驹形杆菌属重组微生物，使用其生产纤维素的方法以及生产所述微生物的方法
阅读：747发布：2020-05-14
专利汇可以提供驹形杆菌属重组微生物，使用其生产纤维素的方法以及生产所述微生物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了一种驹形杆菌(Komagataeibacter)属 微 生物 ，所述微生物具有增强的 纤维 素生产能 力 和收率，一种通过使用其生产 纤维素 的方法，以及生产所述微生物的方法。，下面是驹形杆菌属重组微生物，使用其生产纤维素的方法以及生产所述微生物的方法专利的具体信息内容。
1.一种重组的驹形杆菌(Komagataeibacter)属微生物，所述微生物包含增加多聚磷酸激酶(PPK)的表达或其活性的基因修饰。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述基因修饰增加编码所述多聚磷酸激酶的基因的表达。
3.根据权利要求1所述的微生物，其中所述基因修饰增加编码所述多聚磷酸激酶的基因的拷贝数或者是对编码所述多聚磷酸激酶基因的表达调控序列的修饰。
4.根据权利要求1所述的微生物，其中所述多聚磷酸激酶属于EC 2.7.4.1。
5.根据权利要求1所述的微生物，其中所述多聚磷酸激酶在将NTP+(磷酸)n转化为NDP+(磷酸)n+1的可逆反应中针对逆向反应的催化活性高于针对正向反应的催化活性，以及NTP和NDP分别代表三磷酸核苷和二磷酸核苷。
6.根据权利要求5所述的微生物，其中所述多聚磷酸激酶在使用GDP、CDP或UDP作为底物的反应中与使用ADP相比将NDP转化为NTP具有较高催化活性，以及NTP和NDP分别代表三磷酸核苷和二磷酸核苷。
7.根据权利要求1所述的微生物，其中所述多聚磷酸激酶是与SEQ ID NO：44、46或48所示的氨基酸序列具有约85％或更高的序列同一性的多肽。
8.根据权利要求1所述的微生物，其中所述多聚磷酸激酶来自Silicibacter属或红细菌(Rhodobacterales)属。
9.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物与没有增加多聚磷酸激酶(PPK)的表达或活性的遗传修饰的相同类型的微生物相比，具有增强的纤维素生产能力。
10.根据权利要求1所述的微生物，所述微生物还包含增加磷酸果糖激酶(PFK)的表达或其活性的基因修饰。
11.根据权利要求10所述的微生物，其中所述基因修饰增加编码所述磷酸果糖激酶的基因的拷贝数或者是对编码所述磷酸果糖激酶基因的表达调控序列的修饰。
12.根据权利要求10所述的微生物，其中所述磷酸果糖激酶属于EC 2.7.1.11。
13.根据权利要求10所述的微生物，其中所述磷酸果糖激酶是与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有约90％或更高的序列同一性的多肽。
14.根据权利要求10所述的微生物，其中所述磷酸果糖激酶来自埃希氏杆菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、分枝杆菌(Mycobacterium)属、发酵单胞菌(Zymomonas)属或弧菌(Vibrio)属。
15.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物是木驹形杆菌(Komagataeibacter xylinus)。
16.一种生产纤维素的方法，所述方法包括:
在培养基中培养权利要求1所述的微生物以生产纤维素；以及
从培养物中收集所述纤维素。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述培养基包含乙醇或外源性纤维素。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述纤维素是羧基化纤维素。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述羧基化纤维素是羧基烷基纤维素。
20.一种生产具有增强的纤维素生产能力的微生物的方法，所述方法包括将编码多聚磷酸激酶的基因引入具有纤维素生产能力的微生物中。
21.根据权利要求19所述的方法，所述方法还包括将编码磷酸果糖激酶的基因引入所述微生物中。
驹形杆菌属重组微生物，使用其生产纤维素的方法以及生产
所述微生物的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2017年8月2日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请号10-2017-0098071和2017年11月29日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请号10-2017-0161834的优先权，其所公开的全部内容通过引用并入本申请。
背景技术
1.发明领域
[0003] 本申请涉及一种重组的驹形杆菌属微生物，使用其生产纤维素的方法以及生产所述微生物的方法。
[0004] 2.相关技术说明
[0005] 通过培养微生物生产的纤维素存在作为一级结构的由葡萄糖组成的β-1,4葡聚糖以及由β-1,4葡聚糖形成的原纤维束的网状结构。这种纤维素也被称为“生物纤维素”或“微生物纤维素”。
[0006] 与植物纤维素不同，这种微生物纤维素是完全不含木质素或半纤维素的纯纤维素。微生物纤维素的宽度为100nm或更窄，并且其与植物纤维素相比具有较强的吸水和保水能力、拉伸强度高、弹性高、耐热性高等特点。由于具有这些特征，已将微生物纤维素开发用于诸如化妆品、医疗产品、膳食纤维、音频扬声器隔膜、功能膜等的多个领域。
[0007] 已报道醋杆菌、农杆菌、根瘤菌(Rhizobia)或八叠球菌(Sarcina)是生产微生物纤维素的菌株。已知其中的木驹形杆菌(Komagataibacter xylinus)(也称为“木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)”)就是一个极好的菌株。在需氧条件下进行静态培养时，在培养基表面上形成具有三维网状结构的纤维素薄膜。
[0008] 磷酸果糖激酶(PFK)是一种在糖酵解中将果糖-6-磷酸磷酸化成果糖-1,6-二磷酸(FBP)的蛋白。PFK在糖酵解中起关键的调控作用。PFK被ATP变构抑制和被AMP变构激活，因此当其经历糖酵解时表现出细胞的能量需求。PFK在细菌和哺乳动物中作为同源四聚体存在以及在酵母中作为八聚体存在。
[0009] 多聚磷酸激酶(PPK)可以催化将NTP+(磷酸)n转化为NDP+(磷酸)n+1的可逆反应。在这里，NTP和NDP分别代表三磷酸核苷和二磷酸核苷。
[0010] 尽管具有如上所述的现有技术，以及已经进行了通过在纤维素生产菌株中引入各种突变以提高纤维素的生产能力的研究，但仍存在对具有增强的纤维素生产能力的重组驹形杆菌属微生物的需求。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明的一个方面提供了一种重组的驹形杆菌属微生物。
[0013] 本发明的另一个方面提供了一种通过使用所述微生物生产纤维素的方法。
[0015] 从以下结合附图对实施方式的描述中，这些和/或其他方面将变得显而易见并且更易于理解，其中：
[0016] 图1显示了引入pfkA基因的K.xylinus菌株的纤维素纳米纤维(CNF)生产情况；
[0017] 图2显示了其中引入pfkA基因的K.xylinus菌株的CNF收率；
[0019] 图4显示了在发酵过程中在含有CMC的培养基中其中引入pfkA基因的K.xylinus菌株的CNF生产情况和收率；以及
[0020] 图5显示了SK3菌株CNF生产情况的比较结果，其中将各ppk基因引入SK3菌株中。
[0021] 发明详述
[0022] 如在本申请中所使用的，术语“表达增加”可以指编码蛋白或酶的基因的转录或翻译增加。
[0023] 如在本申请中所使用，术语“活性增加”或“增加的活性”可以指细胞、蛋白或酶活性可检测的增加。“活性增加”或“增加的活性”还可以指经修饰(例如，经基因工程改造)的细胞、蛋白或酶的活性水平高于相同类型的比较细胞、蛋白或酶，如不具有给定基因修饰的细胞、蛋白或酶(例如，原始或“野生型”的细胞、蛋白或酶)。“细胞活性”可以指细胞的特定蛋白或酶的活性。例如，经修饰或工程改造的细胞的活性与相同类型的未经工程改造的细胞或亲代细胞(即野生型细胞的特定蛋白或酶)的活性相比可能增加约5％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约50％或更高、约60％或更高、约70％或更高或者约100％或更高。可以采用本领域公知的任何方法对具有增加的蛋白或酶活性的细胞进行鉴定。
[0024] 可以通过增加其表达或特定活性实现增加酶或多肽的活性。可以通过将编码酶或多肽的多核苷酸引入细胞，通过增加其拷贝数或者通过修饰多肽的调控实现表达增加。在其中引入该基因的微生物可以是内源性地含有或不含该基因的微生物。该基因可以与能够使其表达的调控序列可操作地连接，例如启动子、多聚腺苷酸化位点或其组合。从外部引入或拷贝数增加的多核苷酸可以是内源性的或外源性的。内源性基因指已经存在于微生物遗传物质中的基因。外源性基因指从外部引入细胞中的基因，并且其相对于引入该基因的宿主细胞可以是同源性或异源性的。术语“异源性”指相对于该物种是“外源性的或非天然的”。
[0025] 可以通过引入或扩增该基因引起，以及可以通过对细胞进行基因工程改造以使得该细胞具有在非基因工程改造的细胞中不存在的基因实现术语“拷贝数增加”。可以由媒介如载体介导基因的引入。引入可以是瞬时引入，在其中基因未整合至基因组，或者引入使得基因整合至基因组。例如可以通过将载体引入细胞，该载体包含编码目标多肽的多核苷酸，然后在细胞中复制载体或通过将多核苷酸整合至基因组进行引入。
[0026] 基因的引入可以通过公知的方法进行，如转化、转染或电穿孔。基因可以通过媒介或通过自身引入。如在本申请中使用的，术语“媒介”指能够将与其连接的其他核酸递送进入细胞的核酸分子。对于介导特定基因引入的核酸序列而言，将本申请中所使用的媒介解释为与载体、核酸构建体或表达盒互换使用。载体可以包括例如质粒载体、来源于病毒的载体等。质粒包括可以连接其他DNA的环状双链DNA。载体可以包括例如质粒表达载体、病毒表达载体(如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒)或其组合。
[0027] 可以使用本领域公知的分子生物学方法进行本公开中使用的基因修饰。
[0028] 术语“亲本细胞”指原始细胞，例如与经过工程改造的微生物是相同类型的未经过基因工程改造的细胞。对于特定的基因修饰而言，“亲本细胞”可以是缺乏特定的基因修饰，但是所有其他方面是相同的细胞。因此，亲本细胞可以是作为用于生产经基因工程改造的具有增加的给定蛋白(例如与磷酸果糖激酶具有约90％或更高的序列同一性的蛋白)活性的微生物的起始原料的细胞。此外，对于由于对编码磷酸果糖激酶的基因进行基因修饰而使得在细胞中具有增加的磷酸果糖激酶活性的微生物而言，亲代细胞可以是未进行基因修饰的微生物。同样的比较也适用于其他基因修饰。
[0029] 如在本申请中所使用的，术语“基因”指编码特定蛋白的核酸片段，并且该片段可以包括或不包括5’-非编码序列和/或3’-非编码序列的调控序列。
[0030] 如在本申请中所使用的，术语多核苷酸或多肽的“序列同一性”指在进行序列比对后获得的序列的碱基或氨基酸残基之间的同一性程度以使得在某些可比较区域中为最佳匹配。序列同一性是通过对两条序列进行最佳比对对在某些可以比较区域中的两条序列进行比较获得的值，其中在某些可比较区域中的序列的部分与参照序列相比可以增加或缺失。可以通过例如在整个可比较区域中对两条最佳比对序列进行比较，确定相同氨基酸或核酸出现的位置数以获得匹配位置数，使用可比较区域中的匹配位置数除以位置总数(例如范围的尺寸)并将除得的结果乘以100以获得序列同一性百分率计算序列同一性百分率。可以使用公知的序列比较程序例如BLASTN(NCBI)、BLASTP(NCBI)、CLC主要工作台(CLC bio)、MegAlignTM(DNASTAR Inc)等确定序列同一性百分率。
[0031] 可以使用不同水平的序列同一性以鉴别具有相同或相似的功能或活性的不同类型的多肽或多核苷酸。例如，序列同一性可以包括约50％或更高、约55％或更高、约60％或更高、约65％或更高、约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约95％或更高、约96％或更高、约97％或更高、约98％或更高、约99％或更高或者100％的序列同一性。
[0032] 如在本申请中所使用的，术语“基因修饰”指在细胞遗传物质的构成或结构中的人工改变。
[0033] 本申请的一个方面提供了一种重组微生物，所述微生物包含增加多聚磷酸激酶(PPK)活性的基因修饰。该重组微生物可以是具有增强的纤维素生产能力的重组微生物。
[0034] 多聚磷酸激酶(PPK)可以催化将NTP+(磷酸)n转化为NDP+(磷酸)n+1的可逆反应。在这里，NTP和NDP分别代表三磷酸核苷和二磷酸核苷。NTP可以是ATP、GTP、CTP或UTP。NDP可以是ADP、GDP、CDP或UDP。在可逆反应中，PPK针对逆向反应的催化活性可以比针对正向反应的催化活性更高。在可逆反应中，PPK在使用GDP、CDP、UDP或其组合作为底物的反应中与使用ADP相比将NDP转化为NTP具有较高催化活性。也就是说，PPK可以通过使用无机多聚磷酸作为供体将NDP转化为NTP。NTP(特别是UTP)可以用于纤维素的合成。在可逆反应中，PPK在使用UDP、GDP或UDP和GDP作为底物的反应中与使用ADP相比将NDP转化为NTP具有较高催化活性。PPK对嘧啶核苷二磷酸可以具有最高的活性和选择性。该活性也称为多聚磷酸驱动的核苷二磷酸激酶(PNDK)活性。可以通过在30℃下孵育包含75mM多聚磷酸(作为磷酸)、30mM MgCl2、5mM NDP和50mM Tris-HCl(pH 7.8)的反应混合物测定该活性。
[0035] PPK可以是外源性的或内源性的。PPK可以属于分类为EC 2.7.4.1的酶。PPK可以来自细菌。PPK可以来自Silicibacter属或红细菌属。PPK可以来自Silicibacter pomeroyi、Silicibacter lacuscaerulensi或Rhodobacterales bacterium。
[0036] PPK可以是与SEQ ID NO:44、46或48所示的氨基酸序列具有约90％或更高的、约95％或更高的或者约100％的序列同一性的多肽。编码PPK的基因可以与SEQ ID NO:45、47或49所示的核苷酸序列具有约90％或更高的、约95％或更高的或者约100％的序列同一性。
[0037] 与没有遗传修饰的相同类型的微生物相比(例如，与亲本微生物相比)，该微生物可以是具有增强的纤维素生产能力的微生物。还可以将该纤维素称为纳米纤维素、纤维素纳米纤维(CNF)、微纤化纤维素(MFC)、纳米晶体纤维素(NCC)或细菌纳米纤维素。该纤维素可以是不含木质素或半纤维素的纤维素。该纤维素的纤维宽度可以是约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约70nm或更小、约60nm或更小、约50nm或更小、约40nm或更小、约30nm或更小、约20nm或更小或者约10nm或更小。该纤维素可具有较高吸收性、较高强度、较高弹性、较高耐热性或其组合。
[0038] 该重组微生物还可以包含增加磷酸果糖激酶(PFK)活性的基因修饰。
[0039] PFK是一种在糖酵解中将果糖-6-磷酸磷酸化成果糖-1,6-二磷酸的蛋白。PFK可以是外源性的或内源性的。PFK还可以是PFK1(也称为“PFKA”)。PFK1可以属于分类为EC 2.7.1.11的酶。PFK可以来自细菌。PFK可以来自埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属、分枝杆菌属、发酵单胞菌属或弧菌属。PFK可以来自E.coli，例如E.coli MG1655。
[0040] PFK可以催化ATP和果糖-6-磷酸转化成果糖-1,6-二磷酸和ADP。PFK可以被ADP和二磷酸核苷变构激活，以及被磷酸烯醇式丙酮酸变构抑制。PFK可以是与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有约90％或更高的、约95％或更高的或者约100％的序列同一性的多肽。编码PFK的基因可以与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有约90％或更高的、约95％或更高的或者约100％的序列同一性。
[0041] 在该微生物中，基因修饰可以增加编码PFK的基因的表达和增加编码PPK的基因的表达的一种或多种。基因修饰可以是增加编码PFK的基因的拷贝数或者是对编码PFK的基因的表达调控序列的修饰。而且，基因修饰可以是增加编码PPK的基因的拷贝数或者是对编码PPK的基因的表达调控序列的修饰。拷贝数的增加可以由将基因由外部引入细胞内或通过扩增内源性基因引起。
[0042] 可以通过例如媒介如载体将基因修饰引入编码PFK的基因和编码PPK的基因。编码PFK的基因和编码PPk的基因的一个或多个可以存在于染色体内部或外部。所引入的编码PFK的基因和编码PPK的基因可以是多个基因，例如2个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、30个或更多个、50个或更多个、100个或更多个或者1000个或更多个。
[0043] 该微生物可以属于驹形杆菌属、葡糖酸醋杆菌属或肠杆菌属，并且可以具有细菌纤维素生产能力。该微生物可以属于驹形杆菌属，并且可以具有细菌纤维素生产能力。该微生物可以不含有内源性PFK1。因此，该微生物可以不具有内源性糖酵解途径。该微生物可以是K.xylinus(也称为“G.xylinus”)、K.rhaeticus、K.swingsii、K.kombuchae、K.nataicola或K.sucrofermentans。该微生物可以不具有内源性PPK。该微生物可以不具有在可逆反应中针对逆向反应的催化活性高于针对正向反应的催化活性的内源性的PPK。而且，该微生物可以不具有在可逆反应中在使用GDP、CDP或UDP作为底物的反应中与使用ADP相比将NDP转化为NTP具有较高催化活性的内源性的PPK。
[0044] 另一个方面提供了一种生产纤维素的方法，所述方法包括在培养基中培养该重组微生物以生产纤维素，所述重组微生物包含增加多聚磷酸激酶活性的基因修饰；以及从培养物中收集纤维素。
[0045] 在该方法中，重组微生物是与如上文所述的相同的。
[0046] 可以在含有适宜碳源(例如葡萄糖)的培养基中进行培养。用于培养微生物的培养基可以是适于宿主细胞生长的任意通用培养基，如含有适宜补充剂的最低或复合培养基。适宜的培养基可以是市售的或采用公知的制备方法制备的。
[0047] 培养基可以是可以满足特定微生物的需求的培养基，其取决于所选择的培养产物。培养基可以是包含选自下组的组分的培养基：碳源、氮源、盐、微量元素及其组合。
[0048] 培养基可以包含乙醇或纤维素。乙醇可以是以培养基体积计约0.1％(v/v)至5％(v/v)，例如约0.3％(v/v)至2.5％(v/v)、约0.3％(v/v)至2.0％(v/v)、约0.3％(v/v)至1.5％(v/v)、约0.3％(v/v)至1.25％(v/v)、约0.3至1.0％(v/v)、约0.3至0.7％(v/v)或约
0.5至3.0％(v/v)。纤维素可以是以培养基的重量计约0.5至5％(w/v)、约0.5至2.5％(w/v)、约0.5至1.5％(w/v)或约0.7至1.25％(w/v)。纤维素可以羧化纤维素。纤维素可以是羧基烷基纤维素。纤维素可以是羧甲基纤维素(CMC)。CMC可以是CMC钠。
0.5至3.0％(v/v)。纤维素可以是以培养基的重量计约0.5至5％(w/v)、约0.5至2.5％(w/v)、约0.5至1.5％(w/v)或约0.7至1.25％(w/v)。纤维素可以羧化纤维素。纤维素可以是羧基烷基纤维素。纤维素可以是羧甲基纤维素(CMC)。CMC可以是CMC钠。
[0049] 可以对培养条件进行适当控制以生产所选择的产物，例如纤维素。可以在有氧条件下进行培养以使得细胞增殖。可以通过旋转培养器静态培养而不是振荡进行培养。微生物的密度可以是提供足够的空间以便不干扰纤维素生产的密度。
[0050] 如在本申请中所使用的，术语“培养条件”指用于培养微生物的条件。此类培养条件可以包括例如被微生物所利用的碳源、氮源或氧气条件。可以被微生物利用的碳源可以包括单糖、二糖或多糖。碳源可以包括作为可同化糖的葡萄糖、果糖、甘露糖或半乳糖。氮源可以是有机氮化合物或无机氮化合物。氮源的例示可以为氨基酸、酰胺、胺、硝酸盐或铵盐。用于培养微生物的氧气条件可以是正常氧分压的有氧条件或者在大气中包含约0.1％至约
10％氧气的低氧条件。可以根据微生物实际使用的碳源或氮源改进代谢途径。
10％氧气的低氧条件。可以根据微生物实际使用的碳源或氮源改进代谢途径。
[0051] 该方法可以包括从培养物中收集纤维素。分离可以是例如收集在培养基表面上形成的纤维素薄膜。可以通过物理剥离纤维素薄膜或通过除去培养基收集纤维素薄膜。分离可以收集纤维素薄膜同时保持其形状不损坏。
[0052] 又一个方面提供了一种生产具有增强的纤维素生产能力的重组微生物的方法，所述方法包括将编码多聚磷酸激酶的基因引入具有纤维素生产能力的微生物。该方法还可以包括将编码PFK的基因引入微生物。
[0053] 引入该基因可以是将含有该基因的媒介引入微生物。在该方法中，基因修饰可以包括扩增基因、对基因的调控序列进行工程化改造或者对基因序列本身进行工程化改造。工程化改造可以是核苷酸的插入、取代、转化或加入。
[0054] 根据一个实施方式，可以将重组微生物用于高效地生产纤维素。
[0055] 根据另一个实施方式，可以将生产纤维素的方法用于高效地生产纤维素。
[0056] 根据又一个实施方式，可以将生产具有增强的纤维素生产能力的微生物的方法用于高效地生产具有增强的纤维素生产能力的微生物。
[0057] 现在将详细地提及实施方式，其示例在附图中示出，其中相同的附图标记始终表示相同的元件。在这方面，本实施方式可以具有不同的形式，并且不应被解释为限于本申请所示的描述。因此，下面仅通过参考附图对实施方式进行描述来解释这些方面。
[0058] 以下，将参照实施例对本发明进行更加详细的描述。然而，这些实施例仅用于说明目的，本发明的范围并非旨在受这些实施例的限制。
[0059] 实施例1：制备包含磷酸果糖激酶基因的K.xylinus和生产纤维素
[0060] 在这个实施例中，将外源性PFK基因引入木驹形杆菌DSM2325，并且培养引入了该基因的微生物，这样微生物消耗葡萄糖并生产纤维素，从而考察基因的引入对纤维素生产能力的影响。
[0061] 1.制备过表达pfkA的载体
[0062] 通过同源重组将磷酸果糖激酶(pfk)基因引入K.xylinus中。具体步骤如下：
[0063] 通过使用pTSa-EX1载体(SEQ ID NO:9)作为模板以及引物对SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6和引物对SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8进行PCR扩增获得扩增产物。使用In-Fusion GD克隆试剂盒(Takara)在pTSa-EX1载体的BamHI和SalI限制性位点克隆扩增产物。pTSa-EX1载体是在E.coli和X.xylinus两者中复制的穿梭载体。
[0064] 为了通过同源重组引入pfkA，使用E.coli K12MG1655的基因组DNA作为模板和引物对SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4作为引物进行PCR扩增生产pfkA基因的开放阅读框架(ORF)(SEQ ID NO:2)。使用In-Fusion GD克隆试剂盒(Takara)在pTSa-EX11载体的BamHI和Sall限制性酶切位点克隆pfkA基因的片段以制备用于过表达pfkA的载体pTSa-Ec.pfkA。
[0065] 2.制备用于插入E.coli pfkA基因的载体
[0066] 使用pTSa-Ec.pfkA载体作为模板和引物对SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11作为引物进行PCR扩增扩增tetA基因。使用In-Fusion GD克隆试剂盒(Takara)在pMSK+载体(Genbank登记号KJ922019)的EcoRI限制性酶切位点克隆PCR产物以制备pTSK+载体。
[0067] 使用X.xylinus的基因组DNA作为模板和引物对SEQ ID NO:12和13、SEQ ID NO:14和15以及SEQ ID NO:16和17作为引物进行PCR扩增将要插入pfkA基因的同源区位点，并使用In-Fusion GD克隆试剂盒(Takara)在pTSK+载体的EcoRI限制性内切酶位点克隆扩增产物以制备pTSK-(del)2760载体。2760基因编码胞质NADPH依赖性葡萄糖脱氢酶。
[0068] 使用pTSa-Ec.pfkA载体作为模板和引物对SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19作为引物进行PCR扩增扩增Ptac::Ec.pfkA基因。使用In-Fusion GD克隆试剂盒(Takara)在pTSK-(del)2760载体的EcoRI限制性内切酶位点克隆PCR产物以制备pTSK-(del)2760-Ec.pfkA载体。
[0069] 3.引入磷酸果糖激酶基因
[0070] 为了向X.xylinus中引入SEQ ID NO:2的核苷酸序列(E.coli的pkfA基因)，使用pTSK-(del)2760-Ec.pfkA载体作为模板和引物对SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17作为引物扩增用于插入Ptac::Ec.pfkA基因的表达盒，并通过下述转化法将扩增产物引入X.xylinus菌株。具体步骤如下：
[0071] 将K.xylinus菌株涂布在添加了2％葡萄糖的HS-培养基(0.5％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.27％Na2HPO4、0.15％柠檬酸、2％葡萄糖和1.5％细菌琼脂)上，然后在30℃下培养3天。将该菌株接种至补充了0.2％(v/v)纤维素酶(sigma，来自里氏木霉ATCC 26921的纤维素酶)的5ml HS培养基中，然后在30℃下培养2天。然后，将培养得到的细胞悬液接种至
100ml补充了0.2％(v/v)纤维素的HS培养基中从而使细胞密度(OD600)为0.04，然后将所得物在30℃下培养以使得细胞密度为0.4至0.7。使用1mM HEPES缓冲液洗涤培养得到的菌株，使用15％的甘油洗涤3次，并且使用1ml 15％的甘油重悬以制备感受态细胞。
100ml补充了0.2％(v/v)纤维素的HS培养基中从而使细胞密度(OD600)为0.04，然后将所得物在30℃下培养以使得细胞密度为0.4至0.7。使用1mM HEPES缓冲液洗涤培养得到的菌株，使用15％的甘油洗涤3次，并且使用1ml 15％的甘油重悬以制备感受态细胞。
[0072] 将100μl如此制备的感受态细胞转移至2mm电子比色杯中，将在第2部分中制备的3μg Ptac::Ec.pfkA表达盒加入其中，并且通过电穿孔(2.4kV,200Ω,25μF)将载体引入感受态细胞。在1ml含有2％葡萄糖和0.1％(v/v)纤维素的HS培养基中将引入载体的细胞重悬，转移至14ml圆底试管中，并且在30℃和160rpm条件下培养16小时。将培养得到的细胞涂布在补充了2％葡萄糖、1％乙醇和5μg/ml四环素的HS培养基上并在30℃下培养4天。选择具有四环素抗性的菌株以制备过表达pfk基因的菌株。
[0073] 4.葡萄糖消耗情况以及纤维素和葡糖酸盐生产情况
[0074] 将选定的K.xylinus菌株接种至50ml补充了5％葡萄糖和1％乙醇的HS培养基中，搅拌所得物并在30℃和230rpm条件下培养5天。然后，对葡萄糖消耗情况和纤维素生产情况进行定量。使用配有Aminex HPX-87H柱的高效液相色谱(HPLC)(Bio-Rad,USA)对葡萄糖和葡糖酸盐进行分析。在使用0.1N氢氧化钠溶液和蒸馏水洗涤烧瓶中产生的纤维素固体并将所得物冻干后通过测定其重量对纤维素产物进行定量。对葡糖酸盐的收率进行分析。
[0075] 结果如图1至3所示。图1显示了从对引入各pfk基因的K.xylinus菌株进行培养的培养物中获得的CNF产物。如图1中所示，当将pfkA基因引入K.xylinus后，与野生型菌株相比CNF的生产量增加约115％。表1显示了图1和图2中的数据。
[0076] [表1]
[0077]
[0078] 图2显示了由通过培养引入各pfk基因的K.xylinus菌株制备的培养物获得的纤维素纳米纤维(CNF)的收率。如图2中所示，当将pfkA基因引入K.xylinus后，与野生型菌株相比CNF的收率增加约113％。
[0079] 而且，将野生型和重组菌株涂布在HSD培养板(5g/L酵母提取物、5g/L细菌蛋白胨、2.7g/L Na2HPO4、1.15g/L柠檬酸和20g/L葡萄糖)和含有20g/L琼脂的平板上，在30℃下将所得物培养3天。
[0080] 通过将100mL HSD培养基加入250mL烧瓶中，接入3环微生物并在30℃和150rpm条件下培养所得物20小时启动发酵。
[0082] 操作条件包括初始体积0.7L、温度30℃、pH 5.0(使用中和剂3N KOH(aq)调节)、搅拌速率150rpm、空气流量0.7L/min、培养基为补充了40g/L葡萄糖的HS培养基以及接种率14％(v/v)。
[0083] 在加入CMC的环境中，发酵评估包括将Na_CMC 1.0％(w/v)加入相同HS培养基中并将搅拌速率由上文所述的条件变为250rpm。根据预处理收集得到的发酵溶液后测定的重量对CNF进行定量，预处理为在90℃下使用0.1N NaOH(aq)溶液洗涤收集得到的发酵溶液2小时。
[0084] 图3显示了当通过发酵培养引入各pfkA基因的K.xylinus菌株时CNF的生产情况和收率。如图3中所示，当将pfkA基因引入K.xylinus后，与对照组相比CNF生产量增加约32％和CNF收率增加约55％。收率是所产生的CNF重量相对于在发酵中所使用的葡萄糖重量的百分比。表2显示了图3中所示的数据。
[0085] [表2]
[0086]
[0087] 图4显示了当在引入各pfkA基因的K.xylinus菌株中使用CMC进行发酵时CNF的生产情况和收率。如图4中所示，当将pfk基因引入K.xylinus后，与对照组相比CNF生产量增加约50％和CNF收率增加约116％。表3显示了图4中的数据。
[0088] [表3]
[0089]
[0090] 这表明引入外源性pfkA将菌株的果糖-6-磷酸磷酸化为果糖-1,6-二磷酸并且从而增强糖酵解和影响纤维素生产情况。
[0091] 实施例2：制备包含多聚磷酸激酶基因的K.xylinus和生产纤维素
[0092] 1.制备载体
[0093] 按照如下所示制备在本实施例中使用的载体。
[0094] 按照如下所示制备pMKO载体。通过使用pTSa-EX2载体(SEQ ID NO:20)作为模板以及引物对SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23和引物对SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:22扩增gapA启动子和rrnB终止子区域。通过使用pK19mob-sacB载体( 87098TM)作为模板和引物对SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25扩增kanR基因。使用In-Fusion GD克隆试剂盒(Takara)在pUC19载体的BamHI限制性酶切位点克隆每个PCR产物以制备pMKO载体。
[0095] 按照如下所示制备pMcodBA载体。通过使用E.coli的gDNA作为模板和引物对SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28扩增codBA基因(SEQ ID NO:50)。codBA基因是需要除去在菌株的制备中使用的标记基因的基因并且该基因是用于负性选择的基因。使用In-Fusion GD克隆试剂盒(Takara)在pMKO载体的BglII限制性酶切位点克隆该PCR产物以制备pMcodBA载体。
[0096] 按照如下所示制备pMCT载体。通过使用pTSa-EX11载体(SEQ ID NO:20)作为模板以及引物对SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30和引物对SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32扩增tac启动子和rrnB终止子区域。而且，通过使用pMcodBA载体作为模板和引物对SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:22扩增codBA和kanR基因。使用In-Fusion GD克隆试剂盒(Takara)在pUC19载体的BamHI限制性酶切位点克隆每个PCR产物以制备pMCT载体。
[0097] 按照如下所示制备pMCT-(del)zwf载体。通过使用K.xylinus的gDNA作为模板以及引物对SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35和引物对SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37扩增zwf基因的上游和下游区域。使用In-Fusion GD克隆试剂盒(Takara)在pMCT载体的BamHI限制性酶切位点克隆每个PCR产物以制备pMCT-(del)zwf载体。
[0098] 为了制备用于插入多聚磷酸激酶(PPK)基因的载体，合成Silicibacter pomeroyi PPK3基因(SEQ ID NO:45)、Silicibacter lacuscaerulensi PPK2(SEQ ID NO:47)和Rhodobacterales bacterium PPK2基因(SEQ ID NO:49)
[0099] (pUC57-Sp.ppk/Sl.ppk/Rb.ppk)。PPK3、PPK2和PPK2编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NOS：44、46和48所示。通过使用引物对SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39，引物对SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41和引物对SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43扩增每个ppk基因，以及使用In-Fusion GD克隆试剂盒(Takara)在pMCT-(del)zwf载体的BglII限制性酶切位点克隆每个所得产物以分别制备pMCT-(del)zwf_Sp.ppk载体、pMCT-(del)zwf_Sl.ppk载体和pMCT-(del)zwf_Rb.ppk载体。
[0100] 2.转化
[0101] 为了引入Silicibacter pomeroyi PPK3(Sp ppk)、Silicibacter lacuscaerulensi PPK2(Sl ppk)和Rhodobacterales bacterium PPK2(Rb ppk)基因，通过下述转化方法将pMCT-(del)zwf_Sp.ppk、pMCT-(del)zwf_Sl.ppk和pMCT-(del)zwf_Rb.ppk转化进入SK3菌株以分别制备SK3-(del)zwf_Sp.ppk、Sl.ppk和Rb.ppk菌株，SK3菌株是实施例1的第3部分中制备的含PFK基因的重组K.xylinus菌株。具体的转化方法如下所示：
[0102] 将K.xylinus菌株涂布在添加了2％葡萄糖的HS-培养基(含有0.5％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.27％Na2HPO4、0.15％柠檬酸、2％葡萄糖和1.5％细菌琼脂)上，并且在30℃下培养3天。将该菌株接种至补充了0.2％纤维素酶(sigma)的5ml HS培养基中，然后在30℃下培养2天。然后，将培养得到的细胞悬液接种至100ml补充了0.2％纤维素的HS培养基中从而使细胞密度(OD600)为0.04，然后将所得物在30℃下培养以使得细胞密度为0.4至0.7。使用1mM HEPES缓冲液洗涤培养得到的菌株，使用15％的甘油洗涤3次，并且使用1ml 15％的甘油重悬以制备感受态细胞。
[0103] 将K.xylinus DSM2325M9菌株涂布在添加了2％葡萄糖的HS培养板上，然后在30℃下培养3天。通过使用无菌水将由此培养的菌株转移至50ml falcon管中，随后涡旋2分钟。将1％纤维素酶(sigma，来自里氏木霉ATCC26921的纤维素酶)加入其中，并且使反应在30℃和160rpm下进行2小时。然后，使用1mM HEPES缓冲液洗涤培养得到的菌株，使用15％的甘油洗涤3次，并且使用1ml 15％的甘油重悬。将100μl如此制备的感受态细胞转移至2mm电子比色杯中，将3μg质粒加入其中，并且通过电穿孔(3.0kV，250Ω，25μF)进行转化。在1ml HS培养基(2％葡萄糖)中重悬细胞，转移至14ml圆底试管中，并且在30℃和230rpm条件下培养16小时。将培养得到的细胞涂布在补充了2％葡萄糖、1％乙醇和5μg/ml四环素或50μg/ml卡那霉素的HS培养板上并在30℃下培养5天。
[0104] 3.CNF的生产情况
[0105] 将引入了各载体的K.xylinus菌株在补充了2％葡萄糖、1％乙醇和5μg/ml四环素或50μg/ml卡那霉素的HS培养板上划线，并在30℃下培养5天。然后，将如此培养得到的菌株接种至25ml补充了5％葡萄糖和1％乙醇的HS培养基中，随后在30℃和230rpm下培养6天。在60℃下使用0.1N NaOH和蒸馏水洗涤如此生产的CNF，然后冻干以从中除去H2O，随后称重。
通过HPLC分析葡萄糖和葡糖酸盐。
通过HPLC分析葡萄糖和葡糖酸盐。
[0106] 对引入各ppk基因的SK3菌株的CNF生产情况进行比较，结果表明与SK3菌株相比，引入各ppk基因的SK3菌株显示出CNF的生产量增加。
[0107] 图5显示了对引入各ppk基因的SK3菌株的CNF生产情况的比较结果。表4显示了图5的结果。
[0108] [表4]
[0109]
[0110] 如表4中所示，与SK3_Δzwf相比，在SK3_Δzwf_Sl ppk中，CNF生产量增加约62.3％，以及CNF收率增加约72.4％，表明引入外源性PPK增强了包括ATP、GTP、UTP、CTP或其组合在内的辅因子的供应并且影响了纤维素的生产情况。
[0111] 应当理解，应将本申请所述的实施方式认为是仅具有描述性意义并且不是出于限制性目的。通常应将在每个实施方式中对特征或方面的描述认为是可供在其他实施方式中相似的特征或方面使用的。
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