一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方法
阅读：712发布：2020-05-24
专利汇可以提供一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种抗A型 口 蹄 疫 病毒 牛 源单链基因工程 抗体 的制备方法，属于抗体制备技术领域。本发明所述制备方法通过从免疫A型FMDV灭活 疫苗 牛体内分离PBMCs，使用染料标A型FMDV 146S 抗原 ，然后对PBMCs进行 染色 ，借助多色流式细胞仪分选能同时分离到结合A型FMDV的单个B细胞，进而获得VH和VL基因，结合EXPI293表达工程抗体技术，表达获得A型FMDV特异性牛源单链基因工程抗体。本发明所述制备方法避免了传统鼠杂交瘤技术复杂的细胞融合筛选流程，对研究A型FMDV宿主特异性抗原位点的鉴定具有重要指导意义，可为口蹄疫分子疫苗的研制奠定 基础 。，下面是一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)从免疫A型FMDV灭活疫苗的牛血液样本中分离外周血单个核细胞；
2)对A型FMDV 146S抗原进行超滤离心，得到浓缩后的A型FMDV 146S抗原，使用染料对浓缩后的A型FMDV 146S抗原进行染色，将染色后的抗原进行超滤离心，得到标记后的A型FMDV 146S抗原；
所述染料包括FluoProbes 647H、Allophycocyanin、DyLight 633、DyLight 650、Atto
633或Cynaine Dye 5；
3)将步骤1)得到的外周血单个核细胞与步骤2)得到的标记后的A型FMDV 146S抗原、鼠抗牛CD21-RPE和鼠抗牛IgM-FITC荧光抗体混合，得到染色后的细胞；
4)使用多色流式细胞仪分选A型FMDV特异性单个B细胞；
5)对步骤4)得到的A型FMDV特异性单个B细胞进行反转录，得到cDNA后进行扩增，得到A型FMDV特异性单个B细胞IgG抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因；
6)将步骤5)得到的重链可变区基因和轻链可变区基因通过如SEQ ID NO.1的柔性Linker连接，在连接后的基因的N端引入如SEQ ID NO.2所述的信号肽序列，在C端引入Flag标签和His标签，参考Homo sapiens(Human)密码子进行基因序列优化，在优化后的基因起始密码子前引入KOZAK序列，插入到pcDNA3.4表达载体，得到牛源单链抗体表达载体；
7)将步骤6)得到牛源单链抗体表达载体转染细胞进行抗体的表达；
所述步骤1)和2)没有时间先后顺序的限定。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)所述牛血液样本为免疫A型FMDV灭活疫苗14～30d的牛血液样本。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)所述超滤离心为：使用截留量
100kDa的超滤管4000rpm离心10min，将抗原或染色后的抗原置换至PBS缓冲液中。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤4)所述分选为：把每孔含有10μL裂解液的96-PCR孔板放入分选舱，设置每孔分选1个细胞模式，上样；划门圈出淋巴及单核细胞，根据FSC-A与FSA-H设置排除粘连细胞，圈出对角线单一细胞；对CD21+IgM-A-FMDV+细胞进行分选。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤5)所述扩增包括巢式PCR扩增方法。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤6)使用Not1和Nhel酶切位点插入到pcDNA3.4表达载体。
7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤7)所述细胞包括Expi293悬浮细胞。
一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及抗体制备技术领域，具体涉及一种抗A型口蹄疫病毒牛源单 链基因工程抗体的制备方法。
背景技术
[0002] 口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是严重危害猪、牛与羊的重大动 物疫病。口蹄疫病毒(FMDV)有七个血清型，分别为A型、O型、Asia 1 型、C型、SAT1～3型，其中每个血清型又根据流行的区域划分为多个拓扑 型(VP1，85％氨基酸同源性)。我国主要流行A型和O型FMDV，其中A 型FMDV在我国主要存在亚洲拓扑型中的G1和G2分支。A型和O型FMDV 血清型之间不能提供交叉免疫保护，甚至同一血清型内不同拓扑型病毒之间 也存在抗原结构的差异，不能对异源毒株提供很好的交叉免疫保护。因此， 研究A型FMDV抗原结构对疫苗毒株设计具有重要意义。单克隆抗体无疑 是解析抗原结构的重要工具。
[0003] 单克隆抗体来源于B细胞，抗体胚系基因VDJ片段通过基因重排和体 细胞突变，产生特异性单个B细胞克隆，B细胞进一步分化成浆细胞，最终 分泌产生特异性单克隆抗体。可以看出抗体胚系基因VDJ重排决定了抗体 的多样性，然而不同物种在VDJ基因片段数量上存在很大差异。据报道， 小鼠重链IGH基因含有101个V基因片段，9个D基因片段，4个J基因片 段。猪重链IGH基因约有20个功能性V基因片段,2个D基因片段和1个 J基因片段。目前，牛重链IGH基因数据库中存在12个V基因片段,23个 D基因片段和4J基因片段(http://www.imgt.org/IMGTveterinary/)。抗体分子 中互补决定区(CDRs)是识别抗原表位的重要部位，尤其是重链互补决定 区(HCDR3)，影响抗体亲和力。牛抗体分子中约10％重链序列含有超长 的HCDR3，最长可达约60个氨基酸，这一特性是其他物种，如小鼠和猪等 所不具备的。据报道，牛超长HCDR3结构域可以单独识别抗原表位。综上 可以看出，不同物种间VDJ基因组成差异以及CDR3长度差异，以及K/L 轻链组成比例差异，所引起的抗体多样性，势必可能导致宿主特异性抗原位 点的产生。因此，利用自然宿主来源单抗鉴定其识别抗原位点对解析A型 FMDV抗原结构和疫苗设计具有重要指导意义。目前，用于研究A型FMDV 抗原结构的单克隆抗体主要是鼠源性单克隆抗体。然而由于牛是FMDV的 自然感染宿主，且鼠与牛的B细胞多样性存在较大差异，因此产生A型 FMDV特异性牛源单克隆抗体对解析A型FMDV抗原结构，尤其是发现 FMDV宿主特异性抗原位点具有重要意义。目前，尚未有A型FMDV特异 性牛源单克隆抗体的报道。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体 的制备方法。本发明所述制备方法操作简单、方便，避免了传统鼠杂交瘤技 术复杂的细胞融合筛选流程，可以通过流式细胞仪直接分选抗原特异性单个 B细胞，体外表达获得单链基因工程抗体，对研究A型FMDV宿主特异性 抗原位点的鉴定具有重要指导意义，可为口蹄疫分子疫苗的研制奠定基础。
[0005] 本发明提供了一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方 法，包括以下步骤：
[0007] 2)对A型FMDV 146S抗原进行超滤离心，得到浓缩后的A型FMDV 146S抗原，使用染料对浓缩后的A型FMDV 146S抗原进行染色，将染色后 的抗原进行超滤离心，得到标记后的A型FMDV 146S抗原；所述染料包括 FluoProbes 647H、Allophycocyanin、DyLight 633、DyLight 650、Atto 633或 Cynaine Dye 5；
[0008] 3)将步骤1)得到的外周血单个核细胞与步骤2)得到的标记后的A型 FMDV 146S抗原、鼠抗牛CD21-RPE和鼠抗牛IgM-FITC荧光抗体混合，得 到染色后的细胞；
[0009] 4)使用多色流式细胞仪分选A型FMDV特异性单个B细胞；
[0010] 5)对步骤4)得到的A型FMDV特异性单个B细胞进行反转录，得到 cDNA后进行扩增，得到A型FMDV特异性单个B细胞IgG抗体的重链可 变区基因和轻链可变区基因；
[0011] 6)将步骤5)得到的重链可变区基因和轻链可变区基因通过如SEQ ID NO.1的柔性Linker连接，在连接后的基因的N端引入如SEQ ID NO.2所述 的信号肽序列，在C端引入Flag标签和His标签，参考Homo sapiens(Human) 密码子进行基因序列优化，在优化后的基因起始密码子前引入KOZAK序列， 插入到pcDNA3.4表达载体，得到牛源单链抗体表达载体；
[0012] 7)将步骤6)得到牛源单链抗体表达载体转染细胞进行抗体的表达；
[0013] 所述步骤1)和2)没有时间先后顺序的限定。
[0014] 优选的是，步骤1)所述牛血液样本为免疫A型FMDV灭活疫苗14～30d 的牛血液样本。
[0015] 优选的是，步骤2)所述超滤离心为：使用截留量100kDa的超滤管4000 rpm离心10min，将抗原或染色后的抗原置换至PBS缓冲液中。
[0016] 优选的是，步骤4)所述分选为：把每孔含有10μL裂解液的96-PCR 孔板放入分选舱，设置每孔分选1个细胞模式，上样；划门圈出淋巴及单核 细胞，根据FSC-A与FSA-H设置排除粘连细胞，圈出对角线单一细胞；对 CD21+IgM-A-FMDV+细胞进行分选。
[0017] 优选的是，步骤5)所述扩增包括巢式PCR扩增方法。
[0018] 优选的是，步骤6)使用Not1和Nhel酶切位点插入到pcDNA3.4表达 载体；
[0019] 优选的是，步骤7)所述细胞包括Expi293悬浮细胞。
[0020] 本发明提供了一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方 法。本发明所述制备方法通过从免疫A型FMDV灭活疫苗牛体内分离 PBMCs，使用染料标A型FMDV 146S抗原，本发明所述染料标记抗原不会 对抗原粒子造成破坏，能保证146S抗原粒子完整性。然后对PBMCs进行染 色，借助多色流式细胞仪分选能同时分离到结合A型FMDV的单个B细胞。 结合单细胞抗体基因测序，分别获得VH和VL基因，通过柔性 linker
“GGGGSGGSGGGGSGGS”连接，及EXPI293表达工程抗体技术，表 达获得A型FMDV特异性牛源单链基因工程抗体，经ELISA、WB和免疫 荧光实验验证本发明制备方法成功获得抗A型FMDV特异性的单链基因工 程抗体。本发明所述制备方法制备得到的抗体基因多样性好，效率高，全宿 主(牛)来源，需要细胞量少；且所述制备方法操作简单、方便，避免了传 统鼠杂交瘤技术复杂的细胞融合筛选流程，可以通过流式细胞仪直接分选抗 原特异性单个B细胞，体外表达获得单链基因工程抗体。该筛选方法对研究 A型FMDV宿主特异性抗原位点的鉴定具有重要指导意义，可为口蹄疫分 子疫苗的研制奠定基础。
附图说明
“GGGGSGGSGGGGSGGS”连接，及EXPI293表达工程抗体技术，表 达获得A型FMDV特异性牛源单链基因工程抗体，经ELISA、WB和免疫 荧光实验验证本发明制备方法成功获得抗A型FMDV特异性的单链基因工 程抗体。本发明所述制备方法制备得到的抗体基因多样性好，效率高，全宿 主(牛)来源，需要细胞量少；且所述制备方法操作简单、方便，避免了传 统鼠杂交瘤技术复杂的细胞融合筛选流程，可以通过流式细胞仪直接分选抗 原特异性单个B细胞，体外表达获得单链基因工程抗体。该筛选方法对研究 A型FMDV宿主特异性抗原位点的鉴定具有重要指导意义，可为口蹄疫分 子疫苗的研制奠定基础。
附图说明
[0021] 图1为本发明提供的牛源单链基因工程抗体的制备示意图；
[0022] 图2为本发明提供的荧光染料标记的A型FMDV抗原电镜观察(放大 30000倍)；
[0023] 图3为本发明提供的流式分析结果；
[0024] 图4为本发明提供的IgG抗体可变区基因PCR扩增；
[0025] 图5为本发明提供的纯化获得的A型FMDV牛源单链基因工程抗体；
[0026] 图6为本发明提供的IFA实验结果；
[0027] 图7为本发明提供的间接ELISA实验结果；
[0028] 图8为本发明提供的WB实验结果。
具体实施方式
[0029] 本发明提供了一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链基因工程抗体的制备方 法，包括以下步骤：
[0030] 1)从免疫A型FMDV灭活疫苗的牛血液样本中分离外周血单个核细胞；
[0031] 2)对A型FMDV 146S抗原进行超滤离心，得到浓缩后的A型FMDV 146S抗原，使用染料对浓缩后的A型FMDV 146S抗原进行染色，将染色后 的抗原进行超滤离心，得到标记后的A型FMDV 146S抗原；所述染料包括 FluoProbes 647H、Allophycocyanin、DyLight 633、DyLight 650、Atto 633或 Cynaine Dye 5；
[0032] 3)将步骤1)得到的外周血单个核细胞与步骤2)得到的标记后的A型 FMDV 146S抗原、鼠抗牛CD21-RPE和鼠抗牛IgM-FITC荧光抗体混合，得 到染色后的细胞；
[0033] 4)使用多色流式细胞仪分选A型FMDV特异性单个B细胞；
[0034] 5)对步骤4)得到的A型FMDV特异性单个B细胞进行反转录，得到 cDNA后进行扩增，得到A型FMDV特异性单个B细胞IgG抗体的重链可 变区基因和轻链可变区基因；
[0035] 6)将步骤5)得到的重链可变区基因和轻链可变区基因通过如SEQ ID NO.1的柔性Linker连接，在连接后的基因的N端引入如SEQ ID NO.2所述 的信号肽序列，在C端引入Flag标签和His标签，参考Homo sapiens(Human) 密码子进行基因序列优化，在优化后的基因起始密码子前引入KOZAK序列， 插入到pcDNA3.4表达载体，得到牛源单链抗体表达载体；
[0036] 7)将步骤6)得到牛源单链抗体表达载体转染细胞进行抗体的表达；
[0037] 所述步骤1)和2)没有时间先后顺序的限定。
[0038] 本发明从免疫A型FMDV灭活疫苗的牛血液样本中分离外周血单个核 细胞。在本发明中，所述牛血液样本为免疫A型FMDV灭活疫苗14～30d的 牛血液样本，更有选为免疫21d的牛血液样本。在本发明中，所述血液样本 优选为牛外周血。本发明对所述外周血单个核细胞的分离方法没有特殊限 定，采用本领域技术人员熟知的常规分离方法即可。
[0039] 本发明对A型FMDV 146S抗原进行超滤离心，得到浓缩后的A型 FMDV 146S抗原，使用染料对浓缩后的A型FMDV 146S抗原进行染色， 将染色后的抗原进行超滤离心，得到标记后的A型FMDV 146S抗原；所述 染料包括FluoProbes 647H、Allophycocyanin、DyLight 633、DyLight 650、 Atto 633或Cynaine Dye 5。在本发明中，所述超滤离心优选为：使用截留量 100kDa的超滤管4000rpm离心10min，将抗原或染色后的抗原置换至PBS 缓冲液中。在本发明中，使用染料染色前，优选将抗原浓缩至1mg/ml，待 标记抗原浓度在1mg/ml时，标记效率最高，同时既能保证荧光素不会对抗 原结构造成破坏，又能保证每个抗原颗粒上都能标记上荧光素分子。本发明 对所述染色的方法没有特殊限定，采用相应染料对应的常规使用方法即可。 本发明对所述染料的来源没有特殊限定，优选使用Lightning-LinkTM Rapid FluoProbes 647H标记试剂盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)、 Lightning-LinkTM Allophycocyanin标记试剂盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)、Lightning-LinkTM DyLight 633标记试剂盒(Innova Biosciences, San Diego，USA)、Lightning-LinkTM DyLight 650标记试剂盒(Innova Biosciences,SanDiego，USA)、Lightning-LinkTMAtto
633标记试剂盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)或Lightning-LinkTM Cynaine Dye
5标记试剂 盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)。得到标记后的A型FMDV 146S 抗原后，本发明优选加入等体积100％甘油进行保存。
633标记试剂盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)或Lightning-LinkTM Cynaine Dye
5标记试剂 盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)。得到标记后的A型FMDV 146S 抗原后，本发明优选加入等体积100％甘油进行保存。
[0040] 得到外周血单个核细胞和标记后的A型FMDV 146S抗原后，本发明将 外周血单个核细胞与标记后的A型FMDV 146S抗原、鼠抗牛CD21-RPE和 鼠抗牛IgM-FITC荧光抗体混合，得到染色后的细胞。在本发明中，通过加 入鼠抗牛CD21-RPE和鼠抗牛IgM-FITC荧光抗体，+ -用来划门圈出CD21IgM的B细胞群体，然后分选在该群细胞中能结合标记后A型FMDV 146S抗原 的B细胞，即为抗原特异性单个B细胞。
[0041] 得到染色后的细胞后，本发明使用多色流式细胞仪分选A型FMDV特 异性单个B细胞。本发明对所述多色流式细胞仪的型号没有特殊限定，本发 明优选使用BD FACSAria Ⅱu流式分选仪，当使用BD FACSAria Ⅱu流式分 选仪时，本发明优选将仪器参数设置为：喷嘴大小：100μm；分选模式：单 细胞模式；分选速度：10000细胞/秒；振幅：20psi；震荡频率：30kHz。 以上参数设置调节后关闭Sweat按钮，使用Accudrop(货号：642412)延迟 微球执行计算液体延迟时间。在本发明中，所述分选优选为：把每孔含有10 μL裂解液的96-PCR孔板放入分选舱，设置每孔分选1个细胞模式，上样； 划门圈出淋巴及单核细胞，根据FSC-A与FSA-H设置排除粘连细胞，圈出 对角线单一细胞；对CD21+IgM-A-FMDV+细胞进行分选。在本发明中，分 选前，优选调节分选舱中96-PCR孔板位置，直至分选细胞准确落入板孔正 中央(通过使用粘有封口膜的96孔板，设置每孔分选60个细胞模式进行调 节，确保细胞能分选到每孔正中心)。
[0042] 分选得到A型FMDV特异性单个B细胞后，本发明对A型FMDV特 异性单个B细胞进行反转录，得到cDNA后进行扩增，得到A型FMDV特 异性单个B细胞IgG抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因。本发明对所 述反转录方法没有特殊限定，采用常规反转录方法即可。在本发明中，所述 扩增优选包括巢式PCR扩增方法。本发明优选采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3～10所示的引物进行扩增。具体如表1所示。
[0043] 表1扩增牛IgG VH和VL基因的引物
[0044]
[0045] 序列中的简并碱基注释，S＝C或G，Y＝C或T，R＝A或G.
[0046] 得到A型FMDV特异性单个B细胞IgG抗体的重链可变区基因和轻链 可变区基因后，本发明将重链可变区基因和轻链可变区基因通过如SEQ ID NO.1的柔性Linker连接，在连接后的基因的N端引入如SEQ ID NO.2所述 的信号肽序列，在C端引入Flag标签和His标签，参考Homo sapiens(Human) 密码子进行基因序列优化，在优化后的基因起始密码子前引入KOZAK序列 (GCCACC，SEQ ID NO.11)，插入到pcDNA3.4表达载体，得到牛源单链 抗体表达载体。在本发明中，优选使用Not1和Nhel酶切位点插入到 pcDNA3.4表达载体。
[0047] 得到得到牛源单链抗体表达载体后，本发明优选将牛源单链抗体表达载 体转染细胞进行抗体的表达。在本发明中，所述细胞包括Expi293悬浮细胞。 具体地，本发明优选通过瞬时转染EXPI293悬浮细胞表达抗体，按每107个 细胞1μg质粒的比值加入质粒，加入250μL OptiPROTMSFM培养基进行稀 释，同时取等量OptiPROTMSFM培养基稀释TM
ExpiFectamine 293转染试剂， 随后将稀释好的质粒和转染试剂混合，室温作用5min。
ExpiFectamine 293转染试剂， 随后将稀释好的质粒和转染试剂混合，室温作用5min。
[0048] 下面结合具体实施例对本发明所述的一种抗A型口蹄疫病毒牛源单链 基因工程抗体的制备方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不 限于以下实施例。
[0049] 实施例1
[0050] 1.FMDV抗原标记方案
[0051] 1.1A型FMDV 146S抗原标记方案
[0052] 使用Lightning-LinkTM Rapid FluoProbes 647H标记试剂盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)标记A型FMDV 146S抗原。首先用截留量 100kDa超滤管把A型FMDV 146S抗原置换至PBS缓冲液中。4000rpm离 心10min，浓缩抗原至1mg/ml(OD260＝7.6约等于1mg/ml)。取100μL146S 抗原加入10μL LL-modifierreagent，轻轻混匀，然后从中吸取100μL加入 到一管Lightning-LinkTM mix反应染料，轻轻抽吸把粉末重悬，室温(20～25℃) 作用3小时。加入10μL LL-quencherreagent，作用30分钟，以终止反应。 然后用100kDa超滤管离心，4000rpm离心10min，把标记后的抗原置换至 PBS缓冲液中。加入等体积100％甘油，-70℃保存。标记后的抗原命名为 A-FMDV 146S-FluoProbes 647H。(也可以使用能被
633激光器激发的其他荧 光染料，如Lightning-LinkTM Allophycocyanin标记试剂盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)，Lightning-LinkTM DyLight 633标记试剂盒 (Innova Biosciences,San Diego，USA)，Lightning-LinkTM DyLight 650标 记试剂盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)，Lightning-LinkTMAtto 633 标记试剂盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)，Lightning-LinkTM Cynaine Dye 5标记试剂盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)。)
633激光器激发的其他荧 光染料，如Lightning-LinkTM Allophycocyanin标记试剂盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)，Lightning-LinkTM DyLight 633标记试剂盒 (Innova Biosciences,San Diego，USA)，Lightning-LinkTM DyLight 650标 记试剂盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)，Lightning-LinkTMAtto 633 标记试剂盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)，Lightning-LinkTM Cynaine Dye 5标记试剂盒(Innova Biosciences,San Diego，USA)。)
[0053] 1.2电镜染色
[0054] 为证实选择上述荧光染料标记A型FMDV抗原粒子不会对抗原粒子完 整性造成破坏，因此对标记后的抗原进行负染色和透射电镜观察。取标记后 的抗原4微升轻轻加入铜网上，室温作用2min，然后用滤纸侧向吸干样本。 然后用镊子夹住样本在1％磷酸钨染色液中进行穿梭染色，采用3滴法，每 滴染液作用10秒，然后用滤纸吸取染液，晾干，电镜观察。
[0055] 2.多色流式染色方案
[0056] 采取免疫A型FMDV疫苗14天的牛外周血，使用淋巴细胞分离液(密 度＝1.083g/mL)从中分离牛PBMCs。
[0057] (1)取107个上述牛PBMCs细胞重悬于200μL细胞分选液，加入 0.5μg A-FMDV 146S-FluoProbes 647H抗原、2μg鼠抗牛CD21-RPE荧光抗 体(Bio-Rad,USA)和1μg鼠抗牛IgM-FITC荧光抗体(Bio-Rad,USA)，冰 上作用25min。
[0058] (2)取不加A-FMDV 146S-FluoProbes 647H抗原染色管作为减一 对照。同时设置单阳管，用于调节补偿。细胞分选液洗细胞两次，400×g，4℃ 离心5min。
[0059] (3)重悬细胞于500μL细胞分选液中，室温作用5min，避光于冰 上，准备上机分选细胞。
[0060] 3.分选A型FMDV特异性单个B细胞
[0061] 使用BD FACSAria Ⅱu流式分选仪分选FMDV特异性单个B细胞。仪 器设置参数为，喷嘴大小：100μm；分选模式：单细胞模式；分选速度：10000 细胞/秒；振幅：20psi；震荡频率：30kHz。以上参数设置调节后关闭Sweat 按钮，使用Accudrop(货号：642412)延迟微球执行计算液体延迟时间。然 后调节分选舱中96-PCR孔板位置，直至分选细胞准确落入板孔正中央(可 通过使用粘有封口膜的96孔板，设置每孔分选60个细胞模式进行调节)。 以上设置均完成后，把含有10μL裂解液的96-PCR板放入分选舱，设置1 个细胞分选模式，开始上样。划门圈出淋巴及单核细胞，根据FSC-A与FSA-H 设置排除粘连细胞，圈出对角线单一细胞。分选以及CD21+IgM-A-FMDV+细胞，即为A型FMDV特异性单个B细胞。
[0062] 4.牛单个B细胞来源IgG抗体可变区基因扩增
[0063] 4.1单细胞cDNA分子制备
[0064] 分选完成后，每孔加入1μL终止液，室温作用5min，终止反应。然后 每孔加入4μL SuperScriopt VILO mix溶液和6μL DNase/RNase-free water， 混匀。1500rpm，4℃离心5min。PCR仪进行反转录扩增。
[0065] 设置反应条件如表2。
[0066] 表2反转录扩增条件
[0067]
[0068] 获得的cDNA-20℃存储，用于后续PCR扩增。
[0069] 4.2单细胞cDNA的PCR扩增
[0070] 使用表1中所示引物，采取巢式PCR方法对牛单个B细胞IgG抗体的 重链可变区(VH)基因和lambda轻链可变区(VL)基因。
[0071] 第一轮PCR反应体系
[0072] 扩增IgG VH和VL基因的第一轮反应体系如表3，除引物和模板不同 外，其余成分均按照该体系进行.
[0073] 表3第一轮PCR反应体系
[0074]
[0076] 表4IgG VL基因第一轮扩增程序
[0077]
[0078] 表5IgG VH基因第一轮扩增程序
[0079]
[0080]
[0081] 第二轮PCR反应体系
[0082] 扩增IgG VH和VL基因的第二轮反应体系，也是除引物和模板(模板 为第一轮PCR扩增产物)不同，其余成分均按照如表6所示体系进行：
[0083] 表6第二轮PCR反应体系
[0084]
[0085] 第二轮PCR扩增IgG VH和VL基因的扩增程序相同，反应程序如表7 所示。
[0086] 表7 IgG VH和VL基因的扩增程序
[0087]
[0088] 4.3PCR产物测序
[0089] 取5μL第二轮扩增的PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，观察扩 增结果。成功扩增出VH和VL基因的样本，将剩余的45μL产物进行DNA 测序，使用DNASTAR和SnapGene软件分析、比对测序结果。
[0090] 5牛源单链抗体表达载体的制备
[0091] 5.1牛源单链抗体表达载体的构建
[0092] 将扩增的牛IgG抗体可变区VH和VL基因通过柔性Linker “GGGGSGGSGGGGSGGS”(SEQ ID NO.1)连接，并在融合基因N端引入 牛源IgG重链抗体分泌信号肽序列“MNPLWTLLFVLSAPRGVLS”(SEQ ID NO.2)，在C端引入Flag标签和6×His标签，以利于检测和纯化，然后参 考Homo sapiens(Human)密码子进行基因序列优化，并在基因起始密码子前 引入KOZAK序列“GCCACC”(SEQ ID NO.11),最后把合成基因通过Not1和 Nhel酶切位点插入到pcDNA3.4表达载体(Thermo scientific，USA)。序列 合成与载体构建委托金唯智生物技术公司进行合成。
[0093] 5.2无内毒素质粒提取
[0095] 6.牛源单链基因工程抗体的表达与纯化
[0096] 通过瞬时转染EXPI293悬浮细胞表达抗体，按每107个细胞1μg质粒的 比值加入质TM TM粒，加入250μL OptiPRO SFM培养基进行稀释，同时取等量 OptiPRO SFM培养基稀释ExpiFectamineTM293转染试剂，随后将稀释好 的质粒和转染试剂混合，室温作用5min。将该混合物缓慢加入至1.5×108个EXPI293细胞中。转染后EXPI293细胞置于37℃恒温悬浮培养箱，悬浮 培养18h后，补加150μL Expi293TMEnhancer和6mL EXPI293TMFeed。37℃ 继续培养
9d后，按10000×g离心30min，收取细胞培养上清，经0.22μm 滤器过滤，用于后续抗体纯化。
使用HiTrap TALON柱子在AKAT蛋白纯化 仪上进行抗体纯化，使用250mM咪唑的PBS液洗脱抗体，然后装入透析袋 置于PBS液中透析3次，每次3h。透析后的抗体，用PEG 8000进行浓缩， 浓缩后进行SDS-PAGE电泳分析。
9d后，按10000×g离心30min，收取细胞培养上清，经0.22μm 滤器过滤，用于后续抗体纯化。
使用HiTrap TALON柱子在AKAT蛋白纯化 仪上进行抗体纯化，使用250mM咪唑的PBS液洗脱抗体，然后装入透析袋 置于PBS液中透析3次，每次3h。透析后的抗体，用PEG 8000进行浓缩， 浓缩后进行SDS-PAGE电泳分析。
[0097] 7.A型FMDV牛源单链基因工程抗体的活性验证
[0098] 7.1间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay，IFA)试验
[0099] 将BHK-21细胞接入24孔板中，待细胞生长至80％时，按MOI＝1的比 例将O型FMDV(O/HN/CHA93毒株)与A型FMDV(A/GDMM/CHA/2013 毒株)分别接种24孔细胞培养板，同时设置未接毒正常细胞对照，37℃细 胞培养箱中孵育4h后，收集上清灭活处理。然后加入-20℃预冷的甲醇︰丙 酮(1:1)固定液固定细胞，室温作用20min。PBS洗细胞3次，按5μg/mL 浓度加入纯化的抗体，37℃孵育1h。PBS洗3次，加入工作浓度的荧光素 标记兔抗牛IgG-FITC(Thermo Scientific，USA)，37℃孵育30min。然后加 入DAPI染料，室温作用10min。PBS洗细胞5次，荧光显微镜观察荧光信 号并拍照记录。
[0100] 7.2间接ELISA
[0101] 将纯化后A型FMDV(A/GDMM/CHA/2013毒株)抗原用PBS稀释至 1μg/mL，按100μL/孔、4℃过夜包被酶标板；PBST洗5遍后，1％明胶封 闭1h，PBST洗5遍后，吹干；待检抗体从1︰100开始2倍系列稀释，按 每孔100μL加入酶标板中，37℃孵育1h；PBST洗5次，每孔加入HRP 标记的抗His标签抗体(1︰10000)100μl，37℃孵育1h；PBST洗5次， 加入100μL TMB显色液，室温显色10min；加入终止液终止显色，用酶标 仪测定450nm处的吸光值(D450)。S/C.O方式统计，S为样本D450值，C.O 即Cut Off值(阳性判定值)，C.O＝2.1×N(N为阴性对照D450值，当N 不足0.05时按0.05计)，S/C.O≥1判定为阳性，S/C.O＜1判定为阴性。
[0102] 7.3病毒中和实验
[0103] 使用A型FMDV(A/GDMM/CHA/2013毒株)对筛选的到的牛源单链 基因工程抗体进行病毒中和实验。具体实验步骤如下：
[0104] a)每孔加入50μL待检区抗体，在96孔板内进行倍比稀释。然后，每 孔加入100μL含100TCID50的FMDV，37℃作用1h。同时设置含有10、100 以及1000个TCID50的对照孔(不加血清样本)。
[0105] b)每孔加入100μL含5×104个BHK21细胞的完全培养基，放入37℃含 5％CO2的培养箱作用72h。
[0106] c)弃去上清细胞液，加入预冷的固定液(甲醇:丙酮＝1:1)，-20℃固定 20min。
[0107] d)弃去固定液，每孔加入100μL结晶紫溶液进行染色。30min后，冲 洗96孔板，观察50％细胞未病变的牛源单链抗体最低浓度(即半数有效抑 制浓度，IC50)指示中和病毒能力，单位μg/mL。使IC50等于50μg/mL时作 为中和作用的临界值，将>50μg/mL确定为非中和活性；＜50μg/mL确定为 具有中和活性
[0108] 7.4蛋白印迹(WesternBlot,WB)试验
[0109] 取约含1μg的A型FMDV(A/GDMM/CHA/2013毒株)抗原进行 SDS-PAGE电泳，然后将分离的蛋白条带转印至硝酸纤维(NC)膜，用含 有5％脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭2h，洗涤后，用含5％脱脂奶粉的TBST 缓冲液稀释抗体至工作浓度(2μg/mL)，室温孵育2h，TBST洗膜后，加 入HRP标记的抗His标签抗体(1︰4000)室温孵育1h，TBST洗膜后，加 入ECL化学发光底物，暗室中压X光片进行曝光成像。
[0110] 实验结果：
[0111] 1、A型FMDV特异性牛源单链基因工程抗体的制备流程
[0112] 牛源单链基因工程抗体的制备示意图如图1所示。
[0113] 2、荧光染料标记的A型FMDV抗原粒子完整性
[0114] 负染后电镜观察结果图2所示，A型FMDV抗原(A/GDMM/CHA/2013 毒株)在荧光染料标记后146S粒子大小均一，直径20～30nm，形状完好。 形态观察结果表明该染料标记抗原不会对抗原粒子造成破坏，能保证146抗 原粒子完整性，因此适于用作诱饵抗原进行分选单个B细胞。
[0115] 3、成功获得A型FMDV特异性单个B细胞
[0116] 图3为流式分选A型FMDV特异性单个B细胞，其中，A：染色后PBMCs 上机，圈出状态良好P1群体；B:P1细胞群体射门，圈出对角线单一细胞， 排除粘连细胞；C：圈出CD21+IgM-B细胞；D：未加入荧光抗原的FMO对 照；E：正常染色样本；F：FMO对照样本中各细胞群体比例细胞(记录约 100万个细胞)；G:正常染色样本各细胞群体比例(记录约100万个细胞)。
[0117] 流式分析结果如图3示，A型FMDV特异性B细胞群体(图3E) 清晰可见，存在于CD21+IgM-的细胞群体，约占总PBMCs的比例为 106/1000000。相比减一对照(FMO)样本(未加入荧光标的A型FMDV 抗原),A型FMDV单阳性B细胞(图3D,P4群体)约为4/1000000(图 3G)，通过+ - +对阳性样本管中P4群体(图3E,CD21IgMA-FMDVB 细胞)圈门分选，使用单细胞分选模式，成功分选获得A型FMDV 特异性的单个B细胞。
[0118] 4、A型FMDV特异性单个B细胞牛IgG可变区基因的获取
[0119] 图4为IgG抗体可变区基因PCR扩增，其中，图4-1：IgG重链可变区 PCR产物电泳；图4-2：IgG轻链可变区PCR产物电泳。
[0120] 巢式PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析结果如图4所示，IgG VH片段在450 bp-500bp之间出现清晰可见条带(图4-1)；IgG VL片段在450bp处出现清晰 条带(图4-2)。测序结果通过Ig BLAST数据库比对，证实巢式PCR扩增获 得的VH和VL片段为牛的IgG抗体可变区基因序列。
[0121] 5、成功表达获得的牛源单链基因工程抗体分子
[0122] 图5为纯化获得的A型FMDV牛源单链基因工程抗体，其中，M代表 蛋白marker，1-5代表纯化获得的牛源单链基因工程抗体1、2、3、4、5。
[0123] SDS-PAGE结果显示，表达抗体的细胞上清经亲和层析纯化后，电泳结 果与预期一致，单链基因工程抗体1、2、3、5在30-35kDa处出现目的条带， 与预期相符。单链基因工程抗体4含有超长重链互补决定区3(HCDR3)， 因此在35-40kDa处出现目的条带，与预期相符。这些结果说明该方法能够 成功表达并纯化出牛源单链基因工程抗体分子。
[0124] 6、成功获得抗A型FMDV牛源单链基因工程抗体
[0125] 6.1IFA结果
[0126] 图6为IFA实验结果，其中，图6-1为单链基因工程抗体1与 A/GDMM/CHA/2013毒株感染BHK21细胞实验结果；图6-2为牛源单链基 因工程抗体1与正常BHK21细胞实验结果；图6-3为单链基因工程抗体2 与A/GDMM/CHA/2013毒株感染BHK21细胞实验结果，图6-4为牛源单链 基因工程抗体2与正常BHK21细胞实验结果；图6-5为单链基因工程抗体3 与A/GDMM/CHA/2013毒株感染BHK21细胞实验结果；图6-6为牛源单链 基因工程抗体3与正常BHK21细胞实验结果；图6-7为单链基因工程抗体4 与A/GDMM/CHA/2013毒株感染BHK21细胞实验结果，图6-8为牛源单链 基因工程抗体4与正常BHK21细胞实验结果，图6-9为单链基因工程抗体5 与A/GDMM/CHA/2013毒株感染BHK21细胞实验结果，图6-10为牛源单 链基因工程抗体5与正常BHK21细胞实验结果。
[0127] IFA检测结果显示，单链基因工程抗体1、2、3、4、5均可与 A/GDMM/CHA/2013毒株感染的BHK-21细胞特异性结合，在细胞核(蓝色) 周围出现绿色荧光，而未接毒的对照细胞无可见绿色荧光。该结果证实成功 获得了能与A型FMDV特异性反应的牛源单链基因工程抗体。
[0128] 6.2间接ELISA结果
[0129] 间接ELISA实验结果如图7所示，筛选获得的5株单链基因工程抗体 均能和A型FMDV抗原结合，这些单链基因工程抗体对A型FMDV抗原相 对亲和力在0.01μg/mL-0.1μg/mL之间，其中单链基因工程抗体5对A型 FMDV抗原相对亲和力稍高于其他单链基因工程抗体。
[0130] 6.3病毒中和试验结果
[0131] 在BHK21细胞上进行微量病毒中和试验来检测这些牛源单链基因工程 抗体是否具有A/GDMM/CHA/2013毒株的活性。结果采取IC50来评价抗体 中和作用，IC50是指被检测抗体的半抑制浓度，单位为μg/mL，IC50的值越 低，表明抗体的中和作用能力越强。使用50μg/mL的IC50值作为中和作用 临界值，当待测抗体IC50≥50μg/mL，认为该抗体不具有中和活性。5株牛 源单链基因工程抗体的病毒中和效价如表8所示，牛源单链基因工程抗体1、 2、3、5具有中和A/GDMM/CHA/2013毒株的能力，为A型FMDV中和抗 体，而牛源单链基因工程抗体4为非中和抗体。
[0132] 表8牛源单链基因工程抗体的中和效价
[0133]牛源单链基因工程抗体株 1 2 3 4 5
A/GDMM/CHA/2013毒株 17.87μg/mL 1.47μg/mL 8.89μg/mL ≥50μg/mL 1.43μg/mL [0134] 6.4WB结果
A/GDMM/CHA/2013毒株 17.87μg/mL 1.47μg/mL 8.89μg/mL ≥50μg/mL 1.43μg/mL [0134] 6.4WB结果
[0135] 对A/GDMM/CHA/2013毒株抗原进行电泳，WB结果如图8所示，其中， 泳道1-5分别代表单链基因工程抗体1、2、3、4、5。结果显示，单链基因 工程抗体1在25kDa与35kDa之间，约28kDa处出现特异结合条带，对应 FMDV结构蛋白VP2，同样单链基因工程抗体2也在此位置处出现同样大小 条带。而单链基因工程抗体3、4、5对A型FMDV抗原无反应。该实验结 果证实单链基因工程抗体1和2识别的是A型FMDV结构蛋白VP2上的线 性表位。而单链基因工程抗体3、4、5识别的是A型FMDV抗原上的构象 表位。
[0136] 小结：
[0137] IFA和ELISA实验结果证实，筛选获得的5株牛源单链基因工程抗体对 A型FMDV能发生特异性结合。进一步通过病毒中和实验，证实牛源单链 基因工程抗体1、2、3、5具有中和A/GDMM/CHA/2013毒株的能力，为A 型FMDV中和抗体。WB实验证实，牛源单链基因工程抗体1和2识别的是 A型FMDV衣壳蛋白VP2上的线性表位，而牛源单链基因工程抗体3、4、 5识别的A型FMDV抗原的构象表位。综合以上结果，本研究提供了一种 抗A型FMDV牛源单链基因工程抗体的方法，该筛选方法对研究A型FMDV 宿主特异性抗原位点的鉴定提供了重要方法，进而为口蹄疫分子疫苗的设计 提供指导。
[0138] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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