工程改造的肉毒杆菌神经毒素
阅读：536发布：2020-05-18
专利汇可以提供工程改造的肉毒杆菌神经毒素专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文中公开了经修饰的肉毒杆菌(Clostridial Botulinum)神经毒素(BoNT)多肽，其具有经修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域，其在对应于血清型B菌株1中的第1248或1249位处包含一个或更多个替换突变。具体的替换突变包括I1248F、I1248Y、I1248H、I1248W、V1249W、V1249F、V1249Y、V1249H、I1248W/V1249F、I1248W/V1249Y、I1248W/V1249H、I1248F/V1249Y、I1248F/V1249H、I1248Y/V1249H、I1248F/V1249W、I1248Y/V1249W、I1248H/V1249W、I1248Y/V1249F、I1248H/V1249F或I1248H/V1249Y。还公开了其他替换突变。还公开了分离的经修饰的受体结合结构域、嵌合分子、药物组合物以及使用其的方法。，下面是工程改造的肉毒杆菌神经毒素专利的具体信息内容。
1.经修饰的肉毒杆菌(Clostridial Botulinum)神经毒素(BoNT)多肽，其包含经修饰的肉毒杆菌血清型B(BoNT/B)的受体结合结构域，其在对应于BoNT血清型B，菌株1(BoNT/B1)中的第1248或1249位包含一个或更多个替换突变。
2.权利要求1所述的经修饰的BoNT多肽，其包含SEQ ID NO：1至8中任一个的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：1至7中任一个的第1248或1249位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：8中的第1249或1250位具有一个或更多个替换突变。
3.权利要求1所述的经修饰的BoNT多肽，其包含与SEQ ID NO：1至8中任一个具有至少
85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：1至7中任一个的第1248或1249位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：8中的第1249或1250位具有一个或更多个替换突变。
4.权利要求1所述的经修饰的BoNT多肽，其由SEQ ID NO：1至8中任一个的氨基酸序列组成，其在SEQ ID NO：1至7中任一个的第1248或1249位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：8中的第1249或1250位具有一个或更多个替换突变。
5.权利要求1至4中任一项所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述替换突变在SEQ ID NO：
1至7任一个中的第1248或1249位、或在SEQ ID NO：8中的第1249或1250位引入色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)中的任一种。
6.权利要求5所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述替换突变在SEQ ID NO：1至7中任一个的第1248和1249位、或在SEQ ID NO：8中的第1249和1250位二者处均引入色氨酸(W)。
7.权利要求6所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：
33的氨基酸序列。
8.权利要求1所述的经修饰的BoNT多肽，其包含SEQ ID NO：9至16中任一个的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：9至15中任一个的第389或390位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：16中的第390或391位具有一个或更多个替换突变。
9.权利要求1所述的经修饰的BoNT多肽，其包含与SEQ ID NO：9至16中任一个具有至少
85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：9至15中任一个的第389或390位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：16中的第390或391位具有一个或更多个替换突变。
10.权利要求8所述的经修饰的BoNT多肽，其由SEQ ID NO：9至16中任一个的氨基酸序列组成，其在SEQ ID NO：9至15中任一个的第389或390位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：16中的第390或391位具有一个或更多个替换突变。
11.权利要求8至10中任一项所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述替换突变在SEQ ID NO：9至15中任一个的第389或390位、或在SEQ ID NO：16中的第390或391位引入色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)中的任一种。
12.权利要求11所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述替换突变在SEQ ID NO：9至15中任一个的第389和390位、或在SEQ ID NO：16中的第390和391位二者处均引入色氨酸(W)。
13.权利要求12所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
14.权利要求1所述的经修饰的BoNT多肽，其包含SEQ ID NO：17至24中任一个的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261或1262位具有一个或更多个替换突变。
15.权利要求1所述的经修饰的BoNT多肽，其包含与SEQ ID NO：17至24中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少
93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261或1262位具有一个或更多个替换突变。
16.权利要求14所述的经修饰的BoNT多肽，其由SEQ ID NO：17至24中任一个的氨基酸序列组成，其在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261或1262位具有一个或更多个替换突变。
17.权利要求14至16中任一项所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述替换突变在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261或1262位引入色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)中的任一种。
18.权利要求17所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述替换突变在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261和1262位二者处均引入色氨酸(W)。
19.权利要求18所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36的氨基酸序列。
20.经修饰的BoNT多肽，其包含对应于血清型B，菌株1(BoNT/B1)的1245位氨基酸和
1252位氨基酸之间的片段之多肽的氨基酸序列，其在对应于BoNT/B1中的第1248位或第
1249位具有一个或更多个替换突变。
21.权利要求20所述的经修饰的BoNT多肽，其包含SEQ ID NO：25至32中任一个的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：25至32中任一个的第4位或第5位具有一个或更多个替换突变。
22.权利要求20所述的经修饰的BoNT多肽，其包含与SEQ ID NO：25至32中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少
93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：25至32中任一个的第4位或第5位具有一个或更多个替换突变。
23.权利要求21所述的经修饰的BoNT多肽，其由SEQ ID NO：25至32中任一个的氨基酸序列组成，其在SEQ ID NO：25至32中任一个的第4位或第5位具有一个或更多个替换突变。
24.权利要求20至23中任一项所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述替换突变在SEQ ID NO：25至32中任一个的第4位或第5位引入色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)中的任一种。
25.权利要求24所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述替换突变在SEQ ID NO：25至32中任一个的第4位和第5位二者处均引入色氨酸(W)。
26.权利要求25所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。
27.权利要求1至26中任一项所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述替换突变在所述受体结合结构域中产生穿透脂质膜的环。
28.权利要求1至27中任一项所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述多肽与相应的野生型BoNT多肽相比具有与神经末梢的增强的结合，并且其中所述增强的结合通过所述环穿透进入脂质膜介导。
29.权利要求28所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述增强的结合对突触前神经末梢是特异性的。
30.权利要求29所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述突触前神经末梢是小鼠突触前神经末梢。
31.权利要求29所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述突触前神经末梢是人突触前神经末梢。
32.权利要求1至19中任一项所述的经修饰的BoNT多肽，其还包含在对应于BoNT/B1中的第1178、1191或1199位的一个或更多个替换突变。
33.权利要求32所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述替换突变对应于BoNT/B1中的E1191M/S1199Y、E1191M/S1199W、E1191M/W1178Q、E1191V/S1199Y、1191V/S1199W、E1199V/W1178Q或E1199Q/S1199Y。
34.权利要求33所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：46至66中任一个的氨基酸序列。
35.权利要求34所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述经修饰的BoNT多肽具有与SytII增强的结合亲和力。
36.核酸分子，其包含编码经修饰的BoNT多肽的多核苷酸，所述经修饰的BoNT多肽包含与权利要求1至35中任一项所述的经修饰的BoNT多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
37.核酸载体，其包含权利要求36所述的核酸分子。
38.细胞，其包含权利要求36所述的核酸分子或权利要求37所述的核酸载体。
39.细胞，其表达权利要求1至35中任一项所述的经修饰的BoNT多肽。
40.生产权利要求1至35中任一项所述的经修饰的BoNT多肽的方法，所述方法包括在其中生产所述经修饰的BoNT多肽的条件下培养权利要求36所述的细胞的步骤。
41.权利要求40所述的方法，其还包括从培养物中回收所述经修饰的BoNT多肽。
42.经修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，其包含：
a)蛋白酶结构域；
b)蛋白酶切割位点；
c)易位结构域；以及
d)经修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域，其在对应于BoNT血清型B，菌株1(BoNT/B1)中的第1248位或第1249位包含一个或更多个替换突变。
43.权利要求42所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述多肽包含BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B5、BoNT/B6、BoNT/B7和BoNT/B8中任一种的经修饰的受体结合结构域。
44.权利要求42或43所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述经修饰的受体结合结构域包含一个替换突变。
45.权利要求44所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述一个替换突变对应于BoNT/B1中的I1248F、I1248Y、I1248H、I1248W、V1249W、V1249F、V1249Y或V1249H。
46.权利要求42或43所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述经修饰的受体结合结构域包含两个替换突变。
47.权利要求46所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述替换突变对应于BoNT/B1中的I1248W/V1249F、I1248W/V1249Y、I1248W/V1249H、I1248F/V1249Y、I1248F/V1249H、I1248Y/V1249H、I1248F/V1249W、I1248Y/V1249W、I1248H/V1249W、I1248Y/V1249F、I1248H/V1249F或I1248H/V1249Y。
48.权利要求42至47中任一项所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自选自A、B、C、D、E、F、G的血清型、及其组合。
49.权利要求48所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自血清型B，菌株1。
50.权利要求48所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自血清型A，菌株1。
51.权利要求41至50中任一项所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述经修饰的BoNT多肽穿透脂质膜。
52.权利要求41至51中任一项所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述经修饰的BoNT多肽与相应的野生型BoNT相比具有与神经末梢的增强的结合，并且其中所述增强的结合通过所述环穿透所述脂质膜介导。
53.权利要求52所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述增强的结合对突触前神经末梢是特异性的。
54.权利要求53所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述突触前神经末梢是小鼠突触前神经末梢。
55.权利要求52所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述突触前神经末梢是人突触前神经末梢。
56.权利要求41至55中任一项所述的经修饰的BoNT多肽，其在对应于BoNT/B1中的第
1178、1191或1199位还包含一个或更多个替换突变。
57.权利要求56所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述替换突变对应于BoNT/B1中的E1191M/S1199Y、E1191M/S1199W、E1191M/W1178Q、E1191V/S1199Y、1191V/S1199W、E1199V/W1178Q或E1199Q/S1199Y。
58.权利要求57所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：46至66中任一个的氨基酸序列。
59.权利要求58所述的经修饰的BoNT多肽，其中所述经修饰的BoNT多肽具有与SytII的增强的结合亲和力。
60.核酸分子，其包含编码经修饰的BoNT多肽的多核苷酸，所述经修饰的BoNT多肽包含与权利要求41至60中任一项所述的经修饰的BoNT多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
61.核酸载体，其包含权利要求60所述的核酸分子。
62.细胞，其包含权利要求60所述的核酸分子或权利要求B20所述的核酸载体。
63.细胞，其表达权利要求41至60中任一项所述的经修饰的BoNT多肽。
64.生产经修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽的方法，所述方法包括在其中生产所述BoNT多肽的条件下培养权利要求63所述细胞的步骤。
65.权利要求64所述的方法，其还包括从培养物中回收所述BoNT多肽。
66.嵌合分子，其包含与第二部分连接的第一部分，其中所述第一部分是权利要求1至
35或41至60中任一项所述的经修饰的BoNT多肽。
67.权利要求66中任一项所述的嵌合分子，其中所述第一部分和所述第二部分共价连接。
68.权利要求66所述的嵌合分子，其中所述第一部分和所述第二部分非共价连接。
69.权利要求66至68中任一项所述的嵌合分子，其中所述第二部分选自小分子、核酸、短多肽和蛋白质。
70.权利要求69所述的嵌合分子，其中所述第二部分是生物活性分子。
71.权利要求69或70所述的嵌合分子，其中所述第二部分是非多肽药物。
72.权利要求69所述的嵌合分子，其中所述第二部分是治疗性多肽。
73.核酸分子，其包含编码权利要求72所述的嵌合分子的多核苷酸序列。
74.核酸载体，其包含权利要求73所述的核酸分子。
75.细胞，其包含权利要求73所述的核酸分子或权利要求74所述的核酸载体。
76.细胞，其表达权利要求75所述的嵌合分子。
77.药物组合物，其包含权利要求1至35或41至60中任一项所述的经修饰的BoNT多肽。
78.药物组合物，其包含权利要求66至76中任一项所述的嵌合分子。
79.权利要求77或78所述的药物组合物，其还包含可药用赋形剂。
80.药盒，其包含权利要求77至79中任一项所述的药物组合物以及用于治疗性施用所述药物组合物的说明书。
81.治疗与不期望的神经元活性相关的病症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的权利要求1至34和41至59中任一项所述的经修饰的BoNT多肽、权利要求66至76中任一项所述的嵌合分子和权利要求77至79中任一项所述的药物组合物以治疗所述病症。
82.权利要求81所述的方法，其中所述病症与过度活跃的神经元或腺体相关。
83.权利要求82所述的方法，其中所述病症选自：痉挛性发声障碍、痉挛性斜颈、喉肌张力障碍、口下颌发音障碍、舌肌张力障碍、颈肌张力障碍、局灶性手肌张力障碍、眼睑痉挛、斜视、半面痉挛、眼睑障碍、大脑性瘫痪、局灶性痉挛和其他语言障碍、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、盆底失迟缓、肢体痉挛、抽搐、震颤、磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困难和其他肌张力障碍以及特征为肌肉群不自主运动的其他障碍、流泪、多汗、过度流涎、过度胃肠分泌、分泌紊乱、肌肉痉挛引起的疼痛、头痛和皮肤病症或美学/美容病症。
84.权利要求81至83中任一项所述的方法，其中所述施用通过注射到达注射部位，其中所述注射是在存在不期望的神经元活性的地方。
85.权利要求81至84中任一项所述的方法，其中在注射部位处神经元对所述经修饰的BoNT多肽的摄取增强，并且其中所述多肽向其他区域的扩散减少。
86.权利要求81至85中任一项所述的方法，其中在注射时神经元对所述经修饰的BoNT多肽的摄取增强，并且其中所述多肽具有降低的免疫原性。
87.权利要求1至34和41至59中任一项所述的经修饰的BoNT多肽、权利要求66至76中任一项所述的嵌合分子和权利要求77至79所述的药物组合物，其用于治疗与不期望的神经元活性相关的病症。
88.权利要求1至34和41至59中任一项所述的经修饰的BoNT多肽、权利要求66至76中任一项所述的嵌合分子和权利要求77至79中任一项所述的药物组合物，其用于医学。
89.制备经修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)的方法，所述方法包括在对应于血清型B，菌株1(BoNT/B1)中的第1248或1249位形成一个或更多个替换突变。
90.权利要求89所述的方法，其中所述替换突变对应于I1248F、I1248Y、I1248H、I1248W、V1249W、V1249F、V1249Y、V1249H、I1248W/V1249F、I1248W/V1249Y、I1248W/V1249H、I1248F/V1249Y、I1248F/V1249H、I1248Y/V1249H、I1248F/V1249W、I1248Y/V1249W、I1248H/V1249W、I1248Y/V1249F、I1248H/V1249F或I1248H/V1249Y。
91.权利要求89或90所述的方法，其中所述BoNT多肽是BoNT血清型B(BoNT/B)。
92.权利要求91所述的方法，其中所述BoNT多肽是BoNT/B，菌株1至8中的任一种。
93.权利要求92所述的方法，其中所述经修饰的BoNT多肽穿透脂质膜。
94.权利要求93所述的方法，其中所述经修饰的BoNT多肽具有与神经元的增强的结合，其中所述增强的结合通过穿透所述脂质膜介导。
95.权利要求94所述的方法，其中所述增强的结合对突触前神经末梢是特异性的。
96.权利要求95所述的方法，其中所述突触前神经末梢是小鼠突触前神经末梢。
97.权利要求95所述的方法，其中所述突触前神经末梢是人突触前神经末梢。
工程改造的肉毒杆菌神经毒素
[0001] 相关申请
[0002] 本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年6月8日提交的美国临时申请号62/347,579的权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
[0003] 近年来，肉毒杆菌(Clostridial Botulinum)神经毒素(BoNT)已被广泛用于治疗越来越多的医学病症：局部注射少量毒素可以削弱靶区域的神经元活性，这在许多医学病症以及美容目的中都是有益的2-4。迄今为止，BoNT血清型A(BoNT/A)和BoNT血清型B(BoNT/B)是目前FDA批准用于人的仅有的两种BoNT2-4。随着BoNT的应用不断增加，已经报道了多种限制和副作用。主要的限制是在患者中产生中和抗体，这使得随后的治疗无效。终止使用BoNT往往使患者没有其他有效的方法来治疗/缓解他们的疾病。与BoNT使用相关的副作用范围从短暂的非严重事件(例如上睑下垂和复视)直至危及生命的事件甚至死亡6，7。BoNT的限制和副作用在很大程度上和剂量相关。非常期望对神经元具有改进特异性的经修饰的BoNT，其以较低剂量维持相同水平的毒素活性。发明内容
[0004] 本公开内容的一些方面提供了经修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，其包含经修饰的肉毒杆菌血清型B(BoNT/B)的受体结合结构域，其在对应于BoNT血清型B，菌株1(BoNT/B1)中的第1248或1249位包含一个或更多个替换突变。
[0005] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：1至8中任一个的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：1至7中任一个的第1248或1249位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：8中的第1249或1250位具有一个或更多个替换突变。
[0006] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含与SEQ ID NO：1至8中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：1至7中的第1248或1249位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：8中的第1249或1250位具有一个或更多个替换突变。
[0007] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：1至8中任一个的氨基酸序列组成，其在SEQ ID NO：1至7中任一个的第1248或1249位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：8中的第1249或1250位具有一个或更多个替换突变。
[0008] 在一些实施方案中，替换突变在SEQ ID NO：1至7中任一个的第1248或1249位或在SEQ ID NO：8中的第1249或125位引入色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)中的任一种。在一些实施方案中，替换突变在SEQ ID NO：1至7中任一个的第1248和1249位或在SEQ ID NO：8中的第1249和1250位二者处均引入色氨酸(W)。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
[0009] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：9至16中任一个的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：9至15中任一个的第389或390位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：16中的第390或391位具有一个或更多个替换突变。
[0010] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含与SEQ ID NO：9至16中的任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：9至15中的第389或390位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：16的第390或391位具有一个或更多个替换突变。
[0011] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：9至16中任一个的氨基酸序列组成，其在SEQ ID NO：9至15中任一个的第389或390位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：16中的第390或391位具有一个或更多个替换突变。
[0012] 在一些实施方案中，替换突变在SEQ ID NO：9至15中任一个的第389或390位或在SEQ ID NO：16的第390和391位引入色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)中的任一种。在一些实施方案中，替换突变在SEQ ID NO：9至15中的任一个的第389和390位或在SEQ ID NO：16中的第390和391位二者处均引入色氨酸(W)。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
[0013] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：17至24中任一个的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：17至24中任一个中的第1261或1262位具有一个或更多个替换突变。
[0014] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含与SEQ ID NO：17至24中的任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261或1262位具有一个或更多个替换突变。
[0015] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：17至24中任一个的氨基酸序列组成，其在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261或1262位具有一个或更多个替换突变。
[0016] 在一些实施方案中，替换突变在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261或1262位引入色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)中的任一种。在一些实施方案中，替换突变在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261和1262位二者处均引入色氨酸(W)。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36的氨基酸序列。
[0017] 本公开内容的一些方面提供了经修饰的BoNT多肽，其包含对应于血清型B，菌株1(BoNT/B1)的氨基酸1245和氨基酸1252之间的片段之多肽的氨基酸序列，所述氨基酸序列在对应于BoNT/B1中第1248或1249位具有一个或更多个替换突变。
[0018] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：25至32中任一个的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：25至32中任一个的第4或5位具有一个或更多个替换突变。
[0019] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT包含与SEQ ID NO：25至32中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列，所述氨基酸序列在SEQ ID NO：25至32中任一个的第4或5位具有一个或更多个替换突变。
[0020] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：25至32中任一个的氨基酸序列组成，其在SEQ ID NO：25至32中任一个的第4或5位具有一个或更多个替换突变。
[0021] 在一些实施方案中，替换突变在SEQ ID NO：25至32中任一个的第4或5位引入色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)中的任一种。在一些实施方案中，替换突变在SEQ ID NO：25至32中的任一个的第4和5位二者处均引入色氨酸(W)。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。
[0022] 在一些实施方案中，替换突变在受体结合结构域中产生穿透脂质膜的环。在一些实施方案中，与相应的野生型BoNT多肽相比，本文中公开的经修饰的BoNT多肽具有与神经末梢的增强的结合，并且其中所述增强的结合通过环穿透进入脂质膜介导。
[0023] 在一些实施方案中，增强的结合对突触前神经末梢特异。在一些实施方案中，突触前神经末梢是小鼠突触前神经末梢。在一些实施方案中，突触前神经末梢是人突触前神经末梢。
[0024] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽还在对应于BoNT/B1中1178、1191或1199位置包含一个或更多个替换突变。在一些实施方案中，替换突变对应于BoNT/B1中的E1191M/S1199Y、E1191M/S1199W、E1191M/W1178Q、E1191V/S1199Y、1191V/S1199W、E1199V/W1178Q或E1199Q/S1199Y。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：46至66中任一个的氨基酸序列。
[0025] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽具有与SytII的增强的结合亲和力。
[0026] 本文中还提供了包含编码经修饰的BoNT多肽的多核苷酸的核酸分子，所述经修饰的BoNT多肽包含与本文中公开的经修饰的BoNT多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。还描述了包含这样核酸分子的核酸载体。
[0027] 本文中还提供了含有本文中所述的核酸分子或核酸载体的细胞。还描述了表达本公开内容的经修饰的BoNT多肽的细胞。
[0028] 本公开内容的其他方面提供了生产本文中公开的经修饰的BoNT多肽的方法，其包括在其中生产所述经修饰的BoNT多肽的条件下培养表达这样经修饰的BoNT多肽的细胞的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括从培养物中回收所述经修饰的BoNT多肽。
[0029] 本公开内容的其他方面提供了经修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，其包含：a)蛋白酶结构域；b)蛋白酶切割位点；c)易位结构域；以及d)经修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域，其在对应于BoNT血清型B，菌株1(BoNT/B1)中1248或1249位置包含一个或更多个替换突变。
[0030] 在一些实施方案中，所述多肽包含BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B5、BoNT/B6、BoNT/B7和BoNT/B8中任一种的经修饰的受体结合结构域。
[0031] 在一些实施方案中，经修饰的受体结合结构域包含一个替换突变。在一些实施方案中，所述一个替换突变对应于BoNT/B1中的I1248F、I1248Y、I1248H、I1248W、V1249W、V1249F、V1249Y或V1249H。
[0032] 在一些实施方案中，经修饰的受体结合结构域包含两个替换突变。在一些实施方案中，替换突变对应于BoNT/B1中的I1248W/V1249F、I1248W/V1249Y、I1248W/V1249H、I1248F/V1249Y、I1248F/V1249H、I1248Y/V1249H、I1248F/V1249W、I1248Y/V1249W、I1248H/V1249W、I1248Y/V1249F、I1248H/V1249F或I1248H/V1249Y。
[0033] 在一些实施方案中，蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自选自A、B、C、D、E、F、G的血清型，及其组合。
[0034] 在一些实施方案中，蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自血清型B，菌株1。在一些实施方案中，蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自血清型A，菌株1。
[0035] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽穿透脂质膜。在一些实施方案中，与相应的野生型BoNT相比，经修饰的BoNT多肽具有与神经末梢的增强的结合，并且其中所述增强的结合通过环穿透脂质膜介导。在一些实施方案中，增强的结合对突触前神经末梢是特异性的。在一些实施方案中，突触前神经末梢是小鼠突触前神经末梢。在一些实施方案中，突触前神经末梢是人突触前神经末梢。
[0036] 在一些实施方案中，本文中公开的经修饰的BoNT多肽还在对应于BoNT/B1中1178、1191或1199位置包含一个或更多个替换突变。在一些实施方案中，替换突变对应于BoNT/B1中的E1191M/S1199Y、E1191M/S1199W、E1191M/W1178Q、E1191V/S1199Y、1191V/S1199W、E1199V/W1178Q或E1199Q/S1199Y。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：
46至66中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽具有与SytII的增强的结合亲和力。
46至66中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽具有与SytII的增强的结合亲和力。
[0037] 本文中还提供了包含编码经修饰的BoNT多肽的多核苷酸的分离的核酸分子，其包含与本公开内容的经修饰的BoNT多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。本文中还提供了包含这样的核酸分子的核酸载体以及含有其的细胞。还考虑了表达经修饰的BoNT多肽的细胞。
[0038] 本文中还提供了生产经修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽的方法，其包括在其中生产所述BoNT多肽的条件下培养本文中所述细胞的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括从培养物中回收所述BoNT多肽。
[0039] 本公开内容的其他一些方面提供了嵌合分子，其包含与第二部分连接的第一部分，其中所述第一部分是本公开内容的经修饰的BoNT多肽。
[0040] 在一些实施方案中，第一部分和第二部分共价连接。在一些实施方案中，第一部分和第二部分非共价连接。
[0042] 还描述了编码这样嵌合分子的核酸、核酸载体、含有核酸的细胞和表达这样嵌合分子的细胞。
[0043] 本公开内容的其他方面提供了包含本文中所述的经修饰的BoNT多肽或嵌合分子的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物还包含可药用赋形剂。
[0045] 本公开内容的其他方面提供了治疗不期望的神经元活性的病症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文中公开的经修饰的BoNT多肽、嵌合分子或药物组合物以治疗所述病症。
[0046] 在一些实施方案中，病症与过度活跃的神经元或腺体相关。在一些实施方案中，所述病症选自痉挛性发声障碍(spasmodic dysphonia)、痉挛性斜颈、喉肌张力障碍、口下颌发音障碍(oromandibular dysphonia)、舌肌张力障碍、颈肌张力障碍、局灶性手肌张力障碍(focal hand dystonia)、眼睑痉挛、斜视、半面痉挛(hemifacial spasm)、眼睑障碍、大脑性瘫痪、局灶性痉挛(focal spasticity)和其他语言障碍、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、盆底失迟缓(anismus)、肢体痉挛、抽搐(tics)、震颤、磨牙症、肛裂、弛缓不能(achalasia)、吞咽困难和其他肌张力障碍以及特征为肌肉群不自主运动的其他障碍、流泪、多汗、过度流涎、过度胃肠分泌、分泌紊乱、肌肉痉挛引起的疼痛、头痛、运动损伤、皮肤病症或美学/美容病症。
[0047] 在一些实施方案中，通过注射施用，其中注射在存在不期望的神经元活性的地方进行。在一些实施方案中，注射部位处神经元对经修饰的BoNT多肽的摄取增强，并且其中多肽向其他区域的扩散减少。
[0048] 在一些实施方案中，在注射时神经元对经修饰的BoNT多肽的摄取增强，并且其中所述多肽具有降低的免疫原性。
[0049] 在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽、嵌合分子和药物组合物可用于治疗与不期望的神经元活性相关的病症。
[0050] 在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽、嵌合分子和药物组合物可用于医学。
[0051] 本公开内容的又一方面提供了制备经修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)的方法，所述方法包括在对应于血清型B，菌株1(BoNT/B1)中1248或1249位置产生一个或更多个替换突变。
[0052] 在一些实施方案中，替换突变对应于I1248F、I1248Y、I1248H、I1248W、V1249W、V1249F、V1249Y、V1249H、I1248W/V1249F、I1248W/V1249Y、I1248W/V1249H、I1248F/V1249Y、I1248F/V1249H、I1248Y/V1249H、I1248F/V1249W、I1248Y/V1249W、I1248H/V1249W、I1248Y/V1249F、I1248H/V1249F或I1248H/V1249Y。
[0053] 在一些实施方案中，BoNT多肽是BoNT血清型B(BoNT/B)。在一些实施方案中，BoNT多肽是BoNT/B，菌株1至8中的任一种。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽穿透脂质膜。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽具有与神经元的增强的结合，其中所述增强的结合通过穿透脂质膜介导。在一些实施方案中，增强的结合对突触前神经末梢是特异的。在一些实施方案中，突触前神经末梢是小鼠突触前神经末梢。在一些实施方案中，突触前神经末梢是人突触前神经末梢。
[0054] 本公开内容的每种限制可以包括本公开内容的多个实施方案。因此，预期涉及任一个元素或元素组合的本公开内容的每种限制可以包括在本公开内容的各个方面中。本公开内容在其应用时不限于其在下面的描述中阐述的或在附图中示出的构造细节和组件安排。本公开内容能够具有其他实施方案并且能够以多种方式实践或实施。
[0055] 附图简述
[0056] 附图不意在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每一个相同或几乎相同的组件由相同的附图标记表示。为了清楚起见，并非在每幅图中的每个组件都加以标记。在图中：
[0057] 图1A至1D示出了BoNT如何靶向神经元的示意模型(图1A)、它们的总蛋白质结构(图1B)、经鉴定的受体列表(图1C)以及BoNT/B与其受体Syt和神经节苷脂结合的结构模型(图1D)。图1A示出了BoNT作用的示意图：BoNT通过与其特异性受体结合识别神经元(步骤1)，通过受体介导的内吞作用进入神经元(步骤2)，然后BoNT的轻链易位跨过内体膜进入胞质溶胶中(步骤3)，在那里这些轻链充当蛋白酶以切割靶宿主蛋白(步骤4)。图1A改编自Arnon，S.等，JAMA，285：1059，200135。图1B示出了由通过二硫键连接的轻链和重链组成的BoNT。重链可以进一步分为两个结构域：易位结构域(HN)和受体结合结构域(HC)。这些功能结构域可在不同的BoNT之间切换。例如，BoNT/B-HC可用于替代BoNT/A-HC以产生嵌合毒素。
图1C提供了鉴定的毒素受体的列表。图1D是示出了BoNT/B与其蛋白质受体Syt(I/II)以及其脂质共受体神经节苷脂在细胞表面上结合的结构模型。类似于BoNT/DC中的环的延伸环被标记为“环1250”。延伸环标记为“环1250”。图1D改编自Chai等，Nature，444：1096，2006。
图1C提供了鉴定的毒素受体的列表。图1D是示出了BoNT/B与其蛋白质受体Syt(I/II)以及其脂质共受体神经节苷脂在细胞表面上结合的结构模型。类似于BoNT/DC中的环的延伸环被标记为“环1250”。延伸环标记为“环1250”。图1D改编自Chai等，Nature，444：1096，2006。
[0058] 图2A至2B示出了穿透进入脂质膜中的BoNT/DC中的延伸环和BoNT/B中的类似环。图2A示出了BoNT/DC-HC和BoNT/B-HC的叠加晶体结构，其中BoNT/DC-HC和BoNT/B-HC中的延伸环用箭头标记。图2B示出了在质膜(PM)上建模的BoNT/B-HC的晶体结构，其示出了延伸环位于与PM相互作用的理想位置。
[0059] 图3A至3B示出了BoNT/B-HC中的I1248W和V1249W突变增强了毒素与脂质体的结合，并且该增强与神经节苷脂结合具有协同作用。图3A是脂质体浮选测定的示意图。图3B示出了如图3A所示进行的实验的结果。简言之，将含有单独的PC或PC加上脑神经节苷脂混合物(神经节苷脂混合物，1％)的脂质体与指定的BoNT/B-HC一起孵育。将样品在蔗糖梯度中以240,000g离心1小时。收集漂浮到梯度顶部的脂质体级分，并进行检测HA标记的BoNT/B-HC的免疫印迹分析。不含脂质体的样品用作阴性对照。WT BoNT/B-HC不与具有或不具有神经节苷脂的PC脂质体结合。相反，BoNT/B-HC(I1248W)和BoNT/B-HC(I1248W/V1249W)示出与PC脂质体的强结合并进一步增强了与含神经节苷脂的脂质体的结合。
[0060] 图4A至4B示出了BoNT/B-HC中的I1248W和V1249W突变增强了毒素与神经元的结合。图4A示出了暴露于指定的BoNT/B-HC(100nM，在高K+缓冲液中5分钟)的经培养大鼠皮层神经元的结果。洗涤并收获细胞。对细胞裂解物进行免疫印迹分析。肌动蛋白作为内部载样对照。图4B示出了量化并对肌动蛋白水平归一化的如图4A所示的BoNT/B-HC与神经元的结合。BoNT/B-HC(I1248W)示出相对于WT BoNT/B-HC提高2.7倍，并且BoNT/B-HC(I1248W/V1249W)示出提高3.5倍。
[0061] 图5示出了BoNT/B-HC中的I1248W和V1249W突变增强了与突触前神经末梢的特异性结合。将培养的大鼠皮质神经元暴露于指定的BoNT/B-HC(100nM，在高K+缓冲液中5分钟)。洗涤细胞、固定并进行免疫染色分析。突触蛋白被标记为突触前末梢的标志物。与WT BoNT/B-HC相比，BoNT/B-HC(I1248W)和BoNT/B-HC(I1248W/V1249W)示出与神经元的结合大大提高。白色方块标记的区域在下面的图中放大，表明BoNT/B-HC(I1248W)和BoNT/B-HC(I1248W/V1249W)的结合与突触蛋白共定位，从而证明这些突变体保持了对突触前末梢的特异性。
[0062] 某些实施方案的详细描述
[0063] 肉毒杆菌神经毒素是一个细菌毒素家族，包括七种主要血清型(BoNT/A-G)1。这些毒素通过阻断神经递质从神经元释放而发挥作用，从而使动物和人麻痹。近年来，BoNT已被广泛用于治疗越来越多的医学病症：局部注射微量毒素可以在目标区域削弱神经元活性，这在许多医学病症以及对于美容目而言都是有益的2-4。
[0064] BoNT/A和BoNT/B是目前FDA批准用于人的仅有的两种BoNT2-4。这些是从细菌中纯化而来，未经任何序列修饰(定义为野生型，WT)的毒素。随着BoNT的应用不断增加，已经报道了多种限制和副作用。主要限制是在患者中产生中和抗体，这使得随后的治疗无效5。终止使用BoNT往往使患者没有其他有效的方法来治疗/缓解他们的病症。抗体应答的可能性5
与毒素剂量和注射频率二者直接相关。因此，这种限制主要发生在涉及高剂量的毒素的肌肉痉挛治疗中。与此相一致地，在使用极低剂量毒素的美容应用中尚未观察到抗体应答5。
与毒素剂量和注射频率二者直接相关。因此，这种限制主要发生在涉及高剂量的毒素的肌肉痉挛治疗中。与此相一致地，在使用极低剂量毒素的美容应用中尚未观察到抗体应答5。
[0065] 主要副作用也往往与治疗肌肉痉挛有关，但与美容应用无关。这是因为副作用主要是由于毒素扩散至身体的其他区域所致，并且毒素扩散的可能性与注射剂量直接相关。副作用的范围从短暂的非严重事件(例如眼睑下垂和复视)直至危及生命的事件甚至死亡6，7。在由Sidney Wolfe博士于2008年向FDA提交的请求书中，记载了共180例严重不良事件，其中包括16例死亡事件。因此，目前FDA要求在所有BoNT产品上标注“黑框警告”，强调毒素蔓延的风险，这一要求是在欧盟颁布了类似警告后作出的。
[0066] 因为中和抗体的产生和毒素扩散均与注射剂量直接相关，所以非常期望降低毒素剂量(同时保持相同水平的毒素活性)，这意味着必须增强单个毒素分子的效力。这样的具有改进的神经元特异性的经修饰的BoNT也将减少由于非特异性进入其他细胞类型而导致的任何潜在的脱靶效应。
[0067] 增强BoNT识别其神经元受体的能力将促进毒素在注射部位吸收进入神经元，从而屏蔽毒素免于触发免疫应答并防止其扩散。增强对神经元受体的亲和力和特异性也将减少由于非特异性进入其他细胞类型而导致的脱靶效应。
[0068] 通过利用蛋白质和神经节苷脂受体二者，BoNT以极高的效力和特异性获得靶向神经元的能力。BoNT/B在人中的特异性和效力较低，原因是其对人Syt II(h-Syt II)的结合亲和力大大降低。人仍然对BoNT/B敏感，因为BoNT/B仍然与人Syt I结合(h-Syt I)。长期以来的临床观察结果是BoNT/B必须以比BoNT/A高约60至100倍的剂量使用以便在患者中达到相同水平的效果。较高的BoNT/B剂量对应于引发抗体应答和发生严重副作用的机会增加。
[0069] 因此，恢复BoNT/B与其靶细胞(例如神经元)的高亲和力结合可以提高其效力和特异性、降低治疗应用中的剂量以及降低该主要治疗性毒素的有害副作用的发生。最近发现了在第1178、1191或S1199位的BoNT/B受体结合结构域的一系列突变(例如，E1191M/S1199Y、E1191M/S1199W、E1191M/W1178Q、E1191V/S1199Y、1191V/S1199W、E1199V/W1178Q或E1199Q/S1199Y)显著增强了BoNT/B与人Syt II的结合(WO 2013180799，其全部内容通过引用在此并入)。
[0070] 本文中描述了新的BoNT/B突变，其通过先前未调查的机制进一步增强了BoNT/B与其靶细胞的结合。这些新突变的鉴定至少部分地基于观察到一种肉毒杆菌神经毒素BoNT/DC在小鼠中示出最高效力(1.1×109LD50/mg，其比任何其他BoNT高约5至30倍)。与其他BoNT类似，BoNT/DC将共享Syt I/II作为其受体并且需要神经节苷脂作为共受体。因此，其优越的效力可能源于其他不明来源。如图2A中所示，BoNT/DC的晶体结构揭示了受体结合结构域中的延伸环(图2A)32。该环含有许多疏水残基并且在本领域中被广泛接受为神经节苷脂结合环(ganglioside binding loop，GBL)，因为该环内的突变消除了BoNT/DC-HC与固定化DE神经节苷脂的结合33，34。
[0071] 本文中提供了新的和意外的发现：该环不直接参与神经节苷脂结合。相反，该环通过非特异性穿透进入疏水性脂质膜间接地有助于神经节苷脂结合。实际上，发现尖端残基(tip residue)的点突变F1253A消除了BoNT/DC-HC与无神经节苷脂的脂质体的结合，这表明该环的尖端穿透进入脂质膜中。该行为提供了对神经元膜的额外的锚定，这极大地促进了BoNT/DC以协同方式与神经节苷脂和Syt I/II结合，因此增强了BoNT/DC与神经元的总的结合。
[0072] 有趣的是，BoNT/B的晶体结构揭示它具有与BoNT/DC中发现的延伸环类似的延伸环(图2B)15。当BoNT/B与神经节苷脂和Syt I/II结合时，它也位于穿透进入膜的理想位置，即使野生型BoNT/B不具有穿透进入膜的能力。BoNT/B中的环与BoNT/DC中的环之间的主要区别在于它们在环的尖端的暴露残基是不同的：BoNT/B包含I1248/V1249，而BoNT/DC包含W1252/F1253。W和F二者都是典型的疏水残基，具有很强的穿透进入脂质膜的倾向，而I和V不太可能与膜相互作用。用W或F残基替代I1248/V1249可能会在BoNT/B中形成一个可以穿透进入膜的环，就像BoNT/DC中的环一样。
[0073] 因此，本公开内容的一些方面提供了经修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)，其包含的经修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域。
[0074] 本文中使用的术语“肉毒杆菌神经毒素(BoNT)”包括来自肉毒杆菌神经毒素的任何多肽或片段。在一些实施方案中，术语BoNT是指全长BoNT。在一些实施方案中，术语BoNT是指其中可以执行BoNT进入神经元并抑制神经递质释放的总细胞机制的BoNT的片段。在一些实施方案中，术语BoNT仅指BoNT的片段，而不需要该片段具有任何特定功能或活性。在整个本公开内容中对于“肉毒杆菌神经毒素”可用的其他术语可以是BoNT、肉毒杆菌毒素(Botulinum toxins)或肉毒杆菌毒素(C.Botulium)。应理解，这些术语可互换使用。
[0075] “经修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)”包括在氨基酸序列中包含的任何修饰，例如截短、添加、氨基酸替换及其任何组合的BoNT。例如，在I1248或V1249处包含氨基酸替换突变的BoNT是经修饰的BoNT。在另一个实例中，全长BoNT的片段或结构域(例如，受体结合结构域)被认为是经修饰的BoNT。在一些实施方案中，BoNT的结构域还可以包含氨基酸替换突变，例如在对应于全长BoNT的1248或1249位置包含替换突变的受体结合结构域。
[0076] 当用于描述本公开内容的BoNT的作用时，术语“进入细胞”包括BoNT与低或高亲和力受体复合物的结合、BoNT与神经节苷脂的结合、BoNT穿透进入脂质膜、毒素内化、毒素轻链易位进入细胞质中以及BoNT底物的酶修饰。
[0077] 本文中使用的术语“肉毒杆菌神经毒素(BoNT)蛋白酶结构域”意指可以执行中毒过程的酶促靶修饰步骤的BoNT结构域。因此，BoNT蛋白酶结构域特异性地靶向肉毒杆菌毒素底物并且包括肉毒杆菌毒素底物(例如SNARE蛋白如SNAP-25底物、VAMP底物和突触融合蛋白底物)的蛋白水解切割。
[0078] 本文中使用的术语“肉毒杆菌神经毒素(BoNT)易位结构域”或“Hn”意指可以执行中毒过程的易位步骤(介导BoNT轻链易位)的BoNT结构域。因此，Hn促进BoNT轻链移动跨膜进入细胞的细胞质。H的非限制性实例包括BoNT/A H、BoNT/B HN、BoNT/C1HN、BoNT/D HN、BoNT/E HN、BoNT/F HN和BoNT/G HN。
[0079] 本文中使用的术语“肉毒杆菌神经毒素(BoNT)受体结合结构域”与“HC结构域”同义，并且意指可以执行中毒过程的细胞结合(包括例如BoNT与位于靶细胞质膜表面的BoNT特异性受体体系的结合)步骤的任何天然存在的BoNT受体结合结构域。本公开内容的一些方面涉及来自血清型B(BoNT/B)的经修饰的BoNT受体结合结构域，其增强BoNT/B与细胞(例如神经元)的结合。BoNT/B具有八种亚型BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B5、BoNT/B6、BoNT/B7和BoNT/B8。因此，本公开内容包括来自八种亚型中的所有和任一种的经修饰的BoNT/B受体结合结构域。应理解，当提及“BoNT/B”时，它包括BoNT/B的所有亚型。在一些实施方案中，“经修饰的BoNT/B受体结合结构域”包含本公开内容中描述的新的氨基酸替换突变。这样的氨基酸替换突变在经修饰的受体结合结构域中形成“膜穿透环”。当神经元接触经修饰的BoNT/B的受体结合结构域时，这样的“膜穿透环”穿透进入神经元的脂质膜中，增强了BoNT与神经元的结合并促进神经元摄取BoNT/B。这样的分子通常通过遗传重组技术产生。
[0080] 术语“结合活性”意指一个分子通过至少一种分子间或分子内作用力(包括但不限于共价键、离子键、金属键、氢键、疏水相互作用、范德瓦尔斯相互作用等，或其任意组合)直接或间接地与另一个分子相接触。“结合(bound)”和“结合(bind)”被认为是关于结合(binding)的术语。
[0081] 本文中使用的术语“肉毒杆菌神经毒素(BoNT)靶细胞”意指天然存在的BoNT能够导致中毒的天然存在的细胞，包括但不限于运动神经元；感觉神经元；自主神经元；例如，如交感神经元和副交感神经元；非肽能神经元，例如胆碱能神经元、肾上腺素能神经元、去甲肾上腺素能神经元、血清素能神经元(serotonergic neurons)、GABA能神经元；以及肽能神经元，例如，P物质神经元、降钙素基因相关肽神经元、血管活性肠肽神经元、神经肽Y神经元、缩胆囊素神经元。
[0082] 本文中使用的术语“结合亲和力”是指分子对特定受体体系的结合活性强弱。一般而言，高结合亲和力来自结合结构域与其受体体系之间的较大分子间力，而低结合亲和力涉及配体与其受体之间较小的分子间作用力。与低结合亲和力的情况相比，高结合亲和力涉及结合结构域在其受体结合位点处较长的滞留时间。从而，具有高结合亲和力的分子意味着需要较低浓度的该分子以最大限度地占据受体体系的结合位点并触发生理应答。相反，低结合亲和力指需要相对高浓度的分子才能在受体体系的受体结合位点被最大限度地占据并且实现最大程度的生理应答。因此，由于高结合亲和力而具有提高的结合活性的本公开内容的肉毒杆菌神经毒素将允许施用降低剂量的毒素，从而减少或防止与毒素扩散入非目标区域相关的不希望的副作用。
[0083] 当用于描述本公开内容的经修饰的BoNT分子与细胞(例如，神经元)的结合亲和力时，本文中使用的术语“增强的结合”是指与未经替换形式的分子相比，对细胞的结合亲和力的提高(例如，提高野生型分子结合亲和力的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)。在一个实施方案中，所述增强的结合比未经替换的神经毒素(例如，具有天然存在的受体结合结构域的神经毒素)的Kd高一个数量级或更高。在一个实施方案中，所述增强的结合比未经替换的片段的Kd显著更高(例如，1.5X、2.0X、2.5X、3.0X或更多)。
[0084] “分离的”是指对于在天然状态下存在的通常与其相伴的组分具有不同游离度的物质。“分离”表示与原始来源或周围环境的分隔度(degree of separation)，例如，与侧翼DNA或该DNA的天然来源的分隔度。术语“纯化的”用于指物质(例如多肽)相对于制剂的其他组分(例如，其他多肽)，而言是“基本上纯的”。它可以指多肽相对于其他组分而言是至少约50％、60％、70％或75％，优选至少约85％、更优选至少约90％，并且最优选至少约95％纯的。对于多肽而言，术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”是指制剂含有低于约20％，更优选低于约15％、10％、8％、7％，最优低于约约5％、4％、3％、2％、1％或低于1％的一种或多种其他组分(例如，其他多肽或细胞组分)。
[0085] 不指代特定氨基酸，术语“替换突变”可包括通常位于该位置处的野生型残基以外的任何氨基酸。这样的替换可以用非极性(疏水性)氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和脯氨酸)进行替代。替换可以用极性(亲水性)氨基酸(例如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)进行替代。替换可以用带电氨基酸(例如带负电荷的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸和带正电荷的氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)进行替代。
[0086] 本文中所述的替换突变通常是以不同的天然存在的氨基酸残基进行替换，但在某些情况下，也可替换非天然存在的氨基酸残基。本文中使用的术语非天然氨基酸是指天然存在或化学合成的非蛋白原(即非蛋白编码)的氨基酸。实例包括但不限于β-氨基酸(β3和β2)、高氨基酸(homo-amino acids)、脯氨酸和丙酮酸衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、线性核氨基酸、二氨基酸、D-氨基酸和N-甲基氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸可以是经取代的或未经取代的。取代的氨基酸或取代基可以是卤代芳香族氨基酸或脂肪族氨基酸；疏水侧链上的卤代脂肪族或芳香族修饰；或脂肪族或芳香族修饰。
[0087] 使用在Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77，1993中修改的Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68，1990的算法确定两个氨基酸序列的“同一性百分比”。这种算法被并入Altschul等J.Mol.Biol.215：403-10，1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质搜索以获得与目标蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空位时，可以如Altschul等，Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402，1997中所述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
[0088] 本公开内容的经修饰的BoNT在对应于在BoNT血清型B，菌株1(BoNT/B1，SEQ ID NO：1)中1248或1249位置包含一个或更多个氨基酸替换突变。BoNT/B有8种亚型(BoNT/B1至B8)。因此，本文中提供了包含来自BoNT/B1(SEQ ID NO：1)、BoNT/B2(SEQ ID NO：2)、BoNT/B3(SEQ ID NO：3)、BoNT/B4(SEQ ID NO：4)、BoNT/B5(SEQ ID NO：5)、BoNT/B6(SEQ ID NO：6)、BoNT/B7(SEQ ID NO：7)和BoNT/B8(SEQ ID NO：8)中任一个的经修饰的受体结合结构域的经修饰的BoNT多肽，其在对应于SEQ ID NO：1中的1248或1249位置具有替换突变。技术人员将能够基于他/她在蛋白质同源性方面的知识，在有或没有序列比对软件的帮助下确定每种亚型中的替换修饰的位置。
[0089] 在一些实施方案中，在对应于BoNT/B1的1248或1249位置的BoNT/B1-BoNT/B8中任一个的氨基酸残基可各自被色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)替换。在一些实施方案中，两个残基中的一个被替换。在一些实施方案中，两个残基都被替换。在一些实施方案中，对应于BoNT/B1的1248和1249位置的氨基酸残基均被W替换。
[0090] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含来自BoNT/B1的经修饰的受体结合结构域，其包含I1248或V1249中的替换突变。因此，经修饰的BoNT/B1受体结合结构域可包含任何以下突变：I1248F；I1248Y；I1248H；I1248W；V1249W；V1249F；V1249Y；V1249H；I1248W/V1249F；I1248W/V1249Y；I1248W/V1249H；I1248F/V1249Y；I1248F/V1249H；I1248Y/V1249H；I1248F/V1249W；I1248Y/V1249W；I1248H/V1249W；I1248Y/V1249F；I1248H/V1249F；或I1248H/V1249Y(“/”表示双突变)。在一些实施方案中，包含经修饰的BoNT/B1的受体结合结构域的经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，并且还包含任何上述替换突变。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，并包含I1248W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，并包含I1248W/V1249W突变。提供了具有双替换突变I1248W/V1249W的BoNT/B1的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO：33)。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0091] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含来自BoNT/B2的经修饰的受体结合结构域，其包含I1248或V1249中的替换突变。因此，经修饰的BoNT/B2受体结合结构域可包含任何以下突变：I1248F；I1248Y；I1248H；I1248W；V1249W；V1249F；V1249Y；V1249H；I1248W/V1249F；I1248W/V1249Y；I1248W/V1249H；I1248F/V1249Y；I1248F/V1249H；I1248Y/V1249H；I1248F/V1249W；I1248Y/V1249W；I1248H/V1249W；I1248Y/V1249F；I1248H/V1249F；或I1248H/V1249Y(“/”表示双突变)。在一些实施方案中，包含经修饰的BoNT/B2的受体结合结构域的经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且还包含任何上述替换突变。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并包含I1248W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并包含I1248W/V1249W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0092] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含来自BoNT/B3的经修饰的受体结合结构域，其包含I1248或V1249中的替换突变。因此，经修饰的BoNT/B3受体结合结构域可包含任何以下突变：I1248F；I1248Y；I1248H；I1248W；V1249W；V1249F；V1249Y；V1249H；I1248W/V1249F；I1248W/V1249Y；I1248W/V1249H；I1248F/V1249Y；I1248F/V1249H；I1248Y/V1249H；I1248F/V1249W；I1248Y/V1249W；I1248H/V1249W；I1248Y/V1249F；I1248H/V1249F；或I1248H/V1249Y(“/”表示双突变)。在一些实施方案中，包含经修饰的BoNT/B3的受体结合结构域的经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列，并且还包含任何上述替换突变。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列，并包含I1248W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列，并包含I1248W/V1249W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0093] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含经修饰的来自BoNT/B4的受体结合结构域，其包含V1248或L1249中的替换突变。因此，经修饰的BoNT/B4受体结合结构域可包含任何以下突变：V1248F；V1248Y；V1248H；V1248W；L1249W；L1249F；L1249Y；L1249H；L1248W/L1249F；V1248W/L1249Y；V1248W/L1249H；V1248F/L1249Y；V1248F/L1249H；V1248Y/L1249H；V1248F/L1249W；V1248Y/L1249W；V1248H/L1249W；V1248Y/L1249F；V1248H/L1249F；或V1248H/L1249Y(“/”表示双突变)。在一些实施方案中，包含经修饰的BoNT/B4的受体结合结构域的经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列，并且还包含任何上述替换突变。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列，并包含V1248W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列并包含V1248W/L1249W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0094] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含来自BoNT/B5的经修饰的受体结合结构域，其包含I1248或V1249中的替换突变。因此，经修饰的BoNT/B5受体结合结构域可包含任何以下突变：I1248F；I1248Y；I1248H；I1248W；V1249W；V1249F；V1249Y；V1249H；I1248W/V1249F；I1248W/V1249Y；I1248W/V1249H；I1248F/V1249Y；I1248F/V1249H；I1248Y/V1249H；I1248F/V1249W；I1248Y/V1249W；I1248H/V1249W；I1248Y/V1249F；I1248H/V1249F；或I1248H/V1249Y(“/”表示双突变)。在一些实施方案中，包含经修饰的BoNT/B5的受体结合结构域的经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列，并且还包含任何上述替换突变。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列，并包含I1248W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可以包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且包含I1248W/V1249W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0095] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含经修饰的来自BoNT/B6的受体结合结构域，其包含I1248或V1249中的替换突变。因此，经修饰的BoNT/B6受体结合结构域可包含任何以下突变：I1248F；I1248Y；I1248H；I1248W；V1249W；V1249F；V1249Y；V1249H；I1248W/V1249F；I1248W/V1249Y；I1248W/V1249H；I1248F/V1249Y；I1248F/V1249H；I1248Y/V1249H；I1248F/V1249W；I1248Y/V1249W；I1248H/V1249W；I1248Y/V1249F；I1248H/V1249F；或I1248H/V1249Y(“/”表示双突变)。在一些实施方案中，包含经修饰的BoNT/B6的受体结合结构域的经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列，并且还包含任何上述替换突变。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列，并包含I1248W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可以包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列，并包含I1248W/V1249W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0096] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含来自BoNT/B7的经修饰的受体结合结构域，其包含I1248或L1249中的替换突变。因此，经修饰的BoNT/B7受体结合结构域可包含任何以下突变：I1248F；I1248Y；I1248H；I1248W；L1249W；L1249F；L1249Y；L1249H；I1248W/L1249F；I1248W/L1249Y；I1248W/L1249H；I1248F/L1249Y；I1248F/L1249H；I1248Y/L1249H；I1248F/L1249W；I1248Y/L1249W；I1248H/L1249W；I1248Y/L1249F；I1248H/L1249F；或I1248H/L1249Y(“/”表示双突变)。在一些实施方案中，包含经修饰的BoNT/B7的受体结合结构域的经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列，并且还包含任何上述替换突变。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列，并包含I1248W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列，并包含I1248W/L1249W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0097] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含来自BoNT/B8的经修饰的受体结合结构域，其包含F1249或V1250中的替换突变。因此，经修饰的BoNT/B8受体结合结构域可包含任何以下突变：F1249Y；F1249H；F1249W；V1250W；V1250F；V1250Y；V1250H；F1249W/V1250F；F1249W/V1250Y；F1249W/V1250H；F1249Y/V1250H；F1249Y/V1250W；F1249H/V1250W；F1249Y/V1250F；F1249H/V1250F；或F1249H/V1250Y(“/”表示双突变)。在一些实施方案中，包含经修饰的BoNT/B8的受体结合结构域的经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列，并且还包含任何上述替换突变。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列，并包含F1249W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：
8中所示的氨基酸序列，并包含F1249W/V1250W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
8中所示的氨基酸序列，并包含F1249W/V1250W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0098] 在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：1至8中任一个的氨基酸序列，其具有本文中所述的氨基酸替换。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽包含与SEQ ID NO：1至8中的任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有本文中所述的氨基酸替换。例如，经修饰的BoNT多肽可包含与SEQ ID NO：1至8中的任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列，所述氨基酸序列在SEQ ID NO：1至7中任一个的第1248或1249位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：8中的第1249或1250位具有一个或更多个替换突变。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：1至8中的任一个具有
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、
99.5％或100％同一性的氨基酸序列，所述氨基酸序列在SEQ ID NO：1至8中任一个的第
1248或1249位，或在SEQ ID NO：8中的第1249或1250位具有氨基酸替换突变。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：1至8中任一个的氨基酸序列组成，其在对应于BoNT/B1(SEQ ID NO：1)中的1248或1249位置具有氨基酸替换突变。
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、
99.5％或100％同一性的氨基酸序列，所述氨基酸序列在SEQ ID NO：1至8中任一个的第
1248或1249位，或在SEQ ID NO：8中的第1249或1250位具有氨基酸替换突变。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：1至8中任一个的氨基酸序列组成，其在对应于BoNT/B1(SEQ ID NO：1)中的1248或1249位置具有氨基酸替换突变。
[0099] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽包含与SEQ ID NO：33具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，经修饰的BoNT多肽可包含与SEQ ID NO：33具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：33具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：33的氨基酸序列组成。
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：33的氨基酸序列组成。
[0100] 在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽可以是在对应于SEQ ID NO：1中的1248或1249位置包含替换突变的经修饰的BoNT/B的受体结合结构域(例如，BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B5、BoNT/B6、BoNT/B7或BoNT/B8的受体结合结构域)。技术人员将基于他/她在蛋白质同源性方面的知识，在有或没有序列比对软件的帮助下能够确定每种亚型中替换修饰的位置。
[0101] 在一些实施方案中，在对应于BoNT/B1的1248或1249位置的BoNT/B1至BoNT/B8中任一个的受体结合结构域中的氨基酸残基可各自被色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸Y)或组氨酸(H)替换。在一些实施方案中，两个残基中的任一个被替换。在一些实施方案中，两个残基都被替换。在一些实施方案中，对应于BoNT/B1的1248或1249位置的氨基酸残基被W替换。
[0102] 在SEQ ID NO：9至16中分别提供了BoNT/B1至BoNT/B8的受体结合结构域的序列。在SEQ ID NO：9至15中任一个的第389或390位，或在SEQ ID NO：16中的第390和391位进行替换突变。因此，在一些实施方案中，例如但不限于，SEQ ID NO：9至15中任一个的第389和
390位被W替换。
390位被W替换。
[0103] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含来自BoNT/B1的经修饰的受体结合结构域，其包含I389或V390中的替换突变。经修饰的BoNT/B1受体结合结构域可包含任何以下突变：I389F；I389Y；I389H；I389W；V390W；V390F；V390Y；V390H；I389W/V390F；I389W/V390Y；I389W/V390H；I389F/V390Y；I389F/V390H；I389Y/V390H；I389F/V390W；I389Y/V390W；
I389H/V390W；I389Y/V390F；I389H/V390F；或I389H/V390Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列，并包含I389W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可以包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列，并包含I389W/V390W突变。
在一些实施方案中，经修饰的BoNT可以包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I389H/V390W；I389Y/V390F；I389H/V390F；或I389H/V390Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列，并包含I389W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可以包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列，并包含I389W/V390W突变。
在一些实施方案中，经修饰的BoNT可以包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0104] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含来自BoNT/B2的经修饰的受体结合结构域，其包含I389或V390中的替换突变。经修饰的BoNT/B2受体结合结构域可包含任何以下突变：I389F；I389Y；I389H；I389W；V390W；V390F；V390Y；V390H；I389W/V390F；I389W/V390Y；I389W/V390H；I389F/V390Y；I389F/V390H；I389Y/V390H；I389F/V390W；I389Y/V390W；
I389H/V390W；I389Y/V390F；I389H/V390F；或I389H/V390Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列，并包含I389W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列，并包含I389W/V390W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I389H/V390W；I389Y/V390F；I389H/V390F；或I389H/V390Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列，并包含I389W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列，并包含I389W/V390W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0105] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含来自BoNT/B3的经修饰的受体结合结构域，其包含I389或V390中的替换突变。经修饰的BoNT/B3受体结合结构域可包含任何以下突变：I389F；I389Y；I389H；I389W；V390W；V390F；V390Y；V390H；I389W/V390F；I389W/V390Y；I389W/V390H；I389F/V390Y；I389F/V390H；I389Y/V390H；I389F/V390W；I389Y/V390W；
I389H/V390W；I389Y/V390F；I389H/V390F；或I389H/V390Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列，并包含I389W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可以包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列，并包含I389W/V390W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I389H/V390W；I389Y/V390F；I389H/V390F；或I389H/V390Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列，并包含I389W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可以包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列，并包含I389W/V390W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0106] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含来自BoNT/B4的经修饰的受体结合结构域，其包含V389或L390中的替换突变。经修饰的BoNT/B4受体结合结构域可包含任何以下突变：V389F；V389Y；V389H；V389W；L390W；L390F；L390Y；L390H；L389W/L390F；V389W/L390Y；V389W/L390H；V389F/L390Y；V389F/L390H；V389Y/L390H；V389F/L390W；V389Y/L390W；
V389H/L390W；V389Y/L390F；V389H/L390F；或V389H/L390Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列，并包含V389W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列，并包含V389W/L390W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
V389H/L390W；V389Y/L390F；V389H/L390F；或V389H/L390Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列，并包含V389W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列，并包含V389W/L390W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0107] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含来自BoNT/B5的经修饰的受体结合结构域，其包含I389或V390中的替换突变。经修饰的BoNT/B5受体结合结构域可包含任何以下突变：I389F；I389Y；I389H；I389W；V390W；V390F；V390Y；V390H；I389W/V390F；I389W/V390Y；I389W/V390H；I389F/V390Y；I389F/V390H；I389Y/V390H；I389F/V390W；I389Y/V390W；
I389H/V390W；I389Y/V390F；I389H/V390F；或I389H/V390Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列，并包含I389W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列，并包含I389W/V390W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I389H/V390W；I389Y/V390F；I389H/V390F；或I389H/V390Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列，并包含I389W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列，并包含I389W/V390W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0108] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含来自BoNT/B6的经修饰的受体结合结构域，其包含I389或V390中的替换突变。经修饰的BoNT/B6受体结合结构域可包含任何以下突变：I389F；I389Y；I389H；I389W；V390W；V390F；V390Y；V390H；I389W/V390F；I389W/V390Y；I389W/V390H；I389F/V390Y；I389F/V390H；I389Y/V390H；I389F/V390W；I389Y/V390W；
I389H/V390W；I389Y/V390F；I389H/V390F；或I389H/V390Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列，并包含I389W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列，并包含I389W/V390W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I389H/V390W；I389Y/V390F；I389H/V390F；或I389H/V390Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列，并包含I389W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列，并包含I389W/V390W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0109] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含来自BoNT/B7的经修饰的受体结合结构域，其包含I389或L390中的替换突变。经修饰的BoNT/B7受体结合结构域可包含任何以下突变：I389F；I389Y；I389H；I389W；L390W；L390F；L390Y；L390H；I389W/L390F；I389W/L390Y；I389W/L390H；I389F/L390Y；I389F/L390H；I389Y/L390H；I389F/L390W；I389Y/L390W；
I389H/L390W；I389Y/L390F；I389H/L390F；或I389H/L390Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列，并包含I389W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可以包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列，并包含I389W/L390W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I389H/L390W；I389Y/L390F；I389H/L390F；或I389H/L390Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列，并包含I389W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可以包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列，并包含I389W/L390W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0110] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含来自BoNT/B8的经修饰的受体结合结构域，其包含F390或V391中的替换突变。经修饰的BoNT/B8受体结合结构域可包含任何以下突变：F390Y；F390H；F390W；V391W；V391F；V391Y；V391H；F390W/V391F；F390W/V391Y；F390W/V391H；F390Y/V391H；F390Y/V391W；F390H/V391W；F390Y/V391F；F390H/V391F；或F390H/V391Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列，并包含F390W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列，并包含F390W/V391W突变。本文中提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0111] 在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：9至16中任一个的氨基酸序列，其具有本文中所述的氨基酸替换。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽包含与SEQ ID NO：9至16中任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列，其具有本文中所述的氨基酸替换。例如，经修饰的BoNT多肽可包含与SEQ ID NO：9至16中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少
99.5％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：9至15中任一个的第389或390位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：16的第390或391位具有一个或更多个替换突变。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：9至16中的任一个具有85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：9至15中任一个的第389或390位具有氨基酸替换突变，或SEQ ID NO：16中第390或391位具有一个或更多个替换突变。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：9至16中任一个的氨基酸序列组成，其在SEQ ID NO：9至15中任一个的第
389或390位具有氨基酸替换突变，或者在SEQ ID NO：16中的第390或391位具有一个或更多个替换突变。
99.5％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：9至15中任一个的第389或390位具有一个或更多个替换突变，或在SEQ ID NO：16的第390或391位具有一个或更多个替换突变。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：9至16中的任一个具有85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：9至15中任一个的第389或390位具有氨基酸替换突变，或SEQ ID NO：16中第390或391位具有一个或更多个替换突变。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：9至16中任一个的氨基酸序列组成，其在SEQ ID NO：9至15中任一个的第
389或390位具有氨基酸替换突变，或者在SEQ ID NO：16中的第390或391位具有一个或更多个替换突变。
[0112] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽包含与SEQ ID NO：34具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，经修饰的BoNT多肽可包含与SEQ ID NO：34具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：34具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成。
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成。
[0113] 在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽可以是嵌合的BoNT多肽，其包含经修饰的BoNT/B的受体结合结构域(例如，BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B5、BoNT/B6、BoNT/B7或BoNT/B8的受体结合结构域)，其在对应于SEQ ID NO：1中的1248或1249位置包含替换突变。
[0114] 在一个非限制性实例中，可以通过用本文中所述的经修饰的BoNT/B受体结合结构域替代BoNT/A的受体结合结构域来产生嵌合BoNT/BA。应理解，BoNT/B1至BoNT/B8任一个的受体结合结构域都适用于嵌合毒素。同样地，BoNT/A的任何亚型都适用于嵌合毒素(例如，BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4、BoNT/A5、BoNT/A6、BoNT/A7和BoNT/A8)。应理解，当提及BoNT/A时，它包括所有BoNT/A亚型)。
[0115] 因此，本公开内容的嵌合BoNT可以是以下任何组合：BoNT/A1-B1、BoNT/A2-B1、BoNT/A3-B1、BoNT/A4-B1、BoNT/A5-B1、BoNT/A7-B1、BoNT/A7-B1、BoNT/A8-B1、BoNT/A2-B1、BoNT/A2-B2、BoNT/A2-B3、BoNT/A2-B4、BoNT/A2-B5、BoNT/A2-B6、BoNT/A2-B7、BoNT/A2-B8、BoNT/A3-B1、BoNT/A3-B2、BoNT/A3-B3、BoNT/A3-B4、BoNT/A3-B5、BoNT/A3-B6、BoNT/A3-B7、BoNT/A3-B8、BoNT/A4-B1、BoNT/A4-B2、BoNT/A4-B3、BoNT/A4-B4、BoNT/A4-B5、BoNT/A4-B6、BoNT/A4-B7、BoNT/A4-B8、BoNT/A5-B1、BoNT/A5-B2、BoNT/A5-B3、BoNT/A5-B4、BoNT/A5-B5、BoNT/A5-B6、BoNT/A5-B7、BoNT/A5-B8、BoNT/A6-B1、BoNT/A6-B2、BoNT/A6-B3、BoNT/A6-B4、BoNT/A6-B5、BoNT/A6-B6、BoNT/A6-B7、BoNT/A6-B8、BoNT/A7-B1、BoNT/A7-B2、BoNT/A7-B3、BoNT/A7-B4、BoNT/A7-B5、BoNT/A7-B6、BoNT/A7-B7、BoNT/A7-B8、BoNT/A8-B1、BoNT/A8-B2、BoNT/A8-B3、BoNT/A8-B4、BoNT/A8-B5、BoNT/A8-B6、BoNT/A8-B7或BoNT/A8-B8。应理解，当提及“BoNT/AB”时，其包括本文中所述的所有亚型的组合。本领域技术人员将能够基于他/她在蛋白质同源性方面的知识，在有或没有序列比对软件的帮助下确定每种嵌合毒素中的替换修饰的位置。
[0116] 为了产生嵌合毒素例如BoNT/AB毒素，将包含BoNT/A1至BoNT/A8(SEQ ID NO：38中45)中任一个的约1至872位氨基酸的BoNT/A片段与任何BoNT/B的受体结合结构域(例如，BoNT/B1至BoNT/B8任一个的受体结合结构域)融合。BoNT/B的受体结合结构域对应于BoNT/B1的约860至1291位氨基酸。应理解，BoNT/A片段和/或BoNT/B的受体结合结构域的边界可以改变1至10个氨基酸。例如，可用于嵌合毒素的BoNT/A片段可包含BoNT/A1至BoNT/A8中任一个的氨基酸1至872、1至871、1至870、1至869、1至868、1至867、1至866、1至865、1至864、1至863、1至873、1至874、1至875、1至876、1至877、1至878、1至879、1至880、1至881或1至882。
同样地，可用于嵌合毒素的BoNT/B的受体结合结构域可包含BoNT/B1至BoNT/B8中任一个的氨基酸861至1291、862至1291、863至1291、864至1291、865至1291、866至1291、867至1291、
868至1291、869至1291、870至1291、860至1291、859至1291、858至1291、857至1291、856至
1291、855至1291、854至1291、853至1291、852至1291或851至1291。将BoNT/A和BoNT/B片段融合的方法是本领域技术人员熟知的标准重组技术。
同样地，可用于嵌合毒素的BoNT/B的受体结合结构域可包含BoNT/B1至BoNT/B8中任一个的氨基酸861至1291、862至1291、863至1291、864至1291、865至1291、866至1291、867至1291、
868至1291、869至1291、870至1291、860至1291、859至1291、858至1291、857至1291、856至
1291、855至1291、854至1291、853至1291、852至1291或851至1291。将BoNT/A和BoNT/B片段融合的方法是本领域技术人员熟知的标准重组技术。
[0117] BoNTA1-B1、BoNT/A2-B1、BoNT/A3-B1、BoNT/A4-B1、BoNT/A5-B1、BoNT/A6-B1、BoNT/A7-B1和BoNT/A8-B1的非限制性示例性序列分别作为SEQ ID NO：17至24提供。对应于BoNT/B1中的第1248或1249位的位置是SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261或1262位。
[0118] 在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽包含BoNT/A1多肽，其受体结合结构域被来自BoNT/B1(BoNT/A1至B1)的经修饰的受体结合结构域替代，所述受体结合结构域在第1261或1262位包含替换突变。嵌合BoNT/A1至B1可包含任何以下突变：I1261F；I1261Y；I1261H；
I1261W；V1262W；V1262F；V1262Y；V1262H；I1261W/V1262F；I1261W/V1262Y；I1261W/V1262H；
I1261F/V1262Y；I1261F/V1262H；I1261Y/V1262H；I1261F/V1262W；I1261Y/V1262W；I1261H/V1262W；I1261Y/V1262F；I1261H/V1262F；或I1261H/V1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列，并包含I1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，并包含I1261W/V1262W突变。在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I1261W；V1262W；V1262F；V1262Y；V1262H；I1261W/V1262F；I1261W/V1262Y；I1261W/V1262H；
I1261F/V1262Y；I1261F/V1262H；I1261Y/V1262H；I1261F/V1262W；I1261Y/V1262W；I1261H/V1262W；I1261Y/V1262F；I1261H/V1262F；或I1261H/V1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列，并包含I1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，并包含I1261W/V1262W突变。在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0119] 在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽包含BoNT/A2多肽，其受体结合结构域被来自BoNT/B1(BoNT/A2至B1)的经修饰的受体结合结构域替代，所述受体结合结构域在第1261或1262位包含替换突变。嵌合BoNT/A2至B1可包含任何以下突变：I1261F；I1261Y；I1261H；
I1261W；V1262W；V1262F；V1262Y；V1262H；I1261W/V1262F；I1261W/V1262Y；I1261W/V1262H；
I1261F/V1262Y；I1261F/V1262H；I1261Y/V1262H；I1261F/V1262W；I1261Y/V1262W；I1261H/V1262W；I1261Y/V1262F；I1261H/V1262F；或I1261H/V1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列，并包含I1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列，并包含I1261W/V1262W突变。在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I1261W；V1262W；V1262F；V1262Y；V1262H；I1261W/V1262F；I1261W/V1262Y；I1261W/V1262H；
I1261F/V1262Y；I1261F/V1262H；I1261Y/V1262H；I1261F/V1262W；I1261Y/V1262W；I1261H/V1262W；I1261Y/V1262F；I1261H/V1262F；或I1261H/V1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列，并包含I1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列，并包含I1261W/V1262W突变。在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0120] 在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽包含BoNT/A3多肽，其受体结合结构域被来自BoNT/B1(BoNT/A3至B1)的经修饰的受体结合结构域替代，其在第1261或1262位包含替换突变。嵌合BoNT/A3至B1可包含任何以下突变：I1261F；I1261Y；I1261H；I1261W；V1262W；V1262F；V1262Y；V1262H；I1261W/V1262F；I1261W/V1262Y；I1261W/V1262H；I1261F/V1262Y；
I1261F/V1262H；I1261Y/V1262H；I1261F/V1262W；I1261Y/V1262W；I1261H/V1262W；I1261Y/V1262F；I1261H/V1262F；或I1261H/V1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列，并包含I1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列，并包含I1261W/V1262W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I1261F/V1262H；I1261Y/V1262H；I1261F/V1262W；I1261Y/V1262W；I1261H/V1262W；I1261Y/V1262F；I1261H/V1262F；或I1261H/V1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列，并包含I1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列，并包含I1261W/V1262W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0121] 在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽包含BoNT/A4多肽，其受体结合结构域被来自BoNT/B1(BoNT/A4至B1)的经修饰的受体结合结构域替代，所述受体结合结构域在第1261或1262位包含替换突变。嵌合BoNT/A4至B1可包含任何以下突变：V1261F；V1261Y；V1261H；
V1261W；L1262W；L1262F；L1262Y；L1262H；L1261W/L1262F；V1261W/L1262Y；V1261W/L1262H；
V1261F/L1262Y；V1261F/L1262H；V1261Y/L1262H；V1261F/L1262W；V1261Y/L1262W；V1261H/L1262W；V1261Y/L1262F；V1261H/L1262F；或V1261H/L1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，并包含V1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列并包含V1261W/L1262W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
V1261W；L1262W；L1262F；L1262Y；L1262H；L1261W/L1262F；V1261W/L1262Y；V1261W/L1262H；
V1261F/L1262Y；V1261F/L1262H；V1261Y/L1262H；V1261F/L1262W；V1261Y/L1262W；V1261H/L1262W；V1261Y/L1262F；V1261H/L1262F；或V1261H/L1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，并包含V1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列并包含V1261W/L1262W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0122] 在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽包含BoNT/A5多肽，其受体结合结构域被来自BoNT/B1(BoNT/A5至B1)的经修饰的受体结合结构域替代，其在第1261或1262位包含替换突变。嵌合BoNT/A5至B1可包含任何以下突变：I1261F；I1261Y；I1261H；I1261W；V1262W；V1262F；V1262Y；V1262H；I1261W/V1262F；I1261W/V1262Y；I1261W/V1262H；I1261F/V1262Y；
I1261F/V1262H；I1261Y/V1262H；I1261F/V1262W；I1261Y/V1262W；I1261H/V1262W；I1261Y/V1262F；I1261H/V1262F；或I1261H/V1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列，并包含I1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列，并包含I1261W/V1262W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I1261F/V1262H；I1261Y/V1262H；I1261F/V1262W；I1261Y/V1262W；I1261H/V1262W；I1261Y/V1262F；I1261H/V1262F；或I1261H/V1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列，并包含I1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列，并包含I1261W/V1262W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0123] 在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽包含BoNT/A6多肽，其受体结合结构域被来自BoNT/B1(BoNT/A6至B1)的经修饰的受体结合结构域替代，其在第1261或1262位包含替换突变。嵌合BoNT/A6至B1可包含任何以下突变：I1261F；I1261Y；I1261H；I1261W；V1262W；V1262F；V1262Y；V1262H；I1261W/V1262F；I1261W/V1262Y；I1261W/V1262H；I1261F/V1262Y；
I1261F/V1262H；I1261Y/V1262H；I1261F/V1262W；I1261Y/V1262W；I1261H/V1262W；I1261Y/V1262F；I1261H/V1262F；或I1261H/V1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列，并包含I1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列，并包含I1261W/V1262W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I1261F/V1262H；I1261Y/V1262H；I1261F/V1262W；I1261Y/V1262W；I1261H/V1262W；I1261Y/V1262F；I1261H/V1262F；或I1261H/V1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列，并包含I1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列，并包含I1261W/V1262W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0124] 在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽包含BoNT/A7多肽，其受体结合结构域被来自BoNT/B1(BoNT/A7至B1)的经修饰的受体结合结构域替代，其在第1261或1262位包含替换突变。嵌合BoNT/A7至B1可包含任何以下突变：I1261F；I1261Y；I1261H；I1261W；L1262W；L1262F；L1262Y；L1262H；I1261W/L1262F；I1261W/L1262Y；I1261W/L1262H；11261F/L1262Y；
I1261F/L1262H；I1261Y/L1262H；I1261F/L1262W；I1261Y/L1262W；I1261H/L1262W；I1261Y/L1262F；I1261H/L1262F；或I1261H/L1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列，并包含I1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列，并包含I1261W/L1262W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I1261F/L1262H；I1261Y/L1262H；I1261F/L1262W；I1261Y/L1262W；I1261H/L1262W；I1261Y/L1262F；I1261H/L1262F；或I1261H/L1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列，并包含I1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列，并包含I1261W/L1262W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0125] 在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽包含BoNT/A8多肽，其受体结合结构域被来自BoNT/B1(BoNT/A8至B1)的经修饰的受体结合结构域替代，其在第1261或1262位包含替换突变。嵌合BoNT/A8-B1可包含任何以下突变：F1261Y；F1261H；F1261W；V1262W；V1262F；V1262Y；V1262H；F1261W/V1262F；F1261W/V1262Y；F1261W/V1262H；F1261Y/V1262H；F1261Y/V1262W；F1261H/V1262W；F1261Y/V1262F；F1261H/V1262F；或F1261H/V1262Y(“/”表示双突变)。例如，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：24中所示的氨基酸序列，并包含F1261W突变。在另一个实例中，嵌合BoNT多肽可包含SEQ ID NO：24中所示的氨基酸序列，并包含F1261W/V1262W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0126] 在一些实施方案中，本公开内容的嵌合BoNT多肽包含SEQ ID NO：17至24中任一个的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有本文中所述的氨基酸替换。在一些实施方案中，本公开内容的嵌合BoNT多肽包含与SEQ ID NO：17至24中任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列，其具有本文中所述的氨基酸替换。例如，嵌合BoNT多肽可包含与SEQ ID NO：17至24中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少
99.5％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261或1262位具有一个或更多个替换突变。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：17至24中的任一个具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261或
1262位具有氨基酸替换突变。在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽由SEQ ID NO：17至24中任一个的氨基酸序列组成，其在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261或1262位具有氨基酸替换突变。
99.5％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261或1262位具有一个或更多个替换突变。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：17至24中的任一个具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261或
1262位具有氨基酸替换突变。在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽由SEQ ID NO：17至24中任一个的氨基酸序列组成，其在SEQ ID NO：17至24中任一个的第1261或1262位具有氨基酸替换突变。
[0127] 在一些实施方案中，嵌合BoNT多肽包含SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽包含与SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，经修饰的BoNT多肽可包含与SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36至少具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36的氨基酸序列组成。
94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36的氨基酸序列组成。
[0128] 本公开内容的经修饰的BoNT多肽(例如，经修饰的全长BoNT/B、BoNT/B的经修饰的受体结合结构域或BoNT/BA嵌合毒素)可包含进一步增强其与靶细胞的结合亲和力的额外突变。这样的突变的实例描述于WO2013180799中，其全部内容通过引用并入本文。因此，本公开内容的经修饰的BoNT多肽还可以在BoNT/B受体结合结构域中对应于BoNT/B1中的1178、1191或1199位置的包含一系列突变(例如，E1191M/S1199Y、E1191M/S1199W、E1191M/W1178Q、E1191V/S1199Y、1191V/S1199W、E1199V/W1178Q或E1199Q/S1199Y)，显著增强了BoNT/B与人Syt II的结合。
[0129] 在一些实施方案中，还包含增强BoNT与人SytII结合的这些替换突变的本公开内容之经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：46至66中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含与SEQ ID NO：46至66中的任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，经修饰的BoNT多肽可包含与SEQ ID NO：46至66中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：46至66中的任一个具有85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：46至66中任一个的氨基酸序列组成。
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：46至66中任一个的氨基酸序列组成。
[0130] 本文中所述的氨基酸替换突变，例如BoNT/B1的I1248W/V1249W，产生穿透进入脂质膜的环，其进而增强BoNT与其靶细胞的结合。野生型BoNT/B中不存在这样的环。因此，本文中还提供了构成所述环的经修饰的BoNT/B多肽，其对应于BoNT/B1的氨基酸1245和氨基酸1252之间的片段，其在对应于BoNT/B1中的1248或1249位置具有一个或更多个替换突变。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含BoNT/B1(包括SEQ ID NO：25)的氨基酸1245和氨基酸1252之间的片段，其在对应于BoNT/B1中的第4或5位(SEQ ID NO：25中的第4和位5)具有一个或更多个替换突变。因此，所述片段可包含任何以下突变：I4F；I4Y；I4H；I4W；V5W；
V5F；V5Y；V5H；I4W/V5F；I4W/V5Y；I4W/V5H；I4F/V5Y；I4F/V5H；I4Y/V5H；I4F/V5W；I4Y/V5W；
I4H/V5W；I4Y/V5F；I4H/V5F；或I4H/V5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列，并包含I4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列，并包含I4W/V5W突变。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT可以包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
V5F；V5Y；V5H；I4W/V5F；I4W/V5Y；I4W/V5H；I4F/V5Y；I4F/V5H；I4Y/V5H；I4F/V5W；I4Y/V5W；
I4H/V5W；I4Y/V5F；I4H/V5F；或I4H/V5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列，并包含I4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列，并包含I4W/V5W突变。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT可以包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0131] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含BoNT/B2(包括SEQ ID NO：26)的氨基酸1245和氨基酸1252之间的片段，所述多肽在对应于BoNT/B1中的第4或5位(SEQ ID NO：26中的第4或5位)具有一个或更多个替换突变。因此，所述片段可包含任何以下突变：I4F；I4Y；I4H；I4W；V5W；V5F；V5Y；V5H；I4W/V5F；I4W/V5Y；I4W/V5H；I4F/V5Y；I4F/V5H；I4Y/V5H；
I4F/V5W；I4Y/V5W；I4H/V5W；I4Y/V5F；I4H/V5F；或I4H/V5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列，并包含I4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列，并包含I4W/V5W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I4F/V5W；I4Y/V5W；I4H/V5W；I4Y/V5F；I4H/V5F；或I4H/V5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列，并包含I4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列，并包含I4W/V5W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0132] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含BoNT/B3(包括SEQ ID NO：27)的氨基酸1245和氨基酸1252之间的片段，所述多肽在对应于BoNT/B1中的第4或5位(SEQ ID NO：27中的第4或5位)具有一个或更多个替换突变。因此，所述片段可包含任何以下突变：I4F；I4Y；I4H；I4W；V5W；V5F；V5Y；V5H；I4W/V5F；I4W/V5Y；I4W/V5H；I4F/V5Y；I4F/V5H；I4Y/V5H；
I4F/V5W；I4Y/V5W；I4H/V5W；I4Y/V5F；I4H/V5F；或I4H/V5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列，并包含I4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列，并包含I4W/V5W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I4F/V5W；I4Y/V5W；I4H/V5W；I4Y/V5F；I4H/V5F；或I4H/V5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列，并包含I4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列，并包含I4W/V5W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0133] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含BoNT/B4(包括SEQ ID NO：28)的氨基酸1245和氨基酸1252之间的片段，所述多肽在对应于BoNT/B1的第4或5位(SEQ ID NO：28中的第4或5位)具有一个或更多个替换突变。因此，所述片段可包含任何以下突变：V4F；V4Y；V4H；V4W；L5W；L5F；L5Y；L5H；L4W/L5F；V4W/L5Y；V4W/L5H；V4F/L5Y；V4F/L5H；V4Y/L5H；V4F/L5W；V4Y/L5W；V4H/L5W；V4Y/L5F；V4H/L5F；或V4H/L5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：28中所示的氨基酸序列并包含V4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可以包含SEQ ID NO：28中所示的氨基酸序列并包含V4W/L5W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0134] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含BoNT/B5(包括SEQ ID NO：29)的氨基酸1245和氨基酸1252之间的片段，其在对应于BoNT/B1中的第4或5位(SEQ ID NO：29中的第4或5位)具有一个或更多个替换突变。因此，所述片段可包含任何以下突变：I4F；I4Y；I4H；
I4W；V5W；V5F；V5Y；V5H；I4W/V5F；I4W/V5Y；I4W/V5H；I4F/V5Y；I4F/V5H；I4Y/V5H；I4F/V5W；
I4Y/V5W；I4H/V5W；I4Y/V5F；I4H/V5F；或I4H/V5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并包含I4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并包含I4W/V5W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I4W；V5W；V5F；V5Y；V5H；I4W/V5F；I4W/V5Y；I4W/V5H；I4F/V5Y；I4F/V5H；I4Y/V5H；I4F/V5W；
I4Y/V5W；I4H/V5W；I4Y/V5F；I4H/V5F；或I4H/V5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并包含I4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并包含I4W/V5W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0135] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含BoNT/B6(包括SEQ ID NO：30)的氨基酸1245和氨基酸1252之间的片段，其在对应于BoNT/B1的第4或5位(SEQ ID NO：30中的第4或5位)具有一个或更多个替换突变。因此，所述片段可包含任何以下突变：I4F；I4Y；I4H；I4W；V5W；V5F；V5Y；V5H；I4W/V5F；I4W/V5Y；I4W/V5H；I4F/V5Y；I4F/V5H；I4Y/V5H；I4F/V5W；
I4Y/V5W；I4H/V5W；I4Y/V5F；I4H/V5F；或I4H/V5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：30中所示的氨基酸序列并包含I4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：30中所示的氨基酸序列并包含I4W/V5W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I4Y/V5W；I4H/V5W；I4Y/V5F；I4H/V5F；或I4H/V5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：30中所示的氨基酸序列并包含I4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：30中所示的氨基酸序列并包含I4W/V5W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0136] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含BoNT/B7(包括SEQ ID NO：31)的氨基酸1245和氨基酸1252之间的片段，其在对应于BoNT/B1中的第4或5位(SEQ ID NO：31中的第4或5位)具有一个或更多个替换突变。因此，所述片段可包含任何以下突变：I4F；I4Y；I4H；
I4W；L5W；L5F；L5Y；L5H；I4W/L5F；I4W/L5Y；I4W/L5H；I4F/L5Y；I4F/L5H；I4Y/L5H；I4F/L5W；
I4Y/L5W；I4H/L5W；I4Y/L5F；I4H/L5F；或I4H/L5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列，并包含I4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列，并包含I4W/L5W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
I4W；L5W；L5F；L5Y；L5H；I4W/L5F；I4W/L5Y；I4W/L5H；I4F/L5Y；I4F/L5H；I4Y/L5H；I4F/L5W；
I4Y/L5W；I4H/L5W；I4Y/L5F；I4H/L5F；或I4H/L5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列，并包含I4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列，并包含I4W/L5W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0137] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含BoNT/B8(包括SEQ ID NO：32)的氨基酸1246和氨基酸1253之间的片段，其在对应于BoNT/B1中的第4或5位(SEQ ID NO：32中的第4或5位)具有一个或更多个替换突变。因此，所述片段可包含任何以下突变：F4Y；F5H；F4W；
V5W；V5F；V5Y；V5H；F4W/V5F；F4W/V5Y；F4W/V5H；F4Y/V5H；F4Y/V5W；F4H/V5W；F4Y/V5F；F4H/V5F；或F4H/V5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列并包含F4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可以包含SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列并包含F4W/V5W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
V5W；V5F；V5Y；V5H；F4W/V5F；F4W/V5Y；F4W/V5H；F4Y/V5H；F4Y/V5W；F4H/V5W；F4Y/V5F；F4H/V5F；或F4H/V5Y(“/”表示双突变)。例如，经修饰的BoNT多肽可包含SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列并包含F4W突变。在另一个实例中，经修饰的BoNT多肽可以包含SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列并包含F4W/V5W突变。这里的实例仅用于说明目的，并不意味着限制。
[0138] 在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：25至32中任一个的氨基酸序列，其具有本文中所述的氨基酸替换。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽包含与SEQ ID NO：25至32中的任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列，其具有本文中所述的氨基酸替换。例如，经修饰的BoNT多肽可包含与SEQ TD NO：25至32中的任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：25至32中任一个的第4或5位具有一个或更多个替换突变。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：25至32中的任一个具有
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、
99.5％或100％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：25至32中任一个的第4或5位具有氨基酸替换突变。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：25至32中任一个的氨基酸序列组成，其在SEQ ID NO：25至32中任一个的第4或5位具有氨基酸替换突变。
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、
99.5％或100％同一性的氨基酸序列，其在SEQ ID NO：25至32中任一个的第4或5位具有氨基酸替换突变。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：25至32中任一个的氨基酸序列组成，其在SEQ ID NO：25至32中任一个的第4或5位具有氨基酸替换突变。
[0139] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽包含与SEQ ID NO：37具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，经修饰的BoNT多肽可包含与SEQ ID NO：37具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：37具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成。
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成。
[0140] 在另一些实施方案中，经修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽包含四个结构域：a)蛋白酶结构域；b)蛋白酶切割位点；c)易位结构域；d)经修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域，其在对应于BoNT血清型B，菌株1(BoNT/B1)中的1248或1249位置包含一个或更多个替换突变。应理解，经修饰的BoNT/B的受体结合结构域可以来自任一种BoNT/B亚型，例如BoNT/B、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B5、BoNT/B6、BoNT/B7或BoNT/B8。
[0141] 在一些实施方案中，(d)的经修饰的受体结合结构域在本文中所述的两个残基的任一个中包含一个替换突变。在一些实施方案中，一个替换突变对应于BoNT/B1中的I1248F、I1248Y、I1248H、I1248W、V1249W、V1249F、V1249Y或V1249H。在一些实施方案中，(d)的经修饰的受体结合结构域包含两个替换突变。在一些实施方案中，两个替换突变对应于BoNT/B1中的I1248W/V1249F、I1248W/V1249Y、I1248W/V1249H、I1248F/V1249Y、I1248F/V1249H、I1248Y/V1249H、I1248F/V1249W、I1248Y/V1249W、I1248H/V1249W、I1248Y/V1249F、I1248H/V1249F或I1248H/V1249Y。
[0142] 在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽是嵌合毒素，其中蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自选自A、B、C、D、E、F、G及其组合的血清型。因此，考虑了BoNT/AB、BoNT/CB、BoNT/DB、BoNT/EB、BoNT/FB和BoNT/GB的嵌合毒素，其中蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自血清型A、C、D、E、F和G的任一种，并且受体结合结构域来自BoNT/B。例如，在一些实施方案中，蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点可以来自血清型A。在一些实施方案中，经修饰的BoNT多肽是全长BoNT/B。例如，蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点可以来自血清型B。对BoNT多肽的这样修饰使其能够穿透进入脂质膜中并增强其对其靶细胞(例如神经元)的结合亲和力。
[0143] 本公开内容的其他方面涉及制备经修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)的方法，所述方法包括在对应于血清型B，菌株1(BoNT/B1)中1248或1249的位置产生一个或更多个替换突变。在一些实施方案中，替换突变对应于BoNT/B中的I1248F；I1248Y；I1248H；I1248W；V1249W；V1249F；V1249Y；V1249H；I1248W/V1249F；I1248W/V1249Y；I1248W/V1249H；I1248F/V1249Y；I1248F/V1249H；I1248Y/V1249H；I1248F/V1249W；I1248Y/V1249W；I1248H/V1249W；
I1248Y/V1249F；I1248H/V1249F；或I1248H/V1249Y。在一些实施方案中，BoNT多肽是BoNT血清型B(BoNT/B)。在一些实施方案中，BoNT多肽是BoNT/B，菌株1至8中的任一种。
I1248Y/V1249F；I1248H/V1249F；或I1248H/V1249Y。在一些实施方案中，BoNT多肽是BoNT血清型B(BoNT/B)。在一些实施方案中，BoNT多肽是BoNT/B，菌株1至8中的任一种。
[0144] 本公开内容的经修饰的BoNT多肽(例如但不限于，包含SEQ ID NO：33至37和46至66中任一个的氨基酸序列的多肽)通常通过在合适的细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)或昆虫细胞)中表达形式的重组核酸来产生并分离。可以通过本领域已知的任何方法获得编码本文中所述多肽的核酸，并确定核酸的核苷酸序列。
[0145] 本文中还提供了编码本文中公开的任何经修饰的BoNT多肽的分离的和/或重组的核酸。编码本公开内容的分离的多肽片段的核酸可以是双链或单链的DNA或RNA。在某些方面，编码分离的多肽片段的主题核酸应进一步理解为包括编码本文中所述的任何经修饰的BoNT多肽之变体的多肽的核酸。
[0146] 变体核苷酸序列包括通过一个或更多个核苷酸替换、添加或缺失而不同的序列，例如等位基因变体。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：33至37和46至66中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：33至37和46至66中任一个具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0147] 在一些实施方案中，核酸包含在载体(例如表达载体)内。在一些实施方案中，载体包含与核酸可操作地连接的启动子。
[0148] 多种启动子可用于表达本文中所述的多肽，其包括但不限于巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子，病毒LTR例如劳氏肉瘤病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1 LTR、猿猴病毒40(SV40)早期启动子，大肠杆菌lac UV5启动子和单纯疱疹tk病毒启动子。还可以使用可调节的启动子。这样的可调节的启动子包括使用来自大肠杆菌的lac阻遏物作为转录调节子来调节携带lac操作子的哺乳动物细胞启动子的转录的那些[Brown，M.等.，Cell，49：603-612(1987)]、使用四环素阻遏物(tetR)的那些[Gossen，M.，和Bujard，H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(1992)；Yao，F.等.，Human Gene Therapy，9：
1939-1950(1998)；Shockelt，P.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：6522-6526(1995)]。
1939-1950(1998)；Shockelt，P.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：6522-6526(1995)]。
[0149] 其他系统包括FK506二聚体、使用astradiol、RU486、diphenol murislerone的VP16或p65或雷帕霉素。可诱导系统可从Invitrogen、Clontech和Ariad获得。可以使用包括具有操纵子的阻遏物的可调节启动子。在一个实施方案中，来自大肠杆菌的lac阻遏物可以作为转录调节子起作用来调节携带lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录[M.Brown等.，Cell，49：603-612(1987)]；Gossen和Bujard(1992)；[M.Gossen等.，Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992)]将四环素阻遏物(tetR)与转录激活因子(VP16)组合以产生tetR-哺乳动物细胞转录激活子融合蛋白tTa(tetR-VP 16)，与来自人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期启动子的携带tetO的最小启动子组合以产生tetR-tet操纵子系统从而控制哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施方案中，使用四环素诱导型开关(Yao等.，Human Gene Therapy；Gossen等.，Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992)；Shockett等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：6522-6526(1995))。
[0150] 另外，载体可以含有，例如，以下的一些或全部：选择标记基因例如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平的转录的来自人CMV的立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止和RNA加工信号；用于合适的附加型复制的SV40多瘤病毒复制起点和ColE1；内部核糖体结合位点(IRES)，多功能多克隆位点；以及用于有义和反义RNA的体外转录的T7和SP6RNA启动子。合适载体和用于产生含有转基因的载体的方法是本领域熟知的并且是可获得的。
[0151] 可以通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包含核酸的表达载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生本文中所述的多肽。在一些实施方案中，本文中所述多肽的表达受组成型、诱导型或组织特异性启动子的调节。
[0152] 用于表达本文中所述的分离的多肽的宿主细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌，或优选真核细胞。特别地，与例如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件等载体结合的哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是免疫球蛋白的有效表达系统(Foecking等(1986)“Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors，”Gene 45：101-106；Cockett等.(1990)“High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification，”Biotechnology 8：662-667)。多种宿主表达载体系统可用于表达本文中所述的分离的多肽。这样的宿主表达系统代表可以通过其产生和随后纯化本文中所述的分离的多肽的编码序列的载体，但也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本文中所述的分离的多肽的细胞。这些包括但不限于用含有本文中所述分离多肽的编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物如细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有编码本文中所述分离多肽的序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces pichia))；用含有编码本文中所述分离多肽的序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有编码本文中所述分离多肽的序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染的或重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、293T、
3T3细胞、淋巴细胞(参见美国专利号5,807,715)、Per C.6细胞(由Crucell开发的人视网膜细胞)，所述重组表达构建体含有来自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的基因组的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
3T3细胞、淋巴细胞(参见美国专利号5,807,715)、Per C.6细胞(由Crucell开发的人视网膜细胞)，所述重组表达构建体含有来自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的基因组的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
[0153] 在细菌系统中，根据所表达的多肽的预期用途，可以有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量这样的蛋白质时，为了产生本文中所述的多肽的药物组合物，可能期望指导易于纯化的高水平融合蛋白产物的表达的载体。这样的载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Rüther等(1983)“Easy Identification Of cDNA Clones，”EMBO J.2：1791-1794)，其中编码序列可单个地连接到载体中并与lac Z编码区同框，从而产生融合蛋白；
pIN载体(Inouye等(1985)“Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli，”Nucleic Acids Res.13：3101-3110；Van Heeke等.(1989)“Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli，”J.Biol.Chem.24：5503-5509)；等等。
pGEX载体也可用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，这样的融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附和结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。
pIN载体(Inouye等(1985)“Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli，”Nucleic Acids Res.13：3101-3110；Van Heeke等.(1989)“Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli，”J.Biol.Chem.24：5503-5509)；等等。
pGEX载体也可用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，这样的融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附和结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。
[0154] 设计pGEX载体以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。编码序列可以单独克隆到病毒的非必需区域(例如，多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
[0155] 在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统。在其中使用腺病毒作为表达载体的情况下，目的编码序列可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如，E1或E3区)将得到重组病毒，其可存活并且能够在受感染的宿主中表达免疫球蛋白分子(例如，参见Logan等(1984)“Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3655-3659)。为了有效翻译插入的抗体编码序列，还可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所期望编码序列的阅读框同相，以确保整个插入序列的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以具有多种来源，包括天然的和合成的二者。
[0156] 通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等可以增强表达效率(参见Bitter等(1987)“Expression And Secretion Vectors For Yeast，”Methods in Enzymol.153：516-544)。另外，可以选择调节插入序列的表达，或以所期望的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这种修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。例如，在某些实施方案中，本文中所述的多肽可以表达为单个基因产物(例如，作为单个多肽链，即作为多蛋白前体)，这需要通过天然或重组细胞机制进行蛋白水解切割以形成本文中所述的单独多肽。
[0157] 因此，本公开内容包括工程改造核酸序列以编码包含本文中所述多肽的多蛋白前体分子，其包括能够指导所述多蛋白前体的翻译后切割的编码序列。多蛋白前体的翻译后切割产生本文中所述的多肽。包含本文中所述多肽的前体分子的翻译后切割可以在体内发生(即，在宿主细胞内通过天然或重组细胞系统/机制，例如在适当位点切割弗林蛋白酶)或可以在体外发生(例如，在包含已知活性的蛋白酶或肽酶的组合物中和/或在包含已知能促进所期望的蛋白水解作用的条件或试剂的组合物中孵育所述多肽链)。
[0158] 重组蛋白的纯化和修饰是本领域熟知的，使得多蛋白前体的设计可包括技术人员容易理解的许多实施方案。本领域已知的任何已知蛋白酶或肽酶可用于所述前体分子的修饰，所述前体分子为例如凝血酶或因子Xa(Nagai等.(1985)“Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli，”Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82：7252-7255，并在Jenny等(2003)“A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa，”Protein Expr.Purif.31：1-11(2003)中进行了综述，其各自通过引用整体并入本文)，肠激酶(Collins-Racie等.(1995)“Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA，”Biotechnology 13：982-987，其通过引用在此整体并入本文)，弗林蛋白酶和AcTEV(Parks等.(1994)“Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase，”Anal.Biochem.216：413-417，其通过引用在此整体并入本文))和口蹄疫病毒蛋白酶C3。
[0159] 不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特异的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于正确加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物之细胞机制的真核宿主细胞。这样的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、
293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。
293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。
[0160] 对于重组蛋白的长期高产率生产，优选稳定的表达。例如，可以工程改造稳定表达本文中所述多肽的细胞系。不使用含有病毒复制起点的表达载体，而是可以用适当的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)和选择标志物控制的DNA转化宿主细胞。在引入外源DNA后，可使工程改造细胞在富集培养基中生长1至2天，然后转换至选择性培养基。重组质粒中的选择标志物赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中并生长形成转化灶(foci)，而转化灶又可以克隆并扩增到细胞系中。该方法可有利地用于工程改造表达本文中所述多肽的细胞系。这样的工程改造细胞系可特别用于筛选和评价与本文中所述多肽直接或间接相互作用的多肽。
[0161] 可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等(1977)“Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells，”Cell 11：223-232)，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska等.(1992)“Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells First Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy，”Bioessays 14：495-500)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等.(1980)“Isolation Of Transforming DNA：Cloning The Hamster aprt Gene，”Cell 22：817-823)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。此外，抗代谢物抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人(1980)“Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567-3570；O′Hare等.(1981)“Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527-1531)；
gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan等.(1981)“Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine
Phosphoribosyltransferase，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072-2076；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Tolstoshev(1993)“Gene Therapy，Concepts，Current Trials And Future Directions，”Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)“The Basic Science Of Gene Therapy，”Science 260：926-932；和Morgan等.(1993)“Human Gene Therapy，”Ann.Rev.Biochem.62：191-217)”Human Gene Therapy，
“Ann.Rev.Biochem.62：191-217)和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等(1984)“Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells，”Gene 30：147-156)。可以使用的重组DNA技术领域中公知的方法描述于Ausubel等(编辑.)，1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY；Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY；以及在第12和13章，Dracopoli等.(编辑)，1994，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，NY.；
Colberre-Garapin等.(1981)“A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells，”J.Mol.Biol.150：1-14中。
gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan等.(1981)“Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine
Phosphoribosyltransferase，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072-2076；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Tolstoshev(1993)“Gene Therapy，Concepts，Current Trials And Future Directions，”Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)“The Basic Science Of Gene Therapy，”Science 260：926-932；和Morgan等.(1993)“Human Gene Therapy，”Ann.Rev.Biochem.62：191-217)”Human Gene Therapy，
“Ann.Rev.Biochem.62：191-217)和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等(1984)“Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells，”Gene 30：147-156)。可以使用的重组DNA技术领域中公知的方法描述于Ausubel等(编辑.)，1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY；Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY；以及在第12和13章，Dracopoli等.(编辑)，1994，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，NY.；
Colberre-Garapin等.(1981)“A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells，”J.Mol.Biol.150：1-14中。
[0162] 本文中所述多肽的表达水平可通过载体扩增来提高(综述参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(Academic Press，New York，1987)。当表达本文中所述多肽的载体系统中的标志物是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的提高将提高标志物基因的拷贝数。由于扩增的区域是与本文中所述多肽的核苷酸序列或本文中所述多肽相关，多肽的产生也将提高(Crouse等.(1983)“Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes，”Mol.Cell.Biol.3：257-266)。
[0163] 一旦重组表达本文中所述的多肽，可以通过本领域已知的用于纯化多肽、多蛋白或抗体的任何方法(例如，类似于基于抗原选择性的抗体纯化方案)，例如通过色谱法(例如，离子交换、亲和力，特别是通过对特异性抗原的亲和力(任选地在其中多肽包含Fc结构域(或其部分)的蛋白A选择后)和大小柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过用于纯化多肽或抗体的任何其他标准技术。本公开内容的其他方面涉及包含本文中所述的核酸或本文中所述的载体的细胞。
[0164] 所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。本文中描述了示例性细胞类型。本公开内容的其他方面涉及表达本文中所述的经修饰的BoNT多肽的细胞。细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。本文中描述了示例性细胞类型。细胞可以用于核酸的扩增(propagation)或用于核酸的表达，或两者。这样的细胞包括但不限于原核细胞，包括但不限于好氧、微需氧、嗜二氧化碳的(capnophilic)、兼性、厌氧、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞，例如来自例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚梭菌(Clostridia perfringens)、艰难梭菌(Clostridia difficile)、新月柄杆菌(Neisseria
meningirulls)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningirulls)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和鼠伤寒沙门氏菌
(Salmonglla typhimurium)的细菌细胞；真核细胞包括但不限于酵母菌株，例如来自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母
(Saccharomyces cerevlslae)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的那些酵母菌株；
昆虫细胞和来自昆虫的细胞系，例如来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和烟草天蛾(Manduca sexta)的那些；以及哺乳动物细胞和来自哺乳动物细胞的细胞系，例如来自小鼠、大鼠、仓鼠、猪、牛、马、灵长类动物的那些。细胞系可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)、欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)和德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)获得。用于选择、制备和使用合适细胞系的特定方案的非限制性实例描述于例如INSECT CELL CULTURE ENGINEERING(Mattheus F.A.Goosen等编辑，Marcel Dekker，1993)；INSECT CELL CULTURES：FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS(J.M.Vlak等编辑，Kluwer Academic Publishers，1996)；Maureen A.Harrison&Ian F.Rae，GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE(Cambridge University Press，1997)；CELL AND TISSUE CULTURE：LABORATORY PROCEDURES(Alan Doyle等编辑.，John Wiley and Sons，1998)；
R.Ian Freshney，CULTURE OF ANIMAL CELLS：A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE(Wiley-Liss，第4版.2000)；ANIMAL CELL CULTURE：A PRACTICAL APPROACH(John R.W.Masters编辑.，Oxford University Press，第3版.2000)；MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，同上，(2001)；BASIC CELL CULTURE：A PRACTICAL APPROACH(John M.Davis，Oxford Press，第2版.2002)；以及CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，同上，(2004)。
meningirulls)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningirulls)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和鼠伤寒沙门氏菌
(Salmonglla typhimurium)的细菌细胞；真核细胞包括但不限于酵母菌株，例如来自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母
(Saccharomyces cerevlslae)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的那些酵母菌株；
昆虫细胞和来自昆虫的细胞系，例如来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和烟草天蛾(Manduca sexta)的那些；以及哺乳动物细胞和来自哺乳动物细胞的细胞系，例如来自小鼠、大鼠、仓鼠、猪、牛、马、灵长类动物的那些。细胞系可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)、欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)和德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)获得。用于选择、制备和使用合适细胞系的特定方案的非限制性实例描述于例如INSECT CELL CULTURE ENGINEERING(Mattheus F.A.Goosen等编辑，Marcel Dekker，1993)；INSECT CELL CULTURES：FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS(J.M.Vlak等编辑，Kluwer Academic Publishers，1996)；Maureen A.Harrison&Ian F.Rae，GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE(Cambridge University Press，1997)；CELL AND TISSUE CULTURE：LABORATORY PROCEDURES(Alan Doyle等编辑.，John Wiley and Sons，1998)；
R.Ian Freshney，CULTURE OF ANIMAL CELLS：A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE(Wiley-Liss，第4版.2000)；ANIMAL CELL CULTURE：A PRACTICAL APPROACH(John R.W.Masters编辑.，Oxford University Press，第3版.2000)；MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，同上，(2001)；BASIC CELL CULTURE：A PRACTICAL APPROACH(John M.Davis，Oxford Press，第2版.2002)；以及CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，同上，(2004)。
[0165] 这些方案是本领域技术人员范围内和根据本文教导的常规方法。本公开内容的其他方面涉及生产本文中所述多肽的方法，所述方法包括获得本文中所述的细胞并在所述细胞中表达本文中所述的核酸。在一些实施方案中，所述方法还包括分离和纯化本文中所述的多肽。
[0166] 在一些实施方案中，肉毒杆菌神经毒素可以通过在发酵罐中建立和培养肉毒杆菌培养物，然后根据已知方法收获和纯化发酵混合物来获得。所有肉毒杆菌毒素血清型最初合成为无活性的单链蛋白，其必须被蛋白酶切割或切开以变成具有神经活性的。
[0167] 制造肉毒杆菌毒素血清型A和G的细菌菌株具有内源性蛋白酶，因此，血清型A和G可以主要以其活性形式从细菌培养物中回收。相反，肉毒杆菌毒素血清型Ci、D和E由非蛋白水解菌株合成，因此当从培养物中回收时通常是无活性的。血清型B和F由蛋白水解和非蛋白水解菌株二者产生，因此可以以活性或无活性形式回收。产生例如B型肉毒杆菌毒素血清型的蛋白水解菌株可能仅切割一部分所产生的毒素。
[0168] 带切口与未带切口分子的确切比例取决于孵育的长度和培养物的温度。因此，一定百分比的例如B型毒素肉毒杆菌毒素的制备物可以是无活性的。在一个实施方案中，本公开内容的神经毒素处于活性状态。在一个实施方案中，神经毒素处于无活性状态。在一个实施方案中，设想了活性和无活性神经毒素的组合。
[0169] 还设想了本文中描述的经修饰的BoNT/B的受体结合结构域可用作靶向人中神经元的递送工具。例如，BoNT/B的经修饰的受体结合结构域可以与其他治疗剂共价或非共价地连接，并且充当靶向载剂以将治疗剂递送至人的神经元。
[0170] 因此，本公开内容的另一方面涉及嵌合多肽分子，其包含与第二部分连接的第一部分，所述第一部分其是经修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域，所述受体结合结构域包含一个或更多个替换突变，其导致与神经元的显著增强的结合。所述分子的第二部分可以是生物活性分子，例如治疗剂(例如，多肽或药物)。所述分子的第一和第二部分的连接可以是共价的(例如，以融合蛋白的形式)或非共价的。这样的连接的方法是本领域已知的，并且本领域技术人员可以容易地应用。当嵌合分子的第二部分是多肽并且嵌合分子是蛋白质形式时，提供了编码这样嵌合分子的核酸和核酸载体。
[0171] 还提供了包含核酸或核酸载体的细胞，以及表达这样嵌合分子的细胞。融合蛋白形式的嵌合分子可以使用本文中公开的方法表达和分离。
[0172] 本公开内容的经修饰的BoNT多肽在受体结合结构域中具有介导穿透进入脂质膜中并增强BoNT与其靶细胞的结合的环。在一些实施方案中，靶细胞位于神经末梢。因此，与相应的野生型BoNT相比，增强了经修饰的BoNT多肽与神经末梢的结合。在一些实施方案中，这种增强的结合还对突触前神经末梢特异。在一些实施方案中，突触前神经末梢是在哺乳动物中。在一些实施方案中，突触前神经末梢是在啮齿动物中。在一些实施方案中，突触前神经末梢是小鼠突触前神经末梢。在一些实施方案中，突触前神经末梢是小鼠突触前神经末梢。在一些实施方案中，突触前神经末梢是人突触前神经末梢。
[0173] 经修饰的BoNT多肽对其靶细胞(例如神经元)具有增强的结合亲和力提供了用于治疗用途的可能性。例如，这样的经修饰的BoNT多肽可以在较低剂量下有效。通常期望用于治疗用途的较低BoNT剂量是因为较少的毒素将在注射部位扩散至周围组织并且可以产生针对BoNT的较少中和抗体。
[0174] 因此，本公开内容还考虑了包含本公开内容的经修饰的BoNT或嵌合分子的药物组合物。如在后面的本公开内容中也变得清楚的，本公开内容的药物组合物还可以包含适合于这种组合物被设计用于治疗的特定疾病的其他治疗剂。在一些实施方案中，本公开内容的药物组合物还包含可药用载体。
[0175] 本文中使用的术语“可药用载体”是指可药用材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或锌)、或参与将多肽从身体的一个部位(例如，递送部位)携带或运输到另一个部位(例如，器官、组织或身体的一部分)的溶剂包封材料。
[0176] 可药用载体在与制剂的其他成分相容方面是“可接受的”，并且对对象的组织无害(例如，生理学相容的、无菌的、生理学的pH等)。可用作可药用载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)辅料，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；
(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等张盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，例如多肽和氨基酸(23)血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇类，例如乙醇；和(23)药物制剂中使用的其他无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于制剂中。术语例如“赋形剂”、“载体”、“可药用载体”等在本文中可互换使用。在一些实施方案中，组合物中本发明的经修饰的BoNT多肽通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物施用，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜，例如弹性膜或纤维。
(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等张盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，例如多肽和氨基酸(23)血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇类，例如乙醇；和(23)药物制剂中使用的其他无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于制剂中。术语例如“赋形剂”、“载体”、“可药用载体”等在本文中可互换使用。在一些实施方案中，组合物中本发明的经修饰的BoNT多肽通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物施用，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜，例如弹性膜或纤维。
[0177] 通常，当施用所述组合物时，使用本公开内容的多肽不吸收的材料。在另一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽在控释系统中递送。这样的组合物和施用方法在美国专利公开号2007/0020295中提供，其内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，可以使用泵(参见，例如，Langer，1990，Science 249：1527-1533；Sefton，1989，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等.，1980，Surgery 88：507；Saudek等.，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料。(参见，例如，Medical Applications of Controlled Release(Langer和Wise编辑.，CRC Press，Boca Raton，Fla.，1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance(Smolen和Ball编辑.，Wiley，New York，1984)；Ranger和Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61.另参见Levy等.，1985，Science 228：190；During等.，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等.，1989，J.Neurosurg.71：105.)。其他控释系统在例如Langer，同上中讨论过。
[0178] 本公开内容的经修饰的BoNT多肽可以作为药物组合物施用，所述药物组合物包含治疗有效量的结合剂和一种或更多种药学上相容的成分。在典型的实施方案中，药物组合物根据常规程序配制成适合于向对象(例如人)进行静脉内或皮下施用的药物组合物。
[0179] 通常，通过注射施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，药物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂(例如利多卡因)以缓解注射部位的疼痛。通常，成分单独地或混合在一起，以单位剂量形式在表明活性剂之量的密封容器例如安瓿或小药囊中，例如作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物供应。当药物通过输注施用时，其可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。当药物通过注射施用时，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水以便在施用前混合各成分。用于全身施用的药物组合物可以是液体，例如无菌盐水、乳酸林格氏液或汉克氏液(Hank’s solution)。此外，药物组合物可以是固体形式，并在使用前立即再溶解或混悬。还考虑了冻干形式。药物组合物可以包含在脂质颗粒或囊泡(例如脂质体或微晶)中，其也适用于肠胃外施用。颗粒可以是任何合适的结构，例如单层或多层，只要其中含有组合物即可。
[0180] 本公开内容的多肽可以包埋在含有促融性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、低水平(5至10mol％)的阳离子脂质的“稳定质粒-脂质颗粒”(SPLP)中，并通过聚乙二醇(PEG)包衣稳定化(Zhang Y.P.等.，Gene Ther.1999，6：1438-47)。带正电荷的脂质例如N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-甲基硫酸铵或“DOTAP”特别优选用于这样的颗粒和囊泡。这样的脂质颗粒的制备是众所周知的。参见，例如，美国专利No.4,880,635；4,906,477；4,911,928；4,917,951；4,920,016；和4,921,757。例如，本公开内容的药物组合物可以作为单位剂量施用或包装。
[0181] 当用于提及本公开内容的药物组合物时，术语“单位剂量”是指适合用于对象的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的经计算可与所需的稀释剂(即载体或载剂)一起产生所期望治疗效果的活性物质。在一些实施方案中，本文中所述的经修饰的BoNT多肽可以与治疗部分例如抗生素缀合。将这样的治疗性部分与多肽(包括例如Fc结构域)缀合的技术是众所周知的；参见，例如，Amon等.，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等.(编辑.)，1985，第243-56页，Alan R.Liss，Inc.)；Hellstrom等.，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(第2版.)，Robinson等.(编辑.)，1987，第623-53页，Marcel Dekker，Inc.)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，in Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等.(编辑.)，1985，第475-506页)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等.(编辑.)，1985，第303-16页，Academic Press；以及Thorpe等.(1982)“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates，”Immunol.Rev.，62：119-158。此外，药物组合物可以作为药物药盒提供，所述药盒包含(a)含有冻干形式的本公开内容的多肽的容器和(b)含有用于注射的可药用稀释剂(例如无菌水)的第二容器。可药用稀释剂可用于重构或稀释本公开内容的冻干多肽。任选地，这样的容器可以伴随具有由管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的通知，该通知反映了机构对于用于人施用的生产、使用或销售的批准。另一方面，包括含有可用于治疗上述疾病的物质的制品。在一些实施方案中，制品包括容器和标签。
[0182] 合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。在一些实施方案中，容器容纳有效治疗本文中所述疾病的组合物，并且可具有无菌进入口。例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。组合物中的活性剂是本公开内容的分离的多肽。在一些实施方案中，容器上或与容器相关的标签表明该组合物用于治疗所选的疾病。所述制品还可包含第二容器，所述第二容器包含可药用缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户角度所期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装说明书。
[0183] 本公开内容的经修饰的BoNT多肽、嵌合分子和药物组合物可用于治疗与不期望的神经元活性相关的病症。因此，本文中还提供了治疗与不期望的神经元活性相关的病症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文中所述的经修饰的BoNT多肽、嵌合分子或药物组合物从而治疗所述病症。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的BoNT多肽、嵌合分子和药物组合物与一种或更多种表现出不期望的神经元活性的神经元接触。
[0184] 通常用神经毒素治疗的病症(例如骨骼肌病症、平滑肌病症、腺体病症、神经肌肉病症、自主神经病症、疼痛或美学/美容病症)与不期望的神经元活性相关，如技术人员所确定的。通过使有效量的组合物与表现出不期望的活性的神经元相接触的途径施用。在一些实施方案中，所述病症可能与过度活跃的神经元或腺体相关。设想通过本文中讨论的方法治疗的具体病症包括但不限于痉挛性发声障碍、痉挛性斜颈、喉肌张力障碍、口下颌发音障碍、舌肌张力障碍、颈肌张力障碍、局灶性手肌张力障碍、眼睑痉挛、斜视、半面痉挛、眼睑障碍、大脑性瘫痪、局灶性痉挛和其他语言障碍、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、盆底失迟缓、肢体痉挛、抽搐、震颤、磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困难和其他肌张力障碍以及特征为肌肉群不自主运动的其他障碍、流泪、多汗、过度流涎、过度胃肠分泌以及其他分泌紊乱、肌肉痉挛引起的疼痛、头痛。此外，本公开内容可用于治疗皮肤病学或美学/美容病症，例如减少眉毛皱纹、减少皮肤皱纹。
[0185] 本公开内容还可以用于治疗运动损伤。Borodic美国专利No.5,053,005公开了使用A型肉毒杆菌用于治疗幼年脊柱弯曲(即脊柱侧凸)的方法。Borodic的公开内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，使用与Borodic公开的基本相似的方法，可以将经修饰的神经毒素施用于哺乳动物(优选人)以治疗脊柱弯曲。在合适的实施方案中，施用包含与基于亮氨酸的基序融合的E型肉毒杆菌的经修饰的神经毒素。甚至更优选地，将包含肉毒杆菌型A至E和融合至其轻链羧基末端的亮氨酸基序的经修饰神经毒素施用于哺乳动物(优选人)以治疗脊柱弯曲。
[0186] 此外，可以使用通常用A型肉毒杆菌进行的众所周知的技术施用经修饰的神经毒素以治疗其他神经肌肉病症。例如，本公开内容可用于治疗疼痛，例如头痛、肌肉痉挛引起的疼痛以及多种形式的炎症性疼痛。例如，Aoki美国专利No.5,721,215和Aoki美国专利No.6,113,915公开了使用A型肉毒杆菌毒素治疗疼痛的方法。这两个专利的公开内容通过引用整体并入本文。
[0187] 自主神经系统疾病还可以用经修饰的神经毒素治疗。例如，腺体功能障碍是一种自主神经系统疾病。腺体功能障碍包括出汗过多和流涎过多。呼吸功能障碍是自主神经系统病症的另一个实例。呼吸功能障碍包括慢性阻塞性肺病和哮喘。Sanders等公开了用于治疗自主神经系统的方法；例如，使用天然存在的肉毒杆菌毒素治疗自主神经系统病症，例如过度出汗、过度流涎、哮喘等。Sander等的公开内容通过引用整体引入本文。
[0188] 在一个实施方案中，可以使用基本上类似于Sanders等的方法，但是使用经修饰的神经毒素来治疗自主神经系统病症，例如上面讨论的病症。例如，经修饰的神经毒素可以以足以使自主神经系统的胆碱能神经元退化的量局部施用于哺乳动物的鼻腔，从而控制鼻腔中的粘液分泌。可通过经修饰的神经毒素治疗的疼痛包括由肌肉紧张或痉挛引起的疼痛或与肌肉痉挛无关的疼痛。例如，Binder在美国专利No.5,714,468公开了由血管紊乱、肌张力、神经痛和神经病变引起的头痛可以用天然存在的肉毒杆菌毒素(例如A型肉毒杆菌)治疗。Binder的公开内容通过引用整体并入本文。
[0189] 在一个实施方案中，可以使用基本上类似于Binder的方法，但是使用经修饰的神经毒素来治疗头痛，尤其是由血管紊乱、肌张力、神经痛和神经病变引起的头痛。肌肉痉挛引起的疼痛还可以通过施用经修饰的神经毒素来治疗。例如，与基于亮氨酸的基序融合的肉毒杆菌E型，优选在肉毒杆菌E型轻链的羧基末端可以在疼痛/痉挛位置肌内施用以减轻疼痛。此外，可以将经修饰的神经毒素施用于哺乳动物以治疗与肌肉紊乱(例如痉挛)无关的疼痛。
[0190] 在一个广泛的实施方案中，治疗非痉挛相关疼痛的本公开内容的方法包括中枢施用或外周施用经修饰的神经毒素。例如，Foster等在美国专利No.5,989,545中公开了可以在中心(鞘内)施用的与靶向部分缀合的肉毒杆菌毒素以减轻疼痛。Foster等的公开内容通过引用整体并入本文。
[0191] 在一个实施方案中，可以使用基本上类似于Foster等的方法，但使用本文中所述的组合物来治疗疼痛。待治疗的疼痛可能是急性疼痛或慢性疼痛。与肌肉痉挛无关的急性或慢性疼痛也可通过将经修饰的神经毒素局部外周施用至哺乳动物的实际或感知的疼痛位置来减轻。
[0192] 在一个实施方案中，经修饰的神经毒素在疼痛位置处或附近(例如，在切口处或切口附近)皮下施用。在一些实施方案中，经修饰的神经毒素在哺乳动物的疼痛位置处或附近(例如，瘀伤位置处或附近)肌内施用。在一些实施方案中，将经修饰的BoNT多肽直接注射到哺乳动物的关节中用于治疗或减轻由关节炎病症引起的疼痛。而且，频繁地将经修饰的神经毒素重复注射或输注到外周疼痛位置也在本公开内容的范围内。这样方法的施用途径是本领域已知的并且本领域技术人员容易对本文中所述的方法进行改编(例如，参见Harrison′s Principles of Internal Medicine(1998)，由Anthony Fauci等编辑.，第14版，由McGraw Hill公布)。
[0193] 作为非限制性实例，神经肌肉病症的治疗可包括向肌肉或肌肉群局部施用有效量的分子的步骤，自主神经病症的治疗可包括局部施用对腺体或一些腺体有效的分子，并且疼痛的治疗可以包括向疼痛部位施用有效量的分子的步骤。另外，疼痛的治疗可包括向脊髓施用有效量的经修饰的神经毒素的步骤。
[0194] 本文中使用的“治疗有效量”是指本公开内容的每种治疗剂单独或与一种或多种其他治疗剂组合赋予对象治疗效果所需的量。如本领域技术人员所认识到的，有效量根据所治疗的具体病症、病症的严重程度、个体对象参数(包括年龄、身体状况、大小、性别和体重、治疗持续时间、同时治疗(如果有的话)的性质、具体的施用途径等杂健康从业者的知识和专长中的相似因素。这些因素是本领域普通技术人员所熟知的，并且可以仅通过常规实验来解决。通常优选使用最大剂量的各组分或其组合，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员将理解，对象可出于医学原因、心理原因或实际上任何其他原因坚持较低剂量或可耐受剂量。经验考虑因素例如半衰期通常将有助于确定剂量。例如，可使用与人免疫系统相容的治疗剂，例如包含来自人源化抗体或完全人抗体的区域的多肽来延长多肽的半衰期并防止多肽被宿主的免疫系统攻击。
[0195] 施用的频率可以在治疗过程中确定和调整，并且通常但不是必须基于疾病的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。或者，多肽的持续连续释放制剂可能是合适的。用于实现持续释放的多种制剂和装置是本领域已知的。在一些实施方案中，剂量是每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天或每六天一次。在一些实施方案中，给药频率是每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次、或每3个月或更长时间一次。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
[0196] 给药方案(包括使用的多肽)可以随时间变化。在一些实施方案中，对于正常体重的成年对象，可以施用范围为约0.01mg/kg至1000mg/kg的剂量。在一些实施方案中，剂量为1mg至200mg。具体的剂量方案，即剂量、时机和重复，将取决于具体对象和对象的病史，以及多肽的性质(例如多肽的半衰期以及本领域其他公认的因素)。
[0197] 为了本公开内容的目的，如本文中所述的治疗剂的合适剂量将取决于所用的具体药剂(或其组合物)、制剂和施用途径、疾病的类型和严重程度、所述多肽是用于预防还是治疗目的、先前的治疗、对象的临床病史和对拮抗剂的应答以及主治医师的判定。通常，临床医生将施用多肽直至达到实现所期望结果的剂量。
[0198] 一种或更多种多肽的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如受体的生理状况、施用的目的是治疗性的还是预防性的以及技术人员已知的其他因素。多肽的施用可以在预选的时间段内基本上连续，或者可以是一系列间隔剂量，例如在疾病发生之前、期间或之后。本文中使用的术语“治疗”是指将多肽或包含多肽的组合物应用或施用于有此需要的对象。
[0199] “有此需要的对象”是指患有疾病、疾病的症状或对疾病有倾向的个体，其目的是治疗、治愈、缓和、减轻、改变、补救、改善、改进或影响疾病、疾病的症状或对疾病的倾向。在一些实施方案中，对象患有CDI。在一些实施方案中，对象患有癌症。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是非人灵长类动物。在一些实施方案中，对象是人。减轻疾病包括延迟疾病的发展或进展，或降低疾病严重程度。减轻疾病并不一定需要治疗结果。
[0200] 其中使用的“延迟”疾病的发展意味着推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推迟疾病的进展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。“延迟”或减轻疾病的发展或延迟疾病发作的方法是，与不使用该方法相比，在给定时间范围内降低发生一种或更多种疾病的症状的可能性和/或在给定的时间范围内降低症状程度的方法。这样的比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学显著结果的许多对象。
[0201] 疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。可以使用本领域熟知的标准临床技术检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法察觉的进展。对于本公开内容的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。
[0202] 本文中使用的疾病的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。可以使用医学领域普通技术人员已知的常规方法将分离的多肽或药物组合物施用于对象，这取决于待治疗的疾病类型或疾病的部位。该组合物还可以通过其他常规途径施用，例如经口、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道或通过植入的储库施用。
[0203] 本文中使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。另外，它可以通过可注射的储库施用途径施用于对象，例如使用1个月、3个月或6个月储库可注射或可生物降解的材料和方法。
[0204] 本文中使用的“对象”是指人或动物。通常动物是脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿动物、家畜或猎获的动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴(Rhesus)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔子和仓鼠。家养和野生动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物例如家猫，犬科动物例如狗、狐狸、狼，鸟类例如鸡、鸸鹋、鸵鸟和鱼例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。患者或对象包括前述的任何子集，例如以上所有，但不包括一个或更多个组或物种，例如人、灵长类动物或啮齿动物。在本文中一些方面的某些实施方案中，对象是哺乳动物，例如灵长类动物(例如人)。
[0205] 术语“患者”和“对象”在本文中可互换使用。对象可以是雄性或雌性。对象可以是完全发育的对象(例如，成年人)或经历发育过程的对象(例如，儿童、婴儿或胎儿)。优选地，对象是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人之外的哺乳动物可以有利地用作代表与不期望的神经元活性相关的病症的动物模型的对象。此外，本文中所述的方法和组合物可用于治疗家养动物和/或宠物。
[0206] 以下实施例旨在说明某些实施方案，并且是非限制性的。在贯穿本申请中引用的所有参考文献(包括参考文献、授权专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)的全部内容在此通过引用明确并并入。实施例
[0207] 工程改造的BoNT/B受体结合域
[0208] 最近报道称由于毒素结合位点内啮齿动物(大鼠/小鼠)Syt II的单个氨基酸变化，BoNT/B对人Syt II(h-Syt II)的结合亲和力大大降低13，23。该变化在第54位从苯丙氨酸(F)到亮氨酸(L)的保守变化。人对BoNT/B保持敏感，因为人Syt I(h-Syt I)在该位置仍含有苯丙氨酸。然而，Syt II似乎是在小鼠运动神经末梢中表达的主要同种型，并且啮齿动物Syt II对BoNT/B的结合亲和力也比Syt I高约10倍24，25。
[0209] 因此，BoNT/B在人中靶向运动神经元方面的效率可能低于在啮齿动物中。长期以来的临床观察结果是，BoNT/B必须以比BoNT/A高约60至100倍的剂量使用，以便在患者中达到相同水平的效果26，27。由于使用小鼠模型测量两种毒素的效力，人对BoNT/B的敏感性确实低于小鼠。因此，恢复BoNT/B对h-Syt II的高亲和力结合可以提高其靶向人神经元的效力28
和特异性，减少治疗应用中的剂量，并减少该主要治疗性毒素的有害副作用的发生 。最近发现了显著增强BoNT/B与人Syt II的结合的BoNT/B受体结合结构域(BoNT/B-HC)的一系列突变，例如E1191M/S1199Y(WO 2013180799)。
和特异性，减少治疗应用中的剂量，并减少该主要治疗性毒素的有害副作用的发生 。最近发现了显著增强BoNT/B与人Syt II的结合的BoNT/B受体结合结构域(BoNT/B-HC)的一系列突变，例如E1191M/S1199Y(WO 2013180799)。
[0210] 此外，毒素扩散和中和抗体的产生不限于BoNT/B，而且对于BoNT/A也观察到如此，这表明BoNT/A与其受体SV2的结合亲和力也需要改善。因为BoNT/B与Syt I/II的结合具有较BoNT/A与SV2结合更高的亲和力18，24，29，30，具有能够结合人Syt II的经修饰的BoNT/B受体结合结构域(BoNT/B-HC)还可用于替代BoNT/A-HC以产生经修饰的嵌合BoNT/A，其具有比WT BoNT/A更强的对人神经元的效力和特异性。
[0211] BoNT/DC中的脂质结合环
[0212] 通过利用蛋白质和神经节苷脂受体二者，BoNT以极高的效力和特异性获得靶向神经元的能力。我们对这一问题的兴趣源于观察到一种肉毒杆菌神经毒素BoNT/DC在小鼠中示出最高的效力(1.1×109LD50/mg，这比其他任何BoNT高约5至30倍)31，因此进一步研究了BoNT与神经元之间的结合的增强。发现与其他BoNT类似，BoNT/DC共享Syt I/II作为其受体并且还需要神经节苷脂作为共受体13。因此可能还有其他原因使BoNT/DC变得如此有效。
[0213] BoNT/DC的晶体结构揭示了受体结合结构域中的延伸环(图2A)32。该环含有许多疏水残基，并且先前已被提出为神经节苷脂结合环(GBL)，因为该环内的突变消除了BoNT/DC-HC与固定化神经节苷脂的结合33，34。然而，最近的研究揭示，该环不直接参与神经节苷脂结合。相反，该环通过非特异性穿透进入疏水脂质膜而促进神经节苷脂结合。实际上，发现尖端残基处的点突变F1253A消除了BoNT/DC-HC与无神经节苷脂的脂质体的结合，这表明该环的尖端穿透进入脂质膜中。该作用为神经元膜提供了额外的锚定，这极大地促进了BoNT/DC以协同方式与神经节苷脂和Syt I/II结合，因此增强了BoNT/DC与神经元的总的结合。
[0214] BoNT/B的晶体结构揭示它具有与BoNT/DC中发现延伸环类似的延伸环(图2B)15。当BoNT/B与神经节苷脂和Syt I/II结合时，它也位于穿透进行入膜的理想位置。BoNT/B中的环与BoNT/DC中的环之间的主要区别在于它们在环尖端的所暴露残基是不同的：BoNT/B包含11248/V1249，而BoNT/DC包含W1252/F1253。W和F二者都是典型的疏水残基，具有很强的穿透进入脂质膜的倾向，而I和V不太可能与膜相互作用。用W或F残基取代I1248/V1249可能会在BoNT/B中形成一个可以穿透进入膜的环，就像BoNT/DC中的环一样。
[0215] 为了验证这一假设，创建了单个突变：BoNT/B-HC(I1248W)和双突变BoNT/B-HC(I1248W/V1249W)二者。使用公认的脂质体浮选测定法检查这些突变体与人工脂质体的结合(图3A)。通过首先将BoNT/B-HC与仅含有磷脂酰胆碱(PC)或PC加神经节苷脂(1％)的脂质体一起孵育来进行测定。然后将混合物在蔗糖梯度中离心。脂质体由于其密度低而会漂浮到梯度的顶部。与脂质体结合的蛋白质将与脂质体一起漂浮到顶部，而不与脂质体结合的蛋白质将停留在离心管的底部(图3A)。然后通过免疫印迹分析检测结合的蛋白质。如图3B所示，BoNT/B-HC(I1248W)和BoNT/B-HC(I1248W/V1249W)获得结合PC脂质体的能力，而WT BoNT/B-HC不与脂质体结合。与BoNT/B(I1248W)相比，BoNT/B-HC(I1248W/V1249W)显示出与脂质体的结合进一步提高。将神经节苷脂添加到脂质体中不会增强WT BoNT/B-HC的结合，因为WT BoNT/B-HC和神经节苷脂之间的相互作用相对较弱。相反，BoNT/B-HC(I1248W)和BoNT/B-HC(I1248W/V1249W)显示出与含神经节苷脂的脂质体的强结合，高于它们与不含神经节苷脂的脂质体的结合(图3B)。总之，这些结果不仅证明BoNT/B-HC(I1248W)和BoNT/B-HC(I1248W/V1249W)获得结合脂质膜的能力，而且还表明它们与脂质的相互作用可与神经节苷脂结合协同，导致对含神经节苷脂的膜的总体结合亲和力大大提高。
[0216] 接下来在生理学相关的神经元表面上验证了这些发现。将培养的大鼠皮质神经元暴露于WT、I1248W或I1248W/V1249W BoNT/B-HC。通过细胞裂解物的免疫印迹分析检测BoNT/B-HC的结合，这提供了量化结合水平的方法，如如图4所示，I128W和I1248W/V1249W BoNT/B-HC显示出比WT BoNT/B-HC显著更高的与神经元的结合，分别比WT高约2.7倍和3.5倍。
[0217] 通过免疫染色分析进一步检查WT、I1248W或I1248W/V1249W BoNT/B-HC与神经元的结合，以确定毒素结合是否特异性地定位于突触前神经末梢。如图5所示，I128W和I1248W/V1249W BoNT/B-HC显示出比WT BoNT/B-HC显著更高的与神经元的结合。重要的是，I1248W和I1248W/V1249W BoNT/B-HC的结合与突触前神经末梢标志物突触蛋白共定位，这表明增强的结合对突触前神经末梢特异。
[0218] 总之，这些结果表明将残基I1248改变为W和V1249改变为W产生功能性环作为BoNT/B-HC中的“第三锚”，其显著增强与神经末梢的结合。类似地，用其他典型的膜相互作用残基如F、Y和H改变I1248/V1249也可以在BoNT/B中产生可以穿透进入膜中并增强BoNT/B与神经元膜的结合的功能性环。
[0219] 因此，用残基W、F、Y或H替换I1248和V1249产生新的工程改造的BoNT/B，其与神经末梢的结合显著增强。这些突变可用于产生新一代BoNT/B，其效力高于天然BoNT/B。含有这些突变的BoNT/B的受体结合结构域也可用于产生嵌合毒素，例如BoNT/AB，其效力可能比天然BoNT/A更高。
[0220] 材料与方法抗体和材料：
[0221] 以下抗体购自指定的供应商：小鼠单克隆抗HA(16B12，Covance)、兔多克隆抗突触蛋白(Millipore)。牛混合脑神经节苷脂购自Matreya LLC(Pleasant Gap，PA)，并如前所述在Tris缓冲盐水(TBS：20mM Tris，150mM NaCl)中重构9。PC脂质购自Avanti(Alabaster，AL)。cDNA和构建体：编码BoNT/B-HC的DNA(残基856-1291，基于GenBank登录号：AB232927)由Geneart Inc.合成，并且已将其密码子优化用于在大肠杆菌中表达。将编码BoNT/B-HC的DNA亚克隆到pET28a载体中，其中His6标签和HA标签(YPYDVPDYA(SEQ ID NO：1))二者与其N-末端融合。使用Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies，CA)，按照制造商的手册，通过PCR产生BoNT/B-HC中的突变。通过测序验证所有构建体。
[0222] 蛋白质表达和纯化：
[0223] BoNT/B-HC的WT和突变体在大肠杆菌中表达为His6标记的重组蛋白。如先前所述纯化His6-融合蛋白9，其中在20℃诱导温度下，用0.25mM IPTG过夜。
[0224] 神经元培养和毒素结合试验：
[0225] 如前所述9，从E18-19胚胎制备大鼠皮质神经元。如前所述9，在高K+缓冲液(与PBS相同，但调整为56mM KCl和87mM NaCl加1mM CaCl2)中进行毒素与皮质神经元的结合持续5分钟。洗涤细胞并进行免疫印迹分析或免疫染色分析。对于免疫染色测定，将细胞固定并透化以用于免疫染色分析。使用具有40x物镜的Leica TCS SP8共聚焦显微镜收集荧光图像。
[0226] 脂质体共浮选测定：
[0227] 将PC溶解在氯仿中。将神经节苷脂溶解在氯仿∶甲醇(3∶1)中。将单独的PC或与神经节苷脂(1％)混合的PC在氮气下干燥。用脂质重建缓冲液(30mM Tris，150mM NaCl，2mM MgCl2，2mM DTT，pH 7.5)使脂质膜再水合。使用振荡器在室温(RT)下将重悬的脂质混合1小时。用挤出机重新悬浮产生脂质体(200nm孔径，20次手动冲程，Avanti)。将脂质体(75μl)与1μM蛋白质在150μl的总体积中在室温下孵育30分钟。然后将脂质体蛋白质混合物添加到
100μl的75％蔗糖溶液(在脂质重构缓冲液中)中以得到250μl 30％蔗糖溶液，其作为底层加载到离心管中，然后添加200μl 25％蔗糖和50μl脂质重建缓冲液，如图5A所示。将加载的蔗糖梯度在240,000g下离心1小时(Beckman TLS-55转子，OptiMax MAX-XP台式离心机)。离心后，从离心管顶部取出50μl溶液，与载样染料混合，并进行免疫印迹分析。
100μl的75％蔗糖溶液(在脂质重构缓冲液中)中以得到250μl 30％蔗糖溶液，其作为底层加载到离心管中，然后添加200μl 25％蔗糖和50μl脂质重建缓冲液，如图5A所示。将加载的蔗糖梯度在240,000g下离心1小时(Beckman TLS-55转子，OptiMax MAX-XP台式离心机)。离心后，从离心管顶部取出50μl溶液，与载样染料混合，并进行免疫印迹分析。
[0228] 表1.肉毒杆菌神经毒素(BoNT)氨基酸序列
[0229] *下划线表示出现替换的氨基酸位置
[0230]
[0231]
[0232]
[0233]
[0234]
[0235]
[0236]
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[0238]
[0239]
[0240]
[0241]
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[0287] 本文说明书中提及的所有出版物、专利和序列数据库条目均通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指明通过引用并入一样。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。
[0288] 其他实施方案
[0289] 本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以被达到相同、等同或相似目的的替代特征所代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列等效或类似特征的一个实例。
[0290] 根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本公开内容的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本公开内容做出多种改变和修改以使其适应多种用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求内。
[0291] 等同方案和范围
[0292] 虽然本文中描述并说明了本发明的几个实施方案，但是本领域的技术人员将容易想到用于执行所述功能和/或获得所述结果和/或本文所述的一个或更多个优点的多种其他手段和/或结构，并且每个这样的变化和/或修改都被视为在本文中描述的本发明的实施方案范围之内。更一般地，本领域的技术人员将容易理解，本文中所描述的所有参数、尺寸、材料和构造意为示例性的且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将取决于具体的应用或使用本发明的教导的应用。本领域的技术人员将认识到或能够仅仅使用常规实验以确定，许多与本文中所描述的本发明的具体实施方案等同的方案。因此，可以理解的是，前述的实施方案仅通过示例的方式给出，且在所附权利要求书及其等同方案的范围之内，可以以除了具体描述和要求保护的其他方式来实施本发明的实施方案。本公开内容的本发明实施方案是针对本文中所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、药盒和/或方法。此外，如果这类特征、系统、制品、材料、药盒和/或方法相互不矛盾，则两个或更多个这类特征、系统、制品、材料、药盒和/或方法的任意组合也包括在本公开内容的本发明范围内。
[0293] 本文中定义和使用的所有定义应理解为凌驾于字典的定义，通过引用并入的文献中的定义，和/或指定术语的普通含义。
[0294] 本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请关于其各自所引用的主题均通过引用并入本文，在某些情况下可涵盖整个文件。
[0295] 除非明确指出相反，否则如本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一”和“一个”，应被理解为是指“至少一个”。
[0296] 如本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应被理解为是指如此结合起来的要素，即，在一些情况下联合存在而其他情况下分开存在的要素的“任一或两者”。用“和/或”列出的多个元素应以相同的方式解释，即，如此结合的“一个或多个”元素。除了通过由“和/或”句子表述所具体确定的元素之外，其他要素也可任选地存在，无论其于具体确定的那些元素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言如“包含”联合使用时，关于“A和/或B”在一个实施方案中指的是A但没有B(任选地包括除了B之外的元素)；在另一个实施方案中，指的是B但没有A(任选包括除了A之外的元素)；在另一个实施方案中，指的是A和B两者(任选包括其他元素)等。
[0297] 如本文在说明书和权利要求书中使用的“或”应被理解为具有与如上所定义“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包括性的，即包括数字或要素列表中的至少一个，但还包括了多于一个，并且任选地包括其他未列出的项目。只有明确表述示相反的术语，例如“仅仅之一”或“正好之一”，或者，在权利要求书中使用“由......组成”时，才指仅包括要素或要素的列表中的一个要素。一般而言，当前面有排他性的术语例如“任一”，“之一”，“仅有之一”或“恰好之一”时，本文所使用的术语“或”应该仅解释为表示排他性的替代选择(即“一个或另一个但不是两者”)。当在权利要求书中使用的“基本由……组成”时，应具有其在专利法领域中所使用的通常含义。
[0298] 关于一个或更多个要素的列表，如本文在说明书和权利要求书中使用的短语“至少一个”应理解为是指选自要素列表中任意一个或更多个要素中的至少一个要素，但是不一定包括要素列表内具体列出的各个要素和每个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中的要素的任意组合。该定义还允许除了短语“至少一个”所指的要素列表内的明确指出的要素之外，可任选其他的要素，不论其与那些明确指出的要素相关或不相关。因此，作为非限制性的实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”或等同地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可指，至少一个A，任选包括多于一个A，而不存在B(并任选地包括除了B之外的要素)；在另一个实施方案中，指的是至少一个B，任选包括多于一个B，而不存在A(且任选地包括除A之外的要素)；在另一个实施方案中，指的是至少一个A，任选地包括多于一个A，和至少一个B，任选包括多于一个B(且任选地包括其他要素)等。
[0299] 还应理解，除非明确指出相反，否则在本文所要求保护的任何包括多于一个步骤或作用的方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定限于所列举的方法的步骤或作用的顺序。
[0300] 在权利要求书以及在上述说明书中，所有的过渡词语例如“包含”，“包括”，“携带”，“具有”，“含有”，“涉及”，“持有”等应理解为开放式的，即意指包括但不限制于。仅过渡短语“由......组成”和“基本上由...组成”应分别是封闭的或半封闭的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册2111.03部分所述。
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