菌纤维素的耐酸菌株及其生产细菌纤维素的方法
技术领域
背景技术
[0002] 细菌纤维素(Bacterial cellulose)是利用细菌发酵产生的纤维素，是葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的高分子聚合物。与植物纤维素相比，细菌纤维素具有高化学纯度、高结晶度、高弹性模量、高吸水性以及优异的生物相容和生物降解性能。因此，细菌纤维素有望广泛用于食品、医药、化妆品、造纸、纺织和化工等领域。
[0003] 目前已知有多个种属的细菌均能够发酵生产细菌纤维素，包括：葡糖醋酸杆菌(Gluconacetobacter)、醋酸杆菌(Acetobacter)、土壤杆菌(Agrobacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、肠杆菌(Enterobacter)等。其中，研究最多的当属木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)(陈竞等，细菌纤维素的制备和应用研究进展，纤维素科学与技术，201422(2)：58-63)。近年来基于重组DNA技术的代谢工程与合成生物学技术发展迅猛，也为细菌纤维素产生菌的遗传改造提供了理论基础和工具(例如：中国专利CN108060112A公开了一株遗传改造的细菌纤维素高产菌)。但是，从自然界直接筛选高产且不易染菌的、适合工业化生产的细菌纤维素生产菌不失为一种行之有效的菌种获取手段。
[0004] 虽然已知多种细菌均能够产生细菌纤维素，但目前细菌纤维素的工业化、大规模、低成本生产依然面临着诸多挑战，例如：营养要求高、产量低、易染菌等。工业化大规模的细菌纤维素生产对于生产菌株的提出更高的要求，具有优异的细菌纤维素生产性能、能够利用廉价原料(如葡萄糖、玉米浆等)，且在生产过程中不易染菌的生产菌株能够有效提高细菌纤维素的生产效率，降低细菌纤维素的生产成本。因此，亟需开发高效的细菌纤维素生产菌株。
发明内容
[0005] 为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一株高产细菌纤维素且耐酸的驹形杆菌(Komagataeibacter sp.)ATC301以及利用该菌株发酵生产细菌纤维素的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0007] 本发明提供一株产细菌纤维素的驹形杆菌(Komagataeibacter sp.)ATC301，该菌株于2019年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为驹形杆菌Komagataeibacter sp.，保藏编号为CGMCC No.17875。
[0008] 本发明提供的驹形杆菌(Komagataeibacter sp.)ATC301的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009] 本发明还提供包含所述驹形杆菌ATC301的菌剂。
[0010] 本发明中，所述包含驹形杆菌ATC301的菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂。所述包含驹形杆菌ATC301的菌剂可以采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
[0011] 本发明通过实验验证证明，驹形杆菌ATC301能够耐受酸性条件，并在酸性条件下高效生产细菌纤维素。
[0012] 进一步地，本发明提供所述驹形杆菌ATC301或含有所述驹形杆菌ATC301的菌剂在细菌纤维素生产中的应用。
[0013] 本发明还提供所述驹形杆菌ATC301或含有所述驹形杆菌ATC301的菌剂在酸性条件下、动态发酵或静态发酵生产细菌纤维素中的应用。
[0014] 上述应用为通过培养所述驹形杆菌ATC301获得细菌纤维素。
[0016] 上述培养驹形杆菌ATC301可以采用常规的含有碳源、氮源及无机离子的天然或合成培养基。
[0017] 本发明中，所述驹形杆菌ATC301的培养温度为28～32℃，pH为4.0～7.0。优选为29～31℃，pH为4.5～5.5。
[0018] 本发明通过实验证实，驹形杆菌ATC301能够耐受pH低至4.0的酸性条件并发酵产生细菌纤维素，其在pH为5.0的酸性条件下能够更高效地生产细菌纤维素。
[0019] 本发明还提供所述驹形杆菌ATC301或含有所述驹形杆菌ATC301的菌剂在构建细菌纤维素生产菌株中的应用。
[0020] 上述应用为利用驹形杆菌ATC301通过诱变、遗传改造等育种方法进行细菌纤维素生产菌的选育。
[0021] 本发明还提供一种细菌纤维素的生产方法，其为利用所述驹形杆菌ATC301生产细菌纤维素。
[0022] 具体地，以包含葡萄糖和/或蔗糖的培养基作为发酵原料，将驹形杆菌ATC301进行动态发酵或静态发酵，获得所述细菌纤维素。
[0023] 优选地，所述细菌纤维素的生产方法包括如下步骤：
[0024] (1)菌种活化：将所述驹形杆菌ATC301接种于活化平板或斜面上，于28～32℃培养2～4天；
[0026] (3)发酵培养：将所述驹形杆菌ATC301的成熟种子接种于发酵培养基中，于28～32℃，振荡、搅拌或静置培养。
[0028] 进一步优选地，上述步骤(2)中，所述种子培养的培养基包括如下组分：10～30g/L糖源，5～15g/L玉米浆，1～2g/L酵母粉，0.1～0.5g/L七水硫酸镁，0.1～0.5g/L磷酸二氢钾，pH 5.0～5.5；所述糖源为选自葡萄糖、蔗糖中的一种或两种。
[0029] 进一步优选地，上述步骤(3)中，所述发酵培养的培养基包括如下组分：20～40g/L糖源，10～25g/L玉米浆，0.5～1g/L七水硫酸镁，0.5～1g/L磷酸二氢钾，pH 5.0～5.5；所述糖源为选自葡萄糖、蔗糖中的一种或两种。
[0030] 进一步优选地，上述步骤(2)中，振荡培养的转速为100-200rpm。种子培养基的装液量为10～20％。种子培养时间为2～4天。
[0031] 进一步优选地，上述步骤(3)中，振荡培养的转速为100-200rpm。种子的接种量为5～10％。发酵培养基的装液量为10～20％。
[0032] 本发明的有益效果在于：本发明通过分离筛选获得驹形杆菌ATC301，该菌株能够耐受酸性条件，在pH低至4～5的酸性条件下生长并高效生产细菌纤维素，能够显著降低生产过程中的染菌风险；同时该菌株可利用廉价易得的发酵原料(如葡萄糖、蔗糖、玉米浆等)通过静态或动态培养高效生产细菌纤维素(而无需添加柠檬酸、醋酸、乳酸等高成本的有机酸作为发酵原料)，具有较高的转化率。本发明提供的驹形杆菌ATC301能够有效提高细菌纤维素的生产效率，降低细菌纤维素的生产成本，可适用于工业化大规模制造细菌纤维素。附图说明
[0033] 图1为本发明实施例2中ATC301菌株的16S rDNA序列的Blast比对结果。
[0034] 图2为本发明实施例3中细菌纤维素的红外吸收图谱。
具体实施方式
[0035] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 下述实施例中如无特殊说明，均为微生物常规无菌操作。
[0038] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039] 实施例1细菌纤维素产生菌的筛选
[0040] 本发明从醋醅中经大量筛选分离得到细菌纤维素高产耐酸菌株ATC301，每次筛选的具体方法包括如下步骤：
[0041] (1)取新鲜醋醅2g，加入5mL无菌水，充分混匀，制得醋醅悬浮液；
[0042] (2)取1mL悬浮液，加入装有49mL液体筛选培养基(20g/L葡萄糖，10g/L乙醇，20g/L玉米浆，1g/L七水硫酸镁，pH 5.0)的250mL三角瓶中，30℃静置培养3天，直至培养液表面形成一层半透明膜；
[0043] (3)无菌水漂洗半透明膜两次，转移至50mL无菌离心管，加入10mL无菌水，加入无菌玻璃珠，Vortex 5min，打碎半透明膜；
[0044] (4)取200μL悬液进行10倍梯度稀释，稀释至10万倍，每个稀释度取100μL涂布于固体筛选培养基平板(上述液体筛选培养基中加入15g/L琼脂粉，pH 5.0)；
[0045] (5)倒置平板于30℃静置培养3天，直至长出单菌落。挑选周边有透明区域的菌落20个反复划线培养3次，获得单菌落；
[0046] (6)取最后一次划线形成菌落形态均一的16块平板，挑单菌落于装有10mL液体筛选培养基(配方同上)的50mL三角瓶中，30℃静置培养3～4天，直至培养液表面形成一层半透明膜；
[0047] (7)不同菌株成膜所需时间和膜厚度有明显差异，取5株成膜快，成膜厚的菌株进行摇瓶振荡培养(培养基成分：30g/L葡萄糖，25g/L玉米浆，1g/L七水硫酸镁，1g/L磷酸二氢钾，pH 5.0，)，30℃培养3-4天，直至培养液中产生大量雪花团/块状物；
[0048] (8)根据湿重(离心后去上清的湿重)筛选菌株。
[0049] 最终筛选得到一株高产细菌纤维素的耐酸菌株，命名为ATC301，对该菌株进行后续的菌种鉴定和摇瓶发酵生产细菌纤维素实验。
[0050] 实施例2菌株ATC301的16S rDNA鉴定
[0051] 利用常规PCR技术，以引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTC AG)和1492R(TACGGCTACCTTGTTACGACTT)为引物对，以菌株ATC301的菌液为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测显示，扩增出1条约1.4kb的DNA片段。PCR反应体系及条件如表1所示：
[0052] 表1 16S rDNA的PCR扩增反应体系和条件
[0053]
[0054] 采用琼脂糖凝胶回收试剂盒，根据说明书操作，回收上述1.4kb的DNA片段，随后进行测序，去除两端低质量序列后，得到菌株ATC301的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示(全长1345bp)。
[0055] 将如SEQ ID NO.1所示的16S rDNA的序列在NCBI上进行BLAST，结果如图1所示，ATC301菌株的16S rDNA序列同Komagataeibacter属的多个物种的16S rDNA序列完全相同。鉴于此，ATC301菌株命名为Komagataeibacter sp.ATC301。ATC301菌株于2019年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为驹形杆菌Komagataeibacter sp.，保藏编号为CGMCC No.17875。
[0056] 实施例3 ATC301菌株产细菌纤维素的摇瓶发酵实验(1)
[0057] 在本实施例中，考察Komagataeibacter sp.ATC301菌株在酸性条件下(pH 5.0)、利用廉价易得的发酵原料(葡萄糖、蔗糖、玉米浆等)、在摇瓶中以动态培养方式发酵生产细菌纤维素的性能，具体方法如下：
[0058] (1)新鲜平板活化ATC301菌株：将甘油保存的ATC301菌株划线到新鲜配制的平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，5g/L葡萄糖，0.5g/L七水硫酸镁，pH 7.0)上，倒置平板于30℃静置培养2-3天至菌落长出。
[0059] (2)摇瓶种子的制备：用接种环从步骤(1)获得的活化平板上挑取2环菌接种到装有20mL种子培养基(10g/L葡萄糖，10g/L蔗糖，15g/L玉米浆，2g/L酵母粉，0.5g/L七水硫酸镁，0.5g/L磷酸二氢钾，pH 5.0)的100mL三角瓶中；30℃，150rpm，振荡培养3天，培养液中含有大量雪花团/块状物。
[0060] (3)摇瓶发酵：以10％的接种体积将步骤(2)的摇瓶种子接种到装有100mL发酵培养基(10g/L葡萄糖，20g/L蔗糖，25g/L玉米浆，1g/L七水硫酸镁，1g/L磷酸二氢钾pH 5.0)的500mL的发酵摇瓶中；30℃，150rpm，振荡培养3天。培养液中含有大量雪花团/块状物，即为细菌纤维素。
[0061] 进一步采用红外吸收鉴定细菌纤维素，具体方法如下：
[0063] 取适量上述得到的白色半透明膜测定其红外吸收，得到的红外吸收图谱如图2所示，其与文献报道的细菌纤维素红外吸收图谱吻合(Neera et al.,Appl Biochem Biotechnol,2015,176(4):1162-73)。
[0064] 将摇瓶发酵的培养物过300目不锈钢丝网，将截留物在80℃干燥至恒重，测定细菌纤维素的产量，结果显示，菌株ATC301摇瓶发酵72小时的细菌纤维素产量为2.4g/L，细菌纤维素相对于糖的转化率为8％。
[0065] 实施例4 ATC301菌株产细菌纤维素的摇瓶发酵实验(2)
[0066] 在本实施例中，考察Komagataeibacter sp.ATC301菌株在酸性条件下(pH 5.0)、利用廉价易得的发酵原料(葡萄糖、蔗糖、玉米浆等)、在摇瓶中以动态培养方式发酵生产细菌纤维素的性能，具体方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中种子培养基的配方如下：20g/L葡萄糖，15g/L玉米浆，2g/L酵母粉，0.5g/L七水硫酸镁，0.5g/L磷酸二氢钾，pH 5.0；
步骤(3)中，发酵培养基的配方如下：30g/L葡萄糖，25g/L玉米浆，1g/L七水硫酸镁，1g/L磷酸二氢钾，pH 5.0。
步骤(3)中，发酵培养基的配方如下：30g/L葡萄糖，25g/L玉米浆，1g/L七水硫酸镁，1g/L磷酸二氢钾，pH 5.0。
[0067] 将摇瓶发酵的培养物过300目不锈钢丝网，将截留物在80℃干燥至恒重后，测定细菌纤维素的产量，结果显示，菌株ATC301摇瓶发酵72小时的细菌纤维素产量为1.8g/L，细菌纤维素相对于糖的转化率为6％。
[0068] 实施例5 ATC301菌株产细菌纤维素的摇瓶发酵实验(3)
[0069] 在本实施例中，考察Komagataeibacter sp.ATC301菌株在酸性条件下(pH 5.0)、利用廉价易得的发酵原料(葡萄糖、蔗糖、玉米浆等)、在摇瓶中以动态培养方式发酵生产细菌纤维素的性能，具体方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中种子培养基的配方如下：20g/L蔗糖，15g/L玉米浆，2g/L酵母粉，0.5g/L七水硫酸镁，0.5g/L磷酸二氢钾，pH 5.0；步骤(3)中，发酵培养基的配方如下：30g/L蔗糖，25g/L玉米浆，1g/L七水硫酸镁，1g/L磷酸二氢钾，pH 5.0。
[0070] 将摇瓶发酵的培养物过300目不锈钢丝网，将截留物在80℃干燥至恒重测定细菌纤维素的产量，结果显示，菌株ATC301摇瓶发酵72小时的细菌纤维素产量为2.5g/L，细菌纤维素相对于糖的转化率为8.3％。
[0071] 以上结果表明，菌株Komagataeibacter sp.ATC301能够耐受酸性条件(pH 5.0)，并在酸性条件下(pH 5.0)、利用廉价易得的发酵原料(葡萄糖、蔗糖、玉米浆等)、动态发酵高产细菌纤维素。
[0072] 实施例6 ATC301菌株产细菌纤维素的摇瓶发酵实验(4)
[0073] 在本实施例中，考察Komagataeibacter sp.ATC301菌株在酸性条件下(pH 5.0)、利用廉价易得的发酵原料(葡萄糖、蔗糖、玉米浆等)、在摇瓶中以静态培养方式发酵生产细菌纤维素的性能，具体方法如下：
[0074] (1)新鲜平板活化ATC301菌株：将甘油保存的ATC301菌株划线到新鲜配制的平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，5g/L葡萄糖，0.5g/L七水硫酸镁，pH 7.0)上，倒置平板于30℃静置培养2-3天至菌落长出。
[0075] (2)摇瓶种子的制备：用接种环从步骤(1)获得的活化平板上挑取2环菌接种到装有20mL种子培养基(10g/L葡萄糖，10g/L蔗糖，15g/L玉米浆，2g/L酵母粉，0.5g/L七水硫酸镁，0.5g/L磷酸二氢钾，pH 5.0)的100mL三角瓶中；30℃，150rpm，振荡培养3天，培养液中含有大量雪花团/块状物。
[0076] (3)摇瓶发酵：以10％的接种体积将步骤(2)的摇瓶种子接种到装有100mL发酵培养基(10g/L葡萄糖，20g/L蔗糖，25g/L玉米浆，1g/L七水硫酸镁，1g/L磷酸二氢钾，pH 5.0)的500mL的发酵摇瓶中；30℃，静置培养3天，培养液表面含有一层1cm厚的凝胶态膜，即为细菌纤维素。
[0077] 进一步采用红外吸收鉴定细菌纤维素，具体方法如下：
[0078] 取5g湿重的凝胶态膜，用0.1M NaOH溶液80℃热处理2h，冷却后用0.1M HCl中和，然后用自来水冲洗干净，80℃干燥过夜，得到白色半透明的膜。
[0079] 取适量上述得到的白色半透明膜测定其红外吸收，得到的红外吸收图谱与文献报道的细菌纤维素红外吸收图谱吻合(Neera et al.,Appl Biochem Biotechnol,2015,176(4):1162-73)。
[0080] 将摇瓶发酵的培养物过300目不锈钢丝网，将截留物在80℃干燥至恒重测定细菌纤维素的产量，结果显示，菌株ATC301摇瓶发酵72小时的细菌纤维素产量为1.2g/L，细菌纤维素相对于糖的转化率为4％。
[0081] 结果表明，菌株Komagataeibacter sp.ATC301能够耐受酸性条件(pH 5.0)，并在酸性条件下(pH 5.0)、利用廉价易得的发酵原料(葡萄糖、蔗糖、玉米浆等)、静态发酵高产细菌纤维素。
[0082] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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