用于癌症治疗或预防的免疫检查点分子拮抗剂和RANK-L（NF-KB配体）拮抗剂的组合或其双特异性结合分子及其用途
阅读：357发布：2020-05-08
专利汇可以提供用于癌症治疗或预防的免疫检查点分子拮抗剂和RANK-L（NF-KB配体）拮抗剂的组合或其双特异性结合分子及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了用于 治疗 或 预防 癌症的 试剂 。更具体地，本 发明 公开了在用于治疗或抑制癌症(包括转移性癌症)的形成、进展或复发的方法和组合物中的包含NF-κB(RANK)配体的受体的拮抗剂和免疫检查点分子的拮抗剂的治疗组合。，下面是用于癌症治疗或预防的免疫检查点分子拮抗剂和RANK-L（NF-KB配体）拮抗剂的组合或其双特异性结合分子及其用途专利的具体信息内容。
1.一种治疗组合，其包含NF-кB(RANK)配体(RANKL)拮抗剂和至少一种免疫检查点分子(ICM)拮抗剂、由NF-кB(RANK)配体(RANKL)拮抗剂和至少一种免疫检查点分子(ICM)拮抗剂组成、或基本上由NF-кB(RANK)配体(RANKL)拮抗剂和至少一种免疫检查点分子(ICM)拮抗剂组成。
2.根据权利要求1所述的治疗组合，其中所述至少一种ICM拮抗剂适当地拮抗选自以下的ICM：程序性死亡1受体(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、A2A腺苷受体(A2AR)、A2B腺苷受体(A2BR)、B7-H3(CD276)、含有V组结构域的T细胞激活抑制剂1(VTCN 1)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、T细胞激活的V结构域Ig抑制剂(VISTA)、
5'-核苷酸酶(CD73)、tactile(CD96)、脊髓灰质炎病毒受体(CD155)、DNAX附属分子1(DNAM-
1)、脊髓灰质炎病毒受体-相关2(CD112)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRS4；OX40；CD134)、肿瘤坏死因子(配体)超家族成员4(TNFSF4；
OX40配体(OX40L)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、CD160、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白配体(GITRL)、诱导型共刺激物(ICOS)、半乳糖凝集素9(GAL-9)、4-1BB配体(4-1BBL；CD137L)、4-1BB(4-1BB；CD137)、CD70(CD27配体(CD27L))、CD28、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、信号调节蛋白(SIRP-1)、整联蛋白相关蛋白(IAP；CD47)；B淋巴细胞激活标记物(BLAST-1；CD48)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)；CD40、CD40配体(CD40L)、疱疹病毒进入介质(HVEM)、包含跨膜和免疫球蛋白结构域2(TMIGD2)、HERV-H LTR-相关2(HHLA2)、血管内皮生长抑制剂(VEGI)、肿瘤坏死因子受体超家族成员25(TNFRS25)、诱导型T细胞共刺激配体(ICOLG；B7RP1)和具有Ig和ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。
3.根据权利要求1所述的治疗组合，其中所述至少一种ICM拮抗剂选自PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂和CTLA4拮抗剂。
4.根据权利要求1所述的治疗组合，其中所述至少一种ICM拮抗剂不是或排除CTLA-4拮抗剂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的治疗组合，其中所述至少一种ICM拮抗剂包括PD-
1拮抗剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的治疗组合，其中所述至少一种ICM拮抗剂包括PD-L1拮抗剂。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的治疗组合，其中所述至少一种ICM拮抗剂包括PD-
1拮抗剂和PD-L1拮抗剂。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的治疗组合，其中所述至少一种ICM拮抗剂包括PD-
1拮抗剂和CTLA4拮抗剂。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的治疗组合，其中所述至少一种ICM拮抗剂包括PD-L1拮抗剂和CTLA4拮抗剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的治疗组合，其中所述RANKL拮抗剂是与RANKL特异性结合的直接RANKL拮抗剂。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的治疗组合，其中所述RANKL拮抗剂是与RANK特异性结合的间接RANKL拮抗剂。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的治疗组合，其中所述RANKL拮抗剂是抗原结合分子。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的治疗组合，其中单个ICM拮抗剂是抗原结合分子。
14.根据权利要求10所述的治疗组合，其中所述抗RANKL抗原结合分子与包含氨基酸序列TEYLQLMVY(SEQ ID NO：1)(即，SEQ ID NO：2所示的天然RANKL序列的残基233-241)的RANKL的区域特异性结合。
15.根据权利要求10或14所述的治疗组合，其中所述抗RANKL抗原结合分子是单克隆抗体(MAb)。
16.根据权利要求15所述的治疗组合，其中所述抗RANKL抗原结合分子是MAb地诺单抗或其抗原结合片段。
17.根据权利要求16所述的治疗组合，其中所述抗RANK抗原结合分子包含SEQ ID NO：3所示的重链氨基酸序列或其抗原结合片段。
18.根据权利要求16或17所述的治疗组合，其中所述抗RANK抗原结合分子包含SEQ ID NO：4所示的轻链氨基酸序列或其抗原结合片段。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的治疗组合，其中所述抗RANKL抗原结合分子与地诺单抗竞争结合RANKL。
20.根据权利要求12所述的治疗组合，其中所述RANK拮抗剂(例如，抗RANK抗原结合分子或拮抗肽)特异性结合、或包含、由以下组成、或基本上由以下组成：对应于选自CDR2(即残基44-85)和CRD3(即残基86-123)的至少一部分富含半胱氨酸的结构域(CRD)的氨基酸序列。
21.根据权利要求20所述的治疗组合，其中所述RANK拮抗剂(例如抗RANK抗原结合分子或拮抗肽)特异性结合、或包含、由以下组成、或基本上由以下组成：对应于RANK CRD3的至少一部分的氨基酸序列，所述RANK CRD3的代表性实例包括YCWNSDCECCY(SEQ ID NO：5)、YCWSQYLCY(SEQ ID NO：6)。
22.根据权利要求12所述的治疗组合，其中所述RANK拮抗剂是抗RANK抗原结合分子，其与以下氨基酸序列的一个或多个氨基酸特异性结合：VSKTEIEEDSFRQMPTEDEYMDRPSQPTDQLLFLTEPGSKSTPPFSEPLEVGENDSLSQCFTGTQSTVGSESCNCTEPLCRTDWTPMS(SEQ ID NO：7)(即，SEQ ID NO：8所示的天然RANK序列的残基330-417)。
23.根据权利要求12或22所述的治疗组合，其中所述抗RANK抗原结合分子是单克隆抗体(MAb)。
24.根据权利要求12所述的治疗组合，其中所述抗RANK抗原结合分子选自MAb 64C1385以及N-1H8和N-2B10、或其抗原结合片段。
25.根据权利要求12和20至24中任一项所述的治疗组合，其中所述抗RANK抗原结合分子与MAb 64C1385、N-1H8或N-2B10竞争结合RANK。
26.根据权利要求12中任一所述的治疗组合，其中所述抗RANK抗原结合分子是短链Fv(scFv)抗原结合分子，例如由Newa等人(Mol Pharm.11(1)：81-9(2014))所公开的，或其抗原结合片段。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的治疗组合，其中相应的ICM拮抗剂是抗ICM抗原结合分子。
28.根据权利要求27所述的治疗组合，其中所述抗ICM抗原结合分子选自抗PD-1抗原结合分子、抗PD-L1抗原结合分子和抗CTLA4抗原结合分子。
29.根据权利要求28所述的治疗组合，其中所述抗PD-1抗原结合分子是MAb，其非限制性实例包括纳武单抗、派姆单抗、匹立珠单抗和MEDI-0680(AMP-514)、AMP-224、JS001-PD-
1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、和BGB-317或其抗原结合片段。
30.根据权利要求28所述的治疗组合，其中所述抗PD-1抗原结合分子与纳武单抗、派姆单抗、匹立珠单抗、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317或MEDI-0680竞争结合PD-1。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的治疗组合，其中所述抗PD-1抗原结合分子与氨基酸序列SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR(SEQ ID NO：9)(即，SEQ ID NO：10中所示的天然PD-1序列的残基62至86)中的一个或多个氨基酸特异性结合，和/或与氨基酸序列
SGTYLCGAISLAPKAQIKE(SEQ ID NO：11)(即，SEQ ID NO：10中所示的天然PD-1序列的残基
118至136)中的一个或多个氨基酸特异性结合。
32.根据权利要求28至30中任一项所述的治疗组合，其中所述抗PD-1抗原结合分子与氨基酸序列NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV(SEQ ID NO：12)(即，对应于SEQ ID NO：
10中所示的天然PD-1序列的残基66至97)中的一个或多个氨基酸特异性结合。
33.根据权利要求28所述的治疗组合，其中所述抗PD-L1抗原结合分子是MAb，其非限制性实例包括杜鲁伐单抗(MEDI4736)、阿特朱单抗(Tecentriq)、奥维单抗、BMS-936559/MDX-
1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480和MPDL3280A或其抗原结合片段。
34.根据权利要求28或33所述的治疗组合，其中所述抗PD-L1抗原结合分子与氨基酸序列SKKQSDTHLEET(SEQ ID NO：13)(即，SEQ ID NO：14所示的全长天然PD-L1氨基酸序列的残基279至290)中的一个或多个氨基酸特异性结合。
35.根据权利要求28或33所述的治疗组合，其中所述抗PD-L1抗原结合分子与杜鲁伐单抗(MEDI4736)、阿特朱单抗(Tecentriq)、奥维单抗、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480和MPDL3280A中的任一个竞争结合PD-L1。
36.根据权利要求28所述的治疗组合，其中所述抗CTLA4抗原结合分子是MAb，其代表性实例包括伊匹单抗和曲美木单抗或其抗原结合片段。
37.根据权利要求28所述的治疗组合，其中所述抗CTLA4抗原结合分子与伊匹单抗或曲美木单抗竞争结合CTLA4。
38.根据权利要求28、36和37中任一项所述的治疗组合，其中所述抗CTLA4抗原结合分子特异性结合选自YASPGKATEVRVTVLRQA(SEQ ID NO：15)(即，SEQ ID NO：16所示的全长天然PD-CTLA4氨基酸序列的残基26至42)、DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD(SEQ ID NO：17)(即，SEQ ID NO：16所示的天然CTLA4序列的残基43至65)和VELMYPPPYYLGIG(SEQ ID NO：18)(即，SEQ ID NO：16所示的天然CTLA4序列的残基96至109)的至少一个氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
39.根据前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述RANKL拮抗剂和所述ICM拮抗剂中的一种或两者是抗原结合分子，并且其中所述抗原结合分子与免疫球蛋白恒定链(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4恒定链)连接。
40.根据权利要求39所述的治疗组合，其中所述免疫球蛋白恒定链包含轻链和重链，所述轻链选自κ轻链或λ轻链，所述重链选自γ1重链、γ2重链、γ3重链和γ4重链。
41.根据前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其包含RANKL拮抗剂和两种或更多种不同的ICM拮抗剂、由RANKL拮抗剂和两种或更多种不同的ICM拮抗剂组成、或基本上由RANKL拮抗剂和两种或更多种不同的ICM拮抗剂组成。
42.根据权利要求41所述的治疗组合，其中所述治疗组合包含以下、由以下组成、或基本上由以下组成：RANKL拮抗剂以及选自CTLA4拮抗剂、PD-1拮抗剂和PD-L1拮抗剂中的至少两种。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的治疗组合，其中各拮抗剂组分为离散组分的形式。
44.根据权利要求1至42中任一项所述的治疗组合，其中各拮抗剂组分彼此融合或以其他方式(直接或间接)缀合。
45.根据权利要求44所述的治疗组合，其中所述治疗组合为多特异性拮抗试剂的形式，其包含RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂。
46.根据权利要求45所述的治疗组合，其中所述多特异性试剂是两个或更多个多肽的复合物。
47.根据权利要求45所述的治疗组合，其中所述多特异性试剂是单链多肽。
48.根据权利要求47所述的治疗组合，其中所述RANKL拮抗剂与相应的ICM拮抗剂的N-末端缀合。
49.根据权利要求47所述的治疗组合，其中所述RANKL拮抗剂与相应的ICM拮抗剂的C-末端缀合。
50.根据权利要求48或49所述的治疗组合，其中所述RANKL拮抗剂和所述ICM拮抗剂直接连接。
51.根据权利要求48或49所述的治疗组合，其中所述RANKL拮抗剂和所述ICM拮抗剂通过中间接头(例如多肽接头)连接。
52.根据权利要求45至51中任一项所述的治疗组合，其中所述多特异性拮抗试剂包含至少两个抗原结合分子。
53.根据权利要求52所述的治疗组合，其中所述多特异性抗原结合分子为重组分子的形式，包括嵌合、人源化和人抗原结合分子。
54.一种用于拮抗RANKL和至少一种ICM的多特异性抗原结合分子，其包含以下、由以下组成、或基本上由以下组成：与RANKL或RANK特异性结合的抗体或其抗原结合片段，以及对于各自的ICM而言，与所述ICM特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
55.根据权利要求54所述的多特异性抗原结合分子，其中所述抗体和/或抗原结合片段直接连接。
56.根据权利要求54所述的多特异性抗原结合分子，其中所述抗体和/或抗原结合片段通过中间接头(例如化学接头或多肽接头)连接。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其为单链多肽形式，其中所述抗体或抗原结合片段可操作地连接。
58.根据权利要求54至56中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其为多个离散的多肽链的形式，所述多个离散的多肽链连接或以其他方式彼此结合以形成复合物。
59.根据权利要求54至58中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其为二价、三价或四价。
60.根据权利要求54至59中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中所述至少一种ICM选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、CD276、VTCN1、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、CD155、DNAM-1、CD112、CRTAM、OX40、OX40L、CD244、CD160、GITR、GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL、4-1BB、CD27L、CD28、CD80、CD86、SIRP-1、CD47、CD48、CD244、CD40、CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、TNFRS25、ICOLG和TIGIT。
61.根据权利要求54至60中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其是双特异性的，其中所述抗ICM抗体或其抗原结合片段不是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段。
62.根据权利要求54至61中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其包含选自Fab、Fab'、F(ab’)2和Fv分子的抗原结合片段以及互补决定区(CDR)。
63.根据权利要求54至62中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中单个抗体或其抗原结合片段包含恒定结构域，该恒定结构域独立地选自IgG、IgM、IgD、IgA和IgE。
64.根据权利要求54至61中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中所述多特异性抗原结合分子选自串联scFv(taFv或scFv2)、双抗体、dAb2/VHH2、旋钮入孔(knobs-in-holes)衍生物、Seedcod-IgG、异Fc-scFv、Fab-scFv、scFv-Jun/Fos、Fab'-Jun/Fos、三抗体、DNL-F(ab)3、scFv3-CH1/CL、Fab-scFv2、IgG-scFab、IgG-scFv、scFv-IgG、scFv2-Fc、F(ab’)2-scFv2、scDB-Fc、scDb-CH3、Db-Fc、scFv2-H/L、DVD-Ig、tandAb、scFv-dhlx-scFv、dAb2-IgG、dAb-IgG、dAb-Fc-dAb、tandab、DART、BiKE、TriKE、mFc-VH、交联的Mab、交叉Mab、MAb2、静电匹配的抗体、对称IgG样抗体、LUZ-Y、Fab交换的抗体、FIT-Ig或其组合。
65.根据权利要求54至64中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其包含与免疫球蛋白恒定链(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4)连接的抗原结合片段。
66.根据权利要求65所述的多特异性抗原结合分子，其中所述免疫球蛋白恒定链包含轻链和/或重链，所述轻链选自κ轻链和λ轻链，所述重链选自γ1重链、γ2重链、γ3重链和γ4重链。
67.根据权利要求54至66中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其包含特异性结合氨基酸序列TEYLQLMVY(SEQ ID NO：1)(即，SEQ ID NO：2所示天然RANKL序列的残基233-
241)的一个或多个氨基酸的抗RANKL抗体或其抗原结合片段。
68.根据权利要求54至66中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其包含特异性结合RANK的胞外区域(即，对应于SEQ ID NO：8所示的人RANK序列的残基30至212)的抗RANK抗体或其抗原结合片段。
69.根据权利要求54至68中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中所述多特异性抗原结合分子拮抗PD-1，并且包含抗PD-1抗体或其抗原结合片段，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段特异性结合选自以下的氨基酸序列的一个或多个氨基酸：
SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR(SEQ ID NO：9)(即，SEQ ID NO：10所示的天然人PD-1序列的残基62至86)、SGTYLCGAISLAPKAQIKE(SEQ ID NO：11)(即，SEQ ID NO：10所示的天然人PD-1序列的残基118至136)和NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV(SEQ ID NO：12)(即，对应于SEQ ID NO：10所示的天然人PD-1序列的残基66至97)。
70.根据权利要求54至69中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含选自纳武单抗、派姆单抗、匹立珠单抗和MEDI-0680(AMP-514)、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317的MAb的重链和轻链或其抗原结合片段。
71.根据权利要求54至68中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中所述多特异性抗原结合分子拮抗PD-L1，并且包含抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段特异性结合氨基酸序列SKKQSDTHLEET(SEQ ID NO：13)(即，SEQ ID NO：14所示的天然人PD-L1氨基酸序列的残基279至290)的一个或多个氨基酸。
72.根据权利要求54至68和71中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含选自杜鲁伐单抗(MEDI4736)、阿特朱单抗(Tecentriq)、奥维单抗、BMS-936559/MDX-1105和MPDL3280A、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480的MAb的重链和轻链，或其抗原结合片段。
73.根据权利要求54至68中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中所述多特异性抗原结合分子拮抗CTLA4，并且所述抗CTLA4抗体或其抗原结合片段特异性结合选自YASPGKATEVRVTVLRQA(SEQ ID NO：15)(即SEQ ID NO：16所示的全长天然PD-CTLA4氨基酸序列的残基26至42)、DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD(SEQ ID NO：17)(即，SEQ ID NO：16所示的天然CTLA4序列的残基43至65)和VELMYPPPYYLGIG(SEQ ID NO：18)(即，SEQ ID NO：16所示的天然CTLA4序列的残基96至109)的氨基酸序列的一个或多个氨基酸。
74.根据权利要求54至68和73中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中所述抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含选自伊匹单抗和曲美木单抗的MAb的重链和轻链，或其抗原结合片段。
75.根据权利要求54所述的多特异性抗原结合分子，其为CrossMAb形式并且拮抗RANKL和PD-1，所述多特异性抗原结合分子包含第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽，所述第一多肽包含对应于SEQ ID NO：240的氨基酸序列，所述第二多肽包含对应于SEQ ID NO：
241的氨基酸序列，所述第三多肽包含对应于SEQ ID NO：242的氨基酸序列，以及所述第四多肽包含对应于SEQ ID NO：244的氨基酸序列。
76.根据权利要求54所述的多特异性抗原结合分子，其为CrossMAb形式并且拮抗RANKL和PD-1，所述多特异性抗原结合分子包含第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽，所述第一多肽包含对应于SEQ ID NO：244的氨基酸序列，所述第二多肽包含对应于SEQ ID NO：
245的氨基酸序列，所述第三多肽包含对应于SEQ ID NO：246的氨基酸序列，以及所述第四多肽包含对应于SEQ ID NO：247的氨基酸序列。
77.根据权利要求54所述的多特异性抗原结合分子，其为CrossMAb形式并且拮抗RANKL和PD-1，所述多特异性抗原结合分子包含第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽，所述第一多肽包含对应于SEQ ID NO：248的氨基酸序列，所述第二多肽包含对应于SEQ ID NO：
249的氨基酸序列，所述第三多肽包含对应于SEQ ID NO：250的氨基酸序列，以及所述第四多肽包含对应于SEQ ID NO：251的氨基酸序列。
78.根据权利要求54所述的多特异性抗原结合分子，其为CrossMAb形式并且拮抗RANKL和PD-1，所述多特异性抗原结合分子包含第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽，所述第一多肽包含对应于SEQ ID NO：252的氨基酸序列，所述第二多肽包含对应于SEQ ID NO：
253的氨基酸序列，所述第三多肽包含对应于SEQ ID NO：254的氨基酸序列，以及所述第四多肽包含对应于SEQ ID NO：255的氨基酸序列。
79.根据权利要求54所述的多特异性抗原结合分子，其为CrossMAb形式并且拮抗RANKL和PD-1，所述多特异性抗原结合分子包含第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽，所述第一多肽包含对应于SEQ ID NO：256的氨基酸序列，所述第二多肽包含对应于SEQ ID NO：
257的氨基酸序列，所述第三多肽包含对应于SEQ ID NO：258的氨基酸序列，以及所述第四多肽包含对应于SEQ ID NO：259的氨基酸序列。
80.根据权利要求54所述的多特异性抗原结合分子，其为CrossMAb形式并且拮抗RANKL和PD-1，所述多特异性抗原结合分子包含第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽，所述第一多肽包含对应于SEQ ID NO：260的氨基酸序列，所述第二多肽包含对应于SEQ ID NO：
261的氨基酸序列，所述第三多肽包含对应于SEQ ID NO：262的氨基酸序列，以及所述第四多肽包含对应于SEQ ID NO：263的氨基酸序列。
81.根据权利要求54所述的多特异性抗原结合分子，其为CrossMAb形式并且拮抗RANKL和PD-1，所述多特异性抗原结合分子包含第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽，所述第一多肽包含对应于SEQ ID NO：264的氨基酸序列，所述第二多肽包含对应于SEQ ID NO：
265的氨基酸序列，所述第三多肽包含对应于SEQ ID NO：266的氨基酸序列，以及所述第四多肽包含对应于SEQ ID NO：267的氨基酸序列。
82.根据权利要求54所述的多特异性抗原结合分子，其为CrossMAb形式并且拮抗RANKL和PD-1，所述多特异性抗原结合分子包含第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽，所述第一多肽包含对应于SEQ ID NO：268的氨基酸序列，所述第二多肽包含对应于SEQ ID NO：
269的氨基酸序列，所述第三多肽包含对应于SEQ ID NO：270的氨基酸序列，以及所述第四多肽包含对应于SEQ ID NO：271的氨基酸序列。
83.根据权利要求54所述的多特异性抗原结合分子，其为CrossMAb形式并且拮抗RANKL和PD-1，所述多特异性抗原结合分子包含第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽，所述第一多肽包含对应于SEQ ID NO：272的氨基酸序列，所述第二多肽包含对应于SEQ ID NO：
273的氨基酸序列，所述第三多肽包含对应于SEQ ID NO：274的氨基酸序列，以及所述第四多肽包含对应于SEQ ID NO：275的氨基酸序列。
84.根据权利要求54所述的多特异性抗原结合分子，其为FIT-Ig形式并且拮抗RANKL和PD-1，所述多特异性抗原结合分子包含第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽包含对应于SEQ ID NO：276的氨基酸序列，所述第二多肽包含对应于SEQ ID NO：277的氨基酸序列，以及所述第三多肽包含对应于SEQ ID NO：278的氨基酸序列。
85.根据权利要求54所述的多特异性抗原结合分子，其为FIT-Ig形式并且拮抗RANKL和CTLA4，所述多特异性抗原结合分子包含第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽包含对应于SEQ ID NO：279的氨基酸序列，所述第二多肽包含对应于SEQ ID NO：277的氨基酸序列，以及所述第三多肽包含对应于SEQ ID NO：280的氨基酸序列。
86.根据权利要求54所述的多特异性抗原结合分子，其为FIT-Ig形式并且拮抗RANKL和PD-L1，所述多特异性抗原结合分子包含第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽包含对应于SEQ ID NO：281的氨基酸序列，所述第二多肽包含对应于SEQ ID NO：277的氨基酸序列，以及所述第三多肽包含对应于SEQ ID NO：282的氨基酸序列。
87.根据前述权利要求中任一项所述的治疗组合或多特异性抗原结合分子，其包含在递送载体(例如脂质体、纳米颗粒、微粒、树枝状聚合物或环糊精)中。
88.根据前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其为单一组合物的形式，其包含每种RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂。
89.根据权利要求87所述的治疗组合，其中所述单一组合物包含RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂的混合物。
90.根据前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂作为离散组分在单独的组合物中提供。
91.根据前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中各拮抗剂是抗原结合分子。
92.根据前述权利要求中任一项所述的治疗组合或多特异性抗原结合分子，其中所述ICM拮抗剂拮抗在调节性T(Treg)细胞中不表达或以低水平表达的ICM。
93.根据权利要求92所述的治疗组合，其中所述至少一种ICM拮抗剂拮抗选自PD-1和PD-L1之一或二者的ICM。
94.根据前述权利要求中任一项所述的治疗组合或多特异性抗原结合分子，其包含抗RANKL抗原结合分子和抗PD-1抗原结合分子、由抗RANKL抗原结合分子和抗PD-1抗原结合分子组成、或基本上由抗RANKL抗原结合分子和抗PD-1抗原结合分子组成。
95.根据前述权利要求中任一项所述的治疗组合或多特异性抗原结合分子，其包含抗RANKL抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子、由抗RANKL抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成或基本上由抗RANKL抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成。
96.根据前述权利要求中任一项所述的治疗组合或多特异性抗原结合分子，其包含抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子，由抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成、或基本上由抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成。
97.根据前述权利要求中任一项所述的治疗组合或多特异性抗原结合分子，其包含抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗CTLA4抗原结合分子，由抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗CTLA4抗原结合分子组成，或基本上由抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗CTLA4抗原结合分子组成。
98.一种或多种构建体，其包含编码前述权利要求中任一项所述多特异性抗原结合分子的核酸序列，所述核酸序列与一个或多个控制序列可操作地连接。
99.一种宿主细胞，其包含权利要求98所限定的构建体。
100.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所限定的治疗组合或多特异性抗原结合分子，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
101.根据权利要求100所述的组合物，其进一步包含至少一种辅助剂，所述辅助剂选自化学治疗剂(例如，选自抗增殖/抗肿瘤药物、细胞抑制剂、抑制癌细胞侵袭的试剂、生长因子功能抑制剂、抗血管生成剂、血管损伤剂等)或免疫治疗剂(例如细胞因子、表达细胞因子的细胞、抗体等)。
102.一种刺激或增强受试者免疫的方法，所述方法包括以下、由以下组成、或基本上由以下组成：向受试者施用有效量的如前述权利要求中任一项所限定的治疗组合或多特异性抗原结合分子，从而刺激或增强所述受试者的免疫。
103.根据权利要求102所述的方法，其中刺激或增强的免疫包括有益的宿主免疫反应，其示例性实例包括以下任一种或多种：减少肿瘤大小；减少肿瘤负荷；稳定疾病；产生针对内源性或外源性抗原的抗体；诱导免疫系统；诱导免疫系统的一种或多种成分；细胞介导的免疫及参与其生产的分子；体液免疫及参与其产生的分子；抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)免疫及参与其产生的分子；补体介导的细胞毒性(CDC)免疫及参与其产生的分子；自然杀伤细胞；细胞因子和趋化因子及参与其产生的分子和细胞；抗体依赖性细胞毒性；补体依赖性细胞毒性；自然杀伤细胞活性；和抗原增强的细胞毒性。
104.根据权利要求102或103所述的方法，其中刺激或增强的免疫包括促炎性免疫反应。
105.一种在受试者中抑制免疫抑制的形成或进展或对肿瘤的耐受性的方法，所述方法包括以下、由以下组成、或基本上由以下组成：使肿瘤与前述权利要求中任一项所限定的治疗组合或多特异性抗原结合分子接触，从而抑制所述受试者中免疫抑制的形成或进展或对肿瘤的耐受性。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述治疗组合或多特异性抗原结合分子也接触将肿瘤抗原呈递给免疫系统的抗原呈递细胞(例如树突状细胞)。
107.一种抑制受试者中癌症的形成、进展或复发的方法，所述方法包括以下、由以下组成、或基本上由以下组成：向受试者施用有效量的前述权利要求中任一项所限定的治疗组合或多特异性抗原结合分子，从而抑制所述受试者中癌症的形成、进展或复发。
108.一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括以下、由以下组成、或基本上由以下组成：向受试者施用有效量的如前述权利要求中任一项所限定的治疗组合或多特异性抗原结合分子，从而治疗所述受试者的癌症。
109.根据权利要求107或108所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、乳癌、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜和子宫癌、胃或胃癌、胰腺癌、前列腺癌、唾液腺癌、肺癌、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、直肠癌、结肠直肠癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆道肿瘤、头颈癌和鳞状细胞癌。
110.根据权利要求107至109中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
111.根据权利要求102至110中任一项所述的方法，其中所述受试者对免疫调节剂具有耐受性或对免疫调节剂的反应性降低或受损。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述免疫调节剂是抗ICM抗原结合分子(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗原结合分子)。
113.根据权利要求102至112中任一项所述的方法，其进一步包括同时施用有效量的辅助抗癌剂。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述辅助抗癌剂选自化学治疗剂、外部束放射、靶向的放射性同位素和信号转导抑制剂。
115.根据权利要求102至114中任一项所述的方法，其包括向受试者同时施用RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述治疗组合为单一组合物的形式。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述单一组合物包含RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂的混合物。
118.根据权利要求117所述的方法，其中各拮抗剂是抗原结合分子。
119.根据权利要求115所述的方法，其中所述治疗组合中的RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂作为离散组分在单独的组合物中提供。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述RANKL拮抗剂和所述至少一种ICM拮抗剂同时施用。
121.根据权利要求119所述的方法，其中所述RANKL拮抗剂和所述至少一种ICM拮抗剂相继施用。
122.根据权利要求121所述的方法，其中在施用所述至少一种ICM拮抗剂之前施用所述RANKL拮抗剂。
123.根据权利要求121所述的方法，其中在施用所述至少一种ICM拮抗剂之后施用所述RANKL拮抗剂。
124.一种试剂盒，其用于刺激或增强免疫、用于抑制免疫抑制的形成或进展或对肿瘤的耐受性、或用于治疗受试者的癌症，所述试剂盒包含任何一种或多种前述权利要求中任一项所述的治疗组合、药物组合物和多特异性抗原结合分子。
用于癌症治疗或预防的免疫检查点分子拮抗剂和RANK-L（NF-
KB配体）拮抗剂的组合或其双特异性结合分子及其用途
[0001] 标题
技术领域
[0003] 本申请要求2017年6月5日提交的题为“用于癌症治疗或预防的试剂及其用途”的澳大利亚临时申请No.2017902125的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
[0004] 本发明一般地涉及用于治疗或预防癌症的试剂。更具体地，本发明涉及在用于治疗或抑制癌症(包括转移性癌症)的形成、进展或复发的方法和组合物中包含NF-κB(RANK)
配体的受体和免疫检查点分子的拮抗剂的治疗组合。
配体的受体和免疫检查点分子的拮抗剂的治疗组合。
背景技术
[0005] 美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)估计，仅在美国，就有三分之一的人在其一生中被诊断患有癌症。此外，大约50％至60％的被诊断患有癌症的人最终会
死于该疾病。该疾病的广泛发生突显了对改进的抗癌疗法的需要，特别是对于恶性癌症的
治疗。
死于该疾病。该疾病的广泛发生突显了对改进的抗癌疗法的需要，特别是对于恶性癌症的
治疗。
[0006] 免疫疗法最近开始在癌症治疗中显示出巨大的希望，并且使用获批的免疫检查点分子阻断抗体，在转移性黑色素瘤的治疗方面取得了相当大的进展。伊匹单抗
(Ipilimumab)是一种抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抗体，其上调抗肿瘤免疫，
并且是第一种在转移性黑色素瘤患者的3期研究中与改善总体生存相关的试剂(参见，
Wolchok等人，2013，New Engl J Med，369：122-133； Smyth等人，2016，J.Clin.Oncol.34(12)：e104-106)。由于尚未完全阐明的原因，伊匹单抗仅与10％和15％患者中的反应相关(Wolchock等人，2013，见上文；Smyth等人2016，见上文)，约30％接受治疗的患者长期生存(Bostwick等人，2015，J Immunoth Cancer，3：19)。因此，尽管在开发单一疗法和组合治疗方面取得了迅速的进展，但是归因于癌症的疾病负担并未显著减轻。
(Ipilimumab)是一种抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抗体，其上调抗肿瘤免疫，
并且是第一种在转移性黑色素瘤患者的3期研究中与改善总体生存相关的试剂(参见，
Wolchok等人，2013，New Engl J Med，369：122-133； Smyth等人，2016，J.Clin.Oncol.34(12)：e104-106)。由于尚未完全阐明的原因，伊匹单抗仅与10％和15％患者中的反应相关(Wolchock等人，2013，见上文；Smyth等人2016，见上文)，约30％接受治疗的患者长期生存(Bostwick等人，2015，J Immunoth Cancer，3：19)。因此，尽管在开发单一疗法和组合治疗方面取得了迅速的进展，但是归因于癌症的疾病负担并未显著减轻。
[0007] 与单独使用PD-1相比，将针对免疫检查点分子程序性死亡1(PD-1)的单克隆抗体(MAb)与抗CTLA4组合可在晚期黑色素瘤中产生优异的肿瘤反应和生存益处。这证明了靶向
肿瘤免疫逃避的非冗余机制的组合免疫疗法的重要性(参见， Larkin等人，2015，N Eng J Med，373：23-24；Postow等人，2015，N Eng J Med， 372：2006-2017；和Wolchok等人，2013同上)。但是，实体和血液恶性肿瘤的免疫疗法中的一个挑战是发现对当前免疫疗法组合产生初级耐受性的患者的新靶标。
肿瘤免疫逃避的非冗余机制的组合免疫疗法的重要性(参见， Larkin等人，2015，N Eng J Med，373：23-24；Postow等人，2015，N Eng J Med， 372：2006-2017；和Wolchok等人，2013同上)。但是，实体和血液恶性肿瘤的免疫疗法中的一个挑战是发现对当前免疫疗法组合产生初级耐受性的患者的新靶标。
[0008] NF-κB的受体(RANK)及其配体(RANKL)分别是肿瘤坏死因子受体和配体超家族的成员，与CD40和CD40L的同源性最高。目前在临床实践中众所周知 RANK(也称为TNFRSF11a)和RANKL(TNFSF11)在骨稳态中的作用，因为从单核巨噬细胞谱系分化破骨细胞需要RANKL
与髓样破骨细胞前体上表达的 RANK相互作用(参见，Dougall等人，1999，Genes Dev.13：
2412-24；和Kong 等人，1999，Nature，397：315-23)。全人IgG2抗RANKL抗体(地诺单抗 (denosumab))在临床实践中被广泛用作有效且耐受良好的抗再吸收剂，用于预防由骨转移
引起的骨骼相关事件以及管理骨巨细胞瘤和骨质疏松症(参见， Branstetter等人，2012，Clin Cancer Res，18：4415-4424)；和Fizazi等人，2011， Lancet，377：813-22)。有趣的是，在患有非小细胞肺癌和骨转移的患者的3期试验的poat-hoc探索分析中，与唑来膦酸相比，地诺单抗增加了总体生存(参见 Scagliotti等人，2012，J.Thorac.Oncol.7：1823-9)。
RANKL最初被鉴定为树突状细胞特异性的存活因子，其被激活的T细胞上调并与成熟树突状
细胞(DC)表面上的RANK相互作用，以防止细胞凋亡(参见Wong等人，1997，J Exp Med， 186：
2075-2080和Hochweller等人，2005，Eur.J.Immunol.35：1086-96)。
与髓样破骨细胞前体上表达的 RANK相互作用(参见，Dougall等人，1999，Genes Dev.13：
2412-24；和Kong 等人，1999，Nature，397：315-23)。全人IgG2抗RANKL抗体(地诺单抗 (denosumab))在临床实践中被广泛用作有效且耐受良好的抗再吸收剂，用于预防由骨转移
引起的骨骼相关事件以及管理骨巨细胞瘤和骨质疏松症(参见， Branstetter等人，2012，Clin Cancer Res，18：4415-4424)；和Fizazi等人，2011， Lancet，377：813-22)。有趣的是，在患有非小细胞肺癌和骨转移的患者的3期试验的poat-hoc探索分析中，与唑来膦酸相比，地诺单抗增加了总体生存(参见 Scagliotti等人，2012，J.Thorac.Oncol.7：1823-9)。
RANKL最初被鉴定为树突状细胞特异性的存活因子，其被激活的T细胞上调并与成熟树突状
细胞(DC)表面上的RANK相互作用，以防止细胞凋亡(参见Wong等人，1997，J Exp Med， 186：
2075-2080和Hochweller等人，2005，Eur.J.Immunol.35：1086-96)。
发明内容
[0009] 本发明部分基于令人惊讶的发现，即拮抗NF-κB的受体激活剂(RANK)配体(RANKL)和免疫检查点分子(ICM)(包括调节性T(Treg)细胞不表达或以低水平表达的ICM)，导致协
同增强对癌症的免疫反应。如下文所述，该发现已被简化为在用于刺激或增强免疫、抑制免疫抑制的形成或进展或对肿瘤的耐受、或抑制癌症的形成、进展或复发的方法和组合物中
实践。
同增强对癌症的免疫反应。如下文所述，该发现已被简化为在用于刺激或增强免疫、抑制免疫抑制的形成或进展或对肿瘤的耐受、或抑制癌症的形成、进展或复发的方法和组合物中
实践。
[0010] 因此，一方面，本发明提供了一种治疗组合，其包含RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂、由RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂组成、或主要由 RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂组成。治疗组合可以是包含每种RANKL 拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂的单一组合物(例如，混合物)的形式。或者，可以将RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂作为离散组分提供在分开的组合物中。
[0011] 所述至少一种ICM拮抗剂适当地拮抗选自以下的ICM：程序性死亡1受体 (PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4
(CTLA-4)、A2A腺苷受体(A2AR)、A2B腺苷受体 (A2BR)、B7-H3(CD276)、含有V组结构域的T细胞激活抑制剂1(VTCN 1)、 B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、T细胞激活的V结构域Ig抑制剂(VISTA)、5'- 核苷酸酶(CD73)、
tactile(CD96)、脊髓灰质炎病毒受体(CD155)、DNAX 附属分子1(DNAM-1)、脊髓灰质炎病毒受体-相关2(CD112)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、肿瘤坏死因子受体超家族成员
4(TNFRS4；OX40； CD134)、肿瘤坏死因子(配体)超家族成员4(TNFSF4；OX40配体(OX40L)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、CD160、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白 (GITR)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白配体(GITRL)、诱导型共刺激物 (ICOS)、半乳糖凝集素9(GAL-9)、4-
1BB配体(4-1BBL；CD137L)、4-1BB (4-1BB；CD137)、CD70(CD27配体(CD27L))、CD28、B7-1(CD80)、 B7-2(CD86)、信号调节蛋白(SIRP-1)、整联蛋白相关蛋白(IAP；CD47)； B淋巴细胞激活标记物(BLAST-1；CD48)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)； CD40、CD40配体(CD40L)、疱疹病毒进入介质(HVEM)、包含跨膜和免疫球蛋白结构域2(TMIGD2)、HERV-H LTR-相关2
(HHLA2)、血管内皮生长抑制剂(VEGI)、肿瘤坏死因子受体超家族成员25(TNFRS25)、诱导型T细胞共刺激配体(ICOLG；B7RP1)和具有Ig和ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序) 结构
域的T细胞免疫受体(TIGIT)。在一些实施方案中，至少一种ICM拮抗剂选自PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂和CTLA4拮抗剂。在一些实施方案中，至少一种ICM拮抗剂不同于或排除CTLA-4拮
抗剂。在一些实施方案中，至少一种ICM 拮抗剂包括PD-1拮抗剂。在一些实施方案中，至少一种ICM拮抗剂包括PD-L1 拮抗剂。在某些实施方案中，至少一种ICM拮抗剂包括PD-1拮抗
剂和PD-L1拮抗剂。在其他实施方案中，至少一种ICM拮抗剂包括PD-1拮抗剂和CTLA4拮抗
剂。在其他实施方案中，至少一种ICM拮抗剂包括PD-L1拮抗剂和CTLA4拮抗剂。在特定的实施方案中，ICM拮抗剂拮抗Treg细胞不表达或以低水平表达的 ICM。在一些相同和其他实施方案中，ICM拮抗剂拮抗在Treg上比在CTLA4上以更低水平表达的ICM(例如，PD-1或PD-L1)。
在一些相同和其他实施方案中， ICM拮抗剂拮抗在免疫效应细胞(例如，效应T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B 细胞等)上比在Treg上以更高水平表达的ICM(例如PD-1或PD-L1)。在这些实施方案的代表性实例中，至少一种ICM拮抗剂拮抗选自PD-1和PD-L1之一或两者的ICM。
(CTLA-4)、A2A腺苷受体(A2AR)、A2B腺苷受体 (A2BR)、B7-H3(CD276)、含有V组结构域的T细胞激活抑制剂1(VTCN 1)、 B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、T细胞激活的V结构域Ig抑制剂(VISTA)、5'- 核苷酸酶(CD73)、
tactile(CD96)、脊髓灰质炎病毒受体(CD155)、DNAX 附属分子1(DNAM-1)、脊髓灰质炎病毒受体-相关2(CD112)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、肿瘤坏死因子受体超家族成员
4(TNFRS4；OX40； CD134)、肿瘤坏死因子(配体)超家族成员4(TNFSF4；OX40配体(OX40L)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、CD160、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白 (GITR)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白配体(GITRL)、诱导型共刺激物 (ICOS)、半乳糖凝集素9(GAL-9)、4-
1BB配体(4-1BBL；CD137L)、4-1BB (4-1BB；CD137)、CD70(CD27配体(CD27L))、CD28、B7-1(CD80)、 B7-2(CD86)、信号调节蛋白(SIRP-1)、整联蛋白相关蛋白(IAP；CD47)； B淋巴细胞激活标记物(BLAST-1；CD48)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)； CD40、CD40配体(CD40L)、疱疹病毒进入介质(HVEM)、包含跨膜和免疫球蛋白结构域2(TMIGD2)、HERV-H LTR-相关2
(HHLA2)、血管内皮生长抑制剂(VEGI)、肿瘤坏死因子受体超家族成员25(TNFRS25)、诱导型T细胞共刺激配体(ICOLG；B7RP1)和具有Ig和ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序) 结构
域的T细胞免疫受体(TIGIT)。在一些实施方案中，至少一种ICM拮抗剂选自PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂和CTLA4拮抗剂。在一些实施方案中，至少一种ICM拮抗剂不同于或排除CTLA-4拮
抗剂。在一些实施方案中，至少一种ICM 拮抗剂包括PD-1拮抗剂。在一些实施方案中，至少一种ICM拮抗剂包括PD-L1 拮抗剂。在某些实施方案中，至少一种ICM拮抗剂包括PD-1拮抗
剂和PD-L1拮抗剂。在其他实施方案中，至少一种ICM拮抗剂包括PD-1拮抗剂和CTLA4拮抗
剂。在其他实施方案中，至少一种ICM拮抗剂包括PD-L1拮抗剂和CTLA4拮抗剂。在特定的实施方案中，ICM拮抗剂拮抗Treg细胞不表达或以低水平表达的 ICM。在一些相同和其他实施方案中，ICM拮抗剂拮抗在Treg上比在CTLA4上以更低水平表达的ICM(例如，PD-1或PD-L1)。
在一些相同和其他实施方案中， ICM拮抗剂拮抗在免疫效应细胞(例如，效应T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B 细胞等)上比在Treg上以更高水平表达的ICM(例如PD-1或PD-L1)。在这些实施方案的代表性实例中，至少一种ICM拮抗剂拮抗选自PD-1和PD-L1之一或两者的ICM。
[0012] RANKL拮抗剂可以是与RANKL特异性结合的直接RANKL拮抗剂，或者是与RANKL的同源受体RANK特异性结合的间接RANKL拮抗剂。
[0013] 许多RANKL和ICM拮抗剂是本领域已知的，它们中的任何一种均可用于本发明的实践中。在各种实施方案中，拮抗剂是拮抗剂抗原结合分子。
[0014] 在这些实施方案中的一些中，RANKL拮抗剂是与RANKL特异性结合的抗 RANKL抗原结合分子。在这种类型的说明性实例中，抗RANKL抗原结合分子特异性结合氨基酸序列
TEYLQLMVY(SEQ ID NO：1)(即，SEQ ID NO：2所示的天然RANKL序列的残基233-241)中的一个或多个氨基酸。
TEYLQLMVY(SEQ ID NO：1)(即，SEQ ID NO：2所示的天然RANKL序列的残基233-241)中的一个或多个氨基酸。
[0015] 在一些实施方案中，抗RANKL抗原结合分子是单克隆抗体(MAb)。抗RANKL 抗原结合分子的非限制性实例是MAb地诺单抗或其抗原结合片段。合适地，抗 RANKL抗原结合分子包含如SEQ ID NO：3所示的重链氨基酸序列或其抗原结合片段和/或如SEQ ID NO：4所示的轻链氨基酸序列或其抗原结合片段。
[0016] 在其他实施方案中，抗RANKL抗原结合分子与地诺单抗竞争结合RANKL。
[0017] 在一些实施方案中，RANKL拮抗剂拮抗RANK。例如，RANK拮抗剂(例如，抗RANK抗原结合分子或拮抗肽)可以特异性结合、或包含、由以下组成、或基本上由以下组成：对应于选自CDR2(即残基44-85)和CRD3(即残基86-123) 的至少一部分富含半胱氨酸的结构域(CRD)的氨基酸序列。在这种类型的非限制性实例中，RANK拮抗剂(例如，抗RANK抗原结合分子或拮抗肽)特异性结合、或包含、由以下组成、或基本上由以下组成：对应于RANK CRD3的至少一部分的氨基酸序列，所述RANK CRD3的代表性实例包括YCWNSDCECCY(SEQ ID NO：5)、
YCWSQYLCY(SEQ ID NO：6)。
YCWSQYLCY(SEQ ID NO：6)。
[0018] 在其他实施方案中，RANK拮抗剂是抗RANK抗原结合分子，其与以下氨基酸序列的一个或多个氨基酸特异性结合：
[0019] VSKTEIEEDSFRQMPTEDEYMDRPSQPTDQLLFLTEPGSKSTPPFSEPLEVGENDSLSQCFTGTQSTVGSESCNC TEPLCRTDWTPMS(SEQ ID NO：7)(即，SEQ ID NO：8所示的天然RANK序列的残基330-
417)。合适地，抗RANK抗原结合分子是单克隆抗体(MAb)。举例来说，抗RANK抗原结合分子可以选自MAb 64C1385以及N-1H8和N-2B10 (Taylor等人Appl Immunohistochem Mol
Morphol.2017；25(5)：299-307； Branstetter等人J Bone Oncol.2015；4(3)：59-68)或其抗原结合片段。在其他实施方案中，抗RANK抗原结合分子可以与MAb 64C1385、N-1H8或N-
2B10竞争结合RANK。在一些实施方案中，抗RANK抗原结合分子是短链Fv(scFv)抗原结合分
子，例如由Newa等人(Mol Pharm.11(1)：81-9(2014))所公开的，或其抗原结合片段。
417)。合适地，抗RANK抗原结合分子是单克隆抗体(MAb)。举例来说，抗RANK抗原结合分子可以选自MAb 64C1385以及N-1H8和N-2B10 (Taylor等人Appl Immunohistochem Mol
Morphol.2017；25(5)：299-307； Branstetter等人J Bone Oncol.2015；4(3)：59-68)或其抗原结合片段。在其他实施方案中，抗RANK抗原结合分子可以与MAb 64C1385、N-1H8或N-
2B10竞争结合RANK。在一些实施方案中，抗RANK抗原结合分子是短链Fv(scFv)抗原结合分
子，例如由Newa等人(Mol Pharm.11(1)：81-9(2014))所公开的，或其抗原结合片段。
[0020] 适当地，相应的ICM拮抗剂是抗ICM抗原结合分子。在特定的实施方案中，抗ICM抗原结合分子选自抗PD-1抗原结合分子、抗PD-L1抗原结合分子和抗 CTLA4抗原结合分子。
[0021] 抗PD-1抗原结合分子可以是MAb，其非限制性实例包括纳武单抗、派姆单抗、匹立珠单抗和MEDI-0680(AMP-514)、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、 Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317或其抗原结合片段。或者，抗PD-1抗原结合分子可以是与纳武单抗、派姆单抗、匹立珠单抗或MEDI-0680 竞争结合PD-1的分子。
[0022] 在 一 些 实 施 方 案 中 ，抗 P D - 1 抗 原 结 合 分 子 与 氨 基 酸 序 列 SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR(SEQ ID NO：9)(即，SEQ ID NO：10 中所示的天然PD-1序列的残基62至86)中的一个或多个氨基酸特异性结合，和/ 或与氨基酸序列SGTYLCGAISLAPKAQIKE(SEQ ID NO：11)(即，SEQ ID NO：10中所示的天然PD-1序列的残基
118至136)中的一个或多个氨基酸特异性结合。在一些相同的实施方案和其他实施方案中，抗PD-1抗原结合分子与氨基酸序列 NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV(SEQ ID NO：12)
(即，对应于SEQ ID NO：10中所示的天然PD-1序列的残基66至97)中的一个或多个氨基酸特异性结合。
118至136)中的一个或多个氨基酸特异性结合。在一些相同的实施方案和其他实施方案中，抗PD-1抗原结合分子与氨基酸序列 NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV(SEQ ID NO：12)
(即，对应于SEQ ID NO：10中所示的天然PD-1序列的残基66至97)中的一个或多个氨基酸特异性结合。
[0023] 在一些实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子是MAb，其非限制性实例包括杜鲁伐单抗(durvalumab，(MEDI4736))、阿特朱单抗(atezolizumab，(Tecentriq))、奥维单抗
(avelumab)、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、 CA-170、GNS-1480和
MPDL3280A或其抗原结合片段。在这种类型的说明性实例中，抗PD-L1抗原结合分子与氨基
酸序列SKKQSDTHLEET(SEQ ID NO：13) (即，SEQ ID NO：14所示的全长天然PD-L1氨基酸序列的残基279至290)中的一个或多个氨基酸特异性结合。或者，抗PD-L1抗原结合分子可以
是与杜鲁伐单抗(MEDI4736)、阿特朱单抗(Tecentriq)、奥维单抗、BMS-936559/MDX-1105、 MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480和MPDL3280A中的任一个竞争结合PD-L1。
(avelumab)、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、 CA-170、GNS-1480和
MPDL3280A或其抗原结合片段。在这种类型的说明性实例中，抗PD-L1抗原结合分子与氨基
酸序列SKKQSDTHLEET(SEQ ID NO：13) (即，SEQ ID NO：14所示的全长天然PD-L1氨基酸序列的残基279至290)中的一个或多个氨基酸特异性结合。或者，抗PD-L1抗原结合分子可以
是与杜鲁伐单抗(MEDI4736)、阿特朱单抗(Tecentriq)、奥维单抗、BMS-936559/MDX-1105、 MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480和MPDL3280A中的任一个竞争结合PD-L1。
[0024] 在一些实施方案中，抗CTLA4抗原结合分子是MAb，其代表性实例包括伊匹单抗和曲美木单抗(tremelimumab)或其抗原结合片段。或者，抗CTLA4抗原结合分子可以是与伊匹单抗或曲美木单抗竞争结合CTLA4的分子。在这种类型的说明性实例中，抗CTLA4抗原结合
分子与选自YASPGKATEVRVTVLRQA(SEQ ID NO：15)(即，SEQ ID NO：16所示的全长天然CTLA4氨基酸序列的残基25 至42)、DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD(SEQ ID NO：17)(即，SEQ ID NO：
16所示的天然CTLA4序列的残基43至65)和VELMYPPPYYLGIG(SEQ ID NO： 18)(即，SEQ ID
NO：16所示的天然CTLA4序列的残基96至109)的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸特异性
结合。
分子与选自YASPGKATEVRVTVLRQA(SEQ ID NO：15)(即，SEQ ID NO：16所示的全长天然CTLA4氨基酸序列的残基25 至42)、DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD(SEQ ID NO：17)(即，SEQ ID NO：
16所示的天然CTLA4序列的残基43至65)和VELMYPPPYYLGIG(SEQ ID NO： 18)(即，SEQ ID
NO：16所示的天然CTLA4序列的残基96至109)的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸特异性
结合。
[0025] 在一些实施方案中，治疗组合包含抗RANKL抗原结合分子和抗PD-1抗原结合分子、由抗RANKL抗原结合分子和抗PD-1抗原结合分子组成、或基本上由抗 RANKL抗原结合分子
和抗PD-1抗原结合分子组成。在其他实施方案中，治疗组合包含抗RANKL抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子、由抗RANKL抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成、或基本上由抗RANKL抗原结合分子和抗 PD-L1抗原结合分子组成。在其他实施方案中，治疗组合包含抗
RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子，由抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成，或基本上由抗RANKL 抗原结合分
子、抗PD-1抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成。在其他实施方案中，治疗组合包含抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗CTLA4 抗原结合分子，由抗RANKL抗原结
合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗CTLA4 抗原结合分子组成，或基本上由抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗CTLA4抗原结合分子组成。在其他实施方案中，治疗组合包含抗RANK抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子、由抗RANK抗原结合分子和抗PD-L1抗原结
合分子组成、或基本上由抗RANK抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成。
和抗PD-1抗原结合分子组成。在其他实施方案中，治疗组合包含抗RANKL抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子、由抗RANKL抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成、或基本上由抗RANKL抗原结合分子和抗 PD-L1抗原结合分子组成。在其他实施方案中，治疗组合包含抗
RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子，由抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成，或基本上由抗RANKL 抗原结合分
子、抗PD-1抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成。在其他实施方案中，治疗组合包含抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗CTLA4 抗原结合分子，由抗RANKL抗原结
合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗CTLA4 抗原结合分子组成，或基本上由抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗CTLA4抗原结合分子组成。在其他实施方案中，治疗组合包含抗RANK抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子、由抗RANK抗原结合分子和抗PD-L1抗原结
合分子组成、或基本上由抗RANK抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成。
[0026] 在其中RANKL或ICM拮抗剂是抗原结合分子的一些实施方案中，抗原结合分子与免疫球蛋白恒定链(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4恒定链) 连接。免疫球蛋白恒定链可包含轻链和重链，所述轻链选自κ轻链或λ轻链，所述重链选自γ1重链、γ2重链、γ3重链和γ4重链。
[0027] 在某些实施方案中，治疗组合包含RANKL拮抗剂和两种或更多种不同的ICM 拮抗剂、由RANKL拮抗剂和两种或更多种不同的ICM拮抗剂组成或基本上由 RANKL拮抗剂和两种
或更多种不同的ICM拮抗剂组成。在这种类型的代表性实例中，治疗组合包含RANKL拮抗剂
和选自CTLA4拮抗剂、PD-1拮抗剂和PD-L1 拮抗剂中的至少两种，由RANKL拮抗剂和选自
CTLA4拮抗剂、PD-1拮抗剂和 PD-L1拮抗剂中的至少两种组成，或基本上由RANKL拮抗剂和
选自CTLA4拮抗剂、PD-1拮抗剂和PD-L1拮抗剂中的至少两种组成。
或更多种不同的ICM拮抗剂组成。在这种类型的代表性实例中，治疗组合包含RANKL拮抗剂
和选自CTLA4拮抗剂、PD-1拮抗剂和PD-L1 拮抗剂中的至少两种，由RANKL拮抗剂和选自
CTLA4拮抗剂、PD-1拮抗剂和 PD-L1拮抗剂中的至少两种组成，或基本上由RANKL拮抗剂和
选自CTLA4拮抗剂、PD-1拮抗剂和PD-L1拮抗剂中的至少两种组成。
[0028] 治疗组合的拮抗剂组分可以是离散组分的形式。或者，它们可以彼此融合或以其他方式(直接或间接)缀合。
[0029] 在特定的实施方案中，治疗组合为多特异性拮抗试剂的形式，其包含RANKL 拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂。多特异性试剂可以是两个或更多个多肽的复合物。或者，多特异性试剂可以是单链多肽。RANKL拮抗剂可以与单个ICM拮抗剂的 N-末端或C-末端缀合。
RANKL拮抗剂和ICM拮抗剂可以直接连接或通过中间接头(例如，多肽接头)连接。在有利的
实施方案中，多特异性拮抗试剂包括至少两种抗原结合分子。适当地，这种多特异性抗原结合分子为重组分子的形式，包括嵌合、人源化和人抗原结合分子。
RANKL拮抗剂和ICM拮抗剂可以直接连接或通过中间接头(例如，多肽接头)连接。在有利的
实施方案中，多特异性拮抗试剂包括至少两种抗原结合分子。适当地，这种多特异性抗原结合分子为重组分子的形式，包括嵌合、人源化和人抗原结合分子。
[0030] 在相关方面，本发明提供了用于拮抗RANKL和至少一种ICM的多特异性抗原结合分子。这些多特异性抗原结合分子通常包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：与RANKL或RANK特异性结合的抗体或其抗原结合片段、和(对于各自的ICM)与该ICM特异性结合的抗
体或其抗原结合片段。抗体和/或抗原结合片段可以直接连接，也可以通过中间接头(例如
化学接头或多肽接头)连接。单个多特异性抗原结合分子可以是单链多肽的形式，其中抗体或抗原结合片段可操作地连接。或者，其可包含多个离散的多肽链，其彼此连接或以其他方式结合以形成复合物。在一些相同和其他实施方案中，多特异性抗原结合分子是二价、三价或四价的。
体或其抗原结合片段。抗体和/或抗原结合片段可以直接连接，也可以通过中间接头(例如
化学接头或多肽接头)连接。单个多特异性抗原结合分子可以是单链多肽的形式，其中抗体或抗原结合片段可操作地连接。或者，其可包含多个离散的多肽链，其彼此连接或以其他方式结合以形成复合物。在一些相同和其他实施方案中，多特异性抗原结合分子是二价、三价或四价的。
[0031] 至少一种ICM合适地选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、 CD276、VTCN1、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、 CD155、DNAM-1、CD112、CRTAM、OX40、OX40L、CD244、CD160、GITR、 GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL、4-1BB、CD27L、CD28、CD80、CD86、SIRP-1、CD47、CD48、CD244、CD40、CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、TNFRS25、 ICOLG和TIGIT。在特定的实施方案中，ICM拮抗剂拮抗Treg细胞不表达或以低水平表达的ICM。在一些相同和其他实施方案中，ICM拮抗剂拮抗在Treg上以比 CTLA4更低的水平表达的ICM(例如PD-1或PD-
L1)。在一些相同和其他实施方案中，ICM拮抗剂拮抗在免疫效应细胞(例如，效应T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞等)上比在Treg上以更高水平表达的ICM(例如PD-1或PD-L1)。在这些实施方案的代表性实例中，至少一种ICM拮抗剂拮抗选自PD-1和PD-L1 之一或两者的
ICM。在其中多特异性抗原结合分子是双特异性的特定实施方案中，抗ICM抗体或其抗原结
合片段不是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段。
L1)。在一些相同和其他实施方案中，ICM拮抗剂拮抗在免疫效应细胞(例如，效应T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞等)上比在Treg上以更高水平表达的ICM(例如PD-1或PD-L1)。在这些实施方案的代表性实例中，至少一种ICM拮抗剂拮抗选自PD-1和PD-L1 之一或两者的
ICM。在其中多特异性抗原结合分子是双特异性的特定实施方案中，抗ICM抗体或其抗原结
合片段不是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段。
[0032] 考虑用于多特异性抗原结合分子中的抗原结合片段可以选自Fab、Fab'、F(ab’)2和Fv分子以及互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，单个抗体或其抗原结合片段包含恒定结构域，其独立地选自IgG、IgM、IgD、IgA和IgE。多特异性抗原结合分子的非限制性实例适当地包括串联scFv(taFv或scFv2)、双抗体、 dAb2/VHH2、旋钮入孔衍生物、Seedcod-IgG、异Fc-scFv、Fab-scFv、scFv-Jun/Fos、 Fab'-Jun/Fos、三抗体、DNL-F(ab)3、scFv3-CH1/CL、Fab-scFv2、IgG-scFab、IgG-scFv、 scFv-IgG、scFv2-Fc、F(ab’)2-scFv2、scDB-Fc、scDb-CH3、Db-Fc、scFv2-H/L、DVD-Ig、 tandAb、scFv-dhlx-scFv、dAb2-IgG、dAb-IgG、dAb-Fc-dAb、tandab、DART、BiKE、 TriKE、mFc-VH、交联的MAb、交叉MAb、MAb2、FIT-Ig、静电匹配的抗体、对称IgG样抗体、LUZ-Y、Fab交换的抗体或其组合。
[0033] 合适的抗原结合片段可以与免疫球蛋白恒定链(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、 IgG3和IgG4)连接。在这种类型的代表性实例中，免疫球蛋白恒定链可包含轻链和/或重链，所述轻链选自κ轻链和λ轻链，所述重链选自γ1重链、γ2重链、γ3 重链和γ4重链。
[0034] 在其中RANKL拮抗剂是直接RANKL拮抗剂的一些实施方案中，多特异性抗原结合分子包含特异性结合氨基酸序列TEYLOLMVY(SEQ ID NO：1)(即， SEQ ID NO：2所示天然RANKL序列的残基233-241)的一个或多个氨基酸的抗 RANKL抗体或其抗原结合片段。在RANKL拮
抗剂是间接的RANKL拮抗剂的其他实施方案中，多特异性抗原结合分子可以包含特异性结
合RANK的胞外区域 (即，对应于SEQ ID NO：8所示的人RANK序列的残基30至212)的抗RANK 抗体或其抗原结合片段。
抗剂是间接的RANKL拮抗剂的其他实施方案中，多特异性抗原结合分子可以包含特异性结
合RANK的胞外区域 (即，对应于SEQ ID NO：8所示的人RANK序列的残基30至212)的抗RANK 抗体或其抗原结合片段。
[0035] 在多特异性抗原结合分子拮抗PD-1的一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段特异性结合选自以下的氨基酸序列的一个或多个氨基酸：
SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR(SEQ ID NO：9)(即，SEQ ID NO：10 所示的天然人PD-1序列的残基62至86)、SGTYLCGAISLAPKAQIKE(SEQ ID NO： 11)(即，SEQ ID NO：10所示的天然人PD-
1序列的残基118至136)和 NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV(SEQ ID NO：12)(即，对应于SEQ ID NO：10所示的天然人PD-1序列的残基66至97)。
SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR(SEQ ID NO：9)(即，SEQ ID NO：10 所示的天然人PD-1序列的残基62至86)、SGTYLCGAISLAPKAQIKE(SEQ ID NO： 11)(即，SEQ ID NO：10所示的天然人PD-
1序列的残基118至136)和 NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV(SEQ ID NO：12)(即，对应于SEQ ID NO：10所示的天然人PD-1序列的残基66至97)。
[0036] 在一些相同的实施方案和其他实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含选自纳武单抗、派姆单抗、匹立珠单抗和MEDI 0680(AMP-514)、AMP-224、 JS001-PD-1、SHR-
1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317 的MAb的重链和轻链或其抗原结合片段。
1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317 的MAb的重链和轻链或其抗原结合片段。
[0037] 在多特异性抗原结合分子拮抗PD-L1的一些实施方案中，抗PD-L1抗体或其抗原结合片段特异性结合氨基酸序列SKKQSDTHLEET(SEQ ID NO：13)(即， SEQ ID NO：14所示的天然人PD-L1氨基酸序列的残基279至290)的一个或多个氨基酸。这种类型的示例性抗体和抗
原结合片段包括以下抗体和抗原结合片段，其包含选自杜鲁伐单抗(MEDI4736)、阿特朱单
抗(Tecentriq)、奥维单抗、 BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-
1480和 MPDL3280A的MAb的重链和轻链或其抗原结合片段。
原结合片段包括以下抗体和抗原结合片段，其包含选自杜鲁伐单抗(MEDI4736)、阿特朱单
抗(Tecentriq)、奥维单抗、 BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-
1480和 MPDL3280A的MAb的重链和轻链或其抗原结合片段。
[0038] 在多特异性抗原结合分子拮抗CTLA4的一些实施方案中，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段特异性结合选自YASPGKATEVRVTVLRQA(SEQ ID NO：15)(即 SEQ ID NO：16所示的全
长天然PD-CTLA4氨基酸序列的残基25至42)、 DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD(SEQ ID NO：17)
(即，SEQ ID NO：16所示的天然CTLA4序列的残基43至65)和VELMYPPPYYLGIG(SEQ ID NO：
18)(即， SEQ ID NO：16所示的天然CTLA4序列的残基96至109)的氨基酸序列的一个或多个氨基酸。这种类型的示例性抗体和抗原结合片段包括包含MAb的重链和轻链的那些，所述
MAb选自伊匹单抗和曲美木单抗、或其抗原结合片段。
长天然PD-CTLA4氨基酸序列的残基25至42)、 DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD(SEQ ID NO：17)
(即，SEQ ID NO：16所示的天然CTLA4序列的残基43至65)和VELMYPPPYYLGIG(SEQ ID NO：
18)(即， SEQ ID NO：16所示的天然CTLA4序列的残基96至109)的氨基酸序列的一个或多个氨基酸。这种类型的示例性抗体和抗原结合片段包括包含MAb的重链和轻链的那些，所述
MAb选自伊匹单抗和曲美木单抗、或其抗原结合片段。
[0039] 在一些实施方案中，多特异性抗原结合分子包含抗RANKL抗原结合分子和抗PD-1抗原结合分子、由抗RANKL抗原结合分子和抗PD-1抗原结合分子组成或基本上由抗RANKL抗
原结合分子和抗PD-1抗原结合分子组成。在其他实施方案中，多特异性抗原结合分子包含
抗RANKL抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子、由抗RANKL抗原结合分子和抗PD-L1抗原结
合分子组成或基本上由抗 RANKL抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成。在其他实施
方案中，多特异性抗原结合分子包含抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗PD-
L1 抗原结合分子，由抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成或基本上由抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗 PD-L1抗原结合分子组
成。在其他实施方案中，多特异性抗原结合分子包含抗 RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗CTLA4抗原结合分子，由抗 RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗
CTLA4抗原结合分子组成或基本上由抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗
CTLA4抗原结合分子组成。在其他实施方案中，多特异性抗原结合分子包含抗RANK抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子、由抗RANK抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成或基本
上由抗RANK抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成。
原结合分子和抗PD-1抗原结合分子组成。在其他实施方案中，多特异性抗原结合分子包含
抗RANKL抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子、由抗RANKL抗原结合分子和抗PD-L1抗原结
合分子组成或基本上由抗 RANKL抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成。在其他实施
方案中，多特异性抗原结合分子包含抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗PD-
L1 抗原结合分子，由抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成或基本上由抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗 PD-L1抗原结合分子组
成。在其他实施方案中，多特异性抗原结合分子包含抗 RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗CTLA4抗原结合分子，由抗 RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗
CTLA4抗原结合分子组成或基本上由抗RANKL抗原结合分子、抗PD-1抗原结合分子和抗
CTLA4抗原结合分子组成。在其他实施方案中，多特异性抗原结合分子包含抗RANK抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子、由抗RANK抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成或基本
上由抗RANK抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子组成。
[0040] 在另一方面，本发明提供了产生上文和本文其他地方广泛描述的治疗组合的方法。这些方法通常包括将抗RANKL或抗RANK抗原结合分子与至少一种抗ICM 抗原结合分子
结合以产生治疗组合。在一些实施方案中，该方法包括产生与治疗组合的靶多肽(例如，
RANKL、RANK或ICM)特异性结合的抗原结合分子(例如，通过用免疫多肽免疫动物，所述免疫多肽包含对应于靶多肽的氨基酸序列；和从动物中鉴定和/或分离B细胞，所述B细胞特异性结合靶多肽或其至少一个区域；和产生由该B细胞表达的抗原结合分子)。在非限制性实例
中，所述方法进一步包括使如此产生的抗原结合分子衍生化以产生与所述抗原结合分子具
有相同的表位结合特异性的衍生的抗原结合分子。衍生的抗原结合分子可以选自抗体片
段，其说明性实例包括Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv、单链(scFv)和结构域抗体(包括，例如，鲨鱼和骆驼科动物抗体)、和包含抗体的融合蛋白以及包含抗原结合/ 识别位点的免疫球蛋白
分子的任何其他修饰构型。
结合以产生治疗组合。在一些实施方案中，该方法包括产生与治疗组合的靶多肽(例如，
RANKL、RANK或ICM)特异性结合的抗原结合分子(例如，通过用免疫多肽免疫动物，所述免疫多肽包含对应于靶多肽的氨基酸序列；和从动物中鉴定和/或分离B细胞，所述B细胞特异性结合靶多肽或其至少一个区域；和产生由该B细胞表达的抗原结合分子)。在非限制性实例
中，所述方法进一步包括使如此产生的抗原结合分子衍生化以产生与所述抗原结合分子具
有相同的表位结合特异性的衍生的抗原结合分子。衍生的抗原结合分子可以选自抗体片
段，其说明性实例包括Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv、单链(scFv)和结构域抗体(包括，例如，鲨鱼和骆驼科动物抗体)、和包含抗体的融合蛋白以及包含抗原结合/ 识别位点的免疫球蛋白
分子的任何其他修饰构型。
[0041] 在一些实施方案中，治疗组合或多特异性抗原结合分子包含在递送载体(例如脂质体、纳米颗粒、微粒、树枝状聚合物或环糊精)中。
[0042] 在另一方面，本发明提供了构建体，其包含与一个或多个控制序列可操作连接的编码如上文和本文其他地方广泛描述的多特异性抗原结合分子的核酸序列。合适的构建体
优选为表达构建体的形式，其代表性实例包括质粒、粘粒、噬菌体和病毒。
优选为表达构建体的形式，其代表性实例包括质粒、粘粒、噬菌体和病毒。
[0043] 本发明的另一方面提供了宿主细胞，其包含如上文和本文其他地方广泛描述的构建体。
[0044] 在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含如上广泛描述的治疗组合或多特异性抗原结合分子，以及药学上可接受的载体或稀释剂。在一些实施方案中，组合物还包含至少一种辅助剂，其选自化学治疗剂(例如，选自抗增殖/抗肿瘤药物、细胞抑制剂、抑制癌细胞侵袭的试剂、生长因子功能抑制剂、抗血管生成剂、血管损伤剂等)或免疫治疗剂(例如细胞因子、表达细胞因子的细胞、抗体等)。
[0045] 本发明的另一方面提供了刺激或增强受试者免疫的方法。这些方法通常包括、由以下组成、或基本上由以下组成：向受试者施用有效量的如上文广泛描述的治疗组合或多
特异性抗原结合分子，从而刺激或增强受试者的免疫。在治疗组合中的RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂作为离散组分提供的实施方案中，将这些组分适当地同时施用于受试者。在这种类型的说明性实例中，RANKL拮抗剂与至少一种ICM拮抗剂同时施用。在其他说明性实
例中，RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂相继施用。例如，可以在施用至少一种ICM拮抗剂之前施用RANKL 拮抗剂。合适地，在施用至少一种ICM拮抗剂之后施用RANKL拮抗剂。
特异性抗原结合分子，从而刺激或增强受试者的免疫。在治疗组合中的RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂作为离散组分提供的实施方案中，将这些组分适当地同时施用于受试者。在这种类型的说明性实例中，RANKL拮抗剂与至少一种ICM拮抗剂同时施用。在其他说明性实
例中，RANKL拮抗剂和至少一种ICM拮抗剂相继施用。例如，可以在施用至少一种ICM拮抗剂之前施用RANKL 拮抗剂。合适地，在施用至少一种ICM拮抗剂之后施用RANKL拮抗剂。
[0046] 通常，被刺激或增强的免疫包括有益的宿主免疫反应，其示例性实例包括以下任何一种或多种：减少肿瘤大小；减少肿瘤负荷；稳定疾病；产生针对内源性或外源性抗原的抗体；诱导免疫系统；诱导免疫系统的一种或多种成分；细胞介导的免疫及参与其生产的分子；体液免疫及参与其产生的分子；抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)免疫及参与其产生的
分子；补体介导的细胞毒性(CDC)免疫及参与其产生的分子；自然杀伤细胞；细胞因子和趋化因子及参与其产生的分子和细胞；抗体依赖性细胞毒性；补体依赖性细胞毒性；自然杀伤细胞活性；和抗原增强的细胞毒性。在这种类型的代表性实例中，被刺激或增强的免疫包括促炎性免疫反应。
分子；补体介导的细胞毒性(CDC)免疫及参与其产生的分子；自然杀伤细胞；细胞因子和趋化因子及参与其产生的分子和细胞；抗体依赖性细胞毒性；补体依赖性细胞毒性；自然杀伤细胞活性；和抗原增强的细胞毒性。在这种类型的代表性实例中，被刺激或增强的免疫包括促炎性免疫反应。
[0047] 本发明的另一方面提供了在受试者中抑制免疫抑制的形成或进展或对肿瘤的耐受性的方法。这些方法通常包括、由以下组成、或基本上由以下组成：使肿瘤与如上广泛描述的治疗组合或多特异性抗原结合分子接触，从而抑制受试者中免疫抑制的形成或进展或
对肿瘤的耐受性。适当地，治疗组合或多特异性抗原结合分子也接触将肿瘤抗原呈递给免
疫系统的抗原呈递细胞(例如树突状细胞)。
对肿瘤的耐受性。适当地，治疗组合或多特异性抗原结合分子也接触将肿瘤抗原呈递给免
疫系统的抗原呈递细胞(例如树突状细胞)。
[0048] 本发明的另一方面提供了抑制受试者中癌症的形成、进展或复发的方法。这些方法通常包括、由以下组成、或基本上由以下组成：向受试者施用有效量的如上文和本文其他地方广泛描述的治疗组合或多特异性抗原结合分子，从而抑制受试者中癌症的形成、进展
或复发。
或复发。
[0049] 在相关方面，本发明提供了用于治疗受试者的癌症的方法。这些方法通常包括、由以下组成、或基本上由以下组成：向受试者施用有效量的如上文和本文其他地方广泛描述的治疗组合或多特异性抗原结合分子，从而治疗癌症。
[0050] 可以根据本发明治疗的癌症的非限制性实例包括黑色素瘤、乳癌、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜和子宫癌、胃或胃癌、胰腺癌、前列腺癌、唾液腺癌、肺癌、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、直肠癌、结肠直肠癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆道肿瘤、头颈癌和鳞状细胞癌。在一些特定的实施方案中，所述癌症是转移性癌症。
[0051] 在涉及向受试者施用治疗组合或多特异性抗原结合分子的任何上述方面中，受试者对免疫调节剂的反应性适当降低或受损，例如受试者对ICM分子拮抗剂(例如，抗PD-1或
抗PD-L1免疫疗法)的反应性降低或受损。
抗PD-L1免疫疗法)的反应性降低或受损。
[0052] 在本发明的一些方法中，将有效量的辅助抗癌剂同时施用于受试者。一些合适的辅助抗癌剂包括化学治疗剂、外部束放射、靶向的放射性同位素和信号转导抑制剂。但是，任何其他已知的抗癌剂同样适用于本发明的方法。
[0053] 在另一方面，本发明提供了用于刺激或增强免疫、用于抑制免疫抑制的形成或进展或对肿瘤的耐受性、或用于治疗受试者的癌症的试剂盒。这些试剂盒包含上文和本文其
他地方广泛描述的任何一种或多种治疗组合、药物组合物和多特异性抗原结合分子。
附图说明
他地方广泛描述的任何一种或多种治疗组合、药物组合物和多特异性抗原结合分子。
附图说明
[0054] 图1是图示，其描述了抗CTLA4和抗RANKL的组合对实验性肺转移的抑制是NK细胞和IFN-γ依赖性的。5-10只C57BL/6野生型(WT)或基因靶向的小鼠 (如所示)的组静脉内注
射B16F10黑色素瘤细胞(2x 105)(A-C)。5-10只C57BL/6 野生型(WT)组静脉内注射RM 1前
列腺癌细胞(1x 104)(D)。在第-1、0和 2天(相对于肿瘤接种)，用cIg、抗CTLA4(UC10-4F10，仓鼠IgG)和/或抗RANKL (IK22/5)(均为200μg/小鼠，腹膜内)治疗小鼠，如所示。(B)在第-
1、0和 7天另外用抗CD8β或抗asGM1(每只均为100μg/小鼠腹膜内)治疗某些组的小鼠。14天后，通过计数肺表面上的菌落来定量肺中的转移负荷。显示了每组的平均值±SEM。如所示，组合改善的转移控制在统计学上是显著的(单因素方差分析(one way ANOVA)，Tukey多重
比较；*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001)。
射B16F10黑色素瘤细胞(2x 105)(A-C)。5-10只C57BL/6 野生型(WT)组静脉内注射RM 1前
列腺癌细胞(1x 104)(D)。在第-1、0和 2天(相对于肿瘤接种)，用cIg、抗CTLA4(UC10-4F10，仓鼠IgG)和/或抗RANKL (IK22/5)(均为200μg/小鼠，腹膜内)治疗小鼠，如所示。(B)在第-
1、0和 7天另外用抗CD8β或抗asGM1(每只均为100μg/小鼠腹膜内)治疗某些组的小鼠。14天后，通过计数肺表面上的菌落来定量肺中的转移负荷。显示了每组的平均值±SEM。如所示，组合改善的转移控制在统计学上是显著的(单因素方差分析(one way ANOVA)，Tukey多重
比较；*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001)。
[0055] 图2是图示，其显示抗CTLA4的同种型影响其与抗RANKL组合以抑制实验性肺转移的功效。5-8只C57BL/6野生型(WT)小鼠的组静脉内注射B16F10黑色素瘤细胞(2×105)，如
所示(A，B)。在第-1、0和2天(相对于肿瘤接种)，用cIg(1D12，小鼠IgG2a)、抗CTLA4的不同同种型(UC10-4F10(仓鼠IgG)、 9D9(小鼠IgG2a、IgG2b、IgG1或IgG1 D265A)和/或cIg(2A3，大鼠IgG2a) 或抗RANKL(IK22/5)(均为200μg/小鼠，腹膜内)治疗小鼠，如所示。14天后，通过计数肺表面上的菌落来定量肺中的转移负荷。显示了每组的平均值±SEM。 (A)是来自两个
独立实验的合并结果。如所示，与单独的抗CTLA4(IgG2a和仓鼠同种型)相比，组合改善的转移控制在统计学上是显著的(单因素方差分析， Tukey多重比较；*P<0.05，**P<0.01，***P<
0.001，****P<0.0001)。(B) 在所指示处，抗CTLA4-IgG2a单独同种型以及各种组合改善的转移控制是显著的 (单因素方差分析，Sidak多重比较，其中将抗CTLA4单一疗法与cIg进行了比较，并与抗RANKL的组合、或与cIg的组合进行了比较；*P<0.05，***P<0.001， ****P<
0.0001)。实验进行一次。
所示(A，B)。在第-1、0和2天(相对于肿瘤接种)，用cIg(1D12，小鼠IgG2a)、抗CTLA4的不同同种型(UC10-4F10(仓鼠IgG)、 9D9(小鼠IgG2a、IgG2b、IgG1或IgG1 D265A)和/或cIg(2A3，大鼠IgG2a) 或抗RANKL(IK22/5)(均为200μg/小鼠，腹膜内)治疗小鼠，如所示。14天后，通过计数肺表面上的菌落来定量肺中的转移负荷。显示了每组的平均值±SEM。 (A)是来自两个
独立实验的合并结果。如所示，与单独的抗CTLA4(IgG2a和仓鼠同种型)相比，组合改善的转移控制在统计学上是显著的(单因素方差分析， Tukey多重比较；*P<0.05，**P<0.01，***P<
0.001，****P<0.0001)。(B) 在所指示处，抗CTLA4-IgG2a单独同种型以及各种组合改善的转移控制是显著的 (单因素方差分析，Sidak多重比较，其中将抗CTLA4单一疗法与cIg进行了比较，并与抗RANKL的组合、或与cIg的组合进行了比较；*P<0.05，***P<0.001， ****P<
0.0001)。实验进行一次。
[0056] 图3是图示，其显示抗CTLA4与抗RANKL组合抑制B16F10皮下肿瘤。5 只C57BL/6野生型(WT)小鼠的组皮下注射B16F10黑色素瘤细胞(1x 105)。在第3、7、9和11天(相对于肿瘤接种)用cIg、抗CTLA4(UC10-4F10，仓鼠 Ig，200μg腹膜内)治疗小鼠。显示了每组的平均值±SEM。图是来自七次独立实验的代表性生长曲线。
[0057] 图4是图示，其显示抗CTLA4的IgG2a同种型与抗RANKL最有效地组合以抑制B16F105
皮下肿瘤。5只C57BL/6野生型(WT)小鼠的组皮下注射B16F10 黑色素瘤细胞(1x 10)。(A)
在第6、8、10和12天或(B)在第3、7、9和 11天(相对于肿瘤接种)，用cIg、抗CTLA4(9D9，小鼠IgG2a或IgG1-D265A， 50μg，腹膜内，如所示)和/或抗RANKL(IK22/5，200μg，腹膜内)治疗小鼠，如所示。显示了每组的平均值±SEM。在所指示处，抗-CTLA4和抗-RANKL组合对皮下肿瘤生长的优势控制是统计学上显著的(单因素方差分析,Tukey多重比较；*P<0.05，**P<
0.01，****P<0.0001)。抗CTLA4-IgG2a和抗RANKL组合，与二者任一作为单一疗法、或clg之间差异显著，如所示(Kruskal-Wallis检验，Dunn多重比较，其中将单一疗法组(arm)或clg与抗CTLA4-IgG2a和抗RANKL 的组合进行比较；*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001)。当将抗 CTLA4-IgG1-D265A和抗RANKL的组合与二者任一作为单一疗法进行比较时，未发现显著差
异。(C)抗CTLA4-IgG2a和抗RANKL疗法的组合最大程度地抑制了B16F10皮下肿瘤的生长。在图中显示了比较七个独立合并实验的治疗组(每组5-6只小鼠)，预测的混合效应重复测量
肿瘤数据(对数标度)。如表中所示，与单一疗法或对照相比，抗RANKL和抗CTLA4(mIgG2a)组合的优势生长抑制是显著的，而抗RANKL和抗CTLA4(mIgG1-D265A)与对照但非单一疗法相
比具有显著抑制(配对比较；**P<0.01，****P<0.0001)。
皮下肿瘤。5只C57BL/6野生型(WT)小鼠的组皮下注射B16F10 黑色素瘤细胞(1x 10)。(A)
在第6、8、10和12天或(B)在第3、7、9和 11天(相对于肿瘤接种)，用cIg、抗CTLA4(9D9，小鼠IgG2a或IgG1-D265A， 50μg，腹膜内，如所示)和/或抗RANKL(IK22/5，200μg，腹膜内)治疗小鼠，如所示。显示了每组的平均值±SEM。在所指示处，抗-CTLA4和抗-RANKL组合对皮下肿瘤生长的优势控制是统计学上显著的(单因素方差分析,Tukey多重比较；*P<0.05，**P<
0.01，****P<0.0001)。抗CTLA4-IgG2a和抗RANKL组合，与二者任一作为单一疗法、或clg之间差异显著，如所示(Kruskal-Wallis检验，Dunn多重比较，其中将单一疗法组(arm)或clg与抗CTLA4-IgG2a和抗RANKL 的组合进行比较；*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001)。当将抗 CTLA4-IgG1-D265A和抗RANKL的组合与二者任一作为单一疗法进行比较时，未发现显著差
异。(C)抗CTLA4-IgG2a和抗RANKL疗法的组合最大程度地抑制了B16F10皮下肿瘤的生长。在图中显示了比较七个独立合并实验的治疗组(每组5-6只小鼠)，预测的混合效应重复测量
肿瘤数据(对数标度)。如表中所示，与单一疗法或对照相比，抗RANKL和抗CTLA4(mIgG2a)组合的优势生长抑制是显著的，而抗RANKL和抗CTLA4(mIgG1-D265A)与对照但非单一疗法相
比具有显著抑制(配对比较；**P<0.01，****P<0.0001)。
[0058] 图5是图示，其描述在B16F10肿瘤微环境(TME)中RANKL和RANK的表达。C57BL/6野生型(WT)组皮下注射B16F10黑色素瘤细胞(1x 105)(A-B)。如所指示的，在相对于肿瘤接种的第3、7天、如果实验持续，则还在第11和15 天用cIg(1-1，大鼠IgG2a，200μg腹膜内，或抗RANKL(IK22/5，200μg腹膜内) 治疗小鼠。(A-B)中的每一个都组合了两个独立的实验，每个实验中每组3-5只小鼠。在(A)中指示了所示时间点上T细胞亚组和器官部位之间RANKL表达
的显著差异(单因素方差分析，Tukey多重比较；*P<0.05，**P<0.01，****P <0.0001)。(B)在第16天分析肿瘤；如所示，在cIg和α-RANKL治疗组之间未观察到显著差异。
的显著差异(单因素方差分析，Tukey多重比较；*P<0.05，**P<0.01，****P <0.0001)。(B)在第16天分析肿瘤；如所示，在cIg和α-RANKL治疗组之间未观察到显著差异。
[0059] 图6是图示，其描述抗CTLA4-IgG2a和抗RANKL治疗组合的功效是FcR-、 IFNγ-、+
Batf3-和CD8 T细胞依赖性的。如所示，C57BL/6野生型(WT)或基因靶向小鼠组皮下注射
B16F10黑色素瘤细胞(1x 105)(A-D)。在相对于肿瘤接种的第3、7天、如果实验持续，则还在第11和15天用cIg(1-1，大鼠IgG2a，200μg 腹膜内+1D12，与抗CTLA4同种型匹配的小鼠
IgG2a或IgG1，50μg腹膜内)、抗CTLA4(如所示的9D9小鼠IgG2a或IgG1-D265A，50μg腹膜内)和/或抗RANKL (IK22/5，200μg腹膜内)对小鼠进行治疗，如所示。一些小鼠在第-1、0和7天用抗CD8β或抗asGM1腹膜内治疗(每只均为100μg/小鼠，腹膜内)，如(B) 所示。显示了每组
4-9只小鼠的平均值±SEM。在所指示处，各组间的肿瘤生长曲线差异显著(单因素方差分
析，Tukey多重比较；**P<0.01，***P<0.001，**** P<0.0001)。用cIg以及α-CTLA4和α-RANKL组合治疗的WT组在(A)和(C) 中相同，但是为了便于解释，它们显示在不同的图中。抗RANKL与抗CTLA4的组合功效是FcR-和Batf3-依赖性的。
Batf3-和CD8 T细胞依赖性的。如所示，C57BL/6野生型(WT)或基因靶向小鼠组皮下注射
B16F10黑色素瘤细胞(1x 105)(A-D)。在相对于肿瘤接种的第3、7天、如果实验持续，则还在第11和15天用cIg(1-1，大鼠IgG2a，200μg 腹膜内+1D12，与抗CTLA4同种型匹配的小鼠
IgG2a或IgG1，50μg腹膜内)、抗CTLA4(如所示的9D9小鼠IgG2a或IgG1-D265A，50μg腹膜内)和/或抗RANKL (IK22/5，200μg腹膜内)对小鼠进行治疗，如所示。一些小鼠在第-1、0和7天用抗CD8β或抗asGM1腹膜内治疗(每只均为100μg/小鼠，腹膜内)，如(B) 所示。显示了每组
4-9只小鼠的平均值±SEM。在所指示处，各组间的肿瘤生长曲线差异显著(单因素方差分
析，Tukey多重比较；**P<0.01，***P<0.001，**** P<0.0001)。用cIg以及α-CTLA4和α-RANKL组合治疗的WT组在(A)和(C) 中相同，但是为了便于解释，它们显示在不同的图中。抗RANKL与抗CTLA4的组合功效是FcR-和Batf3-依赖性的。
[0060] 图7是图示，其显示组合的抗RANKL和抗CTLA4治疗导致CD8+ T细胞向肿瘤中的募集增加。4-8只C57BL/6野生型(WT)小鼠的组皮下注射B16F10黑色素瘤细胞(1x 105)。数据
从2-5个独立实验合并(A-H)。在相对于肿瘤接种的第3、7、和11和15天(A-E，G-H)或第3和7天(F)，用cIg(1-1，大鼠 IgG2a，200μg腹膜内+1D12，小鼠IgG2a，50μg腹膜内)、抗CTLA4(9D9，IgG2a， 50μg腹膜内)和/或抗RANKL(IK22/5，200μg腹膜内)治疗小鼠，如所示。在大小相对于伦理终点的末期(第16天)(A-E，G-H)或第9天(F)处死小鼠，对肿瘤进行FACS分析。如所指示处，(A)增加的总活细胞的CD45+TIL的比例、 (E)增加的CD8+Ki-67+ T细胞的比例、在+ + + +
第(9)天(F)和第15-16天(G)增加的CD8 T细胞与Treg的比例(定义为TCRβCD4、FoxP3)、
以及增加的CD8+T 细胞与CD11b+GR1hi细胞的比例(H)是显著的(单因素方差分析，Dunnett
多重比较，其中每组与抗CTLA4-IgG2a+抗RANKL组合治疗进行比较；*P<0.05，** P<
0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。(B)如所示处，增加的CD8+ T细胞占总CD45+TIL的比例是显著的(Kruskal-Wallis检验，Dunn多重比较，其中每组与组合9D9 IgG2a+IK22/5处理进行比较；*P<0.05，****P<0.0001)。(C)组合治疗增加了肿瘤内CD8+ T细胞数量的增加(单因素方差分析，Dunnett的多重比较，其中每组与抗CTLA4-IgG2a+抗RANKL组合治疗进行比较；**P<0.01， ***P<0.001)。(D)显示与cIg或抗RANKL治疗相比，抗CTLA4-IgG2a降低的Treg是显著的(单因素方差分析，Tukey多重比较；**P<0.01)。
从2-5个独立实验合并(A-H)。在相对于肿瘤接种的第3、7、和11和15天(A-E，G-H)或第3和7天(F)，用cIg(1-1，大鼠 IgG2a，200μg腹膜内+1D12，小鼠IgG2a，50μg腹膜内)、抗CTLA4(9D9，IgG2a， 50μg腹膜内)和/或抗RANKL(IK22/5，200μg腹膜内)治疗小鼠，如所示。在大小相对于伦理终点的末期(第16天)(A-E，G-H)或第9天(F)处死小鼠，对肿瘤进行FACS分析。如所指示处，(A)增加的总活细胞的CD45+TIL的比例、 (E)增加的CD8+Ki-67+ T细胞的比例、在+ + + +
第(9)天(F)和第15-16天(G)增加的CD8 T细胞与Treg的比例(定义为TCRβCD4、FoxP3)、
以及增加的CD8+T 细胞与CD11b+GR1hi细胞的比例(H)是显著的(单因素方差分析，Dunnett
多重比较，其中每组与抗CTLA4-IgG2a+抗RANKL组合治疗进行比较；*P<0.05，** P<
0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。(B)如所示处，增加的CD8+ T细胞占总CD45+TIL的比例是显著的(Kruskal-Wallis检验，Dunn多重比较，其中每组与组合9D9 IgG2a+IK22/5处理进行比较；*P<0.05，****P<0.0001)。(C)组合治疗增加了肿瘤内CD8+ T细胞数量的增加(单因素方差分析，Dunnett的多重比较，其中每组与抗CTLA4-IgG2a+抗RANKL组合治疗进行比较；**P<0.01， ***P<0.001)。(D)显示与cIg或抗RANKL治疗相比，抗CTLA4-IgG2a降低的Treg是显著的(单因素方差分析，Tukey多重比较；**P<0.01)。
[0061] 图8是图示，其显示抗RANKL通过增加T细胞细胞因子多功能性改善抗 CTLA4的功效。4-8只C57BL/6野生型(WT)小鼠组皮下接种B16F10黑色素瘤细胞(1x 105)。(A-E)在相对于肿瘤接种的第3、7、11和15天，用cIg(1-1，大鼠IgG2a，200μg腹膜内+1D12，小鼠IgG2a，50μg腹膜内)、抗CTLA4(9D9， IgG2a，50μg腹膜内)和/或抗RANKL(IK22/5，200μg腹膜内)治疗小鼠，如所示。在相对于肿瘤接种的第16天处死小鼠，并在进行ICS之前离体处理和刺激肿瘤。
如所示，使用组合治疗增加的阳性染色(A)IFNγ、(B)IFNγ和IL-2、或(C) IFNγ、IL-2和TNFα共表达(“三阳性”)的CD8+ T细胞比例；和(D)增加的表达IFNγ的CD4+ T细胞的比例是显著的(Kruskal-Wallis检验，Dunn多重比较，其中每组与组合9D9 IgG2a+IK22/5治疗进行比较；*P<0.05，**P<0.01，*** P<0.001，****P<0.0001)。(A-D)中显示了2-3个合并的独立实验。对于所示的四个治疗组中的每个，显示了来自两个合并实验的表达零、一、二或三种细胞因子(IFNγ、IL-2和TNFα)的CD8+ T细胞的平均比例(E)。
如所示，使用组合治疗增加的阳性染色(A)IFNγ、(B)IFNγ和IL-2、或(C) IFNγ、IL-2和TNFα共表达(“三阳性”)的CD8+ T细胞比例；和(D)增加的表达IFNγ的CD4+ T细胞的比例是显著的(Kruskal-Wallis检验，Dunn多重比较，其中每组与组合9D9 IgG2a+IK22/5治疗进行比较；*P<0.05，**P<0.01，*** P<0.001，****P<0.0001)。(A-D)中显示了2-3个合并的独立实验。对于所示的四个治疗组中的每个，显示了来自两个合并实验的表达零、一、二或三种细胞因子(IFNγ、IL-2和TNFα)的CD8+ T细胞的平均比例(E)。
[0062] 图9是图示，其显示PD-1/PD-L1和RANKL的共同阻断导致对转移的协同抑制。C57BL/6WT小鼠组静脉内注射(A，C)B16F10黑色素瘤或(B，D)RM 1 前列腺癌(2x 105细胞)。
在第-1、0和2天(相对于肿瘤接种)用cIg(2A3， 200μg腹膜内)、(A-B)抗PD-1(RMP1-14，200μg腹膜内)或(C-D)抗PD-L1 (10F.9G2，200μg腹膜内)和/或抗RANKL(IK22/5，200μg腹膜内)治疗小鼠，如所示。14天后，通过计数肺表面上的菌落来定量肺中的转移负荷。显示了每组
5只小鼠的平均值±SEM。(A)中合并了两个实验。如所示，组合改善的转移控制是统计学上
显著的(单因素方差分析，Tukey多重比较；*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001，****P<
0.0001)。
在第-1、0和2天(相对于肿瘤接种)用cIg(2A3， 200μg腹膜内)、(A-B)抗PD-1(RMP1-14，200μg腹膜内)或(C-D)抗PD-L1 (10F.9G2，200μg腹膜内)和/或抗RANKL(IK22/5，200μg腹膜内)治疗小鼠，如所示。14天后，通过计数肺表面上的菌落来定量肺中的转移负荷。显示了每组
5只小鼠的平均值±SEM。(A)中合并了两个实验。如所示，组合改善的转移控制是统计学上
显著的(单因素方差分析，Tukey多重比较；*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001，****P<
0.0001)。
[0063] 图10是图示，其显示抗PD-1和抗RANKL MAb抑制肿瘤的皮下生长。在第 0天用(A)MC38或(B)CT26结肠癌(1x 105细胞)皮下注射(A)C57BL/6 或(B)BALB/c野生型雄性小鼠
组。然后在第6、9、12和15天，用cIg(2A3或 1-1，250mg腹膜内)、抗PD-1单独(RMP1-14，250mg腹膜内)、抗RANKL 单独(IK22/5，200mg腹膜内)或其组合对小鼠进行i.p.治疗，如所示。使用数字卡尺测量肿瘤生长，每组5-6只小鼠的肿瘤大小表示为平均值±SEM。如所示处，降低的皮下肿瘤生长是显著的(单因素方差分析，Tukey多重比较；*P<0.05，** P<0.01，***P<
0.001，****P<0.0001)。
组。然后在第6、9、12和15天，用cIg(2A3或 1-1，250mg腹膜内)、抗PD-1单独(RMP1-14，250mg腹膜内)、抗RANKL 单独(IK22/5，200mg腹膜内)或其组合对小鼠进行i.p.治疗，如所示。使用数字卡尺测量肿瘤生长，每组5-6只小鼠的肿瘤大小表示为平均值±SEM。如所示处，降低的皮下肿瘤生长是显著的(单因素方差分析，Tukey多重比较；*P<0.05，** P<0.01，***P<
0.001，****P<0.0001)。
[0064] 图11是图示，其显示抗RANKL抑制皮下肿瘤生长的能力依赖于BatF3，但不依赖于Fc受体表达。如所示，C57Bl/6或基因靶向小鼠的组皮下注射MCA1956 纤维肉瘤细胞(1×
106)。在相对于肿瘤接种的第3、7、11和15天，用抗RANKL (IK22/5，200ug腹膜内)或cIg(1-
1，200ug腹膜内)治疗小鼠。显示了每组5-7 只小鼠的平均值+/-SEM。使用单因素方差分析、Sidak多重比较，来比较相似基因型的治疗组，如所示处，肿瘤大小显著不同(*p<0.05)。
106)。在相对于肿瘤接种的第3、7、11和15天，用抗RANKL (IK22/5，200ug腹膜内)或cIg(1-
1，200ug腹膜内)治疗小鼠。显示了每组5-7 只小鼠的平均值+/-SEM。使用单因素方差分析、Sidak多重比较，来比较相似基因型的治疗组，如所示处，肿瘤大小显著不同(*p<0.05)。
[0065] 图12是图示，其显示RANK和PD-L1在肿瘤浸润的骨髓细胞中的共表达。 C57Bl/6皮下注射MCA1956纤维肉瘤细胞(1x 106个细胞)。允许肿瘤未经任何处理生长22天，直到达到约50mm3。收集肿瘤，产生单细胞悬液并进行流式细胞术。在图板A中，在RANK阳性门控的
CD11c+/MHCII+DC中分析了PDL-1和 CD103的表达，表明几乎100％的RANK阳性DC同时表达
PD-L1和CD103。在图板B中，分析了CD11b+、F480+巨噬细胞上的CD206和RANK表达，表明
52％肿瘤浸润的巨噬细胞共表达RANK和CD206。
CD11c+/MHCII+DC中分析了PDL-1和 CD103的表达，表明几乎100％的RANK阳性DC同时表达
PD-L1和CD103。在图板B中，分析了CD11b+、F480+巨噬细胞上的CD206和RANK表达，表明
52％肿瘤浸润的巨噬细胞共表达RANK和CD206。
[0066] 图13是编码示例性RANKL-PD-1双特异性抗体的DNA载体的图示。(A) 表示编码RANKL-PD-1双抗体的表达载体。(B)表示编码RANKL-PD-1三抗体的DNA构建体。第一构建体
编码PD-1 Fab L结构域和第一RANKL scFv结构域，第二构建体编码PD-1 Fab Fd结构域和
第二RANKL scFv结构域。因此，所得三抗体将具有两个RANKL结合片段和单个PD-1结合片
段。(C)表示编码PD-1-RANKL 三抗体的DNA构建体。第一构建体编码RANKL Fab L结构域和
第一PD-1 scFv 结构域，第二构建体编码RANKL Fab Fd结构域和第二scFv结构域。
编码PD-1 Fab L结构域和第一RANKL scFv结构域，第二构建体编码PD-1 Fab Fd结构域和
第二RANKL scFv结构域。因此，所得三抗体将具有两个RANKL结合片段和单个PD-1结合片
段。(C)表示编码PD-1-RANKL 三抗体的DNA构建体。第一构建体编码RANKL Fab L结构域和
第一PD-1 scFv 结构域，第二构建体编码RANKL Fab Fd结构域和第二scFv结构域。
[0067] 图14是卡通表示的示例性双特异性抗RANKL、抗PD-1三抗体。
[0068] 图15是图示，其显示抗RANKL组合治疗的功效不完全依赖于Treg的耗尽。 C57BL/6 FoxP3-DTR小鼠组皮下注射(A-C)B16F10黑色素瘤细胞(1x 105)或 (D，E)RM-1前列腺癌细胞(5x 104)。在相对于肿瘤接种的(A，B)第3、7、 11和15天、或(C-E)第3、7和11天，用cIg(1-
1；大鼠IgG2a，200μg腹膜内 +1D12；小鼠IgG2a，50μg腹膜内)、DT(250ng腹膜内，仅在第3天(A)或仅在第3和7天(C-E))和/或抗RANKL(IK22-5；大鼠IgG2a，200μg腹膜内) 治疗小鼠，如所示。(A，B)B16F10皮下肿瘤生长(显示为平均值±SEM)，(C) B16F10肿瘤排斥(定义为治疗后已确立的皮下肿瘤的完全消退，在肿瘤接种后第 15天评估)，(D)RM-1肿瘤生长(显示为
平均值±SEM)，和(E)在(D) 所示的实验中Treg占总TIL的比例，每组显示4-6只小鼠。如所
示，通过单因素方差分析，Tukey多重比较确定统计学上的显著性(**p<0.01，***p<
0.001，**** p<0.0001)。
1；大鼠IgG2a，200μg腹膜内 +1D12；小鼠IgG2a，50μg腹膜内)、DT(250ng腹膜内，仅在第3天(A)或仅在第3和7天(C-E))和/或抗RANKL(IK22-5；大鼠IgG2a，200μg腹膜内) 治疗小鼠，如所示。(A，B)B16F10皮下肿瘤生长(显示为平均值±SEM)，(C) B16F10肿瘤排斥(定义为治疗后已确立的皮下肿瘤的完全消退，在肿瘤接种后第 15天评估)，(D)RM-1肿瘤生长(显示为
平均值±SEM)，和(E)在(D) 所示的实验中Treg占总TIL的比例，每组显示4-6只小鼠。如所
示，通过单因素方差分析，Tukey多重比较确定统计学上的显著性(**p<0.01，***p<
0.001，**** p<0.0001)。
[0069] 图16是图示，其显示RANKL鉴定在TME中表达PD-1hi的T细胞。(A-C) BALB/c野生型(WT)小鼠组(n＝10/组)皮下注射2×105CT26结肠癌细胞。肿瘤接种后第10天，将小鼠随机
分为带有相等的中值肿瘤大小的组，并如所示用单一剂量抗体腹膜内治疗小鼠：cIg(200μg)、抗CTLA4(9D9，mIgG2a同种型， 50μg)、抗-PD-1(200μg)或指定组合。治疗后三天，收集肿瘤并处理以用于流式细胞术，对白细胞形态的活CD45.2细胞进行门控。(A)表达PD-1的
RANKL+ (黑条)或RANKL-(灰条)CD8+ T细胞TIL的比例，(B)RANKL+(黑条)或 RANKL-(灰条)
CD8+ T细胞TIL的PD-1表达水平(表示为几何MFI，gMFI)，和(C)RANKL+(黑条)或RANKL-(灰
条)CD8+ T细胞TIL的CTLA4表达水平(表示为几何MFI，gMFI)。统计差异由单因素方差分析
和Tukey后验分析确定，(C)除外，其中使用Mann-Whitney检验来比较治疗组内的差异(*p<
0.05， **p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。
分为带有相等的中值肿瘤大小的组，并如所示用单一剂量抗体腹膜内治疗小鼠：cIg(200μg)、抗CTLA4(9D9，mIgG2a同种型， 50μg)、抗-PD-1(200μg)或指定组合。治疗后三天，收集肿瘤并处理以用于流式细胞术，对白细胞形态的活CD45.2细胞进行门控。(A)表达PD-1的
RANKL+ (黑条)或RANKL-(灰条)CD8+ T细胞TIL的比例，(B)RANKL+(黑条)或 RANKL-(灰条)
CD8+ T细胞TIL的PD-1表达水平(表示为几何MFI，gMFI)，和(C)RANKL+(黑条)或RANKL-(灰
条)CD8+ T细胞TIL的CTLA4表达水平(表示为几何MFI，gMFI)。统计差异由单因素方差分析
和Tukey后验分析确定，(C)除外，其中使用Mann-Whitney检验来比较治疗组内的差异(*p<
0.05， **p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。
[0070] 图17是图示，其描绘用PD-1/PD-L1单独或与CTLA-4组合共靶向RANKL 抑制皮下肿瘤的生长。在第0天，BALB/c(A，B)野生型(WT)或TRAMP转基因I小鼠组(n＝5-17/组)皮下注射1x 105 CT26(A，B)或1x 106 Tramp-Cl 前列腺癌I，监测肿瘤的生长。在(A-C)第10、14、
18和22天或I 20、24、28 和32天(相对于肿瘤接种)，用以下抗体腹膜内治疗小鼠：cIg(总计
250-350μg)、抗CTLA4(9D9 mIgG2a，50μg)、抗PD-1(克隆RMP1-14；A，D：250μg；C： 100μg)、抗PD-Ll(克隆10F.9G2；100μg)、抗RANKL(克隆IK22.5；200μg) 或其组合，如所示。肿瘤大小表示为平均值±SEM。(A)代表2-3个独立实验，所有其他实验进行一次。除非另有说明，否则通过在测量最后一天采用单因素方差分析和Tukey后验分析确定指定组之间的统计差异(*p<
0.05，**p<0.01，*** p<0.001，****p<0.0001)。在(C)中，评估了第30天双抗体和三抗体组合之间在肿瘤大小上的显著差异；在图中未显示在第22天进行的以下比较：抗PD-1 与抗
PD-1+抗RANKL(****)；#：在第35天，通过未配对t检验确定了其余两组之间的显著差异(*p<
0.05)。在(B)中，#表示通过未配对t检验确定的所示比较的显著差异(*p<0.05)。在(A，C)括号中：肿瘤排斥率(没有括号表示没有排斥)。在(A)中，将两个相同实验的排除率合并，并用斜体括号括起来；通过卡方(χ2)分析(Fisher精确检验；**p<0.01)确定各指定组排斥率之间的显著差异。
18和22天或I 20、24、28 和32天(相对于肿瘤接种)，用以下抗体腹膜内治疗小鼠：cIg(总计
250-350μg)、抗CTLA4(9D9 mIgG2a，50μg)、抗PD-1(克隆RMP1-14；A，D：250μg；C： 100μg)、抗PD-Ll(克隆10F.9G2；100μg)、抗RANKL(克隆IK22.5；200μg) 或其组合，如所示。肿瘤大小表示为平均值±SEM。(A)代表2-3个独立实验，所有其他实验进行一次。除非另有说明，否则通过在测量最后一天采用单因素方差分析和Tukey后验分析确定指定组之间的统计差异(*p<
0.05，**p<0.01，*** p<0.001，****p<0.0001)。在(C)中，评估了第30天双抗体和三抗体组合之间在肿瘤大小上的显著差异；在图中未显示在第22天进行的以下比较：抗PD-1 与抗
PD-1+抗RANKL(****)；#：在第35天，通过未配对t检验确定了其余两组之间的显著差异(*p<
0.05)。在(B)中，#表示通过未配对t检验确定的所示比较的显著差异(*p<0.05)。在(A，C)括号中：肿瘤排斥率(没有括号表示没有排斥)。在(A)中，将两个相同实验的排除率合并，并用斜体括号括起来；通过卡方(χ2)分析(Fisher精确检验；**p<0.01)确定各指定组排斥率之间的显著差异。
[0071] 图18是图示，其显示在用ICB第一次治疗后在TME内有利的RANKL表达的早期改变。(A-C)BALB/c野生型(WT)小鼠的组(n＝5-10/组)皮下注射2 ×105CT26结肠癌细胞。在肿瘤
接种后第10天，将小鼠随机分为具有相等的中值肿瘤大小的组，并如所示用单一剂量抗体
腹膜内治疗小鼠：cIg(200μg)、抗CTLA4 (9D9，mIgG2a同种型，50μg)、抗PD-1(克隆RMP1-14；
200μg)或指定的组合。治疗三天后，收集肿瘤并处理用于流式细胞术，针对(A-D)白细胞形态的活 CD45.2细胞、或(E)从淋巴细胞门排除的单个活CD45.2+细胞进行门控。显示指定治疗组的(A)表达RANKL的CD8+T细胞TIL的比例、(B)表达RANKL 的gp70特异性CD8+ T细胞TIL
的比例、和(C)表达RANKL的CD4+ T细胞TIL 的比例。显示了平均值±SEM。通过单因素方差
与Tukey后验分析确定统计学上的差异，但(A)除外，其中使用Kruskal-Wallis检验与Dunn
后验分析(*p<0.05， **p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。
接种后第10天，将小鼠随机分为具有相等的中值肿瘤大小的组，并如所示用单一剂量抗体
腹膜内治疗小鼠：cIg(200μg)、抗CTLA4 (9D9，mIgG2a同种型，50μg)、抗PD-1(克隆RMP1-14；
200μg)或指定的组合。治疗三天后，收集肿瘤并处理用于流式细胞术，针对(A-D)白细胞形态的活 CD45.2细胞、或(E)从淋巴细胞门排除的单个活CD45.2+细胞进行门控。显示指定治疗组的(A)表达RANKL的CD8+T细胞TIL的比例、(B)表达RANKL 的gp70特异性CD8+ T细胞TIL
的比例、和(C)表达RANKL的CD4+ T细胞TIL 的比例。显示了平均值±SEM。通过单因素方差
与Tukey后验分析确定统计学上的差异，但(A)除外，其中使用Kruskal-Wallis检验与Dunn
后验分析(*p<0.05， **p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。
[0072] 图19是图示，其描述抗PD-1与抗CTLA4治疗后TME中独特的变化。(A， B)BALB/c野生型(WT)小鼠组(n＝5-10/组)皮下注射2×105CT26结肠癌细胞。肿瘤接种后第10天，将小
鼠随机分为具有相等的中值肿瘤大小的组，并如下所示用单一剂量抗体进行腹膜内治疗：
cIg(200μg)、抗CTLA4(9D9，mIgG2a 同种型，50μg)、抗-PD-1(克隆RMP1-14；200μg)或指定的组合。治疗三天后，收集肿瘤并处理以用于流式细胞术，针对(A-D)白细胞形态的活CD45.2细胞、或(E)从淋巴细胞门排除的单个活CD45.2+细胞进行门控。(A)显示指定治疗组gp70特异性CD8+ T细胞TIL的PD-1表达的几何平均荧光强度(gMFI)。(B) 显示指定治疗组的表达
PD-L1的细胞的比例。显示了平均值±SEM。通过单因素方差分析与Tukey后验分析确定统计
差异，(B)除外，其中通过Mann-Whitney 检验确定指定比较的统计差异(*p<0.05，**p<
0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。另外，在(A)中，通过Mann-Whitney检验确定抗PD-1单独或与抗RANKL组合的指定比较中gMFI的统计差异(#p＜0.05)。
鼠随机分为具有相等的中值肿瘤大小的组，并如下所示用单一剂量抗体进行腹膜内治疗：
cIg(200μg)、抗CTLA4(9D9，mIgG2a 同种型，50μg)、抗-PD-1(克隆RMP1-14；200μg)或指定的组合。治疗三天后，收集肿瘤并处理以用于流式细胞术，针对(A-D)白细胞形态的活CD45.2细胞、或(E)从淋巴细胞门排除的单个活CD45.2+细胞进行门控。(A)显示指定治疗组gp70特异性CD8+ T细胞TIL的PD-1表达的几何平均荧光强度(gMFI)。(B) 显示指定治疗组的表达
PD-L1的细胞的比例。显示了平均值±SEM。通过单因素方差分析与Tukey后验分析确定统计
差异，(B)除外，其中通过Mann-Whitney 检验确定指定比较的统计差异(*p<0.05，**p<
0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。另外，在(A)中，通过Mann-Whitney检验确定抗PD-1单独或与抗RANKL组合的指定比较中gMFI的统计差异(#p＜0.05)。
[0073] 图20是图示，其显示共靶向RANKL与CTLA-4的组合抑制皮下肿瘤生长。在第0天，BALB/c小鼠组(n＝5-17/组)皮下注射1x 105CT26，并监测肿瘤生长。在相对于肿瘤接种的
第10、14、18和22天，用以下抗体腹膜内治疗小鼠： cIg(总计250-350μg)、抗CTLA4(9D9 mIgG2a，50μg)、抗PD-1(克隆RMP1-14； A，D：250μg；C：100μg)、抗PD-L1(克隆10F.9G2；100μg)、抗RANKL(克隆IKK22.5；200μg)或其组合，如所示。肿瘤大小表示为平均值±SEM。除非另有说明，否则在测量的最后一天通过单因素方差分析与Tukey后验分析确定指定组之间的
统计差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。#表示通过未配对t检验确定的所示比较的显著差异(*p<0.05)。
第10、14、18和22天，用以下抗体腹膜内治疗小鼠： cIg(总计250-350μg)、抗CTLA4(9D9 mIgG2a，50μg)、抗PD-1(克隆RMP1-14； A，D：250μg；C：100μg)、抗PD-L1(克隆10F.9G2；100μg)、抗RANKL(克隆IKK22.5；200μg)或其组合，如所示。肿瘤大小表示为平均值±SEM。除非另有说明，否则在测量的最后一天通过单因素方差分析与Tukey后验分析确定指定组之间的
统计差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。#表示通过未配对t检验确定的所示比较的显著差异(*p<0.05)。
[0074] 图21是图示，其显示抗PD-1和抗RANKL的最佳抗肿瘤功效受抗体施用顺序的影响。C57BI/6野生型(WT)小鼠的组(n＝5/组)皮下注射5x 105 3LL肺癌细胞。对于同时进行的治
疗组(黑色标记)，在相对于肿瘤接种的第8、12、16 和20天(箭头所示)，用cIg(1-1，100μg)、抗PD-1(RMP1-14，100μg)和/ 或抗RANKL(IK22/5，100μg)腹膜内治疗小鼠，如所示。对于顺序治疗组(彩色标记)，其中治疗顺序在图例中指示，分别在第8天和第12天(第一抗体)和第
16天和第20天(第二抗体)(相对于肿瘤接种)，用cIg(1-1，200μg)、抗 PD-1(RMP1-14，200μg)和/或抗RANKL(IK22/5，200μg)对小鼠进行腹膜内治疗，如所示。显示了每个治疗组的平均值±SEM肿瘤大小。在第22天，通过单因素方差分析与Tukey后验分析确定各组之间的统
计差异，显示关键的比较(*p <0.05，**p<0.01，****p<0.0001)。合并了两个独立的实验。
疗组(黑色标记)，在相对于肿瘤接种的第8、12、16 和20天(箭头所示)，用cIg(1-1，100μg)、抗PD-1(RMP1-14，100μg)和/ 或抗RANKL(IK22/5，100μg)腹膜内治疗小鼠，如所示。对于顺序治疗组(彩色标记)，其中治疗顺序在图例中指示，分别在第8天和第12天(第一抗体)和第
16天和第20天(第二抗体)(相对于肿瘤接种)，用cIg(1-1，200μg)、抗 PD-1(RMP1-14，200μg)和/或抗RANKL(IK22/5，200μg)对小鼠进行腹膜内治疗，如所示。显示了每个治疗组的平均值±SEM肿瘤大小。在第22天，通过单因素方差分析与Tukey后验分析确定各组之间的统
计差异，显示关键的比较(*p <0.05，**p<0.01，****p<0.0001)。合并了两个独立的实验。
[0075] 图22是图示，其显示RANKL鉴定的TME中表达PD1hi的T细胞。BALB/c 野生型(WT)小鼠(n＝10/组)皮下注射2×105CT26结肠癌细胞。肿瘤接种后第13天，收获肿瘤并处理用于
流式细胞术，针对白细胞形态的活CD45.2细胞进行门控。在RANKL+细胞或RANKL-细胞CD8+ T细胞TIL上分析PD-1表达。
流式细胞术，针对白细胞形态的活CD45.2细胞进行门控。在RANKL+细胞或RANKL-细胞CD8+ T细胞TIL上分析PD-1表达。
[0076] 图23是图示，其显示抗RANKL/PD-1 FIT-Ig的示例性产生和表征。(A)抗原结合结构域标记的抗RANKL/PD-1 FIT-Ig的示意图。“A”序列表示地诺单抗抗体序列，“B”序列表示纳武单抗抗体序列。(B)编码RANKL/PD-1 FIT-Ig的三种DNA构建体的设计。“A”序列表示地诺单抗抗体序列，“B”序列表示纳武单抗。
[0077] 图24是图示，其显示抗RANKL/CTLA4 FIT-Ig的示例性产生和表征。(A) 抗原结合结构域标记的抗RANKL/CTLA4 FIT-Ig的示意图。“A”序列表示地诺单抗抗体序列，“B”序列表示伊匹单抗抗体序列。(B)编码抗RANKL/CTLA4 FIT-Ig 的三种DNA构建体的设计。“A”序列表示地诺单抗抗体序列，“B”序列表示伊匹单抗抗体序列。
[0078] 图25是图示，其显示抗RANKL/PD-L1 FIT-Ig的示例性产生和表征。(A) 抗原结合结构域标记的抗RANKL/PD-L1 FIT-Ig的示意图。“A”序列表示地诺单抗抗体序列，“B”序列表示阿特朱单抗抗体序列。(B)编码抗RANKL/PD-L1 FIT-Ig 的三种DNA构建体的设计。“A”序列表示地诺单抗抗体序列，“B”序列表示阿特朱单抗抗体序列。
[0079] 图26是图示，其显示用所示的四条链产生的双特异性抗RANKL/PD-1 CrossMab抗体。重链抗体序列在透明/白色框中表示，轻链抗体序列在灰色框中表示。RMP1-14 CH1和CL序列交换并融合到人IgG1 Fc上(称为RMP1-14 CH-CL-huIgG1Fc)，IK22-5序列保持不变，并融合到人IgG1 Fc上(IK22-5-huIgG1Fc WT)。异源二聚化通过指定的“旋钮入孔(knob-in-
hole)”和Fc结构域中额外的S354C和Y349C突变进一步增强。每个人Fc结构域也具有D265A
突变。
hole)”和Fc结构域中额外的S354C和Y349C突变进一步增强。每个人Fc结构域也具有D265A
突变。
[0080] 图27是照片图示，其显示在瞬时ExpiCHO-S细胞培养中表达并通过蛋白A 亲和色谱法纯化的RMP1-14 CH-CL X IK225 WT双特异性抗体CrossMAb的分析 SDS-PAGE/蛋白印
迹分析。泳道M1：蛋白标记物，TaKaRa，目录号3452；泳道 M2：蛋白标记物，GenScript，目录号M00521；泳道1：还原条件；泳道2：非还原条件；泳道P：人IgG1，κ(Sigma，目录号I5154)作为阳性对照；一抗：山羊抗人IgG-HRP(GenScript，目录号A00166)；一抗：山羊抗人κ-HRP (SouthernBiotech，目录号2060-05)。
迹分析。泳道M1：蛋白标记物，TaKaRa，目录号3452；泳道 M2：蛋白标记物，GenScript，目录号M00521；泳道1：还原条件；泳道2：非还原条件；泳道P：人IgG1，κ(Sigma，目录号I5154)作为阳性对照；一抗：山羊抗人IgG-HRP(GenScript，目录号A00166)；一抗：山羊抗人κ-HRP (SouthernBiotech，目录号2060-05)。
[0081] 图28是图示，其显示通过流式细胞术检测的由HEK-293细胞瞬时表达的小鼠 RANKL。HEK-293亲本细胞的单细胞悬液未转染或瞬时转染小鼠RANKL构建体，然后在转染后
48小时以两步孵育步骤对表面进行染色。一抗是2.5μg生物素化的鼠RANK-Fc，2.5μg生物素化的抗RANKL/PD-1双特异性抗体或生物素化的同种型对照Ab(huIgG1 mAb对照)，与HEK-
293细胞在冰上孵育30分钟。然后，与链霉亲和素二抗(来自Biolegend的APC)在冰上孵育另外30分钟，检测一抗的结合。在Fortessa 4(BD Biosciences)流式细胞仪上分析样品和数
据，并使用FlowJo v10软件(Tree Star，Inc.)进行分析。
48小时以两步孵育步骤对表面进行染色。一抗是2.5μg生物素化的鼠RANK-Fc，2.5μg生物素化的抗RANKL/PD-1双特异性抗体或生物素化的同种型对照Ab(huIgG1 mAb对照)，与HEK-
293细胞在冰上孵育30分钟。然后，与链霉亲和素二抗(来自Biolegend的APC)在冰上孵育另外30分钟，检测一抗的结合。在Fortessa 4(BD Biosciences)流式细胞仪上分析样品和数
据，并使用FlowJo v10软件(Tree Star，Inc.)进行分析。
[0082] 图29是显示抗体竞争RANKL-RANK结合的图示。将用小鼠RANKL瞬时转染的HEK-293细胞与各种浓度的抗RANKL/PD-1双特异性、抗RANKL mAb IK22-5、大鼠IgG2a同种型对照或人IgG1同种型对照在冰上孵育30分钟。然后，将细胞与2.5μg生物素化的重组鼠RANK-Fc在冰上孵育另外30分钟。用FACS 缓冲液(PBS+10％FCS)洗涤两次后，最后在冰上与链霉亲和
素APC孵育另外的30分钟。在Fortessa 4(BD Biosciences)流式细胞仪上分析样品和数据，并使用FlowJo v10软件(Tree Star，Inc.)进行分析。显示了两个独立实验的代表性FACS
图和抑制RANK-Fc结合的概要数据。
素APC孵育另外的30分钟。在Fortessa 4(BD Biosciences)流式细胞仪上分析样品和数据，并使用FlowJo v10软件(Tree Star，Inc.)进行分析。显示了两个独立实验的代表性FACS
图和抑制RANK-Fc结合的概要数据。
[0083] 图30是图示，其显示通过流式细胞术检测由HEK-293细胞瞬时表达的小鼠 PD-1的抗体。将HEK-293亲本细胞的单细胞悬液未转染或瞬时转染小鼠PD-1质粒，然后在转染后48小时以两步孵育步骤进行表面染色。一抗为2.5μg抗 RANKL/PD-1双特异性抗体或同种型对照Ab(huIgG1 mAb对照)，在冰上与 HEK-293细胞孵育30分钟。然后，与山羊抗人二抗(来自Thermo Fisher Scientific 的Alexa Fluor 647)在冰上孵育另外30分钟，用于检测抗体
结合。在Fortessa 4(BD Biosciences)流式细胞仪上分析样品和数据，并使用FlowJo v10
软件(Tree Star， Inc.)进行分析。在深灰色阴影区域中指示同种型对照的染色，而在浅灰色阴影区域中指示抗RANKL/PD-1双特异性抗体的染色。
结合。在Fortessa 4(BD Biosciences)流式细胞仪上分析样品和数据，并使用FlowJo v10
软件(Tree Star， Inc.)进行分析。在深灰色阴影区域中指示同种型对照的染色，而在浅灰色阴影区域中指示抗RANKL/PD-1双特异性抗体的染色。
[0084] 图31是显示抗体竞争PD-1/PD-L1结合的图示。将用小鼠PD-1瞬时转染的 HEK-293细胞与各种浓度的抗RANKL/PD-1双特异性、抗PD-1 mAb RMP1-14、大鼠IgG2a同种型对照或人IgG1同种型对照在冰上孵育30分钟。然后，将细胞与2.5μg生物素化的重组鼠PD-L1-Fc在冰上孵育另外30分钟。用FACS缓冲液 (PBS+10％FCS)洗涤两次后，最后在冰上与链霉亲和
素-APC孵育另外的30分钟。在Fortessa 4(BD Biosciences)流式细胞仪上分析样品和数
据，并使用FlowJo v10软件(Tree Star，Inc.)进行分析。显示了两个独立实验的代表性
FACS图和抑制PD-L1-Fc结合的概要数据。
素-APC孵育另外的30分钟。在Fortessa 4(BD Biosciences)流式细胞仪上分析样品和数
据，并使用FlowJo v10软件(Tree Star，Inc.)进行分析。显示了两个独立实验的代表性
FACS图和抑制PD-L1-Fc结合的概要数据。
[0085] 图32是图示，其显示抗RANKL/PD-1双特异性抗体对体外破骨细胞生成的抑制作用。在存在或不存在浓度为1000ng/mL至50ng/mL的抗IK22-5 mAb作为阳性对照、huIgG1同
种型对照或抗RANKL/PD-1双特异性抗体的情况下培养鼠骨髓 (BM)细胞。在补充有CSF-1和
小鼠RANKL的DMEM中进行BM细胞的培养。 7天后，计数TRAP+多核(多于三个核)细胞。数据表示为一式三份培养物的平均值±SEM。
种型对照或抗RANKL/PD-1双特异性抗体的情况下培养鼠骨髓 (BM)细胞。在补充有CSF-1和
小鼠RANKL的DMEM中进行BM细胞的培养。 7天后，计数TRAP+多核(多于三个核)细胞。数据表示为一式三份培养物的平均值±SEM。
[0086] 图33是图示，其显示用双特异性抗RANKL/PD-1共靶向RANKL和PD-1抑制实验性黑色素瘤向肺的转移。C57BL/6野生型(WT)小鼠组(n＝6-10/组) 静脉内注射2x 105个B16F10
黑色素瘤细胞。在第-1、0和2天(相对于肿瘤接种)，用cIg(200μg腹膜内，重组Mac4-人IgG1 D265A)、抗RANKL(100μg腹膜内，重组IK22.5-人IgG1 D265A)、抗PD-1(100μg腹膜内，重组RMP1-14-人IgG1 D265A)、抗RANKL+抗PD-1(各100μg腹膜内)、抗RANKL-PD-1双特异性 (50至200μg腹膜内，人IgG1 D265A)治疗小鼠，如所示。14天后，通过计数肺表面上的菌落来定量肺中的转移负荷。显示了平均值±SEM。通过单因素方差分析与Dunnett多重比较检验确
定指定组之间的统计学差异(*p<0.05)。
黑色素瘤细胞。在第-1、0和2天(相对于肿瘤接种)，用cIg(200μg腹膜内，重组Mac4-人IgG1 D265A)、抗RANKL(100μg腹膜内，重组IK22.5-人IgG1 D265A)、抗PD-1(100μg腹膜内，重组RMP1-14-人IgG1 D265A)、抗RANKL+抗PD-1(各100μg腹膜内)、抗RANKL-PD-1双特异性 (50至200μg腹膜内，人IgG1 D265A)治疗小鼠，如所示。14天后，通过计数肺表面上的菌落来定量肺中的转移负荷。显示了平均值±SEM。通过单因素方差分析与Dunnett多重比较检验确
定指定组之间的统计学差异(*p<0.05)。
[0087] 图34是图示，其显示用双特异性抗RANKL/PD-1共靶向RANKL和PD-1抑制实验性前列腺癌向肺的转移。C57BL/6野生型(WT)小鼠组(n＝6/组)静脉内注射2x 105RM-1前列腺癌
细胞。在第-1、0和2天(相对于肿瘤接种)，用cIg (200μg腹膜内，人IgG1 D265A)、抗RANKL(100μg腹膜内，IK22.5人IgG1 D265A)、抗PD-1(100μg腹膜内，人IgG1 D265A)、抗RANKL+抗PD-1(各 100μg腹膜内)、抗RANKL-PD-1双特异性(100或200μg腹膜内，人IgG1 D265A) 治疗小鼠，如所示。14天后，通过计数肺表面上的菌落来定量肺中的转移负荷。显示了平均值±SEM。通过单因素方差分析与Tukey后验分析确定指定组之间的统计学差异(**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns＝不显著)。
细胞。在第-1、0和2天(相对于肿瘤接种)，用cIg (200μg腹膜内，人IgG1 D265A)、抗RANKL(100μg腹膜内，IK22.5人IgG1 D265A)、抗PD-1(100μg腹膜内，人IgG1 D265A)、抗RANKL+抗PD-1(各 100μg腹膜内)、抗RANKL-PD-1双特异性(100或200μg腹膜内，人IgG1 D265A) 治疗小鼠，如所示。14天后，通过计数肺表面上的菌落来定量肺中的转移负荷。显示了平均值±SEM。通过单因素方差分析与Tukey后验分析确定指定组之间的统计学差异(**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns＝不显著)。
[0088] 图35是图示，其显示用双特异性抗RANKL/PD-1共靶向RANKL和PD-1抑制肺癌细胞系3LL的皮下肿瘤生长。C57Bl/6野生型(WT)小鼠组皮下注射5× 105 3LL肺癌细胞。在相对
于肿瘤接种的第8、12、16和20天(如箭头所示)，用cIg(400μg腹膜内，大鼠IgG2a)、抗RANKL(100μg腹膜内，IK22-5大鼠IgG2a)、抗PD-1(100μg腹膜内，RMP1-14大鼠IgG2a)、抗RANKL+抗PD-1(IK22-5 和RMP1-14各100μg腹膜内)以及剂量滴定的抗RANKL/PD-1双特异性(100、
200和400μg腹膜内，人IgG1 D265A)腹膜内治疗小鼠，如所示。显示了每个治疗组的平均值±SEM肿瘤大小。
于肿瘤接种的第8、12、16和20天(如箭头所示)，用cIg(400μg腹膜内，大鼠IgG2a)、抗RANKL(100μg腹膜内，IK22-5大鼠IgG2a)、抗PD-1(100μg腹膜内，RMP1-14大鼠IgG2a)、抗RANKL+抗PD-1(IK22-5 和RMP1-14各100μg腹膜内)以及剂量滴定的抗RANKL/PD-1双特异性(100、
200和400μg腹膜内，人IgG1 D265A)腹膜内治疗小鼠，如所示。显示了每个治疗组的平均值±SEM肿瘤大小。
[0089] 图36是图示，其显示用双特异性抗RANKL/PD-1共靶向RANKL和PD-1抑制结肠癌细胞系CT26的皮下肿瘤生长。在第0天，BALB/c小鼠组(n＝5-17/ 组)皮下注射1×105CT26，并监测肿瘤生长。在第9、17、18和21天(相对于肿瘤接种)用以下抗体腹膜内治疗小鼠：cIg(总计300μg)、双特异性抗 RANKL/PD-1(huIgG1D265A主链；100μg或200μg，如所示)、抗PD-1(RMP1-14 100μg)；抗RANKL(IK22-5，100μg)或其组合，如所示。肿瘤大小表示为平均值±SEM。
[0090] 图37是图示，其显示用双特异性抗RANKL/PD-1共靶向RANKL和PD-1增强CT26肿瘤模型中抗CTLA4治疗的抗肿瘤功效。在第0天，BALB/c小鼠组(n ＝5-17/组)皮下注射1x
105CT26，并监测肿瘤的生长。在第9、17、18和21天 (相对于肿瘤接种)使用以下抗体腹膜内治疗小鼠：cIg(总计300μg)、双特异性抗RANKL/PD-1(huIgG1D265A主链；200μg)、抗CTLA4(UC10-4F10，100μg)、抗PD-1(RMP1-14，100μg)、抗RANKL(IK22-5，100μg)或其组合，如所示。
肿瘤大小表示为平均值±SEM。
105CT26，并监测肿瘤的生长。在第9、17、18和21天 (相对于肿瘤接种)使用以下抗体腹膜内治疗小鼠：cIg(总计300μg)、双特异性抗RANKL/PD-1(huIgG1D265A主链；200μg)、抗CTLA4(UC10-4F10，100μg)、抗PD-1(RMP1-14，100μg)、抗RANKL(IK22-5，100μg)或其组合，如所示。
肿瘤大小表示为平均值±SEM。
[0091] 图38是图示，其显示用双特异性抗RANKL/PD-1共靶向RANKL和PD-1抑制乳癌细胞系AT3-OVA的皮下肿瘤生长。在第0天C57Bl/6野生型(WT)组(n ＝6/组)皮下注射1×
106AT3-OVA，并监测肿瘤生长。在第19、22、25和28天 (相对于肿瘤接种)，用以下抗体腹膜内治疗小鼠：cIg(重组MAC4-huIgG1D265A 主链；200μg)、双特异性抗RANKL/PD-1
(huIgG1D265A主链；100μg或200μg，如所示)、抗PD-1(重组RMP1-14-huIgG1D265A主链；100μg)；抗RANKL(重组IK22-5-huIgG1D265A主链；100μg)或其组合，如所示。肿瘤大小表示为平均值±SEM。
106AT3-OVA，并监测肿瘤生长。在第19、22、25和28天 (相对于肿瘤接种)，用以下抗体腹膜内治疗小鼠：cIg(重组MAC4-huIgG1D265A 主链；200μg)、双特异性抗RANKL/PD-1
(huIgG1D265A主链；100μg或200μg，如所示)、抗PD-1(重组RMP1-14-huIgG1D265A主链；100μg)；抗RANKL(重组IK22-5-huIgG1D265A主链；100μg)或其组合，如所示。肿瘤大小表示为平均值±SEM。
[0092] 表A
[0093] 序列的简单描述
[0094]
[0095]
[0096]
[0097]
[0098]
[0099]
[0100]
具体实施方式
[0101] 1.定义
[0102] 除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。描述了优选的方法和材料，尽管类似于或等同于本文
描述的那些方法和材料的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中。为了本发明
的目的，以下术语如下定义。
描述的那些方法和材料的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中。为了本发明
的目的，以下术语如下定义。
[0103] 冠词“一种(a)”和“一种(an)”在本文中用于指代冠词的语法对象中的一个或多个(即，至少一个)。举例来说，“一种元件”是指一个元件或一个以上元件。
[0104] “大约”是指数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参照数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。
[0105] 术语“同时施用”或“同时地施用”或“共施用”等是指施用含有两种或更多种活性成分的单一组合物，或每种活性成分作为单独的组合物施用和/或通过单独的途径同时期地或同时地或在足够短的时间内顺序递送，其有效结果等同于所有这些活性成分作为单一
组合物施用时所获得的结果。“同时地”是指将活性剂基本上同时地、并且期望地以相同制剂一起施用。“同时期地”是指将活性剂在时间上紧密地施用，例如，一种试剂在另一种试剂之前或之后约一分钟至约一天之内施用。可以使用任何同时期的时间。然而，通常的情况
是，当不同时施用时，试剂将在约一分钟至约八小时内施用，合适地在少于约一至约四小时内施用。当同时期地施用时，所述试剂合适地在受试者的相同部位施用。术语“相同部位”包括确切位置，但是可以在约0.5至约15厘米之内，优选在约0.5至约5厘米之内。如本文所用，术语“单独地”是指以一定间隔，例如以大约一天至数周或数月的间隔来施用试剂。可以以任何顺序施用活性剂。如本文所用，术语“相继地”是指以例如数分钟、数小时、数天或数周的一个或多个间隔，按顺序地施用试剂。如果合适，可以以规则的重复周期施用活性剂。
组合物施用时所获得的结果。“同时地”是指将活性剂基本上同时地、并且期望地以相同制剂一起施用。“同时期地”是指将活性剂在时间上紧密地施用，例如，一种试剂在另一种试剂之前或之后约一分钟至约一天之内施用。可以使用任何同时期的时间。然而，通常的情况
是，当不同时施用时，试剂将在约一分钟至约八小时内施用，合适地在少于约一至约四小时内施用。当同时期地施用时，所述试剂合适地在受试者的相同部位施用。术语“相同部位”包括确切位置，但是可以在约0.5至约15厘米之内，优选在约0.5至约5厘米之内。如本文所用，术语“单独地”是指以一定间隔，例如以大约一天至数周或数月的间隔来施用试剂。可以以任何顺序施用活性剂。如本文所用，术语“相继地”是指以例如数分钟、数小时、数天或数周的一个或多个间隔，按顺序地施用试剂。如果合适，可以以规则的重复周期施用活性剂。
[0106] 如本文中所使用的，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关的所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代方式(或)解释时，没有组合。
[0107] 术语“拮抗剂”以最广义使用，包括在任何环境(包括体外、原位或体内) 下部分或完全阻断、抑制、停止、减少、降低、阻碍、损害或中和RANKL或ICM 的一种或多种生物学活性或功能的任何分子，所述生物学活性或功能例如但不限于，结合、信号传导、复合物的形成、增殖、迁移、侵袭、存活或生存。同样，术语“拮抗”、“拮抗”等在本文可交换使用，是指阻断、抑制、停止、减少、降低、阻碍、损害或中和例如上文和本文其他地方所述的活性或功能。举例来说，“拮抗”可以指活性或功能降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％或100％。
[0108] 本文所用的术语“抗体”是指包含至少一个与特定抗原(例如RANKL或ICM) 特异性结合或相互作用的互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含四条多肽链，即，通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链，以及它们的多聚体(例如，IgM)。每条重链包含重链可变区(可以缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(可以缩写为LCVR或 VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方案中，本发明的抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或者可以是天然或人工修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并排分析来定义氨基酸共有序列。
[0109] 抗体包括任何类别的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不必是任何特定类别。根据其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。免疫球蛋白有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
[0110] 术语“抗原结合片段”、“抗原结合部分”、“抗原结合结构域”和“抗原结合位点”在本文可交换使用，是指参与抗原结合的抗原结合分子的一部分。这些术语包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋
白。可以使用任何合适的标准技术，例如蛋白水解消化或重组基因工程技术(包括操作和表达编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的DNA)，从例如全长抗体分子衍生抗体的抗原
结合片段。这样的DNA 是已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌
体-抗体文库) 获得，或者可以被合成。DNA可以被测序，通过化学方法操作，或使用分子生物学技术，例如，将一个或多个可变和/或恒定结构域排列成合适的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰，添加或删除氨基酸等。
白。可以使用任何合适的标准技术，例如蛋白水解消化或重组基因工程技术(包括操作和表达编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的DNA)，从例如全长抗体分子衍生抗体的抗原
结合片段。这样的DNA 是已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌
体-抗体文库) 获得，或者可以被合成。DNA可以被测序，通过化学方法操作，或使用分子生物学技术，例如，将一个或多个可变和/或恒定结构域排列成合适的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰，添加或删除氨基酸等。
[0111] 抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii) Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii) 由模拟抗体高变区(例如，分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)或限制的 FR3-CDR3-FR4肽的氨基酸残基组成的最小识别单元。其他工程化的分子，例如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR接枝抗体、双抗体、三抗体、四抗体、迷你抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小分子免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域，也包括在本文所用的
表述“抗原结合片段”中。
表述“抗原结合片段”中。
[0112] 抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，并且通常将包含至少一个与一个或多个框架序列相邻或在框内的CDR。
在具有与VL结构域连接的VH结构域的抗原结合片段中，VH和 VL结构域可以以任何合适的排列相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体并且包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可包含单体 VH或VL结构域。
在具有与VL结构域连接的VH结构域的抗原结合片段中，VH和 VL结构域可以以任何合适的排列相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体并且包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可包含单体 VH或VL结构域。
[0113] 在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可包含与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可以在本发明抗体的抗原结合片段内发现的可变和恒定结构域的
非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3； (iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3,(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii) VL-CH1；(ix)VL-CH2,(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；
(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii) VL-CH2-CH3和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型(包括上面列出的任何示例性构型)中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接，或
者可以通过全部或部分铰链或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多)氨基酸组成，其形成单个多肽分子中的相邻可变和/或恒定结构域之间的柔性或半
柔性连接。此外，本发明抗体的抗原结合片段可以包含以上列出的任何可变和恒定结构域
构型的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)，所述可变和恒定结构域彼此非共价连接和/
或与一个或多个单体VH或VL结构域连接 (例如，通过二硫键)。
非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3； (iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3,(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii) VL-CH1；(ix)VL-CH2,(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；
(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii) VL-CH2-CH3和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型(包括上面列出的任何示例性构型)中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接，或
者可以通过全部或部分铰链或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多)氨基酸组成，其形成单个多肽分子中的相邻可变和/或恒定结构域之间的柔性或半
柔性连接。此外，本发明抗体的抗原结合片段可以包含以上列出的任何可变和恒定结构域
构型的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)，所述可变和恒定结构域彼此非共价连接和/
或与一个或多个单体VH或VL结构域连接 (例如，通过二硫键)。
[0114] 与全长抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域都能够特异性结合单独的抗原或相同抗原上的不同表位。使用本领域可用的常规
技术，任何多特异性抗原结合分子形式(包括本文公开的示例性双特异性抗原结合分子形
式)，都可以适用于本发明抗体的抗原结合片段的上下文中。
技术，任何多特异性抗原结合分子形式(包括本文公开的示例性双特异性抗原结合分子形
式)，都可以适用于本发明抗体的抗原结合片段的上下文中。
[0115] 如本文所用，术语“抗原”及其语法等同表达(例如“抗原的”)是指可以被特定体液或细胞免疫产物(例如抗体分子或T细胞受体)特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单的中间代谢产物、糖(例如寡糖)、脂质和激素以及大分子例如复杂的碳水化合物(例如多糖)、磷脂和蛋白质。抗原的常见类别包括但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其他寄生虫抗原、肿瘤抗原、涉及自身免疫疾病、变态反应和移植排斥的抗原、毒素和其他混杂的抗原。
[0116] “抗原结合分子”是指对靶抗原具有结合亲和力的分子。应当理解，该术语扩展到表现出抗原结合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白衍生的蛋白质框架。可用于实施本发明的代表性抗原结合分子包括抗体及其抗原结合片段。术语“抗原结合分
子”包括抗体和抗体的抗原结合片段。
子”包括抗体和抗体的抗原结合片段。
[0117] 术语“双特异性抗原结合分子”是指具有与相同抗原上的两个不同表位或两个不同抗原结合的能力的多特异性抗原结合分子。双特异性抗原结合分子可以是二价、三价或
四价。如本文所用，“价”、“化合价”、“价”或它们的其他语法变化是指抗原结合分子中抗原结合位点的数目。这些抗原识别位点可以识别相同的表位或不同的表位。二价和双特异性
分子描述于例如Kostelny等人J Immunol 148(1992)：1547,Pack and Pluckthun
Biochemistry 31(1992)1579,Gruber等人 J lmmunol(1994)5368,Zhu等人Protein Sci 6
(1997)：781,Hu等人Cancer Res. 56(1996)：3055,Adams等人Cancer Res.53(1993)：4026,和McCartney等人 Protein Eng.8(1995)：301。三价双特异性抗原结合分子和四价双特异
性抗原结合分子在本领域中也是已知的。参见，例如Kontermann RE(编辑),Springer
Heidelberg Dordrecht London New York,pp.199-216(2011)。双特异性抗原结合分子也
可以具有高于4的化合价，并且也在本发明的范围内。这样的抗原结合分子可以通过例如对接和锁定缀合方法产生(Chang,C.-H.等人In：Bispecific Antibodies.Kontermann RE
(2011)同上)。
四价。如本文所用，“价”、“化合价”、“价”或它们的其他语法变化是指抗原结合分子中抗原结合位点的数目。这些抗原识别位点可以识别相同的表位或不同的表位。二价和双特异性
分子描述于例如Kostelny等人J Immunol 148(1992)：1547,Pack and Pluckthun
Biochemistry 31(1992)1579,Gruber等人 J lmmunol(1994)5368,Zhu等人Protein Sci 6
(1997)：781,Hu等人Cancer Res. 56(1996)：3055,Adams等人Cancer Res.53(1993)：4026,和McCartney等人 Protein Eng.8(1995)：301。三价双特异性抗原结合分子和四价双特异
性抗原结合分子在本领域中也是已知的。参见，例如Kontermann RE(编辑),Springer
Heidelberg Dordrecht London New York,pp.199-216(2011)。双特异性抗原结合分子也
可以具有高于4的化合价，并且也在本发明的范围内。这样的抗原结合分子可以通过例如对接和锁定缀合方法产生(Chang,C.-H.等人In：Bispecific Antibodies.Kontermann RE
(2011)同上)。
[0118] 短语“特异性结合”或“特异性结合”是指两个分子之间的结合反应，其在生理条件下至少是背景的两倍，更通常是背景分子结合的10至100倍以上。当使用一种或多种为蛋白质的可检测结合剂时，特异性结合决定了在蛋白质和其他生物的异质群中蛋白质的存在。因此，在指定的免疫测定条件下，指定的抗原结合分子与特定的抗原决定簇结合，从而鉴定其存在。在这样的条件下与抗原决定簇的特异性结合需要选择对该决定簇具有特异性的抗
原结合分子。该选择可以通过排除与其他分子交叉反应的抗原结合分子来实现。可以使用
多种免疫测定形式来选择抗原结合分子(例如免疫球蛋白)，以使它们与特定抗原发生特异
性免疫反应。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质具有特异性免疫反应性的抗体(参见例如，Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)，描述了可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件)。确定结合亲和力和特异性的方法在本领
域中也是众所周知的(参见，例如，Harlow和Lane，同上)。 Friefelder,“Physical
Biochemistry：Applications to biochemistry and molecular biology”(W.H.Freeman and Co.1976))。
原结合分子。该选择可以通过排除与其他分子交叉反应的抗原结合分子来实现。可以使用
多种免疫测定形式来选择抗原结合分子(例如免疫球蛋白)，以使它们与特定抗原发生特异
性免疫反应。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质具有特异性免疫反应性的抗体(参见例如，Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)，描述了可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件)。确定结合亲和力和特异性的方法在本领
域中也是众所周知的(参见，例如，Harlow和Lane，同上)。 Friefelder,“Physical
Biochemistry：Applications to biochemistry and molecular biology”(W.H.Freeman and Co.1976))。
[0119] 当用于分子时，术语“嵌合的”是指该分子包含衍生自、获得自或分离自或基于两种或更多种不同起源或来源的部分。因此，当多肽包含两个或更多个不同来源的氨基酸序列并且包括(1)在自然界中不是一起存在的多肽序列(即，至少氨基酸序列之一相对于至少
一个其他氨基酸序列是异源的)或(2)非天然邻接的氨基酸序列时，该多肽是嵌合的。
一个其他氨基酸序列是异源的)或(2)非天然邻接的氨基酸序列时，该多肽是嵌合的。
[0120] “编码序列”是指有助于基因的多肽产物或基因的最终mRNA产物(例如，剪接后基因的mRNA产物)编码的任何核酸序列。相反，术语“非编码序列”是指无助于基因的多肽产物或基因的最终mRNA产物编码的任何核酸序列。
[0121] 如本文所用，术语“互补决定区”(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其存在对于抗原结合是必需的。每个可变结构域通常具有三个CDR区，分别标识为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可以包含例如由Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即，轻链可变结构域中的约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，重链可变结构域中的31-35 (H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5th版Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda,Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即轻链可变结构域中的大约残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，和重链可变结构域中的 26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196： 901-917(1987))。在一些情况下，互补决定区可以包括来自根据Kabat定义的 CDR区和高变环的氨基酸。
[0122] 如本文所用，术语“复合物”是指彼此直接和/或间接接触的分子(例如，肽、多肽等)的集合或聚集。在特定的实施方案中，“接触”，或更具体地，“直接接触”是指两个或更多个分子足够接近，使得有吸引力的非共价相互作用，例如范德华力、氢键、离子和疏水相互作用等占分子之间相互作用的主导地位。在这样的实施方案中，在使得该复合物热力学上有利的条件下形成(例如，与其组分分子的非聚集或非复合状态相比)分子的复合物(例如
肽和多肽)。如本文所用，术语“多肽复合物”或“蛋白质复合物”是指三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体、十一聚体、十二聚体或更高阶的寡聚体。
肽和多肽)。如本文所用，术语“多肽复合物”或“蛋白质复合物”是指三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体、十一聚体、十二聚体或更高阶的寡聚体。
[0123] 在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为暗示包括陈述的步骤或元件或步骤或元件的组，但不排除任何其他步骤或元件或步骤或元件的组。因此，使用术语“包括”等表示所列出的元件是必需的或强制性的，但是其他元件是可选的并且可以存在或可以不存在。“由……组成”是指包括且限于短语“由...组成”后面的任何内容。因此，短语“由... 组成”表示所列出的元件是必需的或强制性的，并且不存在其他元件。“基本上由...组成”是指包括在短语之后列出的任何元件，并且限于不干扰或不影响本公开中针对所列元件所规定的活性或作用的其他元件。因此，短语“基本上
由……组成”表示所列出的元件是必需的或强制性的，但是其他元件是可选的，并且取决于它们是否影响所列举的元件的活性或作用，可以存在或可以不存在。在一些实施方案中，在所述亚基序列(例如氨基酸序列)的上下文中，短语“基本上由... 组成”表示该序列可以包含至少一个另外的上游亚基(例如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、
44、45、46、47、48、49、50或更多个上游亚基；例如，氨基酸)和/或至少一个另外的下游亚基(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多上游亚基；例如氨基酸)，其中上游亚基的数量和下游亚基的数量是独立选择的。
由……组成”表示所列出的元件是必需的或强制性的，但是其他元件是可选的，并且取决于它们是否影响所列举的元件的活性或作用，可以存在或可以不存在。在一些实施方案中，在所述亚基序列(例如氨基酸序列)的上下文中，短语“基本上由... 组成”表示该序列可以包含至少一个另外的上游亚基(例如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、
44、45、46、47、48、49、50或更多个上游亚基；例如，氨基酸)和/或至少一个另外的下游亚基(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多上游亚基；例如氨基酸)，其中上游亚基的数量和下游亚基的数量是独立选择的。
[0124] 在通过其他方式，包括化学缀合或重组方式(例如，通过基因融合)将两个以上的元件或组分或结构域结合在一起的上下文中，本文所用术语“缀合的”、“连接的”、“融合的”或“融合”及其语法等价形式可交换使用。化学缀合方法(例如使用异双官能交联剂)是本领域已知的。
[0125] 在本申请中使用的术语“恒定结构域”或“恒定区”是指除可变区以外的抗体的结构域的总和。恒定区不直接参与抗原的结合，但是表现出各种免疫效应功能。
[0126] 术语“构建体”是指包含来自不同来源的一个或多个分离的核酸序列的重组遗传分子。因此，构建体是嵌合分子，其中两个或更多个不同来源的核酸序列组装成单个核酸分子，构建体包括任何以下构建体，其含有(1)核酸序列，所述核酸序列包括自然界中不共同存在的调控和编码序列(即，至少一个核苷酸序列相对于其中的至少一个其他核苷酸序列
而言是异源的)，或(2)编码部分非天然邻接的功能性RNA分子或蛋白质的序列，或(3)非天
然邻接的启动子的部分。代表性的构建体包括任何重组核酸分子，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体或线性或环状单链或双链DNA或RNA核酸分子，其来源于任
何能够进行基因组整合或自主复制的来源，包括其中一个或多个核酸分子已被可操作连接
的核酸分子。本发明的构建体通常将包括指导表达也包含在该构建体中的感兴趣核酸序列
(例如靶核酸序列或调节核酸序列)的必需元件。此类元件可以包括控制元件，例如与感兴
趣核酸序列可操作地连接(以指导其转录)的启动子，并且通常还包括聚腺苷酸化序列。在
本发明的某些实施方案中，构建体可以包含在载体内。除构建体的组分外，载体还可包括例如一种或多种选择标记物、一种或多种复制起点，例如原核和真核起点、至少一个多克隆位点和/或促进将该构建体稳定整合到宿主细胞基因组中的元件。两个或更多个构建体可以
包含在单个核酸分子(例如单个载体)内，或者可以包含在两个或更多个单独的核酸分子
内，例如包含在两个或更多个单独的载体内。“表达构建体”通常包括至少一个可操作地连接至感兴趣核苷酸序列的控制序列。以这种方式，例如，在表达构建体中提供与待表达的核苷酸序列可操作连接的启动子，以在包括宿主细胞的生物体或其部分中表达。为了实施本
发明，本领域技术人员熟知用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法，参见
例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第3版，第1、2和3卷.J.F.Sambrook,
D.W.Russell和N.Irwin,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2000。
而言是异源的)，或(2)编码部分非天然邻接的功能性RNA分子或蛋白质的序列，或(3)非天
然邻接的启动子的部分。代表性的构建体包括任何重组核酸分子，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体或线性或环状单链或双链DNA或RNA核酸分子，其来源于任
何能够进行基因组整合或自主复制的来源，包括其中一个或多个核酸分子已被可操作连接
的核酸分子。本发明的构建体通常将包括指导表达也包含在该构建体中的感兴趣核酸序列
(例如靶核酸序列或调节核酸序列)的必需元件。此类元件可以包括控制元件，例如与感兴
趣核酸序列可操作地连接(以指导其转录)的启动子，并且通常还包括聚腺苷酸化序列。在
本发明的某些实施方案中，构建体可以包含在载体内。除构建体的组分外，载体还可包括例如一种或多种选择标记物、一种或多种复制起点，例如原核和真核起点、至少一个多克隆位点和/或促进将该构建体稳定整合到宿主细胞基因组中的元件。两个或更多个构建体可以
包含在单个核酸分子(例如单个载体)内，或者可以包含在两个或更多个单独的核酸分子
内，例如包含在两个或更多个单独的载体内。“表达构建体”通常包括至少一个可操作地连接至感兴趣核苷酸序列的控制序列。以这种方式，例如，在表达构建体中提供与待表达的核苷酸序列可操作连接的启动子，以在包括宿主细胞的生物体或其部分中表达。为了实施本
发明，本领域技术人员熟知用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法，参见
例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第3版，第1、2和3卷.J.F.Sambrook,
D.W.Russell和N.Irwin,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2000。
[0127] “控制元件”或“控制序列”是指在特定宿主细胞中表达可操作连接的编码序列所必需的核酸序列(例如DNA)。适用于原核细胞的控制序列例如包括启动子，和任选的cis作用序列，例如操纵子序列和核糖体结合位点。适用于真核细胞的控制序列包括转录控制序
列(例如启动子、聚腺苷酸化信号、转录增强子)、翻译控制序列(例如翻译增强子和内部核糖体结合位点(IRES)、调节mRNA稳定性的核酸序列、以及将转录的多核苷酸编码的产物靶
向至细胞内的细胞内组分或细胞外环境的靶向序列。
列(例如启动子、聚腺苷酸化信号、转录增强子)、翻译控制序列(例如翻译增强子和内部核糖体结合位点(IRES)、调节mRNA稳定性的核酸序列、以及将转录的多核苷酸编码的产物靶
向至细胞内的细胞内组分或细胞外环境的靶向序列。
[0128] “对应于”或“对应着”是指与参考核酸序列显示实质的序列同一性的核酸序列(例如，与参考核酸序列的全部或其部分具有至少约50、51、52、53、54、 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、
86、97、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99％或甚至高达100％序列同一性)或与参考氨基酸序列显示实质的序列相似性或同一性的氨基酸序列(例如，与参考氨基酸序列的
全部或其部分具有至少约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、 61、62、63、64、65、66、67、
68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、97、88、89、90、91、92、
93、94、95、96、 97、98、99％或甚至高达100％序列相似性或同一性)。
86、97、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99％或甚至高达100％序列同一性)或与参考氨基酸序列显示实质的序列相似性或同一性的氨基酸序列(例如，与参考氨基酸序列的
全部或其部分具有至少约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、 61、62、63、64、65、66、67、
68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、97、88、89、90、91、92、
93、94、95、96、 97、98、99％或甚至高达100％序列相似性或同一性)。
[0129] “细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)”(也称为ALPS5、CD、CD152、 CELIAC3、CTLA-4、GRD4、GSE、IDDM12)，是指一种蛋白受体，其作为免疫检查点发挥作用，下调免疫反应。CTLA4在T调节细胞(Treg)中组成型表达，但在激活后仅在常规T细胞中上调。当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86 结合时，它作为“关闭”开关发挥作用。本文所用的术语“CTLA4”包括人CTLA4 (hCTLA4)、hCTLA4的变体、同种型和物种同系物、以及与hCTLA4具有至少一个共同表位的类似物。完整的hCTLA4序列可在UniProt登录号P16410下找到。
[0130] 术语“DART”(双亲和力再靶向试剂)是指包含至少两条多肽链的免疫球蛋白分子，所述至少两条多肽链结合(特别是通过共价相互作用)形成至少两个表位结合位点，其可以识别相同或不同的表位。DART的每条多肽链包含一个免疫球蛋白轻链可变区和一个免疫球
蛋白重链可变区，但这些区域不相互作用形成表位结合位点。而是，DART多肽链的一条(例如，第一)的免疫球蛋白重链可变区与不同(例如第二)的DART多肽链的免疫球蛋白轻链可
变区相互作用以形成表位结合位点。类似地，DART多肽链的一条(例如，第一)的免疫球蛋白轻链可变区与不同的(例如，第二)DART多肽链的免疫球蛋白重链可变区相互作用，形成表
位结合位点。DART可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的等，因此能够同时结合一个、两个、三个或更多个不同的表位(它们可以是相同或不同的抗原)。DART另外可以是一价、二价、三价、四价、五价、六价等，因此能够同时结合一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个分子。可以组合DART 的这两个属性(即特异性程度和效价)，例如产生四价(即能够结合
四组表位) 的双特异性抗体(即能够结合两个表位)等。DART分子在国际PCT公开号WO
2006/113665、WO 2008/157379和WO 2010/080538中详细公开了。
蛋白重链可变区，但这些区域不相互作用形成表位结合位点。而是，DART多肽链的一条(例如，第一)的免疫球蛋白重链可变区与不同(例如第二)的DART多肽链的免疫球蛋白轻链可
变区相互作用以形成表位结合位点。类似地，DART多肽链的一条(例如，第一)的免疫球蛋白轻链可变区与不同的(例如，第二)DART多肽链的免疫球蛋白重链可变区相互作用，形成表
位结合位点。DART可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的等，因此能够同时结合一个、两个、三个或更多个不同的表位(它们可以是相同或不同的抗原)。DART另外可以是一价、二价、三价、四价、五价、六价等，因此能够同时结合一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个分子。可以组合DART 的这两个属性(即特异性程度和效价)，例如产生四价(即能够结合
四组表位) 的双特异性抗体(即能够结合两个表位)等。DART分子在国际PCT公开号WO
2006/113665、WO 2008/157379和WO 2010/080538中详细公开了。
[0131] 在治疗或预防疾病或病症(例如癌症)的上下文中，“有效量”是指以单一剂量或作为系列或缓慢释放系统的一部分向受试者施用一定量的活性剂，其对治疗或预防该疾病或病症有效。有效量将根据受试者的健康和身体状况以及待治疗的个体的分类组、组合物的
配方、医疗状况的评估以及其他相关因素而变化。
配方、医疗状况的评估以及其他相关因素而变化。
[0132] 如本文所用，术语“编码”、“编码”等是指核酸提供另一种核酸或多肽的能力。例如，如果核酸序列能够被转录和/或翻译以产生多肽，或者能够被加工成可以被转录和/或翻译以产生多肽的形式，则认为该核酸序列“编码”多肽。这样的核酸序列可以包括编码序列或包括编码序列和非编码序列两者。因此，术语“编码”、“编码”等包括由DNA分子转录产生的RNA产物、由RNA分子翻译产生的蛋白质、由DNA分子转录形成RNA产物以及随后的RNA产物翻译产生的蛋白质、或从DNA分子转录以提供RNA产物，对RNA产物进行加工以提供加工的 RNA产物(例如mRNA)以及随后加工的RNA产物进行翻译而产生的蛋白质。
[0133] 术语“表位”和“抗原决定簇”在本文中可交换使用，是指被抗原结合分子或其抗原结合片段结合的抗原区域。表位既可以由连续氨基酸形成(线性表位)，也可以由蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成(构象表位)。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变
性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常以独特
的空间构象包含至少3个，更通常至少5 或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包
括，例如，X射线晶体学和2维核磁共振(参见，例如，Morris G.E.,Epitope Mapping
Protocols,Meth Mol Biol,66 (1996))。用于表位作图的优选方法是表面等离子体共振。
双特异性抗体可以是二价、三价或四价。当在本文中在双特异性抗体的上下文中使用时，术语“价”、“化合价”、“化合价”或它们的其他语法变化是指抗体分子中抗原结合位点的数量。
这些抗原识别位点可以识别相同的表位或不同的表位。二价双特异性分子描述于例如
Kostelny等人，(1992)J Immunol 148：1547；Pack和Pluckthun(1992) Biochemistry 31：
1579；Hollinger等人，1993,同上,Gruber等人，(1994)J Immunol 5368,Zhu等人，(1997)Protein Sci 6：781；Hu等人，(1996)Cancer Res 56： 3055；Adams等人，(1993)Cancer Res
53：4026；和McCartney等人，(1995) Protein Eng 8：301。三价双特异性抗体和四价双特异性抗体在本领域中也是已知的(参见，例如，Kontermann R E(编辑),Springer Heidelberg Dordrecht London New York,199-216(2011))。双特异性抗体也可以具有高于4的化合价，并且也在本发明的范围内。这样的抗体可以通过例如对接和锁定缀合方法来产生(参见，
Chang, C.-H.等人In：Bispecific Antibodies.Kontermann R E(编辑),Springer
Heidelberg Dordrecht London New York,pp.199-216(2011))。
性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常以独特
的空间构象包含至少3个，更通常至少5 或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包
括，例如，X射线晶体学和2维核磁共振(参见，例如，Morris G.E.,Epitope Mapping
Protocols,Meth Mol Biol,66 (1996))。用于表位作图的优选方法是表面等离子体共振。
双特异性抗体可以是二价、三价或四价。当在本文中在双特异性抗体的上下文中使用时，术语“价”、“化合价”、“化合价”或它们的其他语法变化是指抗体分子中抗原结合位点的数量。
这些抗原识别位点可以识别相同的表位或不同的表位。二价双特异性分子描述于例如
Kostelny等人，(1992)J Immunol 148：1547；Pack和Pluckthun(1992) Biochemistry 31：
1579；Hollinger等人，1993,同上,Gruber等人，(1994)J Immunol 5368,Zhu等人，(1997)Protein Sci 6：781；Hu等人，(1996)Cancer Res 56： 3055；Adams等人，(1993)Cancer Res
53：4026；和McCartney等人，(1995) Protein Eng 8：301。三价双特异性抗体和四价双特异性抗体在本领域中也是已知的(参见，例如，Kontermann R E(编辑),Springer Heidelberg Dordrecht London New York,199-216(2011))。双特异性抗体也可以具有高于4的化合价，并且也在本发明的范围内。这样的抗体可以通过例如对接和锁定缀合方法来产生(参见，
Chang, C.-H.等人In：Bispecific Antibodies.Kontermann R E(编辑),Springer
Heidelberg Dordrecht London New York,pp.199-216(2011))。
[0134] 如本文所用，术语“功能”、“功能性”等是指生物学的、酶的或治疗的功能。
[0135] “框架区”(FR)是除CDR残基之外的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有标识为FR1、FR2、FR3和FR4的四个FR。如果根据Kabat定义CDR，则轻链FR残基大约位于残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3) 和98-107(LCFR4)，重链FR残基大约位于重链残基中的残基1-30(HCFR1)、 36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)和103-113(HCFR4)。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，则轻链FR残基大约位于轻链中的残基1-25(LCFR1)、33-49 (LCFR2)、53-90(LCFR3)和97-107(LCFR4)，重链FR残基大约位于重链残基中的残基1-25
(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)和102-113(HCFR4)。在一些情况下，当CDR包含来自Kabat定义的CDR和高变环的CDR的氨基酸时， FR残基将被相应地调整。例如，当CDRH1包括氨基酸H26-H35时，重链FR1残基位于位置1-25，而FR2残基在位置36-49。
(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)和102-113(HCFR4)。在一些情况下，当CDR包含来自Kabat定义的CDR和高变环的CDR的氨基酸时， FR残基将被相应地调整。例如，当CDRH1包括氨基酸H26-H35时，重链FR1残基位于位置1-25，而FR2残基在位置36-49。
[0136] 如本文所用，涉及细胞标记物或生物标记物的测量值的术语“更高”是指与参考水平相比，生物标记物测量值的水平有统计学上显著的且可测量的差异，其中生物标记物测量值大于参考水平。所述差异合适地为至少约10％、或至少约 20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％。
[0137] 如本文所用，涉及细胞标记物或生物标记物的测量值的术语“更低”是指与参考水平相比，生物标记物测量值的水平有统计学上显著的且可测量的差异，其中生物标记物测量值小于参考水平。所述差异合适地为至少约10％、或至少约 20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％。
[0138] 术语“免疫检查点分子”包括作为免疫检查点发挥作用的受体和配体。免疫检查点是一种免疫逃逸机制，可防止免疫系统攻击自己的身体。免疫检查点受体存在于T细胞上，并与抗原呈递细胞上表达的免疫检查点配体相互作用。T细胞识别存在于MHC分子上的抗原并被激活以产生免疫反应，而与上述同时发生的免疫检查点受体和配体之间的相互作用控
制T细胞的激活。示例性免疫检查点分子包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、B7-H3 CD276、 VTCN1、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、CD155、 DNAM-
1、CD112、CRTAM、TNFRS4(OX40、CD134)、TNFSF4(OX40L)、 CD244、CD160、GITR、GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL(CD137L)、4-1BB(CD137)、 CD70、CD27L、CD28、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、SIRP-1、IAP(CD47)、 BLAST-1(CD48)、CD244；CD40、CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、 TNFRS25、ICOLG(B7RP1)和TIGIT。在特定的实施方案中，免疫检查点分子是 PD-1、PD-L1或CTLA-4。
制T细胞的激活。示例性免疫检查点分子包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、B7-H3 CD276、 VTCN1、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、CD155、 DNAM-
1、CD112、CRTAM、TNFRS4(OX40、CD134)、TNFSF4(OX40L)、 CD244、CD160、GITR、GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL(CD137L)、4-1BB(CD137)、 CD70、CD27L、CD28、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、SIRP-1、IAP(CD47)、 BLAST-1(CD48)、CD244；CD40、CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、 TNFRS25、ICOLG(B7RP1)和TIGIT。在特定的实施方案中，免疫检查点分子是 PD-1、PD-L1或CTLA-4。
[0139] 在本发明的上下文中，术语“免疫效应细胞”涉及在免疫反应过程中发挥效应功能的细胞。例如，此类细胞分泌细胞因子和/或趋化因子，杀死微生物，分泌抗体，识别感染或癌细胞，并任选地消除此类细胞。例如，免疫效应细胞包括T 细胞(细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、肿瘤浸润T细胞)、B细胞、自然杀伤 (NK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞。
[0140] 在本发明的上下文中，术语“免疫效应功能”包括由免疫系统的组分介导的任何功能，其例如导致杀死病毒感染的细胞或肿瘤细胞，或抑制肿瘤生长和//或抑制肿瘤形成，包括抑制肿瘤的扩散和转移。优选地，在本发明的上下文中，免疫效应功能是T细胞介导的效应功能。在辅助T细胞(CD4+ T细胞)的情况下，此类功能包括通过T细胞受体识别在MHC II类分子情况下的抗原或源自抗原的抗原肽、释放细胞因子和/或激活CD8+淋巴细胞(CTL)
和/或B细胞，在CTL的情况下，包括通过T细胞受体识别在MHC I类分子情况下的抗原或源自抗原的抗原肽、消除在MHC I类分子情况下呈递的细胞，即特征在于通过I类MHC呈递抗原的细胞，例如通过细胞凋亡或穿孔素介导的细胞裂解、产生细胞因子，例如如IFN-γ和TNF-α、以及对表达抗原的靶细胞的特异性溶细胞杀死。
和/或B细胞，在CTL的情况下，包括通过T细胞受体识别在MHC I类分子情况下的抗原或源自抗原的抗原肽、消除在MHC I类分子情况下呈递的细胞，即特征在于通过I类MHC呈递抗原的细胞，例如通过细胞凋亡或穿孔素介导的细胞裂解、产生细胞因子，例如如IFN-γ和TNF-α、以及对表达抗原的靶细胞的特异性溶细胞杀死。
[0141] 术语“免疫系统”是指细胞、分子组分和机制，分别包括适应性免疫系统和固有免疫系统的抗原特异性和非特异性类别，其提供针对伤害和损害和物质的防御，后者由抗原性分子组成，包括但不限于肿瘤、病原体和自反应性细胞。“适应性免疫系统”是指抗原特异性细胞、分子成分和机制，其在几天内出现并与特异性抗原反应并去除抗原。适应性免疫系统在宿主的一生中都会形成。适应性免疫系统基于白细胞，并被分为两个主要部分：体液免疫系统(主要通过B细胞产生的免疫球蛋白发挥作用)和细胞介导的免疫系统(主要通过T细
胞发挥作用)。
胞发挥作用)。
[0142] “接头”是指连接两个分子并经常用来将两个分子置于期望构型的分子或分子组(例如单体或聚合物)。在特定的实施方案中，“肽接头”是指连接两个蛋白质、多肽、肽、结构域、区域或基序的氨基酸序列，并且可以提供与抗原结合片段的间隔相容的间隔功能，使得它们可以特异性结合其同源表位)。在某些实施方案中，接头由例如约2至约35个氨基酸组
成，或例如由约4至约20个氨基酸或约8至约15个氨基酸或约15至约25个氨基酸组成。
成，或例如由约4至约20个氨基酸或约8至约15个氨基酸或约15至约25个氨基酸组成。
[0143] 如本文所用，术语“微环境”是指生物细胞、组织或器官的连接、支持框架。如本文所用，术语“肿瘤微环境”或“TME”是指肿瘤环境的任何和所有元件，其为恶性过程的存活和/或扩增和/或扩散产生结构和/或功能环境。通常，术语“肿瘤微环境”或“TME”是指存在肿瘤的细胞环境，包括紧邻成纤维细胞、白细胞和内皮细胞的区域以及细胞外基质(ECM)。因此，肿瘤微环境的细胞包括恶性细胞以及支持其生长和存活的非恶性细胞。非恶性细胞，也称为基质细胞，占据或积累在与恶性细胞相同的细胞空间中，或占据或积累在与恶性细
胞相邻或接近的细胞空间，从而调节肿瘤细胞的生长或存活。术语“基质细胞”包括成纤维细胞、白细胞和血管细胞。肿瘤微环境的非恶性细胞包括成纤维细胞、上皮细胞、血管细胞(包括血液和淋巴管内皮细胞和周细胞)、驻留和/或募集的炎性和免疫性(例如巨噬细胞、
树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞等)。这些细胞，特别是激活的成纤维细胞积极参与转移的形成。
胞相邻或接近的细胞空间，从而调节肿瘤细胞的生长或存活。术语“基质细胞”包括成纤维细胞、白细胞和血管细胞。肿瘤微环境的非恶性细胞包括成纤维细胞、上皮细胞、血管细胞(包括血液和淋巴管内皮细胞和周细胞)、驻留和/或募集的炎性和免疫性(例如巨噬细胞、
树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞等)。这些细胞，特别是激活的成纤维细胞积极参与转移的形成。
[0144] 如本文所用，术语“单克隆抗体”(Mab)是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的天然突变以外，构成该群的各抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原表位具有高度特异性。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并且不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以首先通过Kohler等人，Nature 256：495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，并且可以通过如上所述的体细胞杂交方法进行修饰；或者可以通过其他重组DNA方法(例如美国
专利号4,816,567 中描述的那些)制备。
专利号4,816,567 中描述的那些)制备。
[0145] 术语“多特异性抗原结合分子”以其最广义使用，并且具体涵盖对至少两个 (例如，2、3、4等)不同表位具有特异性的抗原结合分子(即，能够特异性结合一种抗原上的两个或多个不同表位，或能够特异性结合两种或更多种不同抗原上的表位)。
[0146] 应用于标记物的“阴性”、“阳性”和“低”表达水平定义如下。具有阴性表达(即，“-”)或“不表达”的细胞在本文中被定义为那些细胞，即表达小于或等于在存在完整抗体染色混合物时荧光通道中用同种型对照抗体观察到的表达的95百分位，在其他荧光发射通道中对其他感兴趣蛋白质进行标记。本领域技术人员将理解，用于定义阴性事件的该步骤称
为“荧光减一”或“FMO”染色。使用上述FMO染色步骤，表达大于用同种型对照抗体观察到的表达的95百分位的细胞在本文中定义为“阳性”(即“+”)。多种细胞群被广泛定义为“阳性”。
例如，具有低表达(即“低”或“lo”)的细胞通常被定义为观察到的表达高于使用同种型对照抗体通过FMO染色确定的95百分位的细胞，并且在使用同种型对照抗体通过上述FMO染色步
骤观察到的表达的95百分位的一个标准差内。关于ICM(例如，PD-1、PD-L1等)的术语“低”或“lo”是指细胞或细胞群(例如，Treg细胞，包括肿瘤微环境中的T细胞)以比一种或多种其他不同细胞或细胞群(例如免疫效应细胞，例如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK T (NKT)细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC)；以及肿瘤细胞)更低的水平表达ICM。例如，已知在肿瘤微环境中，CTLA4在Treg上的表达水平显著高于PD-1，而PD-1在免疫效应细胞(包
括效应T细胞)上的表达水平则显著高于Treg(Jacobs等人，2009.Neuro-Oncology 11(4)：
394–402)。
为“荧光减一”或“FMO”染色。使用上述FMO染色步骤，表达大于用同种型对照抗体观察到的表达的95百分位的细胞在本文中定义为“阳性”(即“+”)。多种细胞群被广泛定义为“阳性”。
例如，具有低表达(即“低”或“lo”)的细胞通常被定义为观察到的表达高于使用同种型对照抗体通过FMO染色确定的95百分位的细胞，并且在使用同种型对照抗体通过上述FMO染色步
骤观察到的表达的95百分位的一个标准差内。关于ICM(例如，PD-1、PD-L1等)的术语“低”或“lo”是指细胞或细胞群(例如，Treg细胞，包括肿瘤微环境中的T细胞)以比一种或多种其他不同细胞或细胞群(例如免疫效应细胞，例如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK T (NKT)细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC)；以及肿瘤细胞)更低的水平表达ICM。例如，已知在肿瘤微环境中，CTLA4在Treg上的表达水平显著高于PD-1，而PD-1在免疫效应细胞(包
括效应T细胞)上的表达水平则显著高于Treg(Jacobs等人，2009.Neuro-Oncology 11(4)：
394–402)。
[0147] 如本文所用，术语“可操作地连接”或“可操作地连接”是指并置，其中所描述的组分处于允许其以其预期方式发挥作用的关系。例如，调控序列(例如启动子)与感兴趣核苷酸序列(例如，编码和/或非编码序列)“可操作地连接”是指控制序列相对于感兴趣核苷酸序列的定位和/或定向，允许在与控制序列相容的条件下表达该序列。控制序列不必与感兴趣核苷酸序列邻接，只要它们发挥指导其表达的功能即可。因此，例如，在启动子和编码序列之间可以存在介于之间的非编码序列(例如，未翻译但仍被转录的序列)，并且启动子序
列仍可以被认为与编码序列“可操作地连接”。同样，将第一抗原结合片段“可操作地连接”到第二抗原结合片段涵盖抗原结合片段的定位和/或定向，以这种方式允许每个抗原结合
片段与其同源表位结合。
列仍可以被认为与编码序列“可操作地连接”。同样，将第一抗原结合片段“可操作地连接”到第二抗原结合片段涵盖抗原结合片段的定位和/或定向，以这种方式允许每个抗原结合
片段与其同源表位结合。
[0148] “药学上可接受的载体”是指由生物学上或其他方面不希望的物质组成的药物载体，即该物质可以与所选的活性剂一起被施用于受试者，而不会引起任何或实质性的不良
反应。载体可包括赋形剂和其他添加剂，例如稀释剂、洗涤剂、着色剂、湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。
反应。载体可包括赋形剂和其他添加剂，例如稀释剂、洗涤剂、着色剂、湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。
[0149] “程序性死亡-1(PD-1)”(也称为CD279、PD1、SLEB2、hPD-1、hPD-1 和hSLE1)是指属于CD28家族的免疫抑制性受体。PD-1主要在体内先前激活的 T细胞上表达，并与两个配体PD-L1和PD-L2结合。术语“PD-1”包括PD-1的片段以及相关的多肽，包括但不限于等位基因变体、剪接变体、衍生物变体、取代变体、缺失变体和/或插入变体、融合多肽和种间同系物。
在某些实施方案中， PD-1多肽包括末端残基，例如但不限于前导序列残基、靶向残基、氨基末端蛋氨酸残基、赖氨酸残基、标签残基和/或融合蛋白残基。在优选的实施方案中，“PD-1”包括人PD-1(hPD-1)、hPD-1的变体、同种型和物种同系物、以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hPD-1序列可在GenBank登录号U64863 下找到。
在某些实施方案中， PD-1多肽包括末端残基，例如但不限于前导序列残基、靶向残基、氨基末端蛋氨酸残基、赖氨酸残基、标签残基和/或融合蛋白残基。在优选的实施方案中，“PD-1”包括人PD-1(hPD-1)、hPD-1的变体、同种型和物种同系物、以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hPD-1序列可在GenBank登录号U64863 下找到。
[0150] “程序性死亡配体1(PD-L1)”(也称为CD274、B7-H、B7H1、PDCD1L1、PDCD1LG1、PDL1和CD274分子)是PD-1的两个细胞表面糖蛋白配体之一(另一个是PD-L2)，它们在与PD-1结合后下调T细胞激活和细胞因子分泌。术语“PD-L1”包括PD-L1的片段，以及相关的多肽，包括但不限于等位基因变体、剪接变体、衍生物变体、取代变体、缺失变体和/或插入变体、融合多肽和种间同系物。在某些实施方案中，PD-1多肽包括末端残基，例如但不限于前导序列残基、靶向残基、氨基末端蛋氨酸残基、赖氨酸残基、标签残基和/或融合蛋白残基。在优选的实施方案中，本文使用的“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)、hPD-L1的变体、同种型和物种同系物、以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hPD-L1序列可以在GenBank登录号Q9NZQ7下找到。
[0151] 术语“多肽”、“蛋白质分子”、“肽”和“蛋白质”在本文可交换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。这些术语不排除修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。对象蛋白质分子的可溶形式是特别有用的。例如，含有一种或多种氨基酸类似物的多肽(包括例如非天然氨基酸或具有取代键的多肽)包括在该定义中。
[0152] “NF-κB配体的受体激活剂(RANKL)”(也称为肿瘤坏死因子配体超家族成员11(TNFSF11)、TNF相关激活诱导的细胞因子(TRANCE)、骨保护素配体(OPGL)和破骨细胞分化
因子(ODF))是指多肽，尤其是其通过与NF-κB 的受体激活剂(RANK)结合而促进破骨细胞形成。术语“RANKL”包括RANKL 的片段以及相关多肽，其包括但不限于等位基因变体、剪接变体、衍生物变体、取代变体、缺失变体和/或插入变体、融合多肽和种间同系物。在某些实施方案中， RANKL多肽包括末端残基，例如但不限于前导序列残基、靶向残基、氨基末端蛋氨酸残基、赖氨酸残基、标签残基和/或融合蛋白残基。术语RANKL包括人RANKL (hRANKL)、
hRANKL的变体、同种型和物种同系物、以及与hRANKL具有至少一个共同表位的类似物。完整的hRANKL序列可在UniProt登录号O14788下找到。
因子(ODF))是指多肽，尤其是其通过与NF-κB 的受体激活剂(RANK)结合而促进破骨细胞形成。术语“RANKL”包括RANKL 的片段以及相关多肽，其包括但不限于等位基因变体、剪接变体、衍生物变体、取代变体、缺失变体和/或插入变体、融合多肽和种间同系物。在某些实施方案中， RANKL多肽包括末端残基，例如但不限于前导序列残基、靶向残基、氨基末端蛋氨酸残基、赖氨酸残基、标签残基和/或融合蛋白残基。术语RANKL包括人RANKL (hRANKL)、
hRANKL的变体、同种型和物种同系物、以及与hRANKL具有至少一个共同表位的类似物。完整的hRANKL序列可在UniProt登录号O14788下找到。
[0153] “NF-κB的受体激活剂(RANK)”(也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员 11a、NF-κB激活剂、CD265、FEO、LOH18CR1、ODFR、OFE、OPTB7、OSTS、 PDB2和TRANCER)是指一种多肽，其是RANK-配体(RANKL)和RANK/RANKL /骨保护素(OPG)信号传导通路的一部分的受体，调节破骨细胞分化和激活。其与骨重塑和修复、免疫细胞功能、淋巴结形成、热调节和乳腺发育相关。术语“RANK”包括RANK的片段以及相关的多肽，包括但不限于等位基因变体、剪接变体、衍生物变体、取代变体、缺失变体和/或插入变体、融合多肽和种间同系物。在某些实施方案中，RANK多肽包括末端残基，例如但不限于前导序列残基、靶向残基、氨基末端蛋氨酸残基、赖氨酸残基、标签残基和/或融合蛋白残基。术语RANK包括人RANK(hRANK)、hRANK的变体、同种型和物种同系物、以及与hRANK具有至少一个共同表位的类似物。完整的hRANK序列可在UniProt 登录号Q9Y6Q6下找到。
[0154] 如本文所用，“重组”抗原结合分子是指任何抗原结合分子，其产生包括在生物体中表达编码所需抗体结构的非天然DNA序列，其非限制性实例包括串联 scFv(taFv或scFv2)、双抗体、dAb2/VHH2、旋钮入孔衍生物、SEED-IgG、异Fc-scFv、 Fab-scFv、scFv-Jun/Fos、Fab'-Jun/Fos、三抗体、DNL-F(ab)3、scFv3-CH1/CL、Fab-scFv2、 IgG-scFab、IgG-scFv、scFv-IgG、scFv2-Fc、F(ab’)2-scFv2、scDB-Fc、scDB-CH3、 Db-Fc、scFv2-H/L、DVD-Ig、tandAb、scFv-dhlx-scFv、dAb2-IgG、dAb-IgG、 dAb-Fc-dAb、CrossMab、MAb2、FIT-Ig及其组合。
[0155] 如本文所用，术语“调节性T细胞”或“Treg”是指负性调节其他T细胞(包括效应T细胞以及固有免疫系统细胞)激活的T细胞。Treg细胞的特征在于持续抑制效应T细胞反应。在一些方面，Treg是CD4+CD25+Foxp3+ T细胞。
[0156] 本文可交换使用的术语“受试者”、“患者”、“宿主”或“个体”是指需要治疗或预防的任何受试者，特别是脊椎动物受试者，甚至更特别是哺乳动物受试者。落入本发明范围内的合适的脊椎动物包括但不限于脊索动物(Chordata) 亚门的任何成员，包括灵长类动物(例如人、猴子和猿、并且包括来自猕猴属(genus Macaca)的猴子物种(例如食蟹猴，如猕猴(Macaca fascicularis)和/或恒河猴 (Macaca mulatta)和狒狒(Papio ursinus)、以及狨
猴(来自Callithrix属的物种)、松鼠猴(来自Saimiri属的物种)和绢毛猴(来自Saguinus属
的物种)、以及猿的物种，例如黑猩猩(Pan troglodytes))、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、兔科(例如兔子、野兔)、牛科(例如牛)、羊科(例如，绵羊)、山羊科(例如，山羊)、猪科(例如，猪)、马科(例如，马)、犬科(例如，狗)、猫科 (例如，猫)、禽类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟，如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(例如，海豚、鲸)、爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼。优选的受试者是需要引起对癌症免疫反应的人。然而，将理解，前述术语并不暗示存在症状。
猴(来自Callithrix属的物种)、松鼠猴(来自Saimiri属的物种)和绢毛猴(来自Saguinus属
的物种)、以及猿的物种，例如黑猩猩(Pan troglodytes))、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、兔科(例如兔子、野兔)、牛科(例如牛)、羊科(例如，绵羊)、山羊科(例如，山羊)、猪科(例如，猪)、马科(例如，马)、犬科(例如，狗)、猫科 (例如，猫)、禽类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟，如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(例如，海豚、鲸)、爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼。优选的受试者是需要引起对癌症免疫反应的人。然而，将理解，前述术语并不暗示存在症状。
[0157] “治疗”、“处理”等意思是包括预防性和治疗性治疗，包括但不限于预防、缓解、改变、逆转、影响、抑制以下各项的形成或进展、改善或治愈：(1)与靶抗原的存在或异常表达相关的疾病或病症、或(2)该疾病或病症的症状、或(3) 对疾病或病症的易感性，包括赋予对受试者的保护性免疫。
[0158] 如本文所用，术语“治疗组合”是指一种或多种活性药物物质的组合，即，当同时施用(即组合治疗)时具有治疗用途的化合物。因此，化合物可以是单一组合物的形式，适当地包含化合物的混合物，或者是单独的组合物的形式。通常，本发明治疗组合中的每种此类化合物将存在于包含该化合物和药学上可接受的载体的药物组合物中。本发明的治疗组合中的化合物以剂型提供，使得每种治疗化合物的有益效果被受试者在期望的时间实现。
[0159] 如本文所用，术语“三特异性抗体”是指包含至少对第一表位具有特异性的第一抗原结合结构域、对第二表位具有特异性的第二抗原结合结构域和对第三表位具有特异性的第三抗原结合结构域的抗体，例如，RANKL和CTLA4、PD-1和 PD-L1中的任意两个。第一、第二和第三表位不相同(即，是不同的靶标，例如，蛋白质)，但可以全部存在(例如，共表达)于单个细胞或至少两个细胞上。
[0160] 如本文所用，术语“肿瘤”是指任何赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性，以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理状况，其通常部分以不受调控的细胞生长为特征。如本文所用，术语“癌症”是指非转移性和转移性癌症，包括早期和晚期癌症。术语“癌前”是指通常在癌症之前或发展成癌症的病症或生长。“非转移性”是指良性或保留在原发部位且尚未渗透到淋巴或血管系统或除原发部位以外的组织中的癌症。通常，非转移性癌症是0期、I期或II期癌症、偶尔是III期癌症中的任何癌症。“早期癌症”是指非侵袭性或转移性或分类为0期、I或II期癌症的癌症。术语“晚期癌症”通常是指III期或IV期癌症，但也可以指II期癌症或II期癌症的子期。本领域技术人员将理解，根据特定的癌症类型将II期癌症分类为早期癌症或晚期癌症。癌症的说明性实例包括但不限于乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲状腺癌、肾癌、癌、黑色素瘤、脑癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、直肠癌和食道癌。在一个示例性的实施方案中，所述癌症选自前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌和骨癌。
[0161] “载体”是指核酸分子，优选地源自例如质粒、噬菌体或植物病毒的DNA分子，其中可以插入或克隆核酸序列。载体优选包含一个或多个独特的限制性位点，并且能够在限定的宿主细胞(包括靶细胞)或组织、或祖细胞或其组织中自主复制，或者与限定宿主的基因
组整合，使得克隆的序列可被复制。因此，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如线性或封闭的环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含确保自我复制的任何装置。或者，载体可以是这样的一种载体，当引入宿主细胞时，该载体被整合到基因组中，并与已经整合到其中的染色体一起复制。载体系统可包含单个载体或质粒、两个或更多个载体或质粒，它们都包含待引入宿主细胞基因组的总DNA或转座子。载体的选择通常将取决于载体与(将载体引入其中的)宿
主细胞的相容性。载体还可包含选择标记物，例如抗生素耐受性基因，其可用于选择合适的转化体。此类耐受性基因的实例是本领域技术人员众所周知的。
组整合，使得克隆的序列可被复制。因此，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如线性或封闭的环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含确保自我复制的任何装置。或者，载体可以是这样的一种载体，当引入宿主细胞时，该载体被整合到基因组中，并与已经整合到其中的染色体一起复制。载体系统可包含单个载体或质粒、两个或更多个载体或质粒，它们都包含待引入宿主细胞基因组的总DNA或转座子。载体的选择通常将取决于载体与(将载体引入其中的)宿
主细胞的相容性。载体还可包含选择标记物，例如抗生素耐受性基因，其可用于选择合适的转化体。此类耐受性基因的实例是本领域技术人员众所周知的。
[0162] 除非另外特别说明，否则本文所述的每个实施方案均加上必要的变更而应用于每个实施方案。
[0163] 2.缩略语
[0164] 在整个申请中使用以下缩写：
[0165]aa＝ 氨基酸
CDR＝ 互补决定区
CTLA4 细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4
Fc＝ 恒定区
FR＝ 构架
h＝ 小时
ICM＝ 免疫检查点分子
Ig＝ 免疫球蛋白
MAb＝ 单克隆抗体
PD-1＝ 程序性死亡1
PD-L1＝ 程序性死亡配体1
RANKL＝ NF-κB配体的受体激活剂
s＝ 秒
VH＝ 重链可变结构域
VL＝ 轻链可变结构域
CDR＝ 互补决定区
CTLA4 细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4
Fc＝ 恒定区
FR＝ 构架
h＝ 小时
ICM＝ 免疫检查点分子
Ig＝ 免疫球蛋白
MAb＝ 单克隆抗体
PD-1＝ 程序性死亡1
PD-L1＝ 程序性死亡配体1
RANKL＝ NF-κB配体的受体激活剂
s＝ 秒
VH＝ 重链可变结构域
VL＝ 轻链可变结构域
[0166] 3.治疗组合
[0167] 本发明提供了治疗组合，其尤其可用于刺激或增强受试者对癌症的免疫反应。这些组合物通常使用(1)NF-κB(RANK)配体的受体激活剂(RANKL)的拮抗剂，和(2)至少一种免疫检查点分子(ICM)拮抗剂。该组合物利用了新鉴定的这两个通路之间协同作用的优点，导致肿瘤或癌症部位的CD8+T细胞的定位增加。有利地，协同组合物适当地刺激效应细胞功能的增强，包括例如增强的效应T细胞功能，包括Th1型细胞因子(例如IFN-γ和/或IL-2)的产生和多功能T细胞的比例增加。
[0168] 在一些优选的实施方案中，本发明的拮抗剂(即，RANKL拮抗剂和ICM拮抗剂)是抗原结合分子。合适的抗原结合分子可以选自抗体及其抗原结合片段，包括重组抗体、单克隆抗体(MAb)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体以及此类抗体的抗原结合片段。
[0169] 为了在人中应用，通常希望降低最初衍生自其他物种(例如小鼠)的抗体的免疫原性。这可以通过构建嵌合抗体或通过称为“人源化”的方法来实现。在此上下文中，“嵌合抗体”应理解为包含衍生自一个物种(例如，小鼠)的结构域 (例如，可变结构域)与衍生自不同物种(例如，人)的结构域(例如，恒定结构域)融合的抗体。
[0170] “人源化抗体”是指包含来自非人(例如鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。此类抗体是嵌合抗体，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体将包含基本上全部至少一个、通常是两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，全部或基本上全部的框架 (FR)区是人免疫球蛋白序列的那些框
架区。人源化抗体还任选包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白
的恒定区(参见Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人Nature 332：323-
329(1988)；和Presta, Curr Op Struct Biol 2：593-596(1992))。可以基本上按照Winter等人(参见Jones 等人，同上；Riechmann等人，同上)和Verhoeyen等人，Science 239：1534-
1536 (1988))的方法进行人源化，用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列。此
外，已经开发了基于衍生自人类基因组的序列产生抗体的技术，例如通过噬菌体展示或使
用转基因动物来(参见，国际专利公开号WO 90/05144；Marks 等人，(1991)By-passing
immunisation.Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage,J Mol
Biol,222,581-597；Knappik等人，J Mol Biol 296：57-86, 2000；Carmen和Jermutus,
Concepts in antibody phage display,Briefings in Functional Genomics and
Proteomics 2002 1(2)：189-203；Lonberg和Huszar,Human antibodies from transgenic mice.Int Rev Immunol 1995；13(1)：65-93；Bruggemann和Taussig, Production of
human antibody repertoires in transgenic mice,Curr Opin Biotechnol 1997 8(4)：
455-8)。在本发明的上下文中，此类抗体是“人抗体”。
架区。人源化抗体还任选包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白
的恒定区(参见Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人Nature 332：323-
329(1988)；和Presta, Curr Op Struct Biol 2：593-596(1992))。可以基本上按照Winter等人(参见Jones 等人，同上；Riechmann等人，同上)和Verhoeyen等人，Science 239：1534-
1536 (1988))的方法进行人源化，用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列。此
外，已经开发了基于衍生自人类基因组的序列产生抗体的技术，例如通过噬菌体展示或使
用转基因动物来(参见，国际专利公开号WO 90/05144；Marks 等人，(1991)By-passing
immunisation.Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage,J Mol
Biol,222,581-597；Knappik等人，J Mol Biol 296：57-86, 2000；Carmen和Jermutus,
Concepts in antibody phage display,Briefings in Functional Genomics and
Proteomics 2002 1(2)：189-203；Lonberg和Huszar,Human antibodies from transgenic mice.Int Rev Immunol 1995；13(1)：65-93；Bruggemann和Taussig, Production of
human antibody repertoires in transgenic mice,Curr Opin Biotechnol 1997 8(4)：
455-8)。在本发明的上下文中，此类抗体是“人抗体”。
[0171] 本发明还考虑了合成的或重组的抗原结合分子，其产生包括在生物体中表达编码所需抗体结构的非天然DNA序列。在一些实施方案中，合成或重组的抗原结合分子是多特异性抗原结合分子，其代表性实例包括串联scFv(taFv或scFv2)、双抗体、dAb2/VHH2、旋钮入孔衍生物、SEED-IgG、异Fc-scFv、Fab-scFv、 scFv-Jun/Fos、Fab'-Jun/Fos、三抗体、DNL-F(ab)3、scFv3-CH1/CL、Fab-scFv2、 IgG-scFab、IgG-scFv、scFv-IgG、scFv2-Fc、F(ab’)2-scFv2、scDB-Fc、scDB-CH3、 Db-Fc、scFv2-H/L、DVD-Ig、tandAb、scFv-dhlx-scFv、dAb2-IgG、dAb-IgG、dAb-Fc-dAb 及其组合。在特定的实施方案中，合成的或重组的抗原结合分子选自IgG样抗体 (例如，triomab/quadroma，Trion Pharma/Fresenius Biotech；旋钮入孔，
Genentech； CrossMAb，Roche；静电匹配抗体，AMGEN；LUZ-Y，Genentech；链交换工程化的结构域(SEED)主体，EMD Serono；biolonic，Merus；和Fab交换的抗体Genmab)、对称的IgG样抗体(例如，双重靶向(DT)-Ig，GSK/Domantis；二合一抗体， Genentech；交联的MAb，karmanos癌症中心；MAb2，F-star；以及Coy X-body， Coy X/Pfizer)、IgG融合体(例如，双可变结构域(DVD)-Ig，Abbott；IgG-样双特异性抗体，Eli Lilly；Ts2Ab，Medimmune/AZ；BsAb,
ZymoGenetics；HERCULES, Biogen Idec；TvAb,Roche)、Fc融合体(例如，ScFv/Fc融合体，Academic Institution； SCORPION，Emergent BioSolutions/Trubion，ZymoGenetics/
BMS；双亲和力再靶向技术(Fc-DART)，MacroGenics；双(ScFv)2-Fab，国家抗体医学研究中心)、 Fab融合体(例如，F(ab)2,Medarex/AMGEN；双作用或Bis-Fab,Genentech；对接和锁定(DNL)，ImmunoMedics；二价双特异性，Biotechnol；和Fab-Fv, UCB-Celltech)、基于ScFv和双抗体的抗体(例如，双特异性T细胞衔接子(BiTE)， Micromet；串联双抗体(Tandab)，
Affimed；DART，MacroGenics；单链双抗体，Academic；TCR样抗体，AIT，Receptor Logics；人血清白蛋白ScFv融合体， Merrimack；和COMBODIES，Epigen Biotech)、IgG/非IgG融合体(例如免疫细胞因子，EMDSerono，Philogen，ImmunGene，ImmunoMedics；超抗原融合蛋白， Active Biotech；以及针对癌症的免疫动员mTCR，IrmmTAC)和寡克隆抗体(例如Symphogen
和Merus)。
Genentech； CrossMAb，Roche；静电匹配抗体，AMGEN；LUZ-Y，Genentech；链交换工程化的结构域(SEED)主体，EMD Serono；biolonic，Merus；和Fab交换的抗体Genmab)、对称的IgG样抗体(例如，双重靶向(DT)-Ig，GSK/Domantis；二合一抗体， Genentech；交联的MAb，karmanos癌症中心；MAb2，F-star；以及Coy X-body， Coy X/Pfizer)、IgG融合体(例如，双可变结构域(DVD)-Ig，Abbott；IgG-样双特异性抗体，Eli Lilly；Ts2Ab，Medimmune/AZ；BsAb,
ZymoGenetics；HERCULES, Biogen Idec；TvAb,Roche)、Fc融合体(例如，ScFv/Fc融合体，Academic Institution； SCORPION，Emergent BioSolutions/Trubion，ZymoGenetics/
BMS；双亲和力再靶向技术(Fc-DART)，MacroGenics；双(ScFv)2-Fab，国家抗体医学研究中心)、 Fab融合体(例如，F(ab)2,Medarex/AMGEN；双作用或Bis-Fab,Genentech；对接和锁定(DNL)，ImmunoMedics；二价双特异性，Biotechnol；和Fab-Fv, UCB-Celltech)、基于ScFv和双抗体的抗体(例如，双特异性T细胞衔接子(BiTE)， Micromet；串联双抗体(Tandab)，
Affimed；DART，MacroGenics；单链双抗体，Academic；TCR样抗体，AIT，Receptor Logics；人血清白蛋白ScFv融合体， Merrimack；和COMBODIES，Epigen Biotech)、IgG/非IgG融合体(例如免疫细胞因子，EMDSerono，Philogen，ImmunGene，ImmunoMedics；超抗原融合蛋白， Active Biotech；以及针对癌症的免疫动员mTCR，IrmmTAC)和寡克隆抗体(例如Symphogen
和Merus)。
[0172] 多特异性抗原结合分子的其他非限制性实例包括Fab-串联免疫球蛋白 (FIT-Ig)(Gong等人，2017.MAbs.9(7)：1118-1128.doi： 10.1080/19420862.2017.1345401.Epub
2017 Jul 10.PubMedPMID：28692328； PubMed Central PMCID：PMC5627593)，并且能够结合两种或更多种抗原。在FIT-Ig 分子的设计中，来自亲本mAb的两个Fab结构域在交叉方向直接串联融合。当在哺乳动物细胞中共表达时，这三个片段组装形成四价多特异性FIT-Ig
分子。例如，可以使用两种亲本单克隆抗体mAb A(与抗原A结合)和mAb B(与抗原B结合)，将双特异性结合蛋白构建为FIT-Ig。在FIT-Ig分子的设计中，来自亲本mAb的两个Fab结构域
在交叉方向直接串联融合。当在哺乳动物细胞中共表达时，这三个片段组装形成四价多特
异性FIT-Ig分子。在代表性的实施方案中，FIT-Ig提供用于拮抗RANKL和至少一种ICM的多
特异性抗原结合分子。这些多特异性抗原结合分子通常包含以下、由以下组成或基本上由
以下组成：与RANKL或RANK特异性结合的构建为FIT-Ig分子的抗体或抗原结合片段，以及与各自的ICM特异性结合的抗体或抗原结合片段。在其中RANKL拮抗剂是直接RANKL拮抗剂的
一些实施方案中，多特异性抗原结合分子包含抗RANKL抗体或其抗原结合片段，其被并入
FIT-Ig分子中。在其中RANKL拮抗剂是间接RANKL拮抗剂的其他实施方案中，多特异性抗原
结合分子包含抗RANK抗体或其抗原结合片段，其将并入 FIT-Ig分子中。至少一种ICM合适
地选自PD-1、PD-L1或CTLA-4，并且并入FIT-Ig 分子中。在其中多特异性抗原结合分子拮抗PD-1的一些实施方案中，多特异性抗原结合分子包含抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在其
中多特异性抗原结合分子拮抗PD-L1的一些实施方案中，多特异性抗原结合分子包含抗PD-
L1抗体或其抗原结合片段。在其中多特异性抗原结合分子拮抗CTLA4的一些实施方案中，多特异性抗原结合分子包含抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。
2017 Jul 10.PubMedPMID：28692328； PubMed Central PMCID：PMC5627593)，并且能够结合两种或更多种抗原。在FIT-Ig 分子的设计中，来自亲本mAb的两个Fab结构域在交叉方向直接串联融合。当在哺乳动物细胞中共表达时，这三个片段组装形成四价多特异性FIT-Ig
分子。例如，可以使用两种亲本单克隆抗体mAb A(与抗原A结合)和mAb B(与抗原B结合)，将双特异性结合蛋白构建为FIT-Ig。在FIT-Ig分子的设计中，来自亲本mAb的两个Fab结构域
在交叉方向直接串联融合。当在哺乳动物细胞中共表达时，这三个片段组装形成四价多特
异性FIT-Ig分子。在代表性的实施方案中，FIT-Ig提供用于拮抗RANKL和至少一种ICM的多
特异性抗原结合分子。这些多特异性抗原结合分子通常包含以下、由以下组成或基本上由
以下组成：与RANKL或RANK特异性结合的构建为FIT-Ig分子的抗体或抗原结合片段，以及与各自的ICM特异性结合的抗体或抗原结合片段。在其中RANKL拮抗剂是直接RANKL拮抗剂的
一些实施方案中，多特异性抗原结合分子包含抗RANKL抗体或其抗原结合片段，其被并入
FIT-Ig分子中。在其中RANKL拮抗剂是间接RANKL拮抗剂的其他实施方案中，多特异性抗原
结合分子包含抗RANK抗体或其抗原结合片段，其将并入 FIT-Ig分子中。至少一种ICM合适
地选自PD-1、PD-L1或CTLA-4，并且并入FIT-Ig 分子中。在其中多特异性抗原结合分子拮抗PD-1的一些实施方案中，多特异性抗原结合分子包含抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在其
中多特异性抗原结合分子拮抗PD-L1的一些实施方案中，多特异性抗原结合分子包含抗PD-
L1抗体或其抗原结合片段。在其中多特异性抗原结合分子拮抗CTLA4的一些实施方案中，多特异性抗原结合分子包含抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。
[0173] 抗体的可变区通常作为单链Fv(scFv)或Fab片段分离。在一些实施方案中，抗原结合分子包含两个或更多个scFv片段。ScFv片段由通过短的10-25个氨基酸的接头连接的VH
和VL结构域组成。分离后，scFv片段可以与本领域已知的任何柔性肽接头连接(例如，Ala-Ala-Ala、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser等的一个或多个重复序列)。可以以多种方式排列所得多
肽，串联scFv(taFv或scFv2)，其中针对taFv 的每个scFv，顺序为VH-VL或VL-VH(Kontermann，同上)。
和VL结构域组成。分离后，scFv片段可以与本领域已知的任何柔性肽接头连接(例如，Ala-Ala-Ala、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser等的一个或多个重复序列)。可以以多种方式排列所得多
肽，串联scFv(taFv或scFv2)，其中针对taFv 的每个scFv，顺序为VH-VL或VL-VH(Kontermann，同上)。
[0174] 在本发明中，抗体的特征在于对抗原的特异性结合活性(Ka)为至少约105 mol-1，106mol-1或更高，优选107mol-1或更高，更优选108mol-1或更高，最优选109 mol-1或更高。本领域普通技术人员容易确定抗体的结合亲和力，例如通过 Scatchard分析(参见，Scatchard,Ann.NY Acad.Sci.51：660-72,1949)。
[0175] 3.1 NF-κB受体激活剂(RANK)配体(RANKL)的拮抗剂
[0176] 适用于本发明的治疗剂中使用的RANKL拮抗剂包括能够拮抗RANKL(例如人RANKL)的任何分子。举例来说，RANKL拮抗剂可以是多肽、多核苷酸、抗原结合分子、碳水化合物或小分子。在一些优选的实施方案中，RANKL拮抗剂是抗RANKL抗原结合分子(例如，MAb或其抗原结合片段)。此类抗RANKL抗原结合分子特异性结合天然RANKL的区域或表位，例如具有以下氨基酸序列的天然人RANKL：
[0177]
[0178] 适当地，本发明的抗RANKL抗原结合分子通常结合RANKL的细胞外结构域的区域或表位(即，对应于SEQ ID NO：2所示的人RANKL序列的残基69至317)。在一些更具体的实施方案中，抗RANKL抗原结合分子适当地结合RANKL的受体结合结构域的区域(即，对应于SEQ ID NO：2所示的人RANKL序列的残基162 至317)。举例来说，抗RANKL抗原结合分子特异性结合氨基酸序列TEYLQLMVY (SEQ ID NO：1)的一个或多个氨基酸(即SEQ ID NO：2所示的天然人RANKL 序列的残基233至241)。
[0179] 在美国专利申请公开号2016/0333101和2012/0087923中描述了特异性结合人 RANKL的已知MAb的实例，其内容通过引用整体并入本文。
[0180] 适用于本发明的一种此类抗RANKL MAb是地诺单抗。因此，在一些实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含全长人IgG2 MAb地诺单抗或其抗原结合片段。在一些相同的实施
方案和其他实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含表1所列的CDR序列。
方案和其他实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含表1所列的CDR序列。
[0181] 表1
[0182]
[0183] 在这种类型的非限制性实例中，抗RANKL抗原结合分子包含地诺单抗的重链氨基酸序列，例如如下所示：
[0184]
[0185] 或其抗原结合片段，其说明性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0186]
[0187] 在这些实施例和其他实施例的一些中，抗RANKL抗原结合分子包含如下所示的地诺单抗的轻链氨基酸序列：
[0188]
[0189] 或其抗原结合片段，其说明性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成、或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0190]
[0191] 地诺单抗的重链和轻链全长序列分别在SEQ ID NO：7和8中列出：
[0192]其中所述IgG2信号肽以下划线
表示；和
表示；和
[0193]其中κ信号肽以下划线表示。
[0194] 可用于实施本发明的其他示例性抗RANKL抗原结合分子包括EP 1257648中公开的抗RANKL抗原结合分子，其内容通过引用整体并入本文。在代表性的实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含如表2所示的CDR序列。
[0195] 表2
[0196]
[0197] 在这些实施方案的一些中，抗RANKL抗原结合分子包含例如如下所示的重链氨基酸序列：
[0198]
[0199] 或其抗原结合片段，其说明性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成、或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0200]
[0201] 在这些实施方案和其他实施方案的一些中，抗RANKL抗原结合分子包含例如如下所示的轻链氨基酸序列：
[0202]
[0203] 或其抗原结合片段，其代表性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0204]
[0205] 在其他代表性的实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含如表3所示的CDR 序列。
[0206] 表3
[0207]
[0208] 在这些实施方案的一些中，抗RANKL抗原结合分子包含例如如下所示的重链氨基酸序列：
[0209]
[0210] 或其抗原结合片段，其说明性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0211]
[0212] 在这些实施方案和其他实施方案的一些中，抗RANKL抗原结合分子包含例如如下所示的轻链氨基酸序列：
[0213]
[0214] 或其抗原结合片段，其代表性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0215]
[0216] 在各种实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含可变轻链(VL)氨基酸序列和可变重链(VH)氨基酸序列，其中各VL链包含称为CDR1(VL)、CDR2 (VL)和CDR3(VL)的CDR氨基酸序列，其被框架氨基酸序列分开，
[0217] CDR1(VL)选自：RASQSISRYLN(SEQ ID NO：49)、RASQSVGSYLA (SEQ ID NO：50)、RASQSVSSSSLA(SEQ ID NO：51)和SGDALPKQY(SEQ ID NO：52)；
[0218] CDR2(VL)选自：GASSLQS(SEQ ID NO：53)、DATNRAT(SEQ ID NO： 54)、GASSRAT(SEQ ID NO：55)和EDSERPS(SEQ ID NO：56)；和
[0219] CDR3(VL)选自：QHTRA(SEQ ID NO：57)、QHRRT(SEQ ID NO：58)、 QQYGA(SEQ ID NO：59)和QSTDSSGTYVV(SEQ ID NO：60)，
[0220] 其中CDR1(VL)、CDR2(VL)和CDR3(VL)彼此独立地选择；和
[0221] 其中每个VH链包含称为CDR1(VH)、CDR2(VH)和CDR3(VH)的CDR 氨基酸序列，其被框架氨基酸序列分开，
[0222] CDR1(VH)选自：NYAIH(SEQ ID NO：61)、NYPMH(SEQ ID NO：62) 和DXAMH(SEQ ID NO：63)，
[0223] CDR2(VH)选自：WINAGNGNTKFSQKFQG(SEQ ID NO：64)、 VISYDGNNKYYADSVKG(SEQ ID NO：65)和GISMNSGRIGYADSVKO(SEQ ID NO：66)，
[0224] CDR3(VH)选自：DSSNMVRGIIIAYYFDY(SEQ ID NO：67)、GGGGFDY (SEQ ID NO：68)和GGSTSARYSSGWYY(SEQ ID NO：69)，
[0225] 其中CDR1(VH)、CDR2(VH)和CDR3(VH)彼此独立地选择。
[0226] 在特定的实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含VL和VH链，其中：
[0227] VL链包含具有序列RASQSISRYLN(SEQ ID NO：49)的CDR1、具有序列 GASSLQS(SEQ ID NO：53)的CDR2和具有序列QHTRA(SEQ ID NO：57) 的CDR3；和
[0228] VH链包括具有序列NYAIH(SEQ ID NO：61)的CDR1、具有序列 WINAGNGNTKFSQKFQG(SEQ ID NO：64)的CDR2和具有序列 DSSNMVRGIIIAYYFDY(SEQ ID NO：67)的CDR3，
[0229] 其中每条VL和VH链上的CDR1、CDR2和CDR3被框架氨基酸序列分开。
[0230] 在其他实施方案中，RANKL拮抗剂是间接RANKL拮抗剂，其与RANKL结合伴侣特异性结合。举例来说，RANKL拮抗剂抑制或消除RANK的功能活性。 RANK(也称为TNFRSF11A，NFKB受体激活剂和CD265)是肿瘤坏死因子受体 (TNFR)分子亚家族的成员。RANK在骨骼肌、胸
腺、肝、结肠、小肠、肾上腺、破骨细胞、乳腺上皮细胞、前列腺、血管细胞和胰腺中组成型表达。
腺、肝、结肠、小肠、肾上腺、破骨细胞、乳腺上皮细胞、前列腺、血管细胞和胰腺中组成型表达。
[0231] 在一些实施方案中，RANK拮抗剂包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列对应于与RANKL相互作用的RANK区，其代表性实例包括选自CDR2(即，残基44-85)和CRD3(即，残基86-123)的至少一个CRD。在这种类型的非限制性实例中，RANK拮抗剂包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由
以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列对应于RANK CRD3，其代表性实例包括YCWNSDCECCY
(SEQ ID NO：5)、YCWSQYLCY(SEQ ID NO：6)。
以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列对应于RANK CRD3，其代表性实例包括YCWNSDCECCY
(SEQ ID NO：5)、YCWSQYLCY(SEQ ID NO：6)。
[0232] 在其他实施方案中，RANK拮抗剂是抗RANK抗原结合分子(例如MAb或其抗原结合片段)，其特异性结合天然RANK的区域或表位，例如天然人RANK (UniProt登录号Q9Y6Q6)，其具有代表性的全长氨基酸序列：
[0233]
[0234] 本发明的抗RANK抗原结合分子通常结合RANK的细胞外结构域的区域(例如，对应于SEQ ID NO：8所示的人RANK序列的残基30至212)，其非限制性实例包括：
[0235](即，SEQ ID NO：8所示的天然RANK序列的残基330-
417)。在这种类型的一些实施方案中，抗RANK抗原结合分子选自 MAb 64C1385(Abcam)、N-
1H8和N-2B10、或其抗原结合分子，包括嵌合的和人源化的抗原结合分子。在其他实施方案中，抗RANK抗原结合分子与MAb 64C1385、N-1H8或N-2B10竞争结合RNAK。
417)。在这种类型的一些实施方案中，抗RANK抗原结合分子选自 MAb 64C1385(Abcam)、N-
1H8和N-2B10、或其抗原结合分子，包括嵌合的和人源化的抗原结合分子。在其他实施方案中，抗RANK抗原结合分子与MAb 64C1385、N-1H8或N-2B10竞争结合RNAK。
[0236] 在一些实施方案中，抗RANK抗原结合分子是短链Fv(scFv)抗原结合分子，例如由Newa等人(2014,同上)所公开的，或其抗原结合片段。这种类型的代表性抗原结合分子可以包含表4所示的CDR序列。
[0237] 表4
[0238]
[0239] 在更具体的实施方案中，抗RANK抗原结合分子包含重链氨基酸序列：
[0240]或
[0241] 或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0242]或
[0243] 在一些相同和其他实施方案中，抗RANK抗原结合分子可包含轻链氨基酸序列：
[0244]
[0245] 或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0246]
[0247] 3.2免疫检查点分子(ICM)拮抗剂
[0248] 可以考虑将可用于治疗的任何合适的ICM拮抗剂用于本发明的实践中。例如，合适的ICM拮抗剂包括多肽、多核苷酸、碳水化合物和小分子。在一些优选的实施方案中，ICM拮抗剂是抗原结合分子。
[0249] 被本发明的治疗组合拮抗的ICM包括任何一种或多种选自以下的抑制性 ICM：
[0250] PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、CD276、VTCN1、BTLA、 IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、CD155、DNAM-1、CD112、 CRTAM、OX40、OX40L、CD244、CD160、GITR、GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL、 4-1BB、CD27L、CD28、CD80、CD86、SIRP-1、CD47、CD48、CD244、CD40、 CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、TNFRS25和ICOLG。适当地，在其中治疗组合包含RANKL拮抗剂和单一ICM拮抗剂的实施方案中，ICM不是 CTLA-4。
[0251] 在一些优选的实施方案中，治疗组合中包括的ICM拮抗剂是PD-1拮抗剂。就这一点而言，“PD-1拮抗剂”包括阻断PD-L1(例如，癌细胞表面表达的PD-L1) 与免疫细胞(例如，T细胞、B细胞或NKT细胞)上表达的PD-1结合的任何化合物或生物分子。PD-1的替代名称或同义词包括PDCD1、PD1、CD279和SLEB2。人PD-1的代表性成熟氨基酸序列(UniProt登录号
Q15116)如下所示：
Q15116)如下所示：
[0252]
[0253] 结合人PD-1并因此在本发明中使用的MAb的实例描述于美国专利公开号 US2003/0039653、US2004/0213795、US2006/0110383、US2007/0065427、 US2007/0122378、US2012/
237522、和国际PCT公开号WO2004/072286、 WO2006/121168、WO2006/133396、WO2007/
005874、WO2008/083174、 WO2008/156712、WO2009/024531、WO2009/014708、WO2009/
114335、 WO2010/027828、WO2010/027423、WO2010/036959、WO2010/029435、 WO2010/
029434、WO2010/063011、WO2010/089411、WO2011/066342、 WO2011/110604、WO2011/110621和WO2012/145493(其全部内容通过引用并入本文)。可用于本发明目的的特异性MAb包括抗
PD-1 MAb纳武单抗、派姆单抗和匹立珠单抗，以及在国际专利公开号WO2008/156712中描述的人源化抗PD-1 抗体h409A11、h409A16和h409A17。
237522、和国际PCT公开号WO2004/072286、 WO2006/121168、WO2006/133396、WO2007/
005874、WO2008/083174、 WO2008/156712、WO2009/024531、WO2009/014708、WO2009/
114335、 WO2010/027828、WO2010/027423、WO2010/036959、WO2010/029435、 WO2010/
029434、WO2010/063011、WO2010/089411、WO2011/066342、 WO2011/110604、WO2011/110621和WO2012/145493(其全部内容通过引用并入本文)。可用于本发明目的的特异性MAb包括抗
PD-1 MAb纳武单抗、派姆单抗和匹立珠单抗，以及在国际专利公开号WO2008/156712中描述的人源化抗PD-1 抗体h409A11、h409A16和h409A17。
[0254] 本发明的抗PD-1抗原结合分子优选结合PD-1的细胞外结构域的区域。举例来说，抗PD-1抗原结合分子可以特异性结合人PD-1的细胞外结构域的区域，该区域包含氨基酸序
列SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR(SEQ ID NO：9)(即， SEQ ID NO：10所示的天然PD-1序列的残基62至86)和SGTYLCGAISLAPKAQIKE (SEQ ID NO：11)(即，SEQ ID NO：10所示的天然PD-1序列的残基118至136) 之一或二者。在另一个实例中，抗PD-1抗原结合分子结合人PD-1的
细胞外结构域的区域，该区域包含氨基酸序列 NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV(SEQ
ID NO：12)(即，对应于SEQ ID NO：10所示的天然人PD-1序列的残基66至97)。
列SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR(SEQ ID NO：9)(即， SEQ ID NO：10所示的天然PD-1序列的残基62至86)和SGTYLCGAISLAPKAQIKE (SEQ ID NO：11)(即，SEQ ID NO：10所示的天然PD-1序列的残基118至136) 之一或二者。在另一个实例中，抗PD-1抗原结合分子结合人PD-1的
细胞外结构域的区域，该区域包含氨基酸序列 NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV(SEQ
ID NO：12)(即，对应于SEQ ID NO：10所示的天然人PD-1序列的残基66至97)。
[0255] 在某些实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包含完全人源化的IgG4 MAb纳武单抗(如美国专利号8,008,449中详细描述的(称为“5C4”)，其通过引用整体并入本文)或其抗原结合片段。在这种类型的代表性实例中，抗PD-1抗原结合分子包含如表5所示的CDR序列。
[0256] 表5
[0257]
[0258] 在更具体的实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包含例如如下所示的纳武单抗的重链氨基酸序列：
[0259]
[0260] 或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成、或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0261]
[0262] 在一些相同和其他实施方案中，抗PD-1抗原结合分子可以包含例如如下所示的纳武单抗的轻链氨基酸序列：
[0263]
[0264] 或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0265]
[0266] 在替代实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包含人源化IgG4 MAb派姆单抗或其抗原结合片段。在这种类型的非限制性实例中，抗PD-1抗原结合分子包含如表 6所示的CDR序
列。
列。
[0267] 表6
[0268]
[0269] 在一些实施方案中，抗PD-1抗原结合分子与MAb派姆单抗竞争结合PD-1。
[0270] 在另外的实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包含例如如下所示的派姆单抗的重链氨基酸序列：
[0271]
[0272] 或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0273]
[0274] 类似地，抗PD-1抗原结合分子可以包括例如如下所示的派姆单抗的轻链氨基酸序列：
[0275]
[0276] 或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0277]
[0278] 在该类型的其他实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包含MAb匹立珠单抗或其抗原结合片段。在一些相关的实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包含如表7所示的CDR序列。
[0279] 表7
[0280]
[0281] 在更具体的实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包含如下所示的匹立珠单抗的重链氨基酸序列：
[0282]
[0283] 或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0284]
[0285] 在一些相同和其他实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包含如下所示的匹立珠单抗的轻链氨基酸序列：
[0286]
[0287] 或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0288]
[0289] 其他合适的MAb在国际专利公开号WO2015/026634中描述，其通过引用整体并入本文。这些包括MAb或其抗原结合片段，其包含：(a)具有氨基酸序列 RASKSVSTSGFSYLH(SEQ ID NO：112)、LASNLES(SEQ ID NO：113) 和QHSWELPLT(SEQ ID NO：114)的轻链CDR(分别为CDR1、CDR2和CDR3)；和具有氨基酸序列SYYLY(SEQ ID NO：115)、GVNPSNGGTNFSEKFKS(SEQ ID NO：116)和RDSNYDGGFDY(SEQ ID NO：117)的重链CDR(分别为CDR1、 CDR2和CDR3)；或(b)具有氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO： 118)、LASYLES(SEQ ID NO：119)和
QHSRDLPLT(SEQ ID NO：120)的轻链CDR(分别为CDR1、CDR2和CDR3)，和具有氨基酸序列
NYYMY(SEQ ID NO：121)、GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO：122)和RDYRFDMGFDY (SEQ ID
NO：123)的重链CDR(分别为CDR1、CDR2和CDR3)。
QHSRDLPLT(SEQ ID NO：120)的轻链CDR(分别为CDR1、CDR2和CDR3)，和具有氨基酸序列
NYYMY(SEQ ID NO：121)、GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO：122)和RDYRFDMGFDY (SEQ ID
NO：123)的重链CDR(分别为CDR1、CDR2和CDR3)。
[0290] 举例来说，此类MAb可包含(a)重链可变区，其包含：
[0291]或其变体或抗原结
合片段；和
合片段；和
[0292] 轻链可变区，其包含选自以下的氨基酸序列：
[0293]或
[0294]或其变体或抗原结合片
段。
段。
[0295] 在另外的示例性实施方案中，抗PD-1 MAb可以包含IgG1重链，其包含：
[0296]或其变体或抗原结合片段；
[0297] 和轻链，其包含以下任一项：
[0298]或其变体或抗原结合片段。
[0299] 在其他实施方案中，ICM拮抗剂是PD-L1拮抗剂。PD-L1的替代名称或同义词包括PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H。通常，PD-L1拮抗剂特异性结合人PD-L1的天然氨基酸序列(UniProt登录号Q9NZQ7)，如下所示：
[0300]
[0301] 合适地，PD-L1拮抗剂是抗PD-L1抗原结合分子。举例来说，适用于本发明的抗PD-L1抗原结合分子包括抗PD-L1 MAb杜鲁伐单抗(MEDI4736)、阿特朱单抗(Tecentriq)、BMS-
936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480、MPDL3280A和奥维单抗。这些和其他抗PD-L1抗体描述于国际公开号WO2007/005874和WO2010/077634，以及美国专利
号8,217,149和8,779,108，其全部内容通过引用并入本文。在国际PCT专利公开号WO2016/
007,235中描述了其他抗PD-L1 MAb，其全部内容也通过引用并入本文。
936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480、MPDL3280A和奥维单抗。这些和其他抗PD-L1抗体描述于国际公开号WO2007/005874和WO2010/077634，以及美国专利
号8,217,149和8,779,108，其全部内容通过引用并入本文。在国际PCT专利公开号WO2016/
007,235中描述了其他抗PD-L1 MAb，其全部内容也通过引用并入本文。
[0302] 抗PD-L1抗原结合分子适当地结合PD-L1的细胞外结构域的区域。举例说明，抗PD-L1抗原结合分子可以特异性结合人PD-L1的细胞外结构域的区域，该区域包含氨基酸序列
SKKQSDTHLEET(SEQ ID NO：13)(即，SEQ ID NO：14所示的天然PD-L1序列的残基279至290)。
在某些实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含完全人源化的IgG1 MAb杜鲁伐单抗(如国际
PCT公开号 WO2011/066389和美国专利公开号2013/034559中关于“MEDI4736”所描述，通过引用将其整体并入本文)或其抗原结合片段。在这种类型的代表性实施方案中，抗PD-L1抗
原结合分子包含如表8所示的CDR序列。
SKKQSDTHLEET(SEQ ID NO：13)(即，SEQ ID NO：14所示的天然PD-L1序列的残基279至290)。
在某些实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含完全人源化的IgG1 MAb杜鲁伐单抗(如国际
PCT公开号 WO2011/066389和美国专利公开号2013/034559中关于“MEDI4736”所描述，通过引用将其整体并入本文)或其抗原结合片段。在这种类型的代表性实施方案中，抗PD-L1抗
原结合分子包含如表8所示的CDR序列。
[0303] 表8
[0304]
[0305] 在更具体的实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含例如如下所示的杜鲁伐单抗的重链氨基酸序列：
[0306]
[0307] 或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0308]
[0309] 在一些相同和其他实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子可包含轻链氨基酸序列：
[0310]
[0311] 或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0312]
[0313] 或者，抗PD-L1抗原结合分子与MAb杜鲁伐单抗竞争结合PD-L1。
[0314] 在其他实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含完全人源化的IgG1 MAb阿特朱单抗(如美国专利号8,217148中所述，其全部内容通过引用并入本文)或其抗原结合片段。在
这种类型的代表性实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含如表9所示的CDR序列。
这种类型的代表性实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含如表9所示的CDR序列。
[0315] 表9
[0316]
[0317] 在更具体的实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含例如如下所示的阿特朱单抗的重链氨基酸序列：
[0318]
[0319] 或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0320]
[0321] 在一些相同和其他实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含例如如下提供的阿特朱单抗的轻链氨基酸序列：
[0322]
[0323] 或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0324]
[0325] 或者，抗PD-L1抗原结合分子与MAb阿特朱单抗竞争结合PD-L1。
[0326] 在其他实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含完全人源化的IgG1 MAb奥维单抗(如美国专利号8,217148中所述，其全部内容通过引用并入本文)或其抗原结合片段。在这
种类型的代表性实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含表10 中所示的CDR序列。
种类型的代表性实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含表10 中所示的CDR序列。
[0327] 表10
[0328]
[0329] 在特定的实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含例如如下提供的奥维单抗的重链氨基酸序列：
[0330]
[0331] 或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0332]
[0333] 在一些相同和其他实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含例如如下所示的奥维单抗的轻链氨基酸序列：
[0334]
[0335] 或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0336]
[0337] 或者，抗PD-L1抗原结合分子与MAb奥维单抗竞争结合PD-L1。
[0338] 在一些实施方案中，ICM拮抗剂是CTLA4的拮抗剂。CTLA4的备选名称或同义词包括ALPS5、CD、CD152、CELIAC3、CTLA-4、GRD4、GSE、IDDM 12。通常，CTLA4拮抗剂与例如如下所示的人CTLA4的成熟氨基酸序列(UniProt登录号P16410)特异性结合：
[0339]
[0340] 合适地，CTLA4拮抗剂是抗CTLA4抗原结合分子。举例来说，适用于本发明的抗CTLA4抗原结合分子包括抗CTLA4 MAb伊匹单抗(BMS-734016、 MDX-010、MDX-101)和曲美木单抗(ticilimumab，CP-675,206)。
[0341] 抗CTLA4抗原结合分子适当地结合CTLA4的细胞外结构域的区域。举例说明，抗CTLA4抗原结合分子可以特异性结合人CTLA4的细胞外结构域的区域，该区域包含氨基酸序
列YASPGKATEVRVTVLRQA(SEQ ID NO：15)(即，SEQ ID NO：16所示的天然CTLA4序列的残基26至42)、 DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD(SEQ ID NO：17)(即，SEQ ID NO：16 所示的天然CTLA4序列的残基43至65)和VELMYPPPYYLGIG(SEQ ID NO： 18)(即，SEQ ID NO：16所示的天然
CTLA4序列的残基96至109)中的任何一个或多个。替代地或另外，抗CTLA4抗原结合分子可
以特异性结合人CTLA4 的细胞外结构域的区域，该区域包含CTLA4成熟形式的以下残基中
的任何一个或多个，优选地全部：K1、A2、M3、E33、R35、Q41、S44、Q45、V46、E48、L91、 I93、K95、E97、M99、P102、P103、Y104、Y105、L106、I108、N110。
列YASPGKATEVRVTVLRQA(SEQ ID NO：15)(即，SEQ ID NO：16所示的天然CTLA4序列的残基26至42)、 DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD(SEQ ID NO：17)(即，SEQ ID NO：16 所示的天然CTLA4序列的残基43至65)和VELMYPPPYYLGIG(SEQ ID NO： 18)(即，SEQ ID NO：16所示的天然
CTLA4序列的残基96至109)中的任何一个或多个。替代地或另外，抗CTLA4抗原结合分子可
以特异性结合人CTLA4 的细胞外结构域的区域，该区域包含CTLA4成熟形式的以下残基中
的任何一个或多个，优选地全部：K1、A2、M3、E33、R35、Q41、S44、Q45、V46、E48、L91、 I93、K95、E97、M99、P102、P103、Y104、Y105、L106、I108、N110。
[0342] 在某些实施方案中，抗CTLA4抗原结合分子包含人IgG1 MAb伊匹单抗(例如，如国际公开WO2014/209804和美国专利公开号2015/0283234中所述，其全部内容通过引用并入
本文)或其抗原结合片段。在这种类型的代表性实施方案中，抗CTA4抗原结合分子包含如表
11所示的CDR序列。
本文)或其抗原结合片段。在这种类型的代表性实施方案中，抗CTA4抗原结合分子包含如表
11所示的CDR序列。
[0343] 表11
[0344]
[0345] 在更具体的实施方案中，抗CTLA4抗原结合分子包含例如如下所示的伊匹单抗的重链氨基酸序列：
[0346]
[0347] 或其抗原结合片段，其非限制性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0348]
[0349] 在一些相同和其他实施方案中，抗CTLA4抗原结合分子包含例如如下所示的伊匹单抗的轻链氨基酸序列：
[0350]
[0351] 或其抗原结合片段，其代表性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0352]
[0353] 抗CTAL4抗原结合分子包含人IgG2 MAb曲美木单抗(例如在美国专利公开号2009/0074787中描述，其全部内容通过引用并入本文)或其抗原结合片段。在这种类型的代表性
实施方案中，抗CTLA4抗原结合分子包含如表12所示的CDR 序列。
实施方案中，抗CTLA4抗原结合分子包含如表12所示的CDR 序列。
[0354] 表12
[0355]
[0356] 在更具体的实施方案中，抗CTLA4抗原结合分子包含例如如下所示的曲美木单抗的重链氨基酸序列：
[0357]
[0358] 或其抗原结合片段，其非限制性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0359]
[0360] 在一些相同和其他实施方案中，抗CTLA4抗原结合分子包含例如如下所示的曲美木单抗的轻链氨基酸序列：
[0361]
[0362] 或其抗原结合片段，其代表性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0363]
[0364] 在其他实施方案中，ICM拮抗剂是B7-H3拮抗剂。通常，本发明的B7-H3拮抗剂特异性结合例如如下所示的人B7-H3的天然氨基酸序列(UniProt登录号 Q5ZPR3)：
[0365]
[0366] 合适地，B7-H3拮抗剂是抗B7-H3抗原结合分子。举例来说，适用于本发明的抗B7-H3抗原结合分子是MAb依诺妥珠单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗B7-H3抗原
结合分子包含如表13所示的CDR序列。
结合分子包含如表13所示的CDR序列。
[0367] 表13
[0368]
[0369]
[0370] 在更具体的实施方案中，抗B7-H3抗原结合分子包含例如如下所示的依诺妥珠单抗的重链氨基酸序列：
[0371]
[0372] 或其抗原结合片段，其代表性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0373]
[0374] 在一些相同和其他实施方案中，抗B7-H3抗原结合分子包含例如如下所提供的依诺妥珠单抗的轻链氨基酸序列：
[0375]
[0376] 或其抗原结合片段，其代表性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0377]
[0378] 在一些替代实施方案中，抗B7-H3抗原结合分子与MAb依诺妥珠单抗竞争结合B7-H3。
[0379] 在其他实施方案中，ICM拮抗剂是IDO拮抗剂。人IDO的成熟氨基酸序列 (UniProt登录号P14902)例如如下所示：
[0380]
[0381] 任何IDO拮抗剂均适用于本发明的治疗剂。目前，三种小分子IDO抑制剂正处在临床应用开发中：GDC-0919(1-环己基-2-(5H-咪唑并(5,1-a)异吲哚-5-基) 乙醇)、吲哚莫德(1-甲基-D-色氨酸)和依帕克司他(1,2,5-恶二唑-3-羧酰亚胺， 4-((2-((氨基磺酰基)氨
基)乙基)氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N'-羟基-， (C(Z))-)。这些分子的各分子结构在下面提供。
基)乙基)氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N'-羟基-， (C(Z))-)。这些分子的各分子结构在下面提供。
[0382]
[0383] 在一些实施方案中，ICM拮抗剂是KIR拮抗剂。在这种类型的优选实施方案中，KIR拮抗剂阻断KIR2-DL-1、-2和-3与其配体之间的相互作用。人KIR的成熟氨基酸序列，即
KIR2-DL1(UniProt登录号P43626)例如如下提供：
KIR2-DL1(UniProt登录号P43626)例如如下提供：
[0384]
[0385] 适用于本发明的抗KIR抗原结合分子可以使用本领域众所周知的方法产生。或者，可以使用本领域公认的KIR抗原结合分子。例如，抗KIR抗原结合分子包括完全人源化的MAb利利弩马单抗或其抗原结合片段，例如如WO2014/066532 中所述，其全部内容通过引用整
体并入本文。合适地，抗KIR抗原结合分子包含如表14所示的CDR区。
体并入本文。合适地，抗KIR抗原结合分子包含如表14所示的CDR区。
[0386] 表14
[0387]
[0388] 在这种类型的代表性实施方案中，抗KIR抗原结合分子可以包含利利弩马单抗的重链可变结构域氨基酸序列，其例如如下所示：
[0389]
[0390] 或其抗原结合片段，其代表性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0391]
[0392] 在一些相同和其他实施方案中，抗KIR抗原结合分子可以包含利利弩马单抗的轻链可变结构域氨基酸序列，例如如下所示：
[0393]
[0394] 或其抗原结合片段，其代表性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0395]
[0396] 在替代实施方案中，ICM拮抗剂是LAG-3拮抗剂。LAG-3是一种503个氨基酸的I型跨膜蛋白，具有四个细胞外Ig样结构域。LAG-3在激活的T细胞、NK 细胞、B细胞和浆细胞样DC上表达。人LAG-3的代表性成熟氨基酸序列(UniProt 登录号P18627)如下所示：
[0397]
[0398] 在一些实施方案中，LAG-3拮抗剂是抗LAG-3抗原结合分子。举例说明，合适的抗LAG抗原结合分子是抗LAG3人源化MAb、BMS-986016。其他抗LAG-3 抗体描述于美国专利公
开号2011/0150892和国际PCT公开号WO2010/019570和 WO2014/008218，其每一个均通过引
用整体并入本文。
开号2011/0150892和国际PCT公开号WO2010/019570和 WO2014/008218，其每一个均通过引
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[0399] 在一些实施方案中，抗LAG-3抗原结合分子包含表15中列出的CDR序列。
[0400] 表15
[0401]
[0402] 抗LAG-3抗原结合分子适当地包含MAb BMS-986016或其抗原结合片段。更具体地，在一些实施方案中，抗LAG-3抗原结合分子具有BMS-986016的重链氨基酸序列，例如如下所示：
[0403]
[0404] 或其抗原结合片段，其代表性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0405]
[0406] 类似地，抗LAG-3抗原结合分子可包含如SEQ ID NO：45所示并在下文提供的BMS-986016的轻链氨基酸序列，其抗原结合片段：
[0407]
[0408] 或其抗原结合片段，其代表性实例包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：
[0409]
[0410] 4.多特异性抗原结合分子
[0411] 本发明提供了由具有不同特异性的抗原结合分子形成的多特异性抗原结合分子，其与RANKL或RANK以及至少一种ICM结合。在某些实施方案中，具有第一抗原结合特异性的
抗原结合分子可以功能性地与一个或多个其他分子实体(例如具有第二抗原结合特异性的
另一抗原结合分子)连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)，以产生双特异性抗原结合分子。可以在本发明的上下文中使用的特定示例性多特异性形式包括但
不限于单链双抗体 (scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚scDb(LD-scDb)、环状二聚scDb (CD-scDb)、双特异性T细胞衔接子(BiTE；串联di-scFv)、二硫键稳定的Fv 片段(Brinkmann等人，Proc Natl Acad Sci USA.1993；90：7538-7542)、串联三 scFv、三抗体、双特异性Fab2、二微型抗体、四抗体、scFv-Fc-scFv融合体、双抗体、DVD-Ig、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体，例如bsAb(连接至轻链C-末端的scFv)、BslAb(连接至轻链N-末端的scFv)、Bs2Ab(连接至重链N-末端的scFv)、Bs3Ab(连接至重链C-末端的scFv)、TslAb(连接至重链和轻链N-末端的scFv)、Ts2Ab(连接至重链C-末端的dsscFv)和旋钮入孔 (KiH)(通过KiH技术制备的双特异性IgG)SEED技术(SEED-IgG)和DuoBody (通过DuoBody技
术制备的双特异性IgG)、VH和VL结构域各自与KiH或 DuoBody的两条不同重链的一个C末端
融合，从而形成一个功能性Fv结构域。特别适用于本文使用的是单链双抗体(scDb)，特别是双特异性单体scDb。对于讨论和提出各种多特异性构建体的综述，参见，例如，Chan
Carter,Nature Reviews Immunology 10(2010)301-316；Klein等人，MAbs 4(2012)1-11；
Schubert等人，Antibodies 1(2012)2-18；Byrne等人，Trends in Biotechnology 31
(2013)621； Metz等人，Protein Engineering Design&Selection 25(2012)571-580)，以及其中引用的参考文献。
抗原结合分子可以功能性地与一个或多个其他分子实体(例如具有第二抗原结合特异性的
另一抗原结合分子)连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)，以产生双特异性抗原结合分子。可以在本发明的上下文中使用的特定示例性多特异性形式包括但
不限于单链双抗体 (scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚scDb(LD-scDb)、环状二聚scDb (CD-scDb)、双特异性T细胞衔接子(BiTE；串联di-scFv)、二硫键稳定的Fv 片段(Brinkmann等人，Proc Natl Acad Sci USA.1993；90：7538-7542)、串联三 scFv、三抗体、双特异性Fab2、二微型抗体、四抗体、scFv-Fc-scFv融合体、双抗体、DVD-Ig、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体，例如bsAb(连接至轻链C-末端的scFv)、BslAb(连接至轻链N-末端的scFv)、Bs2Ab(连接至重链N-末端的scFv)、Bs3Ab(连接至重链C-末端的scFv)、TslAb(连接至重链和轻链N-末端的scFv)、Ts2Ab(连接至重链C-末端的dsscFv)和旋钮入孔 (KiH)(通过KiH技术制备的双特异性IgG)SEED技术(SEED-IgG)和DuoBody (通过DuoBody技
术制备的双特异性IgG)、VH和VL结构域各自与KiH或 DuoBody的两条不同重链的一个C末端
融合，从而形成一个功能性Fv结构域。特别适用于本文使用的是单链双抗体(scDb)，特别是双特异性单体scDb。对于讨论和提出各种多特异性构建体的综述，参见，例如，Chan
Carter,Nature Reviews Immunology 10(2010)301-316；Klein等人，MAbs 4(2012)1-11；
Schubert等人，Antibodies 1(2012)2-18；Byrne等人，Trends in Biotechnology 31
(2013)621； Metz等人，Protein Engineering Design&Selection 25(2012)571-580)，以及其中引用的参考文献。
[0412] 在特定的实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其包含与RANK 或RANKL特异性结合的第一抗原结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)和与 ICM特异性结合
的第二抗原结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)。在具体的实施方案中，ICM不是CTLA-4。
双特异性抗原结合分子适当地包含上文和本文其他地方详细描述的任何抗原结合分子。
的第二抗原结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)。在具体的实施方案中，ICM不是CTLA-4。
双特异性抗原结合分子适当地包含上文和本文其他地方详细描述的任何抗原结合分子。
[0413] 举例来说，第一抗原结合分子可以与人RANKL的区域特异性结合，第二抗原结合分子可以与人PD-1的区域特异性结合，优选与人PD-1的细胞外结构域的区域特异性结合。
[0414] 这些实施方案的非限制性实例包括包含表1-3中任何一个所示的CDR序列的第一抗原结合分子。在这种类型的具体实例中，第一抗原结合分子可至少包含MAb 地诺单抗的
抗原结合片段。
抗原结合片段。
[0415] 适当地，与PD-1特异性结合的第二抗原结合分子包含表4-6中任一个所示的 CDR序列。在这种类型的具体实例中，第二抗原结合分子可至少包含选自纳武单抗、派姆单抗和匹立珠单抗的任何一种MAb的抗原结合片段。
[0416] 在其他实施方案中，第二抗原结合分子特异性结合人PD-L1的区域，优选特异性结合人PD-L1的细胞外结构域的区域。因此，在一些实施方案中，第二抗原结合分子特异性结合PD-L1的区域，并包含表5-9中任一所列的CDR序列。在这种类型的具体实例中，第二抗原结合分子可以至少包含选自杜鲁伐单抗、阿特朱单抗和奥维单抗的任何一种MAb的抗原结
合片段。
合片段。
[0417] 在其他实施方案中，第二抗原结合分子特异性结合人CTLA4的区域。因此，在一些实施方案中，第二抗原结合分子特异性结合人CTLA4并包含表10-11中任一所列的CDR序列。
在这种类型的具体实例中，第二抗原结合分子可以至少包含选自伊匹单抗和曲美木单抗的
任何一种MAb的抗原结合片段。
在这种类型的具体实例中，第二抗原结合分子可以至少包含选自伊匹单抗和曲美木单抗的
任何一种MAb的抗原结合片段。
[0418] 本发明还提供了多特异性构建体，其包含对RANKL或RANK具有特异性的 RANK拮抗剂抗原结合分子和对两种或多种ICM具有特异性的多个ICM拮抗剂抗原结合分子。在非限制
性实例中，多个ICM拮抗剂抗原结合分子对选自以下的ICM 组合具有特异性：(1)PD-1和PD-L1，(2)PD-1和CTLA4，(3)PD-L1和 CTLA4和(4)PD-1、PD-L1和CTLA4。多特异性构建体可以包含对特定ICM组合具有特异性的任何合适的抗体或抗原结合片段，包括本文公开的抗体或
抗原结合片段。
性实例中，多个ICM拮抗剂抗原结合分子对选自以下的ICM 组合具有特异性：(1)PD-1和PD-L1，(2)PD-1和CTLA4，(3)PD-L1和 CTLA4和(4)PD-1、PD-L1和CTLA4。多特异性构建体可以包含对特定ICM组合具有特异性的任何合适的抗体或抗原结合片段，包括本文公开的抗体或
抗原结合片段。
[0419] 本发明的多特异性抗原结合分子可以通过本领域众所周知的许多方法产生。合适的方法包括生物学方法(例如体细胞杂交)、遗传方法(例如在生物体中表达编码所需抗体
结构的非天然DNA序列)、化学方法(例如两种抗体的化学缀合) 或其组合(参见，
Kontermann R E(编辑),Bispecific Antibodies,Springer Heidelberg Dordrecht
London New York,1-28(2011))。
结构的非天然DNA序列)、化学方法(例如两种抗体的化学缀合) 或其组合(参见，
Kontermann R E(编辑),Bispecific Antibodies,Springer Heidelberg Dordrecht
London New York,1-28(2011))。
[0420] 4.1产生双特异性抗原结合分子的化学方法。
[0421] 化学缀合的双特异性抗原结合分子源自两种现有抗体或抗体片段的化学偶联，例如上文和本文其他地方所述的那些。典型的偶联包括交联两个不同的全长抗体，交联两个
不同的Fab'片段以产生双特异性F(ab’)2，以及交联F(ab’)2片段与不同的Fab'片段以产生双特异性F(ab’)3。对于化学缀合，可以使用氧化重结合策略。当前的方法包括使用同或异双功能交联剂(Id.)。
不同的Fab'片段以产生双特异性F(ab’)2，以及交联F(ab’)2片段与不同的Fab'片段以产生双特异性F(ab’)3。对于化学缀合，可以使用氧化重结合策略。当前的方法包括使用同或异双功能交联剂(Id.)。
[0422] 异双功能交联剂对例如抗体分子上的两个不同的反应基团具有反应性。异双功能交联剂的例子包括SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、 SATA(琥珀酰亚
胺基乙酰硫代乙酸酯)、SMCC(琥珀酰亚胺基反式4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸
酯)、EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、PEAS(N-(((2-吡啶基二硫代)乙基)-
4-叠氮基水杨酰胺)、ATFB-SE (4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸，琥珀酰亚胺酯)、二苯甲
酮-4-马来酰亚胺、二苯甲酮-4-异硫氰酸酯、4-苯甲酰基苯甲酸、琥珀酰亚胺酯、碘乙酰胺叠氮化物、碘乙酰胺炔烃、Click-iT马来酰亚胺DIBO炔烃、叠氮基(PEO)4丙酸、琥珀酰亚胺酯、炔烃、琥珀酰亚胺酯、Click_iT琥珀酰亚胺酯DIBO炔烃、磺基-SBED(磺基-N-羟基琥珀酰亚胺基-2-(6-(生物素氨基)-2-(对叠氮基苯甲酰胺基)-己酰氨基)乙基-1,3'-二硫代丙酸
酯)、光反应性氨基酸(例如L-光亮氨酸和L-光蛋氨酸)、 NHS-卤代乙酰交联剂(例如，磺基SIAB)、SIAB、SBAP、SIA、NHS-马来酰亚胺交联剂(例如，磺基-SMCC)、SM(PEG)n系列交联剂、SMCC、LC-SMCC、磺基-EMCS、EMCS、磺基-GMBS、GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、MBS、磺基-SMPB、SMPB、AMAS、BMPS、SMPH、PEG12-SPDP、PEG4-SPDP、磺基 -LC-SPDP、LC-SPDP、SMPT、DCC(N，N'-二环己基碳二亚胺)、EDC(1-乙基 -3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、NHS(N-羟基琥珀酰
亚胺)、磺基-NHS(N- 羟基琥珀酰亚胺)、BMPH、EMCH、KMUH、MPBH、PDPH和PMPI。
胺基乙酰硫代乙酸酯)、SMCC(琥珀酰亚胺基反式4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸
酯)、EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、PEAS(N-(((2-吡啶基二硫代)乙基)-
4-叠氮基水杨酰胺)、ATFB-SE (4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸，琥珀酰亚胺酯)、二苯甲
酮-4-马来酰亚胺、二苯甲酮-4-异硫氰酸酯、4-苯甲酰基苯甲酸、琥珀酰亚胺酯、碘乙酰胺叠氮化物、碘乙酰胺炔烃、Click-iT马来酰亚胺DIBO炔烃、叠氮基(PEO)4丙酸、琥珀酰亚胺酯、炔烃、琥珀酰亚胺酯、Click_iT琥珀酰亚胺酯DIBO炔烃、磺基-SBED(磺基-N-羟基琥珀酰亚胺基-2-(6-(生物素氨基)-2-(对叠氮基苯甲酰胺基)-己酰氨基)乙基-1,3'-二硫代丙酸
酯)、光反应性氨基酸(例如L-光亮氨酸和L-光蛋氨酸)、 NHS-卤代乙酰交联剂(例如，磺基SIAB)、SIAB、SBAP、SIA、NHS-马来酰亚胺交联剂(例如，磺基-SMCC)、SM(PEG)n系列交联剂、SMCC、LC-SMCC、磺基-EMCS、EMCS、磺基-GMBS、GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、MBS、磺基-SMPB、SMPB、AMAS、BMPS、SMPH、PEG12-SPDP、PEG4-SPDP、磺基 -LC-SPDP、LC-SPDP、SMPT、DCC(N，N'-二环己基碳二亚胺)、EDC(1-乙基 -3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、NHS(N-羟基琥珀酰
亚胺)、磺基-NHS(N- 羟基琥珀酰亚胺)、BMPH、EMCH、KMUH、MPBH、PDPH和PMPI。
[0423] 同双功能交联剂对分子例如抗体上的相同反应基团具有反应性。同双功能交联剂的例子包括DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、o-PDM(邻苯二甲基亚胺)、DMA(己二酸二甲酯)、DMP(庚二酸二甲酯)、DMS(次亚磺酸二甲酯)、 DTBP(二硫代双丙酰亚胺)、BS(PEG)5、BS(PEG)9、BS3、BSOCOES、DSG、 DSP、DSS、DST、DTSSP、EGS、磺基-EGS、TSAT、DFDNB、BM(PEG)n交联剂、BMB、BMDB、BMH、BMOE、DTME和TMEA。
[0424] 4.2产生双特异性抗原结合分子的生物学方法
[0425] 体细胞杂交是两种不同杂交瘤(产生特定抗体的B细胞与骨髓瘤细胞的融合) 细胞系的融合，产生能够产生两条不同的抗体重链(即，VHA和VHB)和轻链(即， VLA和VLB)的四价瘤(quadroma)(Kontermann，同上)。这些重链和轻链在细胞内随机组合，产生双特异性抗原结合分子(例如，VHA链组合VLA链，VHB 链组合VLB链)，以及一些非功能性(例如，两条VHA链组合两条VLB链)和单特异性(例如，两条VHA链组合两条VHA链)抗原结合分子。然后可以使用已经建立的方法(例如使用两个不同的亲和色谱柱)纯化双特异性抗原结合分子。
[0426] 与单特异性抗原结合分子相似，双特异性抗原结合分子也可以包含Fc区，其在抗原结合下游引起Fc介导的作用。可以通过例如，通过胃蛋白酶消化从双特异性抗体蛋白水
解切割Fc区，从而产生双特异性F(ab’)2分子而降低这些作用(Id.)。
解切割Fc区，从而产生双特异性F(ab’)2分子而降低这些作用(Id.)。
[0427] 4.3产生多特异性抗原结合分子的遗传方法
[0428] 多特异性抗原结合分子也可以通过本领域中已经建立的遗传方法来产生，例如，体外表达含有对应于所需抗体结构的DNA序列的质粒(参见，例如， Kontermann，同上)。
[0429] 4.4双抗体
[0430] 在一些实施方案中，多特异性抗原结合分子是双抗体。双抗体由来自例如结合RANKL和ICM的抗体的两条单独的多肽链组成，每条链带有两个可变结构域 (VHA-VLB和VHB-VLA或VLA-VHB和VLB-VHA)。通常，连接可变结构域的多肽接头是短的(即，约2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基)。短的多肽接头防止同一条链上的VH和VL结构域结合，因此促进了不同链上的VH和VL结构域结合。形成具有针对两种靶抗原的功能的异二聚体(例如，VHA-VLB与 VHB-VLA，或VLA-VHB与VLB-VHA)。但是，也可以形成同二聚体(例如，VHA-VLB 与VHA-VLB、VHB-VLA与VHB-VLA等)，导致产生非功能性分子。本领域已知几种防止同二聚化的策略，包括引入二硫键以共价连接两条多肽链，修饰多肽链以在一条链上包含大的氨基酸，而在另一链上
包含小的氨基酸(旋钮入孔结构，如上文和本文其他地方所讨论)，和在C-末端延伸部分添
加半胱氨酸残基。另一种策略是通过多肽接头序列将两条多肽链连接起来，产生单链双抗
体分子(scDb)，其呈现比taFv更紧密的结构。ScDb或双抗体也可以与IgG1 CH3结构域或Fc
区融合，产生双-双抗体。双-双抗体的例子包括但不限于，scDb-Fc、Db-Fc、scDb-CH3 和Db-CH3。另外，scDb可用于制备四价双特异性分子。通过将scDb的多肽接头序列从约15个氨基酸缩短至约5个氨基酸，得到二聚体单链双抗体分子，称为 TandAb(如Muller和Kontermann在Bispecific Antibodies Kontermann R E(编辑), Springer Heidelberg Dordrecht
London New York,83-100(2011)中描述的)。
包含小的氨基酸(旋钮入孔结构，如上文和本文其他地方所讨论)，和在C-末端延伸部分添
加半胱氨酸残基。另一种策略是通过多肽接头序列将两条多肽链连接起来，产生单链双抗
体分子(scDb)，其呈现比taFv更紧密的结构。ScDb或双抗体也可以与IgG1 CH3结构域或Fc
区融合，产生双-双抗体。双-双抗体的例子包括但不限于，scDb-Fc、Db-Fc、scDb-CH3 和Db-CH3。另外，scDb可用于制备四价双特异性分子。通过将scDb的多肽接头序列从约15个氨基酸缩短至约5个氨基酸，得到二聚体单链双抗体分子，称为 TandAb(如Muller和Kontermann在Bispecific Antibodies Kontermann R E(编辑), Springer Heidelberg Dordrecht
London New York,83-100(2011)中描述的)。
[0431] 4.5用于抗原结合分子生成的其他缀合技术
[0432] 根据本发明生成多特异性抗原结合分子的另一种合适的策略包括将异二聚体肽缀合或以其他方式连接至抗体分子(例如，scFv或Fab)的C-末端。
[0433] 该策略的非限制性例子是使用与jun-fos亮氨酸拉链连接的抗体片段(例如， scFv-Jun/Fos和Fab'-Jun/Fos)。
[0434] 生成双特异性抗原结合分子的另一种方法包括用生物素衍生具有不同抗原结合片段的两种抗体，然后通过链霉亲和素连接这两种抗体，然后纯化和分离所得双特异性抗
体。
体。
[0435] 根据本发明的双特异性抗原结合分子的其他类型包括对于每个抗原包含一个以上抗原结合位点的分子。例如，可以使另外的VH和VL结构域与现有抗体的VH和VL结构域的N-末端融合，从而有效地串联排列抗原结合位点。这些类型的抗体称为双可变结构域抗体
(DVD-Ig)(参见Tarcsa,E.等人在Bispecific Antibodies. Kontermann中，同上，第171-
185页)。产生针对一种抗原包含一个以上抗原结合位点的抗体的另一种方法是使scFv片段
融合至重链的N-末端或轻链的C-末端 (在下文中更详细地讨论)。
(DVD-Ig)(参见Tarcsa,E.等人在Bispecific Antibodies. Kontermann中，同上，第171-
185页)。产生针对一种抗原包含一个以上抗原结合位点的抗体的另一种方法是使scFv片段
融合至重链的N-末端或轻链的C-末端 (在下文中更详细地讨论)。
[0436] 多特异性抗原结合分子复合物或构建体的抗体或抗原结合片段独立地选自 IgM、IgG、IgD、IgA、IgE或其片段，其通过其重链恒定区的氨基酸序列彼此区分。这些Ig类别中的几个进一步分为亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1 和IgA2。对应于不同类别的抗体，重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。可以在所有五种抗体类别中找到的轻链恒定区(CL)选自κ(kappa)和λ(lambda)。保留抗原识别和结合能力的抗体片段，是Fab、Fab'、F(ab’)2和Fv片段。此外，第一和第二抗原结合片段直接或通过接头(例如多肽接头)连接。
[0437] 4.6使用IgG支架生成双特异性抗原结合分子。
[0438] 恒定的免疫球蛋白结构域可以适当地用于促进两条多肽链的异二聚化(例如 IgG样抗体)。用于产生双特异性抗体的该策略的非限制性实例包括将旋钮入孔结构引入两个
多肽中并利用天然存在的CL和CH1结构域进行异二聚化(参见 Kontermann,同上，第1-28页
(2011)Ridgway等人，Protein Eng.1996 Jul；9(7)： 617-21；Atwell等人，J Mol
Biol.1997 Jul 4；270(1)：26-35)。
多肽中并利用天然存在的CL和CH1结构域进行异二聚化(参见 Kontermann,同上，第1-28页
(2011)Ridgway等人，Protein Eng.1996 Jul；9(7)： 617-21；Atwell等人，J Mol
Biol.1997 Jul 4；270(1)：26-35)。
[0439] 可以将根据本发明的大多数重组抗原结合分子工程化为IgG样，这意味着它们还包括Fc结构域。与需要异源二聚化工程化的多肽链的双抗体相似，IgG样抗原结合分子也需要异源二聚化，以防止来自不同特异性的两种抗体的相似重链或重链和轻链之间的相互作
用(Jin,P.和Zhu,Z.于Bispecific Antibodies.Kontermann RE(编辑),Springer
Heidelberg Dordrecht London New York,第151-169页(2011))。
用(Jin,P.和Zhu,Z.于Bispecific Antibodies.Kontermann RE(编辑),Springer
Heidelberg Dordrecht London New York,第151-169页(2011))。
[0440] 通过将大的氨基酸(旋钮)引入所需异二聚体的一条链中并将小的氨基酸(孔) 引入所需异二聚体的另一条链中，旋钮入孔结构有助于多肽链的异二聚化。空间相互作用将
有利于旋钮与孔的相互作用，而不是旋钮与旋钮或孔与孔的相互作用。在双特异性IgG样抗体的情况下，可以通过将旋钮入孔(KiH)结构引入Fc区的 CH3结构域来防止类似的重链同
二聚化。类似地，可以通过在VH-VL界面处工程化KiH结构来促进对同一抗原具有特异性的
重链和轻链的相互作用。具体地，在 KiH方法中，将大的氨基酸侧链引入重链之一的CH3结构域中，该侧链匹配另一条重链的CH3结构域中适当设计的腔(参见，例如Ridgeway等人，
Protein Eng.9 (1996),617-621和Atwell等人，J.Mol.Biol.270(1997),677-681，其通过
引用并入本文)。因此，重链的异二聚体倾向于比任一同二聚体更稳定，并形成更大比例的表达多肽。另外，可以通过修饰双特异性抗体的一个Fab(Fab区)以“交换”轻链和重链之间的恒定区或恒定区和可变区，来诱导所需的轻链/重链配对的结合。因此，在修饰的Fab结构域中，重链将分别包含例如CL-VH或CL-VL结构域，而轻链将分别包含CH1-VL或CH1-VH结构域。
这防止了修饰链(即，修饰的轻链或重链)的重/轻链Fab部分与标准/未修饰臂的重/轻链
Fab部分的相互作用。通过解释的方式，包含CL结构域的修饰臂Fab结构域中的重链，不与未修饰的臂 /Fab结构域的轻链优先相互作用，所述轻链也包含CL结构域(防止“不当的”或不需要的重链/轻链配对)。防止“不适当的”轻/重链结合的这种技术被称为“CrossMAb”技术，当与KiH技术组合时，导致显著增强的所需双特异性分子的表达(参见例如Schaefer等人
Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(27)：11187-92；和美国专利公开号2010/0159587，其全部内容通过引用并入本文)。存在KiH结构的其他示例，上面讨论的示例不应解释为限
制性的。其他促进Fc区异二聚化的方法包括将电荷极性工程化至Fc结构域(参见
Gunasekaran等人，2010)和SEED 技术(SEED-IgG)(Davis等人，Protein Eng Des Sel.2010 Apr；23(4)：195-202, 2010)。
有利于旋钮与孔的相互作用，而不是旋钮与旋钮或孔与孔的相互作用。在双特异性IgG样抗体的情况下，可以通过将旋钮入孔(KiH)结构引入Fc区的 CH3结构域来防止类似的重链同
二聚化。类似地，可以通过在VH-VL界面处工程化KiH结构来促进对同一抗原具有特异性的
重链和轻链的相互作用。具体地，在 KiH方法中，将大的氨基酸侧链引入重链之一的CH3结构域中，该侧链匹配另一条重链的CH3结构域中适当设计的腔(参见，例如Ridgeway等人，
Protein Eng.9 (1996),617-621和Atwell等人，J.Mol.Biol.270(1997),677-681，其通过
引用并入本文)。因此，重链的异二聚体倾向于比任一同二聚体更稳定，并形成更大比例的表达多肽。另外，可以通过修饰双特异性抗体的一个Fab(Fab区)以“交换”轻链和重链之间的恒定区或恒定区和可变区，来诱导所需的轻链/重链配对的结合。因此，在修饰的Fab结构域中，重链将分别包含例如CL-VH或CL-VL结构域，而轻链将分别包含CH1-VL或CH1-VH结构域。
这防止了修饰链(即，修饰的轻链或重链)的重/轻链Fab部分与标准/未修饰臂的重/轻链
Fab部分的相互作用。通过解释的方式，包含CL结构域的修饰臂Fab结构域中的重链，不与未修饰的臂 /Fab结构域的轻链优先相互作用，所述轻链也包含CL结构域(防止“不当的”或不需要的重链/轻链配对)。防止“不适当的”轻/重链结合的这种技术被称为“CrossMAb”技术，当与KiH技术组合时，导致显著增强的所需双特异性分子的表达(参见例如Schaefer等人
Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(27)：11187-92；和美国专利公开号2010/0159587，其全部内容通过引用并入本文)。存在KiH结构的其他示例，上面讨论的示例不应解释为限
制性的。其他促进Fc区异二聚化的方法包括将电荷极性工程化至Fc结构域(参见
Gunasekaran等人，2010)和SEED 技术(SEED-IgG)(Davis等人，Protein Eng Des Sel.2010 Apr；23(4)：195-202, 2010)。
[0441] 在特定的实施方案中，多特异性抗原结合分子是CrossMAb，其衍生自独立的亲本抗体，其中基于KiH方法进行抗体结构域交换。通过使用结构域交换来克服轻链错配，并使用KIH方法异二聚化重链。对于结构域交换，可变结构域或恒定结构域在轻链和重链之间交换，以产生两个不对称的Fab臂，从而避免轻链错配，同时“交换”保持抗原结合亲和力。与天然抗体相比，CrossMAb显示出更高的稳定性。在不同区域中有几种不同的CrossMAb形式，例如Fab、VH-VL和CH1-CL交换。在优选的实施方案中，多特异性抗原结合分子基于CrossMAbCH1-CL形式，其交换双特异性抗体的CH1和CL区。
[0442] 另外的异二聚化的IgG样抗原结合分子包括但不限于：异Fc-scFv、Fab-scFv、 IgG-scFv和scFv-IgG。异Fc-scFv将两个不同的scFv连接至可异二聚化的Fc结构域，而Fab-scFv包含对一个表位特异的Fab结构域，其与对不同表位特异的scFv 连接。IgG-scFv和
scFv-IgG是Ig样抗体，其是具有分别与其C-末端和N-末端连接的scFv(参见，Kontermann R E(编辑),同上,第151-169页)。
scFv-IgG是Ig样抗体，其是具有分别与其C-末端和N-末端连接的scFv(参见，Kontermann R E(编辑),同上,第151-169页)。
[0443] 代表性的CrossMAb实施方案在本文的第5.4节中描述，其中通过替换该多肽 CH3结构域内至少一个接触残基，在第一IgG样多肽的界面中产生工程化的突起。特别地，要在第一多肽上替换的接触残基对应于位置366上的IgG残基(残基编号根据Fc晶体结构
(Deisenhofer,Biochem.20：2361(1981))，其中工程化的突起包括用编码输入残基(具有比原始残基更大的侧链体积)的核酸替换编码原始残基的核酸。具体而言，位置366上的苏氨
酸(T)残基突变为色氨酸(W)。在第二步骤中，通过替换多肽CH3结构域内至少一个接触残基在第二多肽的界面中产生工程化的腔，其中工程化的腔包括用编码输入残基(具有比原始
残基更小的侧链体积)的核酸替换编码原始残基的核酸。具体而言，要在第二多肽上替换的接触残基对应于位置407上的IgG残基。具体而言，位置407的酪氨酸(Y)残基突变为丙氨酸
(A)。可以在不同IgG亚型上工程化该步骤，所述IgG亚型选自 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。
(Deisenhofer,Biochem.20：2361(1981))，其中工程化的突起包括用编码输入残基(具有比原始残基更大的侧链体积)的核酸替换编码原始残基的核酸。具体而言，位置366上的苏氨
酸(T)残基突变为色氨酸(W)。在第二步骤中，通过替换多肽CH3结构域内至少一个接触残基在第二多肽的界面中产生工程化的腔，其中工程化的腔包括用编码输入残基(具有比原始
残基更小的侧链体积)的核酸替换编码原始残基的核酸。具体而言，要在第二多肽上替换的接触残基对应于位置407上的IgG残基。具体而言，位置407的酪氨酸(Y)残基突变为丙氨酸
(A)。可以在不同IgG亚型上工程化该步骤，所述IgG亚型选自 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。
[0444] 在CrossMAb技术的另一个说明性实例中，多特异性抗原结合分子可以基于双抗体平台/cFAE(GenMAb)，例如在WO2008119353和WO 2011131746中描述 (其各自通过引用整体
并入本文)，其中通过在两个不同的宿主细胞中单独表达组分抗体，然后纯化并在两个单特异性抗体之间通过受控的Fab臂交换组装成双特异性异二聚体抗体，产生双特异性抗体。通过在两个单特异性起始蛋白的CH3 区中引入不对称的匹配突变(例如，F405L和K409R，根据EU编号索引)，可以迫使类似于Fab-臂交换变得具有方向性，从而产生在还原条件下稳定的异二聚体对(例如描述于Labrijn等人，Proc Natl Acad Sci U S A 2013；110(13)：5145-
5150； Gramer等人MAbs 2013；5(6)：962–973；Labrijn等人Nature Protocols 2014； 9(10)：2450-63，在此全文引入作为参考)。实际上，可以从两个纯化的二价亲本抗体产生双特异性人IgG1 Ab，每个亲本抗体具有各自的单个互补突变：K409R 或F405L。可以在人
IgG1、IgG2、IgG3或IgG4骨架上进行相同的策略(Labrijn 2013，同上)。
并入本文)，其中通过在两个不同的宿主细胞中单独表达组分抗体，然后纯化并在两个单特异性抗体之间通过受控的Fab臂交换组装成双特异性异二聚体抗体，产生双特异性抗体。通过在两个单特异性起始蛋白的CH3 区中引入不对称的匹配突变(例如，F405L和K409R，根据EU编号索引)，可以迫使类似于Fab-臂交换变得具有方向性，从而产生在还原条件下稳定的异二聚体对(例如描述于Labrijn等人，Proc Natl Acad Sci U S A 2013；110(13)：5145-
5150； Gramer等人MAbs 2013；5(6)：962–973；Labrijn等人Nature Protocols 2014； 9(10)：2450-63，在此全文引入作为参考)。实际上，可以从两个纯化的二价亲本抗体产生双特异性人IgG1 Ab，每个亲本抗体具有各自的单个互补突变：K409R 或F405L。可以在人
IgG1、IgG2、IgG3或IgG4骨架上进行相同的策略(Labrijn 2013，同上)。
[0445] 4.7静电转向
[0446] 在其他实施方案中，多特异性抗原结合分子基于静电转向(Amgen，其中CH3 结构域的电荷互补性通过选定的突变而改变，从而通过静电转向作用导致抗体Fc 异二聚体形
成增强(Gunasekaran等人，J Biol Chem 2010；285(25)：19637-46； WO 2009089004 A1，其通过引用并入本文)。可以在人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 主链上进行相同的策略(WO
2009089004 A1)。接头
成增强(Gunasekaran等人，J Biol Chem 2010；285(25)：19637-46； WO 2009089004 A1，其通过引用并入本文)。可以在人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 主链上进行相同的策略(WO
2009089004 A1)。接头
[0447] 接头可用于共价连接不同的抗原结合分子以形成包含至少两个抗原结合分子的嵌合分子。抗原结合分子之间的连接可以提供空间关系，以允许各抗原结合分子与其相应
的同源表位结合。在本文中，各接头用于连接两个不同的功能性抗原结合分子。接头的类型包括但不限于化学接头和多肽接头。
的同源表位结合。在本文中，各接头用于连接两个不同的功能性抗原结合分子。接头的类型包括但不限于化学接头和多肽接头。
[0448] 接头可以是化学的，包括例如亚烷基链、聚乙二醇(PEG)链、聚琥珀酸酐、聚-L-谷氨酸、聚(乙烯亚胺)、寡糖、氨基酸链或任何其他合适的连接。在某些实施方案中，接头本身可以在生理条件下是稳定的，例如亚烷基链，或者所述接头可以在生理条件下，例如通过酶(例如，连接包含作为肽酶底物的肽序列)、或通过水解(例如，连接含有可水解的基团，例如酯或硫酯)是可切割的。所述接头可以是生物学上无活性的，例如PEG、聚乙醇酸或聚乳酸链，或者可以是生物学上有活性的，例如寡肽或多肽，当从部分上切割下来时，其结合受体、使酶失活等。接头可以通过任何合适的键或官能团(包括碳-碳键、酯、醚、酰胺、胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、磺酰胺等)连接至第一抗体和第二抗体或抗原结合片段。
[0449] 在某些实施方案中，接头代表至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10或更多)衍生或非衍生的氨基酸。在这种类型的说明性实例中，接头优选是非免疫原性的和柔性的，例如包含丝氨酸和甘氨酸序列或Ala-Ala-Ala重复序列的那些接头。取决于具体的构建体，接头可以是长的(例如，长度大于12个氨基酸) 或短的(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12氨基酸长度)。例如，为了制备单链双抗体，第一和第三接头的长度优选为约3至约12个氨基酸(更优选长度为约5个氨基酸)，第二接头优选长度大于12个氨基酸(更优选长度为约 15个氨基酸)。将接头长度减少到三个残基以下可以迫使单链抗体片段进入本发明，从而允许双特异性抗体根据需要变成二价、三价或四价。
[0450] 代表性的肽接头可以选自：(AAA)n、(SGGGG)n、(GGGGS)n、(GGGGG) n、(GGGKGGGG)n、(GGGNGGGG)n、(GGGCGGGG)n，其中n是1至10的整数，合适地1至5，更合适地1至3。
[0451] 5.多特异性抗原结合构建体
[0452] 本发明的一个方面涉及嵌合构建体，其包含多个具有不同特异性的抗原结合分子，这些抗原结合分子直接或通过接头融合或以其他方式缀合在一起。
[0453] 5.1抗RANKL-抗PD-1双抗体
[0454] 本发明考虑了多特异性构建体，其是双特异性的并且包含抗RANKL抗原结合分子和抗PD-1抗原结合分子，其代表性实例包括选自以下的序列、由选自以下的序列组成或基
本上由选自以下的序列组成：
本上由选自以下的序列组成：
[0455] a)
[0456] 其中：
[0457] 大写的常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变重链氨基酸序列，
[0458] 小写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb纳武单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0459] 大写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb纳武单抗的可变重链氨基酸序列，
[0460] 小写的常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0461] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0462] b)
[0463] 其中：
[0464] 大写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb纳武单抗的可变重链氨基酸序列，
[0465] 小写的常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0466] 大写的常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变重链氨基酸序列，
[0467] 小写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb纳武单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0468] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0469] c)
[0470] 其中：
[0471] 大写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变重链氨基酸序列，
[0472] 小写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb纳武单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0473] 大写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb纳武单抗的可变重链氨基酸序列，
[0474] 小写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变轻链氨基酸序列，
[0475] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0476] d)
[0477] 其中：
[0478] 大写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb纳武单抗的可变重链氨基酸序列，
[0479] 小写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变轻链氨基酸序列，
[0480] 大写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变重链氨基酸序列，
[0481] 小写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb纳武单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0482] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0483] e)
[0484] 其中：
[0485] 大写的常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变重链氨基酸序列，
[0486] 小写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb派姆单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0487] 大写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb派姆单抗的可变重链氨基酸序列，
[0488] 小写的常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0489] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0490] f)
[0491] 其中：
[0492] 大写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb派姆单抗的可变重链氨基酸序列，
[0493] 小写的常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0494] 大写的常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变重链氨基酸序列，
[0495] 小写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb派姆单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0496] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3，
[0497] g)
[0498] 其中：
[0499] 大写常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体的另一实施方案的可变重链氨基酸序列，
[0500] 小写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb派姆单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0501] 大写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb派姆单抗的可变重链氨基酸序列，
[0502] 小写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体的另一实施方案的可变轻链氨基酸序列，
[0503] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3，
[0504] h)
[0505] 其中：
[0506] 大写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb派姆单抗的可变重链氨基酸序列，
[0507] 小写常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体的另一个实施方案的可变轻链氨基酸序列，
[0508] 大写常规文字对应于EP 1257648中公开中的抗RANKL抗体的另一个实施方案的可变重链氨基酸序列，
[0509] 小写带下划线的文字对应于抗PD-1 MAb派姆单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0510] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0511] 5.2抗RANKL-抗PD-L1双抗体
[0512] 或者，双特异性构建体包含抗RANKL抗原结合分子和抗PD-L1抗原结合分子，其代表性实例包括选自以下的序列、由选自以下的序列组成或基本上由选自以下的序列组成：
[0513] a)
[0514] 其中：
[0515] 大写的常规文字对应于抗RANKL MAb 地诺单抗的可变重链氨基酸序列，
[0516] 小写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb 杜鲁伐单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0517] 大写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb 杜鲁伐单抗的可变重链氨基酸序列，
[0518] 小写常规文字对应于抗RANKL MAb 地诺单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0519] 每次出现的（SGGGG）n都是柔性接头，其中n=1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n=1，对于第二柔性接头的实例，n=3。
[0520] b)
[0521] 其中：
[0522] 大写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb 杜鲁伐单抗的可变重链氨基酸序列，
[0523] 小写的常规文字对应于抗RANKL MAb 地诺单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0524] 大写常规文字对应于抗RANKL MAb 地诺单抗的可变重链氨基酸序列，
[0525] 小写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb 杜鲁伐单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0526] 每次出现的（SGGGG）n都是柔性接头，其中n=1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n=1，对于第二柔性接头的实例，n=3。
[0527] c)
[0528] 其中：
[0529] 大写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变重链氨基酸序列，
[0530] 小写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb杜鲁伐单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0531] 大写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb杜鲁伐单抗的可变重链氨基酸序列，
[0532] 小写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变轻链氨基酸序列，
[0533] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0534] d)
[0535] 其中：
[0536] 大写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb杜鲁伐单抗的可变重链氨基酸序列，
[0537] 小写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变轻链氨基酸序列，
[0538] 大写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变重链氨基酸序列，
[0539] 小写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb杜鲁伐单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0540] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0541] e)
[0542] 其中：
[0543] 大写的常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变重链氨基酸序列，
[0544] 小写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb阿特朱单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0545] 大写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb阿特朱单抗的可变重链氨基酸序列，
[0546] 小写常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0547] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0548] f)
[0549] 其中：
[0550] 大写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb阿特朱单抗的可变重链氨基酸序列，
[0551] 小写常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0552] 大写常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变重链氨基酸序列，
[0553] 小写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb阿特朱单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0554] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0555] g)
[0556] 其中：
[0557] 大写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变重链氨基酸序列，
[0558] 小写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb阿特朱单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0559] 大写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb阿特朱单抗的可变重链氨基酸序列，
[0560] 小写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变轻链氨基酸序列，
[0561] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0562] h)
[0563] 其中：
[0564] 大写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb阿特朱单抗的可变重链氨基酸序列，
[0565] 小写常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体的另一个实施方案的可变轻链氨基酸序列，
[0566] 大写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体的另一个实施方案的可变重链氨基酸序列，
[0567] 小写带下划线的文字对应于抗PD-L1 MAb阿特朱单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0568] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0569] 5.3抗RANKL-抗CTLA4双抗体
[0570] 或者，双特异性构建体包含抗RANKL抗原结合分子和抗CTLA4抗原结合分子，其代表性实例包括选自以下的序列、由选自以下的序列组成或基本上由选自以下的序列组成：
[0571] a)
[0572] 其中：
[0573] 大写的常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变重链氨基酸序列，
[0574] 小写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb伊匹单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0575] 大写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb伊匹单抗的可变重链氨基酸序列，
[0576] 小写常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0577] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0578] b)
[0579] 其中：
[0580] 大写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb伊匹单抗的可变重链氨基酸序列，
[0581] 小写常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0582] 大写常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变重链氨基酸序列，
[0583] 小写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb伊匹单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0584] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0585] c)
[0586] 其中：
[0587] 大写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变重链氨基酸序列，
[0588] 小写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb伊匹单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0589] 大写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb伊匹单抗的可变重链氨基酸序列，
[0590] 小写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变轻链氨基酸序列，
[0591] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3，
[0592] d)
[0593] 其中：
[0594] 大写下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb伊匹单抗的可变重链氨基酸序列，
[0595] 小写的常规文字对应于EP 1257648中所公开的抗RANKL抗体的另一个实施方案的可变轻链氨基酸序列，
[0596] 大写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变重链氨基酸序列，
[0597] 小写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb伊匹单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0598] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0599] e)
[0600] 其中：
[0601] 大写的常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变重链氨基酸序列，
[0602] 小写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb曲美木单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0603] 大写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb曲美木单抗的可变重链氨基酸序列，
[0604] 小写常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0605] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3，
[0606] f)
[0607] 其中：
[0608] 大写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb曲美木单抗的可变重链氨基酸序列，
[0609] 小写的常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0610] 大写常规文字对应于抗RANKL MAb地诺单抗的可变重链氨基酸序列，
[0611] 小写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb曲美木单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0612] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0613] g)
[0614] 其中：
[0615] 大写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变重链氨基酸序列，
[0616] 小写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb曲美木单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0617] 大写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb曲美木单抗的可变重链氨基酸序列，
[0618] 小写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变轻链氨基酸序列，
[0619] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0620] h)
[0621] 其中：
[0622] 大写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb曲美木单抗的可变重链氨基酸序列，
[0623] 小写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变轻链氨基酸序列，
[0624] 大写的常规文字对应于EP 1257648中公开的抗RANKL抗体另一个实施方案的可变重链氨基酸序列，
[0625] 小写带下划线的文字对应于抗CTLA4 MAb曲美木单抗的可变轻链氨基酸序列，
[0626] 每次出现的(SGGGG)n都是柔性接头，其中n＝1、2、3或4，对于第一和第三柔性接头的实例，优选n＝1，对于第二柔性接头的实例，n＝3。
[0627] 5.4抗RANKL-抗PD-1 CrossMAb构建体
[0628] 本发明还考虑了CrossMAb多特异性抗原结合分子。在CrossMAb构建的第一步中，通过替换多肽的CH3结构域内的至少一个接触残基，在第一IgG样多肽的界面中产生工程化
的突起。具体地，在第一多肽上待替换的接触残基对应于位置 366的IgG残基(残基编号根
据Fc晶体结构(Deisenhofer，Biochem.20：2361 (1981))，并且其中工程化的突起包括用编码输入残基(具有比原始残基更大的侧链体积)的核酸替换编码原始残基的核酸。具体而
言，位置366上的苏氨酸 (T)残基突变为色氨酸(W)。在第二步骤中，通过替换在多肽的CH3结构域内的至少一个接触残基在第二多肽的界面中产生工程化的腔，其中工程化的腔包括
用编码输入残基(具有比原始残基更小的侧链体积)的核酸替换编码原始残基的核酸。具体
而言，在第二多肽上待替换的接触残基对应于位置407上的IgG残基。具体而言，位置407的酪氨酸(Y)残基突变为丙氨酸(A)。可以在不同IgG亚型上工程化该步骤，所述IgG亚型选自
IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。
的突起。具体地，在第一多肽上待替换的接触残基对应于位置 366的IgG残基(残基编号根
据Fc晶体结构(Deisenhofer，Biochem.20：2361 (1981))，并且其中工程化的突起包括用编码输入残基(具有比原始残基更大的侧链体积)的核酸替换编码原始残基的核酸。具体而
言，位置366上的苏氨酸 (T)残基突变为色氨酸(W)。在第二步骤中，通过替换在多肽的CH3结构域内的至少一个接触残基在第二多肽的界面中产生工程化的腔，其中工程化的腔包括
用编码输入残基(具有比原始残基更小的侧链体积)的核酸替换编码原始残基的核酸。具体
而言，在第二多肽上待替换的接触残基对应于位置407上的IgG残基。具体而言，位置407的酪氨酸(Y)残基突变为丙氨酸(A)。可以在不同IgG亚型上工程化该步骤，所述IgG亚型选自
IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。
[0629] 在随后的步骤中，为了促进区分异二聚体双特异性IgG中可能存在的两条轻链/重链之间的相互作用，可以通过修饰双特异性抗体的一个Fab(Fab区)以“交换”轻链和重链之间的恒定区或恒定区和可变区，来诱导所需的轻链/重链配对的结合(参见，例如Schaefer
等人，2011，同上)。因此，在修饰的Fab结构域中，重链将分别包含例如CL-VH或CL-VL结构域，而轻链将分别包含CH1-VL或CH1-VH结构域。这防止了修饰链(即，修饰的轻链或重链)的重/轻链Fab部分与标准/未修饰臂的重/轻链Fab部分的相互作用。通过解释的方式，包含CL结构
域的修饰臂 Fab结构域中的重链，不与未修饰的臂/Fab结构域的轻链优先相互作用，所述
轻链也包含CL结构域(防止“不当的”或不需要的重链/轻链配对)。防止“不适当的”轻/重链结合的这种技术被称为“CrossMAb”技术，当与KiH技术组合时，导致显著增强的所需双特异性分子的表达(参见例如Schaefer等人2011，同上)。
等人，2011，同上)。因此，在修饰的Fab结构域中，重链将分别包含例如CL-VH或CL-VL结构域，而轻链将分别包含CH1-VL或CH1-VH结构域。这防止了修饰链(即，修饰的轻链或重链)的重/轻链Fab部分与标准/未修饰臂的重/轻链Fab部分的相互作用。通过解释的方式，包含CL结构
域的修饰臂 Fab结构域中的重链，不与未修饰的臂/Fab结构域的轻链优先相互作用，所述
轻链也包含CL结构域(防止“不当的”或不需要的重链/轻链配对)。防止“不适当的”轻/重链结合的这种技术被称为“CrossMAb”技术，当与KiH技术组合时，导致显著增强的所需双特异性分子的表达(参见例如Schaefer等人2011，同上)。
[0630] 异二聚体双特异性IgG抗体的产生是通过以下实现：首先将编码双特异性IgG 的4条链的每个抗体基因克隆到哺乳动物表达载体中，以使得能够在哺乳动物细胞(例如
HEK293)中分泌表达。使用293fectin或类似技术，将每条抗体链cDNA 以等摩尔比一起转染到HEK293细胞中，收集含抗体的细胞培养上清液，并使用蛋白A琼脂糖从上清液中纯化抗
体。
HEK293)中分泌表达。使用293fectin或类似技术，将每条抗体链cDNA 以等摩尔比一起转染到HEK293细胞中，收集含抗体的细胞培养上清液，并使用蛋白A琼脂糖从上清液中纯化抗
体。
[0631] 在一些实施方案中，可以使用2个重链和2个轻链构建体构建由抗RANKL 抗原结合分子和抗PD-1抗原结合分子二者组成的双特异性异二聚体IgG，其中重链CH3结构域之一在
位置366(T366W)处改变，称为“旋钮”，另一条重链CH3结构域在位置407(Y407A)处改变，称为“孔”，以促进重链的KiH异二聚化。
位置366(T366W)处改变，称为“旋钮”，另一条重链CH3结构域在位置407(Y407A)处改变，称为“孔”，以促进重链的KiH异二聚化。
[0632] 5.4.1地诺单抗CrossMAb-CH1-CL交换的构建体
[0633] 说明性的地诺单抗CrossMAb可以包含衍生自IgG2的重链序列，并且可以通过修饰抗RANKL抗原结合分子的Fab结构域，使得Ig链之间的CH1和CL结构域交换，来诱导所需的轻链/重链配对。以下四个构建体用于此构建。
[0634] 构建体1
[0635] 地诺单抗CrossMAb CH1-CL huIgG2旋钮突变，重链
[0636]
[0637] 其中：
[0638] IgG2信号肽为带下划线的大写文字；
[0639] 地诺单抗VH为常规大写文字；
[0640] 地诺单抗CL结构域为粗体小写文字；
[0641] 铰链区为带下划线的小写文字；
[0642] 地诺单抗CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0643] T366W取代为粗体大写文字。
[0644] 构建体2
[0645] 地诺单抗CrossMAb CH1-CL轻链
[0646]
[0647] 其中：
[0648] Kappa信号肽为带下划线的大写文字；
[0649] 地诺单抗VL为常规大写文字；和
[0650] 地诺单抗CH1结构域为粗体小写文字。
[0651] 构建体3
[0652] 纳武单抗IgG2孔突变，重链
[0653]
[0654] 其中：
[0655] 纳武单抗VH为常规大写文字；
[0656] 纳武单抗CH1结构域为粗体小写文字；
[0657] HuIgG2铰链区为带下划线的小写文字；
[0658] HuIgG2CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0659] Y407A取代为粗体大写文字。
[0660] 构建体4
[0661] 纳武单抗轻链
[0662]
[0663] 5.4.2地诺单抗CrossMAb-VH-VL交换的构建体
[0664] 在地诺单抗CrossMAb的另一个实施方案中，可以通过修饰抗RANKL抗原结合分子的Fab结构域，使得Ig链之间的VH和VL结构域交换，来诱导所需的轻链 /重链配对。在一个实施方案中，其包含衍生自IgG2的重链序列，并且通过KiH改变促进重链异二聚化。以下四个构建体用于此构建。
[0665] 构建体1
[0666] 地诺单抗CrossMAb VH-VL hulgG2旋钮突变，重链
[0667]
[0668] 其中：
[0669] IgG2信号肽为带下划线的大写文字；
[0670] 地诺单抗VL为常规大写文字；
[0671] 地诺单抗CH1结构域为粗体小写文字；
[0672] 铰链区为带下划线的小写文字；
[0673] 地诺单抗CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0674] T366W取代为粗体大写文字。
[0675] 构建体2
[0676] 地诺单抗CrossMAb VH-VL轻链
[0677]
[0678] 其中：
[0679] Kappa信号肽为带下划线的大写文字；
[0680] 地诺单抗VH为常规大写文字；和
[0681] 地诺单抗CL结构域为粗体小写文字。
[0682] 构建体3
[0683] 纳武单抗IgG2孔突变，重链
[0684]
[0685] 其中：
[0686] 纳武单抗VH为常规大写文字；
[0687] 纳武单抗CH1结构域为粗体小写文字；
[0688] HuIgG2铰链区为带下划线的小写文字；
[0689] HuIgG2CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0690] Y407A取代为粗体大写文字。
[0691] 构建体4
[0692] 纳武单抗轻链
[0693]
[0694] 5.4.3地诺单抗CrossMAb-Fab-Fab交换的构建体
[0695] 在地诺单抗CrossMAb的另一个实施方案中，可以通过修饰抗RANKL抗原结合分子的Fab结构域，使在Ig链之间Fab结构域交换，来诱导所需的轻链/重链配对。在该实施方案中，其包含衍生自IgG2的重链序列，并且通过KIH改变促进重链异二聚化。以下四个构建体用于此构建。
[0696] 构建体1
[0697] 地诺单抗CrossMAb Fab hulgG2旋钮突变，重链
[0698]
[0699] 其中：
[0700] IgG2信号肽为带下划线的大写文字；
[0701] 地诺单抗VL为常规大写文字；
[0702] 地诺单抗CL结构域为粗体小写文字；
[0703] 铰链区为带下划线的小写文字；
[0704] 地诺单抗CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0705] T366W取代为粗体大写文字。
[0706] 构建体2
[0707] 地诺单抗CrossMAb Fab轻链
[0708]
[0709] 其中：
[0710] Kappa信号肽为带下划线的大写文字；
[0711] 地诺单抗VH为常规大写文字；和
[0712] 地诺单抗CH1结构域为粗体小写文字。
[0713] 构建体3
[0714] 纳武单抗IgG2孔突变，重链
[0715]
[0716] 其中：
[0717] 纳武单抗VH为常规大写文字；
[0718] 纳武单抗CH1结构域为粗体小写文字；
[0719] HuIgG2铰链区为带下划线的小写文字；
[0720] HuIgG2CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0721] Y407A取代为粗体大写文字。
[0722] 构建体4
[0723] 纳武单抗轻链
[0724]
[0725] 5.4.4地诺单抗CrossMAb-CH1-CL交换-IgG4CH的构建体
[0726] 在地诺单抗CrossMAb的另一个实施方案中，地诺单抗CrossMAb包含衍生自IgG4的重链序列。在该实施方案中，可以通过修饰抗RANKL抗原结合分子的 Fab结构域，使得Ig链之间的CH1和CL结构域交换，来诱导所需的轻链/重链配对。以下四个构建体用于此构建。
[0727] 构建体1
[0728] 地诺单抗CrossMAb CH1-CL huIgG4旋钮突变，重链
[0729]
[0730] 其中：
[0731] IgG2信号肽为用带下划线的大写文字；
[0732] 地诺单抗VH为常规大写文字；
[0733] 地诺单抗CL结构域为粗体小写文字；
[0734] IgG4铰链区为带下划线的小写文字；
[0735] IgG4 CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0736] T366W取代为粗体大写文字。
[0737] 构建体2
[0738] 地诺单抗CrossMAb CH1-CL轻链
[0739]
[0740] 其中：
[0741] Kappa信号肽为带下划线的大写文字；
[0742] 地诺单抗VL为常规大写文字；和
[0743] 地诺单抗CH1结构域为粗体小写文字。
[0744] 构建体3
[0745] 纳武单抗IgG4孔突变，重链
[0746]
[0747] 其中：
[0748] 纳武单抗VH为常规大写文字；
[0749] 纳武单抗CH1结构域为粗体小写文字；
[0750] IgG4铰链区为带下划线的小写文字；
[0751] IgG4 CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0752] Y407A取代为粗体大写文字。
[0753] 构建体4
[0754] 纳武单抗轻链
[0755]
[0756] 5.4.5地诺单抗CrossMAb-VH-VL交换-IgG4CH的构建体
[0757] 在地诺单抗CrossMAb的另一个实施方案中，可以通过修饰抗RANKL抗原结合分子的Fab结构域，使得Ig链之间的VH和VL结构域交换，来诱导所需的轻链/重链配对。在该实施方案中，其包含衍生自IgG4的重链序列，并且通过KiH改变促进重链异二聚化。以下四个构建体用于此构建。
[0758] 构建体1
[0759] 地诺单抗CrossMAb VH-VL huIgG4旋钮突变，重链
[0760]
[0761] 其中：
[0762] IgG2信号肽为带下划线的大写文字；
[0763] 地诺单抗VL为常规大写文字；
[0764] 地诺单抗CH1结构域为粗体小写文字；
[0765] IgG4铰链区为带下划线的小写文字；
[0766] IgG4 CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0767] T366W取代为粗体大写文字。
[0768] 构建体2
[0769] 地诺单抗CrossMAb VH-VL轻链
[0770]
[0771] 其中：
[0772] Kappa信号肽为带下划线的大写文字；
[0773] 地诺单抗VH为常规大写文字；和
[0774] 地诺单抗CL结构域为粗体小写文字。
[0775] 构建体3
[0776] 纳武单抗IgG4孔突变，重链
[0777]
[0778] 其中：
[0779] 纳武单抗VH为常规大写文字；
[0780] 纳武单抗CH1结构域为粗体小写文字；
[0781] IgG4铰链区为带下划线的小写文字；
[0782] IgG4 CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0783] Y407A取代为粗体大写文字。
[0784] 构建体4
[0785] 纳武单抗轻链
[0786]
[0787] 5.4.6地诺单抗CrossMAb-Fab-Fab交换-IgG4 CH的构建体
[0788] 在地诺单抗CrossMAb的另一个实施方案中，可以通过修饰抗RANKL抗原结合分子的Fab结构域，使得Ig链之间的Fab结构域交换，来诱导所需的轻链/ 重链配对。在该实施方案中，其包含衍生自IgG4的重链序列，并且通过KiH改变促进重链异二聚化。以下四个构建体用于此构建。
[0789] 构建体1
[0790] 地诺单抗CrossMAb Fab huIgG4旋钮突变，重链
[0791]
[0792] 其中：
[0793] IgG2信号肽为带下划线的大写文字；
[0794] 地诺单抗VL为常规大写文字；
[0795] 地诺单抗CL结构域为粗体小写文字；
[0796] IgG4铰链区为带下划线的小写文字；
[0797] IgG4 CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0798] T366W取代为粗体大写文字。
[0799] 构建体2
[0800] 地诺单抗CrossMAb Fab轻链
[0801]
[0802] 其中：
[0803] Kappa信号肽为带下划线的大写文字；
[0804] 地诺单抗VH为常规大写文字；和
[0805] 地诺单抗CH1结构域为粗体小写文字。
[0806] 构建体3
[0807] 纳武单抗IgG4孔突变，重链
[0808]
[0809] 其中：
[0810] 纳武单抗VH为常规大写文字；
[0811] 纳武单抗CH1结构域为粗体小写文字；
[0812] IgG4铰链区为带下划线的小写文字；
[0813] IgG4 CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0814] Y407A取代为粗体大写文字。
[0815] 构建体4
[0816] 纳武单抗轻链
[0817]
[0818] 5.4.7地诺单抗CrossMAb-CH1-CL交换-IgG1 CH的构建体
[0819] 地诺单抗CrossMAb的另一个实施方案包含衍生自IgG1的重链序列。在该实施方案中，可以通过修饰抗RANKL抗原结合分子的Fab结构域，使得Ig链之间的CH1和CL结构域交换，来诱导所需的轻链/重链配对。以下四个构建体用于此构建。
[0820] 构建体1
[0821] 地诺单抗CrossMAb CH1-CL huIgG1旋钮突变，重链
[0822]
[0823] 其中：
[0824] IgG2信号肽为带下划线的大写文字；
[0825] 地诺单抗VH为常规大写文字；
[0826] 地诺单抗CL结构域为粗体小写文字；
[0827] IgG1铰链区为带下划线的小写文字；
[0828] IgG1 CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0829] T366W取代为粗体大写文字。
[0830] 构建体2地诺单抗CrossMAb CH1-CL轻链
[0831]
[0832] 其中：
[0833] Kappa信号肽为带下划线的大写文字；
[0834] 地诺单抗VL为常规大写文字；和
[0835] 地诺单抗CH1结构域为粗体小写文字。
[0836] 构建体3
[0837] 纳武单抗IgG1孔突变，重链
[0838]
[0839] 其中：
[0840] 纳武单抗VH为常规大写文字；
[0841] 纳武单抗CH1结构域为粗体小写文字；
[0842] IgG1铰链区为带下划线的小写文字；
[0843] IgG1 CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0844] Y407A取代为粗体大写文字。
[0845] 构建体4
[0846] 纳武单抗轻链
[0847]
[0848] 5.4.8地诺单抗CrossMAb-VH-VL交换-IgG1CH的构建体
[0849] 在地诺单抗CrossMAb的另一个实施方案中，可以通过修饰抗RANKL抗原结合分子的Fab结构域，使得Ig链之间的VH和VL结构域交换，来诱导所需的轻链 /重链配对。在一个实施方案中，其包含衍生自IgG1的重链序列，并且通过KiH改变促进重链异二聚化。以下四个构建体用于此构建。
[0850] 构建体1
[0851] 地诺单抗CrossMAb VH-VL huIgG1旋钮突变，重链
[0852]
[0853]
[0854] 其中：
[0855] IgG2信号肽为带下划线的大写文字；
[0856] 地诺单抗VL为常规大写文字；
[0857] 地诺单抗CH1结构域为粗体小写文字；
[0858] IgG1铰链区为带下划线的小写文字；
[0859] IgG1 CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0860] T366W取代为粗体大写文字。
[0861] 构建体2
[0862] 地诺单抗CrossMAb VH-VL轻链
[0863]
[0864] 其中：
[0865] Kappa信号肽为带下划线的大写文字；
[0866] 地诺单抗VH为常规大写文字；和
[0867] 地诺单抗CL结构域为粗体小写文字。
[0868] 构建体3
[0869] 纳武单抗IgG1孔突变，重链
[0870]
[0871] 其中：
[0872] 纳武单抗VH为常规大写文字；
[0873] 纳武单抗CH1结构域为粗体小写文字；
[0874] IgG1铰链区为带下划线的小写文字；
[0875] IgG1 CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0876] Y407A取代为粗体大写文字。
[0877] 构建体4
[0878] 纳武单抗轻链
[0879]
[0880] 5.4.9地诺单抗CrossMAb-Fab-Fab交换-IgG1 CH的构建体
[0881] 在地诺单抗CrossMAb的另一个实施方案中，可以通过修饰抗RANKL抗原结合分子的Fab结构域，使得Ig链之间的Fab结构域交换，来诱导所需的轻链/ 重链配对。在一个实施方案中，其包含衍生自IgG1的重链序列，并且通过KiH改变促进重链异二聚化。以下四个构建体用于此构建。
[0882] 构建体1
[0883] 地诺单抗CrossMAb Fab huIgG1旋钮突变，重链
[0884]
[0885] 其中：
[0886] IgG2信号肽为带下划线的大写文字；
[0887] 地诺单抗VL为常规大写文字；
[0888] 地诺单抗CL结构域为粗体小写文字；
[0889] IgG1铰链区为带下划线的小写文字；
[0890] IgG1 CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0891] T366W取代为粗体大写文字。
[0892] 构建体2
[0893] 地诺单抗CrossMAb Fab轻链
[0894]
[0895] 其中：
[0896] Kappa信号肽为带下划线的大写文字；
[0897] 地诺单抗VH为常规大写文字；和
[0898] 地诺单抗CH1结构域为粗体小写文字。
[0899] 构建体3
[0900] 纳武单抗IgG1孔突变，重链
[0901]
[0902] 其中：
[0903] 纳武单抗VH为常规大写文字；
[0904] 纳武单抗CH1结构域为粗体小写文字；
[0905] IgG1铰链区为带下划线的小写文字；
[0906] IgG1 CH2-CH3结构域为常规小写文字；和
[0907] Y407A取代为粗体大写文字。
[0908] 构建体4
[0909] 纳武单抗轻链
[0910]
[0911] 在生产和纯化单特异性二价亲本抗体后，可以通过两个单特异性抗体之间受控的Fab-臂交换来组装双特异性异二聚体抗体，如所述(Labrijn等人Nature Protocols 2014；
9(10)：2450-63)。
9(10)：2450-63)。
[0912] 在各种实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含抗RANKL抗原结合分子的 Fab结构域，使得Ig链之间的Fab结构域交换，其包含SEQ ID NO：272(地诺单抗CrossMAb Fab
huIgG1旋钮突变，重链)和SEQ ID NO：273(地诺单抗 CrossMAb Fab轻链)。
huIgG1旋钮突变，重链)和SEQ ID NO：273(地诺单抗 CrossMAb Fab轻链)。
[0913] 在其他实施方案中，修饰抗RANKL抗原结合分子的Fab结构域，使得Ig链之间的VH和VL结构域交换，其包含SEQ ID NO：268(地诺单抗CrossMAb VH-VL huIgG1旋钮突变，重链)和SEQ ID NO：269(地诺单抗CrossMAb VH-VL轻链)。
[0914] 6.药物组合物
[0915] 本发明的药物组合物通常包含如上所述和本文其他地方所述的治疗组合或多特异性抗原结合分子，其与一种或多种药学上可接受的载体配制。任选地，药物组合物包含一种或多种其他化合物、药物、成分和/或材料。不管选择的施用途径如何，本发明的治疗组合或多特异性抗原结合分子通过本领域技术人员已知的常规方法被配制为药学上可接受的
剂型(参见，例如，Remington,The Science and Practice of Pharmacy(第21版,
Lippincott Williams and Wilkins,Philadelphia,Pa.)。
剂型(参见，例如，Remington,The Science and Practice of Pharmacy(第21版,
Lippincott Williams and Wilkins,Philadelphia,Pa.)。
[0916] 本发明的药物组合物可以以任何期望和有效的方式施用于受试者。例如，可以将药物组合物配制成用于口服摄取、或配制成软膏或滴剂用于局部施用于眼睛、或用于肠胃
外或用于任何适当方式的其他施用，例如腹膜内、皮下、局部、皮内、吸入、肺内、直肠、阴道、舌下、肌肉内、静脉内、心房内、鞘内或淋巴管内。此外，本发明的药物组合物可以与一种或多种辅助治疗联合施用，如下文详细描述。如果需要的话，本发明的药物组合物可以被包封或被保护免受胃或其他分泌物的侵害。
外或用于任何适当方式的其他施用，例如腹膜内、皮下、局部、皮内、吸入、肺内、直肠、阴道、舌下、肌肉内、静脉内、心房内、鞘内或淋巴管内。此外，本发明的药物组合物可以与一种或多种辅助治疗联合施用，如下文详细描述。如果需要的话，本发明的药物组合物可以被包封或被保护免受胃或其他分泌物的侵害。
[0917] 本发明的药物组合物可以包含与一种或多种药学上可接受的载体以及任选地一种或多种其他化合物、药物、成分和/或材料混合的一种或多种活性成分。不论选择的施用途径如何，都可以通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的双特异性抗体配制成药
学上可接受的剂型(参见例如Remington,The Science and Practice of Pharmacy(第21
版,Lippincott Williams and Wilkins,Philadelphia,Pa.))。
学上可接受的剂型(参见例如Remington,The Science and Practice of Pharmacy(第21
版,Lippincott Williams and Wilkins,Philadelphia,Pa.))。
[0918] 药学上可接受的载体是本领域众所周知的(参见例如Remington,The Science and Practice of Pharmacy(第21版,Lippincott Williams and Wilkins,Philadelphia,
Pa.)和The National Formulary(American Pharmaceutical Association,Washington,
D.C.))，其包括糖(例如乳糖、蔗糖、甘露醇和脱水山梨糖醇)、淀粉、纤维素制剂、磷酸钙(例如磷酸二钙、磷酸三钙和磷酸氢钙)、柠檬酸钠、水、水性溶液(例如盐水、氯化钠注射液、林格注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、乳酸林格注射液)、醇(例如乙醇、丙醇和苄醇)、多元醇(例如甘油、丙二醇和聚乙二醇)、有机酯(例如油酸乙酯和甘油三酸酯)、可生物降解聚合物(例如，聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐))、弹性体基质、脂质体、微球、油(例如，玉米、胚芽、橄榄、蓖麻、芝麻、棉籽、和花生)、可可脂、蜡(例如栓剂蜡)、石蜡、硅酮、滑石、硅酸盐等。在与制剂的其他成分相容并且对受试者无害的意义上讲，本发明的药物组合物中使用的每种药学上可接受的载体必须是“可接受的”。适用于所选剂型和预期施用途径的载体是本领域众所周知的，并且可以使用本领域的普通技术确定用于所选剂
型和施用方法的可接受载体。
Pa.)和The National Formulary(American Pharmaceutical Association,Washington,
D.C.))，其包括糖(例如乳糖、蔗糖、甘露醇和脱水山梨糖醇)、淀粉、纤维素制剂、磷酸钙(例如磷酸二钙、磷酸三钙和磷酸氢钙)、柠檬酸钠、水、水性溶液(例如盐水、氯化钠注射液、林格注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、乳酸林格注射液)、醇(例如乙醇、丙醇和苄醇)、多元醇(例如甘油、丙二醇和聚乙二醇)、有机酯(例如油酸乙酯和甘油三酸酯)、可生物降解聚合物(例如，聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐))、弹性体基质、脂质体、微球、油(例如，玉米、胚芽、橄榄、蓖麻、芝麻、棉籽、和花生)、可可脂、蜡(例如栓剂蜡)、石蜡、硅酮、滑石、硅酸盐等。在与制剂的其他成分相容并且对受试者无害的意义上讲，本发明的药物组合物中使用的每种药学上可接受的载体必须是“可接受的”。适用于所选剂型和预期施用途径的载体是本领域众所周知的，并且可以使用本领域的普通技术确定用于所选剂
型和施用方法的可接受载体。
[0919] 本发明的药物组合物任选地包含药物组合物中常用的其他成分和/或材料，包括治疗性抗原结合分子制剂。这些成分和材料在本领域中是众所周知的，包括(1) 填充剂或
增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和阿拉伯胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、淀粉羟乙酸钠、交联的羧甲基纤维素钠和碳酸钠；(5)缓溶剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土；(9) 润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇和月桂基硫酸钠；(10) 悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶；
(11)缓冲剂；(12)赋形剂，例如乳糖、乳中的糖、聚乙二醇、动植物脂肪、油、蜡、石蜡、可可脂、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石、水杨酸盐、氧化锌、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉；(13)惰性稀释剂，例如水或其他溶剂；(14)防腐剂；(15)表面活性剂；(16)分散剂；(17)控释或吸收延迟剂，例如羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、可生物降解的聚合物、脂质体、微球、单硬脂酸铝、明胶和蜡；(18)乳浊剂；(19)佐剂；(20)润湿剂；(21)乳化悬浮剂； (22)增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯；(23)推进剂，例如氯氟烃和挥发性未取代的烃，例如丁烷和丙烷；(24) 抗氧化剂；(25)使制剂与预期接受者的血液等渗的试剂，例如糖和氯化钠；(26) 增稠剂；(27)包衣材料，例如卵磷脂；和(28)甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。每种这样的成分或材料在与制剂的其他成分相容并且对受试者无害的意义上必须是“可接受的”。适用于所选剂型和预期施用途径的成分和材料是本领域众所周知的，并且可以使用本领域的普通技术确定用于所选剂型和施用方法
的可接受的成分和材料。
增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和阿拉伯胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、淀粉羟乙酸钠、交联的羧甲基纤维素钠和碳酸钠；(5)缓溶剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土；(9) 润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇和月桂基硫酸钠；(10) 悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶；
(11)缓冲剂；(12)赋形剂，例如乳糖、乳中的糖、聚乙二醇、动植物脂肪、油、蜡、石蜡、可可脂、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石、水杨酸盐、氧化锌、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉；(13)惰性稀释剂，例如水或其他溶剂；(14)防腐剂；(15)表面活性剂；(16)分散剂；(17)控释或吸收延迟剂，例如羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、可生物降解的聚合物、脂质体、微球、单硬脂酸铝、明胶和蜡；(18)乳浊剂；(19)佐剂；(20)润湿剂；(21)乳化悬浮剂； (22)增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯；(23)推进剂，例如氯氟烃和挥发性未取代的烃，例如丁烷和丙烷；(24) 抗氧化剂；(25)使制剂与预期接受者的血液等渗的试剂，例如糖和氯化钠；(26) 增稠剂；(27)包衣材料，例如卵磷脂；和(28)甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。每种这样的成分或材料在与制剂的其他成分相容并且对受试者无害的意义上必须是“可接受的”。适用于所选剂型和预期施用途径的成分和材料是本领域众所周知的，并且可以使用本领域的普通技术确定用于所选剂型和施用方法
的可接受的成分和材料。
[0920] 适用于口服施用的本发明药物组合物可以是胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、粉剂、颗粒剂、在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、水包油或油包水的液体乳剂、酏剂或糖浆剂、锭剂、大丸剂、药糖剂或糊剂的形式。这些制剂可以通过本领域已知的方法制备，例如通过常规的锅包衣、混合、制粒或冻干方法制备。
[0921] 可以例如通过将活性成分与一种或多种药学上可接受的载体以及任选地一种或多种填充剂、增量剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、缓溶剂、吸收促进剂、润湿剂、吸收剂、润滑剂和/或着色剂混合来制备用于口服施用的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣剂、粉剂、颗粒剂等)。可以使用合适的赋形剂将相似类型的固体组合物用作软和硬的填充明胶胶囊中的
填充剂。片剂可以通过压制或模制制成，任选地与一种或多种附属成分一起制成。可以使用合适的粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂、表面活性剂或分散剂来制备压制的片剂。可以通过在合适的机器中模制来制备模制的片剂。片剂和其他固体剂型，例如糖衣剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂，可以任选地刻痕或用包衣和衣壳(例如肠溶性包衣和药物配制领域中众所周知的其他包衣)制备。它们也可以被配制为提供其中的活性成分缓慢或受控释放。
它们可以通过例如通过细菌截留过滤器进行过滤来灭菌。这些组合物还可以任选地包含乳
浊剂，并且其可以是这样的组合物，即，其仅仅或优选地在胃肠道的特定部分中释放活性成分，任选地以延迟的方式释放。活性成分也可以是微胶囊的形式。
填充剂。片剂可以通过压制或模制制成，任选地与一种或多种附属成分一起制成。可以使用合适的粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂、表面活性剂或分散剂来制备压制的片剂。可以通过在合适的机器中模制来制备模制的片剂。片剂和其他固体剂型，例如糖衣剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂，可以任选地刻痕或用包衣和衣壳(例如肠溶性包衣和药物配制领域中众所周知的其他包衣)制备。它们也可以被配制为提供其中的活性成分缓慢或受控释放。
它们可以通过例如通过细菌截留过滤器进行过滤来灭菌。这些组合物还可以任选地包含乳
浊剂，并且其可以是这样的组合物，即，其仅仅或优选地在胃肠道的特定部分中释放活性成分，任选地以延迟的方式释放。活性成分也可以是微胶囊的形式。
[0922] 本发明用于直肠或阴道施用的药物组合物可以栓剂形式存在，其可以通过将一种或多种活性成分与一种或多种在室温下为固体但在体温下为液体的合适的非刺激性载体
混合而制备，因此会在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。适用于阴道施用的本发明
药物组合物还包括阴道栓、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂，其含有本领域已知的合适的药学上可接受的载体。
混合而制备，因此会在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。适用于阴道施用的本发明
药物组合物还包括阴道栓、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂，其含有本领域已知的合适的药学上可接受的载体。
[0923] 用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。液体剂型可包含本领域通常使用的合适的惰性稀释剂。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包含佐剂，例如润湿剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。悬浮液可能含有悬浮剂。
[0924] 适用于肠胃外施用的本发明药物组合物包含一种或多种试剂/化合物/抗原结合分子，组合一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳
液，或无菌粉剂(其可以在使用前即时重构为无菌注射液或分散液)，其中可含有合适的抗
氧化剂、缓冲剂、溶质(使制剂与预期接受者的血液等渗)、或悬浮剂或增稠剂。可以例如通过使用包衣材料、在分散液的情况下通过维持所需的粒径、以及通过使用表面活性剂来维
持适当的流动性。这些组合物也可以含有合适的佐剂，例如润湿剂、乳化剂和分散剂。也可能需要包括等渗剂。此外，通过包含延迟吸收的试剂可以实现延长的可注射药物形式的吸
收。
液，或无菌粉剂(其可以在使用前即时重构为无菌注射液或分散液)，其中可含有合适的抗
氧化剂、缓冲剂、溶质(使制剂与预期接受者的血液等渗)、或悬浮剂或增稠剂。可以例如通过使用包衣材料、在分散液的情况下通过维持所需的粒径、以及通过使用表面活性剂来维
持适当的流动性。这些组合物也可以含有合适的佐剂，例如润湿剂、乳化剂和分散剂。也可能需要包括等渗剂。此外，通过包含延迟吸收的试剂可以实现延长的可注射药物形式的吸
收。
[0925] 用于局部或透皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂、滴剂和吸入剂。可以在无菌条件下将活性剂(例如治疗组合或多特异性抗原结合分子)与合适的药学上可接受的载体混合。软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂可包含赋形剂。粉剂和喷雾剂可包含赋形剂和推进剂。
[0926] 在某些情况下，为了延长药物组合物的作用，需要减慢其从皮下或肌肉内注射的吸收。这可以通过包含水溶性差的晶体或无定形材料的液体悬浮液来实现。
[0927] 然后，活性剂(例如治疗组合或多特异性抗原结合分子)的吸收速率取决于其溶解速率，而其溶解速率又取决于晶体尺寸和晶体形式。或者，可以通过将活性剂或抗体溶解或悬浮在油载体中来实现肠胃外施用试剂或抗体的延迟吸收。可通过在可生物降解的聚合物
中形成活性成分的微胶囊基质来制备可注射的贮库形式。根据活性成分与聚合物的比例以
及所使用的特定聚合物的性质，可以控制活性成分的释放速率。还可以通过将药物截留在
与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备可注射储库的制剂。可注射材料可以例如通过
细菌截留过滤器进行过滤而灭菌。
中形成活性成分的微胶囊基质来制备可注射的贮库形式。根据活性成分与聚合物的比例以
及所使用的特定聚合物的性质，可以控制活性成分的释放速率。还可以通过将药物截留在
与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备可注射储库的制剂。可注射材料可以例如通过
细菌截留过滤器进行过滤而灭菌。
[0928] 所述制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封的容器中，例如存在于安瓿和小瓶中，并且可以在冻干条件下储存，仅需在使用前即刻加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可以由上述类型的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。
[0929] 6.1辅助治疗
[0930] 上文和本文其他地方公开的治疗组合、多特异性抗原结合分子和药物组合物可以与一种或多种其他治疗剂(例如抗癌剂、细胞毒性剂或细胞抑制剂、激素治疗、疫苗和/或其他免疫疗法)共同施用。替代地或另外，将治疗剂、双特异性抗体和药物组合物与其他治疗形式组合施用，所述其他治疗形式包括外科手术、放射、冷冻手术和/或热疗法。这样的组合疗法可以有利地利用较低剂量的所施用的治疗剂，从而避免了可能的毒性或并发症。
[0931] 例如，本文公开的组合疗法也可以与标准癌症治疗组合。例如，已知PD-1单一疗法可有效地与化学疗法组合。在这些情况下，有可能减少施用的化学治疗剂的剂量(Mokyr,M.等人(1998)Cancer Research 58：5301-5304)。在某些实施方案中，本文所述的方法和组合物与一种或多种其他抗体分子、化学疗法、其他抗癌疗法(例如靶向抗癌疗法或溶瘤药)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法(例如细胞因子)、外科手术和/或放射方法组合施用。可以与之组合施用的示例性细胞毒性剂包括抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢剂、有丝分裂抑制剂、烷基化剂、蒽环类药物、长春花生物碱、插入剂、能够干扰信号转导通路的试剂、促进细胞凋亡的试剂、蛋白酶体抑制剂和放射(例如局部或全身放射)。
[0932] 在一些实施方案中，将治疗组合或多特异性抗原结合分子与已经在受试者的治疗中用作常规标准的化学治疗剂组合使用。合适的化学治疗剂包括但不限于阿那曲唑
(ARIMIDEX)、比卡鲁胺(CASODEX)、硫酸博来霉素(BLENOXANE)、白消安(MYLERAN)、白消安注射液(BUSULFEX)、卡培他滨(XELODA)、 N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂
(PARAPLATIN)、卡莫司汀(BICNU)、苯丁酸氮芥(LEUKERAN)、顺铂(PLATINOL)、克拉屈滨
(LEUSTATIN)、环磷酰胺(CYTOXAN或NEOSAR)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(CYTOSAR-U)、阿糖胞苷脂质体注射液(DEPOCYT)、达卡巴嗪(DTIC-DOME)、放线菌素(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素(CERUBIDINE)、柠檬酸柔红霉素脂质体注射剂(DAUNOXOME)、地塞米松、多西紫杉醇(TAXOTERE)、盐酸阿霉素(ADRIAMYCIN，RUBEX)、依托泊苷(VEPESID)、氟达拉滨磷酸酯 (FLUDARA)、5-氟尿嘧啶(ADRUCIL,EFUDEX)、氟他米特(EULEXIN)、替扎西汀、吉西他滨(GEMZAR)、羟基脲(HYDREA)、伊达比星(IDAMYCIN)、异环磷酰胺(IFEX)、伊立替康
(CAMPTOSAR)、L-天冬酰胺酶(ELSPAR)、亚叶酸钙、美法仑(ALKERAN)、6-巯基嘌呤
(PURINETHOL)、甲氨蝶呤(FOLEX)、米托蒽醌(NOVANTRONE)、米洛塔格、紫杉醇(TAXOL)、纳布紫杉醇 (ABRAXANE)、菲尼克斯(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、带有卡莫司汀植入物的聚苯丙生20(GLIADEL wafer)、他莫昔芬柠檬酸盐(NOLVADEX)、替尼泊苷(VUMON)、6-硫代鸟嘌呤、噻替帕、替拉帕明(TIRAZONE)、盐酸托泊替康注射液(HYCAMPTIN)、长春花碱(VELBAN)、长春新碱(ONCOVIN) 和长春瑞滨(NAVELBINE)。
(ARIMIDEX)、比卡鲁胺(CASODEX)、硫酸博来霉素(BLENOXANE)、白消安(MYLERAN)、白消安注射液(BUSULFEX)、卡培他滨(XELODA)、 N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂
(PARAPLATIN)、卡莫司汀(BICNU)、苯丁酸氮芥(LEUKERAN)、顺铂(PLATINOL)、克拉屈滨
(LEUSTATIN)、环磷酰胺(CYTOXAN或NEOSAR)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(CYTOSAR-U)、阿糖胞苷脂质体注射液(DEPOCYT)、达卡巴嗪(DTIC-DOME)、放线菌素(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素(CERUBIDINE)、柠檬酸柔红霉素脂质体注射剂(DAUNOXOME)、地塞米松、多西紫杉醇(TAXOTERE)、盐酸阿霉素(ADRIAMYCIN，RUBEX)、依托泊苷(VEPESID)、氟达拉滨磷酸酯 (FLUDARA)、5-氟尿嘧啶(ADRUCIL,EFUDEX)、氟他米特(EULEXIN)、替扎西汀、吉西他滨(GEMZAR)、羟基脲(HYDREA)、伊达比星(IDAMYCIN)、异环磷酰胺(IFEX)、伊立替康
(CAMPTOSAR)、L-天冬酰胺酶(ELSPAR)、亚叶酸钙、美法仑(ALKERAN)、6-巯基嘌呤
(PURINETHOL)、甲氨蝶呤(FOLEX)、米托蒽醌(NOVANTRONE)、米洛塔格、紫杉醇(TAXOL)、纳布紫杉醇 (ABRAXANE)、菲尼克斯(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、带有卡莫司汀植入物的聚苯丙生20(GLIADEL wafer)、他莫昔芬柠檬酸盐(NOLVADEX)、替尼泊苷(VUMON)、6-硫代鸟嘌呤、噻替帕、替拉帕明(TIRAZONE)、盐酸托泊替康注射液(HYCAMPTIN)、长春花碱(VELBAN)、长春新碱(ONCOVIN) 和长春瑞滨(NAVELBINE)。
[0933] 示例性的烷基化剂包括氮芥、亚乙基亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：尿嘧啶芥末(AMINOURACIL MUSTARD、CHLORETHAMINACIL、 DEMETHYLDOPAN、
DESMETHYLDOPAN、HAEMANTHAMINE、NORDOPAN、URACIL NITROGEN MUSTARD、URACILLOST、
URACILMOSTAZA、 URAMUSTIN、URAMUSTINE)、氯次甲基(chlormethine)(MUSTARGEN)、环磷酰胺(CYTOXAN、NEOSAR、CLAFEN、ENDOXAN、PROCYTOX、 REVIMMUNE)、达卡巴嗪(DTIC-DOME)、异环磷酰胺(MITOXANA)、美法仑(ALKERAN)、苯丁酸氮芥(LEUKERAN)、哌泊溴烷(AMEDEL、
VERCYTE)、三亚乙基蜜胺(HEMEL、HEXALEN、HEXASTAT)、三亚乙基硫代磷胺、替莫唑胺
(TEMODAR和TEMODAL)、噻替帕(THIOPLEX)、白消安(BUSILVEX、MYLERAN)、卡莫斯汀(BICNU)、洛莫司汀(CCNUCEENU)、链脲菌素(ZANOSAR)、奥沙利铂(ELOXATIN)；放线菌素(也称为放线菌素 -D，COSMEGEN)；美法仑(L-PAM、L-肌溶素、苯丙氨酸芥末、ALKERAN)、六甲蜜胺(六甲基蜜胺(HMM)、HEXALEN)、苯达莫司汀(TREANDA)、白消安(BUSULFEX和MYLERAN)、卡铂
(PARAPLATIN)、顺铂(CDDP、 PLATINOL和PLATINOL-AQ)、苯丁酸氮芥(LEUKERAN)、达卡巴嗪(DTIC、 DIC和咪唑羧酰胺、DTIC-DOME)、六甲蜜胺(六甲基蜜胺(HMM)、HEXALEN)、异环磷酰胺(IFEX)、泼尼丁星、丙卡巴嗪(MATULANE)和噻替派(硫代磷酰胺、TESPA和TSPA、
THIOPLEX)。
DESMETHYLDOPAN、HAEMANTHAMINE、NORDOPAN、URACIL NITROGEN MUSTARD、URACILLOST、
URACILMOSTAZA、 URAMUSTIN、URAMUSTINE)、氯次甲基(chlormethine)(MUSTARGEN)、环磷酰胺(CYTOXAN、NEOSAR、CLAFEN、ENDOXAN、PROCYTOX、 REVIMMUNE)、达卡巴嗪(DTIC-DOME)、异环磷酰胺(MITOXANA)、美法仑(ALKERAN)、苯丁酸氮芥(LEUKERAN)、哌泊溴烷(AMEDEL、
VERCYTE)、三亚乙基蜜胺(HEMEL、HEXALEN、HEXASTAT)、三亚乙基硫代磷胺、替莫唑胺
(TEMODAR和TEMODAL)、噻替帕(THIOPLEX)、白消安(BUSILVEX、MYLERAN)、卡莫斯汀(BICNU)、洛莫司汀(CCNUCEENU)、链脲菌素(ZANOSAR)、奥沙利铂(ELOXATIN)；放线菌素(也称为放线菌素 -D，COSMEGEN)；美法仑(L-PAM、L-肌溶素、苯丙氨酸芥末、ALKERAN)、六甲蜜胺(六甲基蜜胺(HMM)、HEXALEN)、苯达莫司汀(TREANDA)、白消安(BUSULFEX和MYLERAN)、卡铂
(PARAPLATIN)、顺铂(CDDP、 PLATINOL和PLATINOL-AQ)、苯丁酸氮芥(LEUKERAN)、达卡巴嗪(DTIC、 DIC和咪唑羧酰胺、DTIC-DOME)、六甲蜜胺(六甲基蜜胺(HMM)、HEXALEN)、异环磷酰胺(IFEX)、泼尼丁星、丙卡巴嗪(MATULANE)和噻替派(硫代磷酰胺、TESPA和TSPA、
THIOPLEX)。
[0934] 示例性蒽环类药物包括，例如，阿霉素(ADRIAMYCIN和RUBEX)、博来霉素(LENOXANE)、柔红霉素(盐酸柔红霉素、柔红霉素、盐酸柔比霉素、和 CERUBIDINE)、柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体和DAUNOXOME)、米托蒽醌(DHAD和NOVANTRONE)、表柔比星(ELLENCE)、伊达比星 (IDAMYCIN和IDAMYCIN PFS)、丝裂霉素C(MUTAMYCIN)、格尔德霉素、除莠霉素、雷维霉素和去乙酰雷维霉素。
[0935] 可与上文和本文其他地方公开的试剂、抗体和方法组合使用的示例性长春花生物碱包括但不限于酒石酸长春瑞滨(NAVELBINE)、长春新碱(ONCOVIN)、长春地辛(ELDISINE)
和长春花碱(硫酸长春花碱)、vincaleukoblastine、VLB、 ALKABAN-AQ和VELBAN)。
和长春花碱(硫酸长春花碱)、vincaleukoblastine、VLB、 ALKABAN-AQ和VELBAN)。
[0936] 可以与本发明一起使用的示例性蛋白酶体抑制剂包括但不限于硼替佐米 (VELCADE)、卡非佐米(PX-171-007)、马利佐米(NPI-0052)、柠檬酸依阿佐米(MLN-9708)、地兰佐米(CEP-18770)、O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基) 羰基]-L-丝氨酰-O-甲基-N-[(1S)-
2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)；达
诺普韦(RG7227，CAS 850876-88-9)、依沙米布(MLN2238，CAS 1072833-77-2)和(S)-N-[(苯基甲氧基)羰基]-L- 亮氨酰-N-(1-甲酰基-3-甲基丁基)-L-亮氨酰胺(MG-132，CAS
133407-82-6)。
2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)；达
诺普韦(RG7227，CAS 850876-88-9)、依沙米布(MLN2238，CAS 1072833-77-2)和(S)-N-[(苯基甲氧基)羰基]-L- 亮氨酰-N-(1-甲酰基-3-甲基丁基)-L-亮氨酰胺(MG-132，CAS
133407-82-6)。
[0937] 在一些实施方案中，试剂(例如，治疗组合或多特异性抗原结合分子)可以与酪氨酸激酶抑制剂(例如，受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂)组合使用。示例性酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于表皮生长因子(EGF)通路抑制剂(例如表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂)、血管
内皮生长因子(VEGF)通路抑制剂(例如血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂(例如VEGFR-
1抑制剂、VEGFR-2抑制剂、VEGFR-3抑制剂))、血小板衍生生长因子(PDGF)通路抑制剂(例如血小板衍生生长因子受体(PDGFR)抑制剂(例如PDGFR-β抑制剂))、RAF-1 抑制剂、KIT抑制剂和RET抑制剂。
内皮生长因子(VEGF)通路抑制剂(例如血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂(例如VEGFR-
1抑制剂、VEGFR-2抑制剂、VEGFR-3抑制剂))、血小板衍生生长因子(PDGF)通路抑制剂(例如血小板衍生生长因子受体(PDGFR)抑制剂(例如PDGFR-β抑制剂))、RAF-1 抑制剂、KIT抑制剂和RET抑制剂。
[0938] 在一些实施方案中，本发明的组合物与刺猬蛋白(hedgehog)通路抑制剂一起配制。已知对癌症治疗有效的合适的刺猬蛋白抑制剂包括但不限于阿昔替尼 (AG013736)、博舒替尼(SKI-606)、西地尼布(RECENTIN、AZD2171)、达沙替尼(SPRYCEL、BMS-354825)、厄洛替尼(TARCEVA)、吉非替尼(IRESSA)、伊马替尼(GLEEVEC、CGP57148B、STI-571)、拉帕替尼(TYKERB、TYVERB)、来他替尼(CEP-701)、那拉替尼(HKI-272)、尼洛替尼(TASIGNA)、塞马克尼(semaxinib、SU5416)、舒尼替尼(SUTENT、SU11248)、托拉尼布(PALLADIA)、凡德他尼
(ZACTIMA、ZD6474)、瓦他兰尼(PTK787、PTK/ZK)、曲妥珠单抗 (HERCEPTIN)、贝伐单抗
(AVASTIN)、利妥昔单抗(RITUXAN)、西妥昔单抗(ERBITUX)、帕尼单抗(VECTIBIX)、兰尼单抗(Lucentis)、尼洛替尼 (TASIGNA)、索拉非尼(NEXAVAR)、阿仑单抗(CAMPATH)、吉妥单抗 (MYLOTARG)、ENMD-2076、PCI-32765、AC220、乳酸多维替尼(TKI258、 CHIR-258)、BIBW 2992(TOVOKTM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、 PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120( )、AP24534、 JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、
CEP-11981、替沃扎尼 (tivozanib)(AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647、XL228、AEE788、 AG-490、AST-6、BMS-599626、CUDC-101、PD153035、培利替尼(EKB-569)、凡德他尼(zactima)、WZ3146、WZ4002、WZ8040、ABT-869(利尼伐尼(linifanib))、 AEE788、AP24534(帕纳替尼)、AV-951(替沃扎尼)、阿昔替尼、BAY 73-4506 (瑞格拉非尼)、丙氨酸布立尼布(BMS-582664)、布利伐尼(BMS-540215)、西地尼布(AZD2171)、CHIR-258(多韦替尼)、CP
673451、CYC116、E7080、 Ki8751、马赛替尼(AB1010)、MGCD-265、二磷酸莫沙尼布(AMG-
706)、MP-470、 OSI-930、盐酸帕唑帕尼、PD173074、甲苯磺酸索拉非尼(Bay 43-9006)、SU
5402、 TSU-68(SU6668)、瓦他拉尼、XL880(GSK1363089、EXEL-2880)、维斯莫德 (2-氯-N-[4-氯-3-(2-吡啶基)苯基]-4-(甲基磺酰基)-苯甲酰胺、GDC-0449(如 PCT公开号WO 06/
028958中所述)、1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-((3- (4-氟苯基)-3,4-二氢-4-氧代-2-
喹唑啉基)甲基)-脲(CAS 330796-24-2)、N-[(2S, 3R,3'R,3aS,4'aR,6S,6'aR,6'bS,7aR,
12'aS,12'bS)-2',3',3a,4,4',4'a,5,5',6,6',6'a, 6'b,7,7',7a,8',10',12',12'a,12'
b-Eicosahydro-3,6,11',12'b-四甲基螺[呋喃并[3,2-b] 吡啶-2(3H)，9'(1'H)-萘[2,1-
a]甘菊环烃(azulen)]-3'-基]-甲磺酰胺(IPI926,CAS 1037210-93-7)、4-氟-N-甲基-N-
[1-[4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-酞嗪基]-4-哌啶基]-2-(三氟甲基)-苯甲酰胺
(LY2940680，CAS 1258861-20-9)、埃司莫德布 (LDE225)。
(ZACTIMA、ZD6474)、瓦他兰尼(PTK787、PTK/ZK)、曲妥珠单抗 (HERCEPTIN)、贝伐单抗
(AVASTIN)、利妥昔单抗(RITUXAN)、西妥昔单抗(ERBITUX)、帕尼单抗(VECTIBIX)、兰尼单抗(Lucentis)、尼洛替尼 (TASIGNA)、索拉非尼(NEXAVAR)、阿仑单抗(CAMPATH)、吉妥单抗 (MYLOTARG)、ENMD-2076、PCI-32765、AC220、乳酸多维替尼(TKI258、 CHIR-258)、BIBW 2992(TOVOKTM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、 PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120( )、AP24534、 JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、
CEP-11981、替沃扎尼 (tivozanib)(AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647、XL228、AEE788、 AG-490、AST-6、BMS-599626、CUDC-101、PD153035、培利替尼(EKB-569)、凡德他尼(zactima)、WZ3146、WZ4002、WZ8040、ABT-869(利尼伐尼(linifanib))、 AEE788、AP24534(帕纳替尼)、AV-951(替沃扎尼)、阿昔替尼、BAY 73-4506 (瑞格拉非尼)、丙氨酸布立尼布(BMS-582664)、布利伐尼(BMS-540215)、西地尼布(AZD2171)、CHIR-258(多韦替尼)、CP
673451、CYC116、E7080、 Ki8751、马赛替尼(AB1010)、MGCD-265、二磷酸莫沙尼布(AMG-
706)、MP-470、 OSI-930、盐酸帕唑帕尼、PD173074、甲苯磺酸索拉非尼(Bay 43-9006)、SU
5402、 TSU-68(SU6668)、瓦他拉尼、XL880(GSK1363089、EXEL-2880)、维斯莫德 (2-氯-N-[4-氯-3-(2-吡啶基)苯基]-4-(甲基磺酰基)-苯甲酰胺、GDC-0449(如 PCT公开号WO 06/
028958中所述)、1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-((3- (4-氟苯基)-3,4-二氢-4-氧代-2-
喹唑啉基)甲基)-脲(CAS 330796-24-2)、N-[(2S, 3R,3'R,3aS,4'aR,6S,6'aR,6'bS,7aR,
12'aS,12'bS)-2',3',3a,4,4',4'a,5,5',6,6',6'a, 6'b,7,7',7a,8',10',12',12'a,12'
b-Eicosahydro-3,6,11',12'b-四甲基螺[呋喃并[3,2-b] 吡啶-2(3H)，9'(1'H)-萘[2,1-
a]甘菊环烃(azulen)]-3'-基]-甲磺酰胺(IPI926,CAS 1037210-93-7)、4-氟-N-甲基-N-
[1-[4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-酞嗪基]-4-哌啶基]-2-(三氟甲基)-苯甲酰胺
(LY2940680，CAS 1258861-20-9)、埃司莫德布 (LDE225)。
[0939] 在某些实施方案中，本发明的组合物与血管内皮生长因子(VEGF)受体抑制剂一起配制，所述抑制剂包括但不限于贝伐单抗(AVASTIN)、阿昔替尼 (INLYTA)、丙氨酸布利伐尼(BMS-582664,(S)-((R)-1-(4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基氧基)-5-甲基吡咯并[2,l-f]
[1,2,4]三嗪-6-基氧基)丙-2-基)2-氨基丙酸酯)、索拉非尼(NEXAVAR)、帕唑帕尼
(VOTRIENT)、苹果酸舒尼替尼 (SUTENT)、西地尼布(AZD2171，CAS 288383-20-1)、尼达尼布(BIBF1120， CAS 928326-83-4)、替瑞替尼(GSK1363089)、替拉替尼(BAY57-9352，
CAS332012-40-5)、阿帕替尼(YN968D1，CAS 811803-05-1)、伊马替尼(GLEEVEC)、帕纳替尼(AP24534，CAS 943319-70-8)、替沃扎尼(AV951，CAS 475108-18-0)、瑞格非尼(BAY73-
4506，CAS 755037-03-7)、盐酸伐他兰尼(PTK787，CAS 212141-51-0)、布里瓦尼(BMS-
540215，CAS 649735-46-6)、凡德他尼(CAPRELSA 或AZD6474)、二磷酸莫替沙尼(AMG706，CAS 857876-30-3，N-(2,3-二氢-3,3- 二甲基-1H-吲哚-6-基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基]-
3-吡啶甲酰胺，在国际PCT公开号WO 02/066470中描述)、二乳酸多维替尼(TKI258，CAS
852433-84-2)、林法尼(ABT869，CAS796967-16-3)、卡博替尼(XL184，CAS 849217-68-1)、来他替尼(CAS 111358-88-4)、N-[5-[[[(5-(l，1-二甲基乙基)-2-恶唑基]甲基] 硫基]-2-噻唑基]-4-哌啶甲酰胺(BMS38703，CAS 345627-80-7)、(3R，4R)-4- 氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2，1-f][l,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)、N-(3,4-二
氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[((3aα，5β，6aα) -八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-
4-喹唑啉胺(XL647，CAS 781613-23-8)、 4-甲基-3-[[1-甲基-6-(3-吡啶基)-1H-吡唑并
[3，4-d]嘧啶-4-基]氨基]-N-[3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺(BHG712，CAS 940310-85-0)和阿柏西普(EYLEA)。
[1,2,4]三嗪-6-基氧基)丙-2-基)2-氨基丙酸酯)、索拉非尼(NEXAVAR)、帕唑帕尼
(VOTRIENT)、苹果酸舒尼替尼 (SUTENT)、西地尼布(AZD2171，CAS 288383-20-1)、尼达尼布(BIBF1120， CAS 928326-83-4)、替瑞替尼(GSK1363089)、替拉替尼(BAY57-9352，
CAS332012-40-5)、阿帕替尼(YN968D1，CAS 811803-05-1)、伊马替尼(GLEEVEC)、帕纳替尼(AP24534，CAS 943319-70-8)、替沃扎尼(AV951，CAS 475108-18-0)、瑞格非尼(BAY73-
4506，CAS 755037-03-7)、盐酸伐他兰尼(PTK787，CAS 212141-51-0)、布里瓦尼(BMS-
540215，CAS 649735-46-6)、凡德他尼(CAPRELSA 或AZD6474)、二磷酸莫替沙尼(AMG706，CAS 857876-30-3，N-(2,3-二氢-3,3- 二甲基-1H-吲哚-6-基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基]-
3-吡啶甲酰胺，在国际PCT公开号WO 02/066470中描述)、二乳酸多维替尼(TKI258，CAS
852433-84-2)、林法尼(ABT869，CAS796967-16-3)、卡博替尼(XL184，CAS 849217-68-1)、来他替尼(CAS 111358-88-4)、N-[5-[[[(5-(l，1-二甲基乙基)-2-恶唑基]甲基] 硫基]-2-噻唑基]-4-哌啶甲酰胺(BMS38703，CAS 345627-80-7)、(3R，4R)-4- 氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2，1-f][l,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)、N-(3,4-二
氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[((3aα，5β，6aα) -八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-
4-喹唑啉胺(XL647，CAS 781613-23-8)、 4-甲基-3-[[1-甲基-6-(3-吡啶基)-1H-吡唑并
[3，4-d]嘧啶-4-基]氨基]-N-[3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺(BHG712，CAS 940310-85-0)和阿柏西普(EYLEA)。
[0940] 在一些实施方案中，本发明的组合物与PI3K抑制剂一起配制。在一个实施方案中，PI3K抑制剂是PI3K的δ和γ同种型的抑制剂。可以组合使用的示例性PI3K 抑制剂在例如WO2010/036380、WO2010/006086、WO09/114870、WO05/113556 中描述，其内容通过引用并入本文。合适地，PI3K抑制剂包括4-[2-(1H-吲唑-4- 基)-6-[[4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]吗啉(也称为 GDC-0941(如国际PCT公开号WO 09/036082和
WO 09/055730所述)、2-甲基-2-[4- [3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2，3-二氢咪唑并[4,
5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈 (BEZ235或NVP-BEZ 235，如国际PCT公开号WO06/122806中所
述)；4-(三氟甲基)-5-(2,6-二吗啉基吡啶-4-基)吡啶-2-胺(BKM 120或NVP-BKM120，在国
际PCT公开号WO2007/084786中描述)、托扎塞替尼(VX680或MK-0457， CAS 639089-54-6)；
(5Z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮 (GSK1059615，CAS 958852-
01-2)；(1E，4S，4aR，5R，6aS，9aR)-5-(乙酰氧基)-1-[(二-2-丙烯基氨基)亚甲基)-4,4a,5,
6,6a,8,9,9a-八氢-1l-羟基-4-(甲氧基甲基)-4a，6a-二甲基-环戊[5,6]萘并[l,2-c]吡
喃-2,7,10(lH)-三酮(PX866， CAS 502632-66-8)；8-苯基-2-(吗啉-4-基)-铬-4-酮
(LY294002，CAS 154447-36-6)、 2-氨基-8-乙基-4-甲基-6-(1H-吡唑-5-基)吡啶基[2,3-
d]嘧啶-7(8H)-酮(SAR 245409 或XL 765)、1,3-二氢-8-(6-甲氧基-3-吡啶基)-3-甲基-1-
[4-(1-哌嗪基)-3-(三氟甲基)苯基]-2H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮、(2Z)-2-丁烯二酸酯
(1：1)(BGT 226)、 5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]-4(3H)-喹唑啉酮
(CAL101)、 2-氨基-N-[3-[N-[3-[(2-氯-5-甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-2-基]氨磺酰基]苯
基]-2-甲基丙酰胺(SAR 245408或XL 147)和(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-
5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)(BYL719)。
WO 09/055730所述)、2-甲基-2-[4- [3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2，3-二氢咪唑并[4,
5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈 (BEZ235或NVP-BEZ 235，如国际PCT公开号WO06/122806中所
述)；4-(三氟甲基)-5-(2,6-二吗啉基吡啶-4-基)吡啶-2-胺(BKM 120或NVP-BKM120，在国
际PCT公开号WO2007/084786中描述)、托扎塞替尼(VX680或MK-0457， CAS 639089-54-6)；
(5Z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮 (GSK1059615，CAS 958852-
01-2)；(1E，4S，4aR，5R，6aS，9aR)-5-(乙酰氧基)-1-[(二-2-丙烯基氨基)亚甲基)-4,4a,5,
6,6a,8,9,9a-八氢-1l-羟基-4-(甲氧基甲基)-4a，6a-二甲基-环戊[5,6]萘并[l,2-c]吡
喃-2,7,10(lH)-三酮(PX866， CAS 502632-66-8)；8-苯基-2-(吗啉-4-基)-铬-4-酮
(LY294002，CAS 154447-36-6)、 2-氨基-8-乙基-4-甲基-6-(1H-吡唑-5-基)吡啶基[2,3-
d]嘧啶-7(8H)-酮(SAR 245409 或XL 765)、1,3-二氢-8-(6-甲氧基-3-吡啶基)-3-甲基-1-
[4-(1-哌嗪基)-3-(三氟甲基)苯基]-2H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮、(2Z)-2-丁烯二酸酯
(1：1)(BGT 226)、 5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]-4(3H)-喹唑啉酮
(CAL101)、 2-氨基-N-[3-[N-[3-[(2-氯-5-甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-2-基]氨磺酰基]苯
基]-2-甲基丙酰胺(SAR 245408或XL 147)和(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-
5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)(BYL719)。
[0941] 在一些实施方案中，本文公开的组合物与mTOR抑制剂配制，例如，一种或多种选自以下的mTOR抑制剂：雷帕霉素、替西罗莫司(TORISEL)、AZD8055、 BEZ235、BGT226、XL765、PF-4691502、GDC0980、SF1126、OSI-027、GSK1059615、 KU-0063794、WYE-354、Palomid 529(P529)、PF-04691502或PKI-587、地磷莫司(正式称为deferolimus，(1R,2R,4S)-4[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧杂-11,36-二氧杂-4-氮杂
4,9
三环[30.3.1.0 ]六金钢烷 -16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次
膦酸酯，也称为AP23573 和MK8669、以及在PCT公开号WO03/064383中描述的那些)、依维莫司 (ARINITOR或RAD001)、雷帕霉素(AY22989，SIROLIMUS)、辛哌莫特(CAS 164301-51-3)、艾莫罗莫司、(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d] 嘧啶-7-基}-2-甲氧基
苯基)甲醇(AZD8055)、2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基) 环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶
基)-4-甲基-吡啶基[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮 (PF04691502，CAS 1013101-36-4)和N2-[1,4-
二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1- 苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨
酰基甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-，内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)、(lr,4r)-4-(4-氨基-5-(7-甲氧基-1H- 吲哚-2-基)咪唑[1,5-f][l，2,4]三嗪-7-基)环己烷羧酸(OSI-027)；
和XL765。
4,9
三环[30.3.1.0 ]六金钢烷 -16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次
膦酸酯，也称为AP23573 和MK8669、以及在PCT公开号WO03/064383中描述的那些)、依维莫司 (ARINITOR或RAD001)、雷帕霉素(AY22989，SIROLIMUS)、辛哌莫特(CAS 164301-51-3)、艾莫罗莫司、(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d] 嘧啶-7-基}-2-甲氧基
苯基)甲醇(AZD8055)、2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基) 环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶
基)-4-甲基-吡啶基[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮 (PF04691502，CAS 1013101-36-4)和N2-[1,4-
二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1- 苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨
酰基甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-，内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)、(lr,4r)-4-(4-氨基-5-(7-甲氧基-1H- 吲哚-2-基)咪唑[1,5-f][l，2,4]三嗪-7-基)环己烷羧酸(OSI-027)；
和XL765。
[0942] 在一些实施方案中，本发明的组合物可以与BRAF抑制剂组合使用，所述 BRAF抑制剂例如GSK2118436、RG7204、PLX4032、GDC-0879、PLX4720和甲苯磺酸索拉非尼(Bay 43-
9006)。在进一步的实施方案中，BRAF抑制剂包括但不限于雷戈非尼(BAY 73-4506，
CAS755037-03-7)、图维扎尼(AV951，CAS 475108-18-0)、维拉非尼(ZELBORAF，PLX-4032，CAS918504-65-1)、恩可拉非尼(又名LGX818)、1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-
基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265，CAS 927880-90-
8)、5-[1- (2-羟乙基)-3-(吡啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]-2,3-二氢茚-1-酮肟(GDC-0879，
CAS 905281-76-7)、5-[2-[4-[2-(二甲基氨基)乙氧基]苯基]-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-4-
基]-2,3-二氢-1H-茚满-1-酮肟(GSK2118436或SB590885)、(+/-)-甲基(5-(2- (5-氯-2-甲
基苯基)-1-羟基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基) 氨基甲酸酯
(也称为XL-281和BMS908662)、和N-(3-(5-氯-1H-吡咯并[2,3-b] 吡啶-3-羰基)-2,4-二氟
苯基)丙烷-1-磺酰胺(也称为PLX4720)。
9006)。在进一步的实施方案中，BRAF抑制剂包括但不限于雷戈非尼(BAY 73-4506，
CAS755037-03-7)、图维扎尼(AV951，CAS 475108-18-0)、维拉非尼(ZELBORAF，PLX-4032，CAS918504-65-1)、恩可拉非尼(又名LGX818)、1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-
基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265，CAS 927880-90-
8)、5-[1- (2-羟乙基)-3-(吡啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]-2,3-二氢茚-1-酮肟(GDC-0879，
CAS 905281-76-7)、5-[2-[4-[2-(二甲基氨基)乙氧基]苯基]-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-4-
基]-2,3-二氢-1H-茚满-1-酮肟(GSK2118436或SB590885)、(+/-)-甲基(5-(2- (5-氯-2-甲
基苯基)-1-羟基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基) 氨基甲酸酯
(也称为XL-281和BMS908662)、和N-(3-(5-氯-1H-吡咯并[2,3-b] 吡啶-3-羰基)-2,4-二氟
苯基)丙烷-1-磺酰胺(也称为PLX4720)。
[0943] 本发明的组合物也可以与MEK抑制剂组合使用。可以与任何MEK抑制剂组合使用，包括但不限于司美替尼(5-[(4-溴-2-氯苯基)氨基]-4-氟-N-(2-羟基乙氧基)-1-甲基-1H-
苯并咪唑-6-甲酰胺(AZD6244或ARRY 142886，在PCT公开号 WO2003/077914中描述)、曲美
替尼二甲亚砜(GSK-1120212，CAS 1204531-25-80)、 RDEA436、N-[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6-甲氧基苯基]-1-[(2R)-2,3- 二羟丙基]-环丙烷磺酰胺(RDEA119或
BAY869766，在PCT公开号WO2007/014011 中描述)、AS703026、BIX 02188、BIX 02189、2-[(2-氯-4-碘苯基)氨基]-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟-苯甲酰胺(也称为CI-1040或
PD184352，在PCT公开号 WO2000/035436中描述)、N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3，4-二氟-
2-[(2-氟-4- 碘代苯基)氨基]-苯甲酰胺(PD0325901，在PCT公开号WO2002/006213中描
述)、 2'-氨基-3'-甲氧基黄酮(PD98059)、2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(U0126，在美国专利号2,779,780中描述)、XL-518(GDC-0973，Cas No.1029872-29-4)、G-
38963和G02443714(也称为AS703206)，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。其他MEK抑制剂公开在WO2013/019906、WO03/077914、 WO2005/121142、WO2007/04415、WO2008/024725和WO2009/085983中，其内容通过引用并入本文。MEK抑制剂的其他实例包括但不限于贝尼替
尼(6-(4-溴 -2-氟苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基乙氧基)-酰胺
(MEK162， CAS 1073666-70-2，在PCT公开号WO2003/077914中描述)、2,3-双[氨基[(2- 氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(U0126，在美国专利号2,779,780中描述)、 (3S,4R,5Z,8S,
9S,11E)-14-(乙氨基)-8,9,16-三羟基-3,4-二甲基-3,4,9,19-四氢-1H-2- 苯并氧杂环十
四烷-1,7(8H)-二酮](E6201，在PCT公开号WO2003/076424中描述)、维罗非尼(PLX-4032，
CAS 918504-65-1)、(R)-3-(2,3-二羟丙基)-6- 氟-5-(2-氟-4-碘代苯基氨基)-8-甲基吡
啶基[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮 (TAK-733，CAS 1035555-63-5)、匹马替尼(AS-
703026，CAS 1204531-26-9)、 2-(2-氟-4-碘代苯基氨基)-N-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲
基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3- 甲酰胺(AZD 8330)和3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-
N-[2-羟基乙氧基)-5-[(3- 氧代-[1,2]恶嗪南-2-基)甲基]苯甲酰胺(CH 4987655或Ro
4987655)。
苯并咪唑-6-甲酰胺(AZD6244或ARRY 142886，在PCT公开号 WO2003/077914中描述)、曲美
替尼二甲亚砜(GSK-1120212，CAS 1204531-25-80)、 RDEA436、N-[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6-甲氧基苯基]-1-[(2R)-2,3- 二羟丙基]-环丙烷磺酰胺(RDEA119或
BAY869766，在PCT公开号WO2007/014011 中描述)、AS703026、BIX 02188、BIX 02189、2-[(2-氯-4-碘苯基)氨基]-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟-苯甲酰胺(也称为CI-1040或
PD184352，在PCT公开号 WO2000/035436中描述)、N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3，4-二氟-
2-[(2-氟-4- 碘代苯基)氨基]-苯甲酰胺(PD0325901，在PCT公开号WO2002/006213中描
述)、 2'-氨基-3'-甲氧基黄酮(PD98059)、2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(U0126，在美国专利号2,779,780中描述)、XL-518(GDC-0973，Cas No.1029872-29-4)、G-
38963和G02443714(也称为AS703206)，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。其他MEK抑制剂公开在WO2013/019906、WO03/077914、 WO2005/121142、WO2007/04415、WO2008/024725和WO2009/085983中，其内容通过引用并入本文。MEK抑制剂的其他实例包括但不限于贝尼替
尼(6-(4-溴 -2-氟苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基乙氧基)-酰胺
(MEK162， CAS 1073666-70-2，在PCT公开号WO2003/077914中描述)、2,3-双[氨基[(2- 氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(U0126，在美国专利号2,779,780中描述)、 (3S,4R,5Z,8S,
9S,11E)-14-(乙氨基)-8,9,16-三羟基-3,4-二甲基-3,4,9,19-四氢-1H-2- 苯并氧杂环十
四烷-1,7(8H)-二酮](E6201，在PCT公开号WO2003/076424中描述)、维罗非尼(PLX-4032，
CAS 918504-65-1)、(R)-3-(2,3-二羟丙基)-6- 氟-5-(2-氟-4-碘代苯基氨基)-8-甲基吡
啶基[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮 (TAK-733，CAS 1035555-63-5)、匹马替尼(AS-
703026，CAS 1204531-26-9)、 2-(2-氟-4-碘代苯基氨基)-N-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲
基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3- 甲酰胺(AZD 8330)和3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-
N-[2-羟基乙氧基)-5-[(3- 氧代-[1,2]恶嗪南-2-基)甲基]苯甲酰胺(CH 4987655或Ro
4987655)。
[0944] 在一些实施方案中，本发明的组合物与JAK2抑制剂一起施用，所述JAK2抑制剂例如CEP-701、INCB18424、CP-690550(他索西替尼)。示例性的JAK抑制剂包括但不限于鲁索替尼(JAKAFI)、托法替尼(CP690550)、阿昔替尼(AG013736， CAS 319460-85-0)、5-氯-N2-
[(1S)-1-(5-氟-2-嘧啶基)乙基]-N4-(5-甲基-1H- 吡唑-3-基)-12,4-嘧啶二胺(AZD1480，
CAS 935666-88-9)、(9E)-15-[2-(1- 吡咯烷基)乙氧基]-7,12,26-三恶唑-19,21,24-三氮
杂四环(18.3.1.12,5.114,18)-廿六-1(24),2,4,9,14,16,18(25),20,22-壬烯(SB-1578，
CAS 937273-04-6)、莫洛替尼(CYT 387)、巴利替尼(INCB-028050或LY-3009104)、帕克替尼(SB1518)、 (16E)-14-甲基-20-氧杂-5,7,14,27-四氮杂四环[19.3.1.12,6.18,12]二十
七-1 (25),2,4,6(27),8,10,12(26),16,21,23-十碳烯(SB 1317)、甘多替尼(LY 2784544) 和N，N-环丙基-4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-乙基-1,6-二氢-1-甲基- 咪唑
[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-7-羧酰胺(BMS 911543)。
[(1S)-1-(5-氟-2-嘧啶基)乙基]-N4-(5-甲基-1H- 吡唑-3-基)-12,4-嘧啶二胺(AZD1480，
CAS 935666-88-9)、(9E)-15-[2-(1- 吡咯烷基)乙氧基]-7,12,26-三恶唑-19,21,24-三氮
杂四环(18.3.1.12,5.114,18)-廿六-1(24),2,4,9,14,16,18(25),20,22-壬烯(SB-1578，
CAS 937273-04-6)、莫洛替尼(CYT 387)、巴利替尼(INCB-028050或LY-3009104)、帕克替尼(SB1518)、 (16E)-14-甲基-20-氧杂-5,7,14,27-四氮杂四环[19.3.1.12,6.18,12]二十
七-1 (25),2,4,6(27),8,10,12(26),16,21,23-十碳烯(SB 1317)、甘多替尼(LY 2784544) 和N，N-环丙基-4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-乙基-1,6-二氢-1-甲基- 咪唑
[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-7-羧酰胺(BMS 911543)。
[0945] 在其他实施方案中，本发明的组合物与疫苗(例如树突状细胞肾癌(DC-RCC) 疫苗)组合施用。在某些实施方案中，药物组合物和DC-RCC疫苗的组合用于治疗癌症，例如本文所述的癌症(例如，肾癌，例如，转移性肾细胞癌(RCC)或透明细胞肾细胞癌(CCRCC)。
[0946] 在其他实施方案中，本文所述的药物组合物可以与化学疗法和/或免疫疗法组合施用。例如，该组合物可单独或与以下一种或多种组合用于治疗骨髓瘤：化学疗法或其他抗癌剂(例如，沙利度胺类似物，例如来那度胺)、抗TIM3抗体、肿瘤抗原脉冲的树突状细胞、肿瘤细胞和树突状细胞的融合(例如电融合)、或用恶性浆细胞产生的免疫球蛋白独特型疫苗
接种。在一个实施方案中，该组合物可以与抗TIM-3抗体组合用于治疗骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤。
接种。在一个实施方案中，该组合物可以与抗TIM-3抗体组合用于治疗骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤。
[0947] 在一些实施方案中，本发明的药物组合物与化学疗法组合使用用于治疗肺癌，例如非小细胞肺癌。在一些实施方案中，药物组合物与铂双线疗法一起使用用于治疗肺癌。
[0948] 在又一个实施方案中，本文公开的药物组合物可以用于治疗肾癌，例如肾细胞癌(RCC)(例如，透明细胞肾细胞癌(CCRCC)或转移性RCC。抗PD-1或 PD-L1抗体分子可以与以
下一种或多种组合施用：基于免疫的策略(例如白介素-2 或干扰素-γ)、靶向剂(例如VEGF抑制剂，例如针对VEGF的单克隆抗体)； VEGF酪氨酸激酶抑制剂，例如舒尼替尼、索拉非尼、阿昔替尼和帕唑帕尼；RNAi 抑制剂)、或VEGF信号传导下游介质的抑制剂，例如，雷帕霉素的哺乳动物靶标的抑制剂(mTOR)，例如，依维莫司和替西罗莫司。
下一种或多种组合施用：基于免疫的策略(例如白介素-2 或干扰素-γ)、靶向剂(例如VEGF抑制剂，例如针对VEGF的单克隆抗体)； VEGF酪氨酸激酶抑制剂，例如舒尼替尼、索拉非尼、阿昔替尼和帕唑帕尼；RNAi 抑制剂)、或VEGF信号传导下游介质的抑制剂，例如，雷帕霉素的哺乳动物靶标的抑制剂(mTOR)，例如，依维莫司和替西罗莫司。
[0949] 用于组合治疗胰腺癌的合适的辅助治疗剂的实例包括但不限于化学治疗剂，例如紫杉醇或紫杉醇试剂(例如，紫杉醇制剂如TAXOL、白蛋白稳定的纳米颗粒紫杉醇制剂(例如ABRAXANE)或脂质体紫杉醇制剂)、吉西他滨(例如吉西他滨单独或与AXP107-11组合)，其他化学治疗剂，例如奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、鲁贝替康、盐酸表柔比星、NC-6004、顺铂、多西紫杉醇(例如 TAXOTERE)、丝裂霉素C、异环磷酰胺、干扰素、酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR 抑制剂(例如埃洛替尼、帕尼单抗、西妥昔单抗、尼莫妥珠单抗)、HER2/neu受体抑制剂(例如曲妥珠单抗)、双重激酶抑制剂(例如，波舒替尼、萨拉卡替尼、拉帕替尼、凡德他尼)、多激酶抑制剂(例如，索拉非尼、舒尼替尼、XL184、帕唑帕尼)、VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗、AV-951、布立尼布)、放射免疫疗法(例如XR303)、癌症疫苗(例如，GVAX、生存素肽)、COX-2抑制剂(例如塞来昔布)、IGF-1受体抑制剂(例如AMG 479，MK-0646)、mTOR抑制剂 (例如依维莫司、替西罗莫司)、IL-6抑制剂(例如，CNTO 328)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如P276-00，UCN-01)、改变的能量代谢指导(AEMD) 化合物(例如CPI-613)、HDAC抑制剂(例如伏立诺他)、TRAIL受体2(TR-2) 激动剂(例如卡那妥单抗)、MEK抑制剂(例如
AS703026，司美替尼，GSK1120212)、 Raf/MEK双重激酶抑制剂(例如RO5126766)、Notch信号传导抑制剂(例如 MK0752)、单克隆抗体-抗体融合蛋白(例如L19IL2)、姜黄素、HSP90抑制剂 (例如丹皮霉素，STA-9090)、rIL-2；丹尼洛丁、拓扑异构酶1抑制剂(例如伊立替康，
PEP02)、他汀(例如辛伐他汀)、因子VIIa抑制剂(例如PCI-27483)、 AKT抑制剂(例如RX-
0201)、缺氧激活的前药(例如TH-302)、盐酸二甲双胍、γ分泌酶抑制剂(例如RO4929097)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如，3-AP)、免疫毒素(例如HuC242-DM4)、PARP抑制剂(例如KU-
0059436，韦利帕利布)、 CTLA-4抑制剂(例如CP-675,206、伊匹单抗)、AdV-tk治疗剂、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(Velcade)，NPI-0052)、噻唑烷二酮(例如，吡格列酮)、 NPC-
1C、Aurora激酶抑制剂(例如R763/AS703569)、CTGF抑制剂(例如FG-3019)、 siG12D LODER和放射疗法(例如，断层扫描、立体定向放射、质子治疗)、手术及其组合。在某些实施方案中，紫杉醇或紫杉醇试剂和吉西他滨的组合可与本文所述的药物组合物一起使用。
AS703026，司美替尼，GSK1120212)、 Raf/MEK双重激酶抑制剂(例如RO5126766)、Notch信号传导抑制剂(例如 MK0752)、单克隆抗体-抗体融合蛋白(例如L19IL2)、姜黄素、HSP90抑制剂 (例如丹皮霉素，STA-9090)、rIL-2；丹尼洛丁、拓扑异构酶1抑制剂(例如伊立替康，
PEP02)、他汀(例如辛伐他汀)、因子VIIa抑制剂(例如PCI-27483)、 AKT抑制剂(例如RX-
0201)、缺氧激活的前药(例如TH-302)、盐酸二甲双胍、γ分泌酶抑制剂(例如RO4929097)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如，3-AP)、免疫毒素(例如HuC242-DM4)、PARP抑制剂(例如KU-
0059436，韦利帕利布)、 CTLA-4抑制剂(例如CP-675,206、伊匹单抗)、AdV-tk治疗剂、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(Velcade)，NPI-0052)、噻唑烷二酮(例如，吡格列酮)、 NPC-
1C、Aurora激酶抑制剂(例如R763/AS703569)、CTGF抑制剂(例如FG-3019)、 siG12D LODER和放射疗法(例如，断层扫描、立体定向放射、质子治疗)、手术及其组合。在某些实施方案中，紫杉醇或紫杉醇试剂和吉西他滨的组合可与本文所述的药物组合物一起使用。
[0950] 用于组合治疗小细胞肺癌的合适疗法的例子包括但不限于化学治疗剂，例如依托泊苷、卡铂、顺铂、伊立替康、托泊替康、吉西他滨、脂质体SN-38、苯达莫司汀、替莫唑胺、贝洛特坎、NK012、FR901228、黄酮哌啶醇)、酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼、吉非替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗)、多重激酶抑制剂(例如索拉非尼、舒尼替尼)、VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗、凡德他尼)、癌症疫苗(例如，GVAX)、Bcl-2抑制剂(例如，奥泊利森钠，ABT-263)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(Velcade)，NPI-0052)、紫杉醇或紫杉醇试剂、多西紫杉醇、IGF-1受体抑制剂(例如，AMG 479)、HGF/SF抑制剂(例如 AMG102，MK-0646)、氯喹、Aurora激酶抑制剂(例如，MLN8237)、放射免疫疗法(例如，TF2)、HSP90抑制剂(例如，丹皮霉素，STA-9090)、mTOR 抑制剂(例如依维莫司)、Ep-CAM-/CD3-双特异性抗体(例如
MT110)、CK-2 抑制剂(例如CX-4945)、HDAC抑制剂(例如贝利司他)、SMO拮抗剂(例如， BMS
833923)、肽癌疫苗和放射疗法(例如，调强放射疗法(IMRT)、超分割放射疗法、低氧引导放射疗法)、手术和/或其任何组合。
MT110)、CK-2 抑制剂(例如CX-4945)、HDAC抑制剂(例如贝利司他)、SMO拮抗剂(例如， BMS
833923)、肽癌疫苗和放射疗法(例如，调强放射疗法(IMRT)、超分割放射疗法、低氧引导放射疗法)、手术和/或其任何组合。
[0951] 用于组合治疗非小细胞肺癌的合适疗法的例子包括但不限于化学治疗剂，例如长春瑞滨、顺铂、多西紫杉醇、培美曲塞二钠、依托泊苷、吉西他滨、卡铂、脂质体SN-38、TLK286、替莫唑胺、托泊替康、培美曲塞二钠、阿扎胞苷、伊立替康、替加氟-吉美拉西坦-奥替拉西钾、萨帕他滨)，酪氨酸激酶抑制剂(例如 EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼、吉非替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、尼珠单抗、 PF-00299804、尼妥珠单抗、RO5083945)，MET抑制剂(例如，PF-02341066、 ARQ 197)，PI3K激酶抑制剂(例如，XL147、GDC-0941)，Raf/MEK双重激酶抑制剂(例如，RO5126766)，PI3K/mTOR双重激酶抑制剂(例如XL765)，SRC 抑制剂(例如达沙替
尼)，双重抑制剂(例如BIBW 2992、GSK1363089、ZD6474、 AZD0530、AG-013736、拉帕替尼、MEHD7945A、利尼伐尼)，多重激酶抑制剂 (例如，索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、AMG 706、XL184、MGCD265、 BMS-690514、R935788)，VEGF抑制剂(例如，恩度素、内皮抑素、贝伐单抗、西地尼布、BIBF 1120、阿昔替尼、替沃扎尼、AZD2171)，癌症疫苗(例如BLP25 脂质体疫苗、GVAX、重组DNA和表达L523S蛋白的腺病毒)，Bcl-2抑制剂(例如，奥泊利森钠)，蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米、卡非佐米、NPI-0052、 MLN9708)，紫杉醇或紫杉醇试剂、多西紫杉醇、IGF-1受体抑制剂(例如，西妥木单抗、MK-0646、OSI 906、CP-751,871、BIIB022)，羟氯喹、HSP90抑制剂(例如丹皮霉素、STA-9090、AUY922、XL888)，mTOR抑制剂(例如依维莫司、替西罗莫司、地磷莫司)，Ep-CAM-/CD3-双特异性抗体(例如，MT110)，CK-2 抑制剂(例如CX-
4945)，HDAC抑制剂(例如MS 275、LBH589、伏立诺他、丙戊酸、FR901228)，DHFR抑制剂(例如，普雷西酯)，类维生素A(例如，贝沙罗汀、维甲酸)，抗体-药物缀合物(例如SGN-15)、双膦酸盐(例如唑来膦酸)，癌症疫苗(例如贝拉根普马图-L)，低分子量肝素(LMWH)(例如替扎肝
素、依诺肝素)，GSK1572932A，褪黑激素，塔拉铁蛋白(talactoferrin)，地美司钠
(dimesna)，拓扑异构酶抑制剂(例如，氨柔比星、依托泊苷、卡瑞特霉素)，奈非那韦，西仑吉肽，ErbB3抑制剂(例如MM-121、U3-1287)，存活素抑制剂(例如YM155、LY2181308)，甲磺酸依瑞布林，COX-2抑制剂(例如塞来昔布)，吡非司亭，Polo样激酶1抑制剂(例如BI 6727)，
TRAIL受体2(TR-2) 激动剂(例如CS-1008)，CNGRC肽-TNFα缀合物，二氯乙酸盐(DCA)，HGF 抑制剂(例如SCH 900105)，SAR240550，PPAR-γ激动剂(例如CS-7017)，γ- 分泌酶抑制剂(例如RO4929097)，表观遗传疗法(例如5-阿扎胞苷)，硝酸甘油，MEK抑制剂(例如AZD6244)，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如， UCN-01)，胆固醇-Fusl，抗微管蛋白剂(例如，
E7389)，法呢基-OH-转移酶抑制剂(例如，洛那法尼)，免疫毒素(例如BB-10901、SS1(dsFv)PE38)，磺达肝素，血管破坏剂(例如AVE8062)，PD-L1抑制剂(例如MDX-1105、 MDX-1106)，β-葡聚糖，NGR-hTNF，EMD 521873，MEK抑制剂(例如 GSK1120212)，埃博霉素类似物(例如依沙贝比隆)，驱动蛋白纺锤抑制剂(例如4SC-205)，端粒靶向剂(例如KML-001)，P70通路抑制剂(例如，LY2584702)，AKT抑制剂(例如，MK-2206)，血管生成抑制剂(例如来那度胺)，Notch信号传导抑制剂(例如，OMP-21M18)，放射疗法，手术及其组合。
尼)，双重抑制剂(例如BIBW 2992、GSK1363089、ZD6474、 AZD0530、AG-013736、拉帕替尼、MEHD7945A、利尼伐尼)，多重激酶抑制剂 (例如，索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、AMG 706、XL184、MGCD265、 BMS-690514、R935788)，VEGF抑制剂(例如，恩度素、内皮抑素、贝伐单抗、西地尼布、BIBF 1120、阿昔替尼、替沃扎尼、AZD2171)，癌症疫苗(例如BLP25 脂质体疫苗、GVAX、重组DNA和表达L523S蛋白的腺病毒)，Bcl-2抑制剂(例如，奥泊利森钠)，蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米、卡非佐米、NPI-0052、 MLN9708)，紫杉醇或紫杉醇试剂、多西紫杉醇、IGF-1受体抑制剂(例如，西妥木单抗、MK-0646、OSI 906、CP-751,871、BIIB022)，羟氯喹、HSP90抑制剂(例如丹皮霉素、STA-9090、AUY922、XL888)，mTOR抑制剂(例如依维莫司、替西罗莫司、地磷莫司)，Ep-CAM-/CD3-双特异性抗体(例如，MT110)，CK-2 抑制剂(例如CX-
4945)，HDAC抑制剂(例如MS 275、LBH589、伏立诺他、丙戊酸、FR901228)，DHFR抑制剂(例如，普雷西酯)，类维生素A(例如，贝沙罗汀、维甲酸)，抗体-药物缀合物(例如SGN-15)、双膦酸盐(例如唑来膦酸)，癌症疫苗(例如贝拉根普马图-L)，低分子量肝素(LMWH)(例如替扎肝
素、依诺肝素)，GSK1572932A，褪黑激素，塔拉铁蛋白(talactoferrin)，地美司钠
(dimesna)，拓扑异构酶抑制剂(例如，氨柔比星、依托泊苷、卡瑞特霉素)，奈非那韦，西仑吉肽，ErbB3抑制剂(例如MM-121、U3-1287)，存活素抑制剂(例如YM155、LY2181308)，甲磺酸依瑞布林，COX-2抑制剂(例如塞来昔布)，吡非司亭，Polo样激酶1抑制剂(例如BI 6727)，
TRAIL受体2(TR-2) 激动剂(例如CS-1008)，CNGRC肽-TNFα缀合物，二氯乙酸盐(DCA)，HGF 抑制剂(例如SCH 900105)，SAR240550，PPAR-γ激动剂(例如CS-7017)，γ- 分泌酶抑制剂(例如RO4929097)，表观遗传疗法(例如5-阿扎胞苷)，硝酸甘油，MEK抑制剂(例如AZD6244)，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如， UCN-01)，胆固醇-Fusl，抗微管蛋白剂(例如，
E7389)，法呢基-OH-转移酶抑制剂(例如，洛那法尼)，免疫毒素(例如BB-10901、SS1(dsFv)PE38)，磺达肝素，血管破坏剂(例如AVE8062)，PD-L1抑制剂(例如MDX-1105、 MDX-1106)，β-葡聚糖，NGR-hTNF，EMD 521873，MEK抑制剂(例如 GSK1120212)，埃博霉素类似物(例如依沙贝比隆)，驱动蛋白纺锤抑制剂(例如4SC-205)，端粒靶向剂(例如KML-001)，P70通路抑制剂(例如，LY2584702)，AKT抑制剂(例如，MK-2206)，血管生成抑制剂(例如来那度胺)，Notch信号传导抑制剂(例如，OMP-21M18)，放射疗法，手术及其组合。
[0952] 用于组合治疗卵巢癌的合适治疗剂的例子包括但不限于化学治疗剂(例如紫杉醇或紫杉醇试剂、多西紫杉醇、卡铂、吉西他滨、阿霉素、托泊替康、顺铂、伊立替康、TLK28、异环磷酰胺、奥拉帕尼、奥沙利铂、美法仑、培美曲塞二钠、 SJG-136、环磷酰胺、依托泊苷、地西他滨)，胃泌素(ghrelin)拮抗剂(例如 AEZS-130)，免疫疗法(例如APC8024、奥戈伏单抗、OPT-821)，酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂(例如埃洛替尼)，双重抑制剂(例如E7080)，多重激酶抑制剂(例如AZD0530、JI-101、索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼)，ON 01910.Na)，VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗、BIBF 1120、西地尼布、AZD2171)， PDGFR抑制剂(例如，IMC-
3G3)，紫杉醇，拓扑异构酶抑制剂(例如卡瑞特霉素、伊立替康)，HDAC抑制剂(例如，丙戊酸、伏立诺他)，叶酸受体抑制剂 (例如，法仑单抗)，血管生成素抑制剂(例如AMG 386)，埃博霉素类似物(例如依沙贝比隆)，蛋白酶体抑制剂(例如卡非佐米)，IGF-1受体抑制剂(例如
OSI 906、AMG 479)，PARP抑制剂(例如韦利帕利布、AG014699、依尼泊利、 MK-4827)，Aurora激酶抑制剂(例如MLN8237、ENMD-2076)，血管生成抑制剂(例如来那度胺)，DHFR抑制剂(例如普雷西酯)，放射免疫治疗性试剂(例如Hu3S193)，他汀(例如洛伐他汀)，拓扑异构酶1抑制剂(例如NKTR-102)，癌症疫苗(例如p53合成长肽疫苗、自体OC-DC疫苗)，mTOR抑制剂(例如替西罗莫司、依维莫司)，BCR/ABL抑制剂(例如伊马替尼)，ET-A受体拮抗剂 (例如
ZD4054)，TRAIL受体2(TR-2)激动剂(例如CS-1008)，HGF/SF抑制剂(例如AMG 102)，EGEN-
001，Polo样激酶1抑制剂(例如，BI 6727)，γ- 分泌酶抑制剂(例如，RO4929097)，Wee-1抑制剂(例如，MK-1775)，抗微管蛋白剂(例如，长春瑞滨、E7389)，免疫毒素(例如，地尼白介素)，SB-485232，血管破坏试剂(例如AVE8062)，整联蛋白抑制剂(例如EMD 525797)，驱动蛋白纺锤抑制剂(例如4SC-205)，雷利米得，HER2抑制剂(例如MGAH22)， ErrB3抑制剂(例如
MM-121)，放射疗法及其组合。
3G3)，紫杉醇，拓扑异构酶抑制剂(例如卡瑞特霉素、伊立替康)，HDAC抑制剂(例如，丙戊酸、伏立诺他)，叶酸受体抑制剂 (例如，法仑单抗)，血管生成素抑制剂(例如AMG 386)，埃博霉素类似物(例如依沙贝比隆)，蛋白酶体抑制剂(例如卡非佐米)，IGF-1受体抑制剂(例如
OSI 906、AMG 479)，PARP抑制剂(例如韦利帕利布、AG014699、依尼泊利、 MK-4827)，Aurora激酶抑制剂(例如MLN8237、ENMD-2076)，血管生成抑制剂(例如来那度胺)，DHFR抑制剂(例如普雷西酯)，放射免疫治疗性试剂(例如Hu3S193)，他汀(例如洛伐他汀)，拓扑异构酶1抑制剂(例如NKTR-102)，癌症疫苗(例如p53合成长肽疫苗、自体OC-DC疫苗)，mTOR抑制剂(例如替西罗莫司、依维莫司)，BCR/ABL抑制剂(例如伊马替尼)，ET-A受体拮抗剂 (例如
ZD4054)，TRAIL受体2(TR-2)激动剂(例如CS-1008)，HGF/SF抑制剂(例如AMG 102)，EGEN-
001，Polo样激酶1抑制剂(例如，BI 6727)，γ- 分泌酶抑制剂(例如，RO4929097)，Wee-1抑制剂(例如，MK-1775)，抗微管蛋白剂(例如，长春瑞滨、E7389)，免疫毒素(例如，地尼白介素)，SB-485232，血管破坏试剂(例如AVE8062)，整联蛋白抑制剂(例如EMD 525797)，驱动蛋白纺锤抑制剂(例如4SC-205)，雷利米得，HER2抑制剂(例如MGAH22)， ErrB3抑制剂(例如
MM-121)，放射疗法及其组合。
[0953] 合适治疗剂的示例单独或与以下一种或多种组合使用用于治疗骨髓瘤：化学疗法或其他抗癌剂(例如沙利度胺类似物，例如来那度胺)、HSCT(Cook,R.(2008) J Manag Care Pharm.14(7Suppl)：19-25)、抗TIM3抗体(Hallett,WHD等人 (2011)J of American
Society for Blood and Marrow Transplantation 17(8)： 1133-145)、肿瘤抗原脉冲树
突状细胞、肿瘤细胞与树突状细胞的融合(例如电融合)、或用恶性浆细胞产生的免疫球蛋
白独特型疫苗接种(在Yi,Q.(2009)Cancer J.15(6)：502-10中综述)。
Society for Blood and Marrow Transplantation 17(8)： 1133-145)、肿瘤抗原脉冲树
突状细胞、肿瘤细胞与树突状细胞的融合(例如电融合)、或用恶性浆细胞产生的免疫球蛋
白独特型疫苗接种(在Yi,Q.(2009)Cancer J.15(6)：502-10中综述)。
[0954] 与本发明的组合物一起使用的用于治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的合适治疗剂的实例包括但不限于化学治疗剂(例如氟达拉滨、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、苯丁酸氮芥、苯达莫司汀、苯丁酸氮芥、白消安、吉西他滨、美法仑、喷司他丁、米托蒽醌、5-氮杂胞苷、培美曲塞二钠)，酪氨酸激酶抑制剂(例如 EGFR抑制剂(例如埃洛替尼)，BTK抑制剂(例如
PCI-32765)，多重激酶抑制剂(例如MGCD265、RGB-286638)，CD-20靶向剂(例如利妥昔单抗、奥法木单抗、RO5072759、LFB-R603)，CD52靶向剂(例如阿仑单抗)，泼尼松龙，达比泊汀α，来那度胺，Bcl-2抑制剂(例如ABT-263)，免疫疗法(例如同种异体 CD4+记忆Th1样T细胞/微粒结合的抗CD3/抗CD28、自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK))，HDAC抑制剂(例如伏立诺他、丙戊酸、LBH589、JNJ-26481585、 AR-42)，XIAP抑制剂(例如，AEG35156)，CD-74靶向剂(例如米拉珠单抗)， mTOR抑制剂(例如依维莫司)，AT-101，免疫毒素(例如CAT-8015、抗Tac(Fv) -PE38(LMB-2))，CD37靶向剂(例如TRU-016)，放射免疫疗法(例如131- 托西单抗)，羟氯喹，哌立福新，SRC抑制剂(例如达沙替尼)，沙利度胺，PI3Kδ抑制剂(例如CAL-101)，类维生素A(例如芬维A胺)，MDM2拮抗剂(例如 RO5045337)，普乐沙福，Aurora激酶抑制剂(例如
MLN8237、TAK-901)，蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)，CD-19靶向剂(例如MEDI-551、
MOR208)， MEK抑制剂(例如ABT-348)，JAK-2抑制剂(例如，INCB018424)，缺氧激活的前药(例如，TH-302)，紫杉醇或紫杉醇试剂，HSP90抑制剂，AKT抑制剂(例如，MK2206)，HMG-CoA抑制剂(例如，辛伐他汀)，GNKG186，放射疗法，骨髓移植，干细胞移植及其组合。
PCI-32765)，多重激酶抑制剂(例如MGCD265、RGB-286638)，CD-20靶向剂(例如利妥昔单抗、奥法木单抗、RO5072759、LFB-R603)，CD52靶向剂(例如阿仑单抗)，泼尼松龙，达比泊汀α，来那度胺，Bcl-2抑制剂(例如ABT-263)，免疫疗法(例如同种异体 CD4+记忆Th1样T细胞/微粒结合的抗CD3/抗CD28、自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK))，HDAC抑制剂(例如伏立诺他、丙戊酸、LBH589、JNJ-26481585、 AR-42)，XIAP抑制剂(例如，AEG35156)，CD-74靶向剂(例如米拉珠单抗)， mTOR抑制剂(例如依维莫司)，AT-101，免疫毒素(例如CAT-8015、抗Tac(Fv) -PE38(LMB-2))，CD37靶向剂(例如TRU-016)，放射免疫疗法(例如131- 托西单抗)，羟氯喹，哌立福新，SRC抑制剂(例如达沙替尼)，沙利度胺，PI3Kδ抑制剂(例如CAL-101)，类维生素A(例如芬维A胺)，MDM2拮抗剂(例如 RO5045337)，普乐沙福，Aurora激酶抑制剂(例如
MLN8237、TAK-901)，蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)，CD-19靶向剂(例如MEDI-551、
MOR208)， MEK抑制剂(例如ABT-348)，JAK-2抑制剂(例如，INCB018424)，缺氧激活的前药(例如，TH-302)，紫杉醇或紫杉醇试剂，HSP90抑制剂，AKT抑制剂(例如，MK2206)，HMG-CoA抑制剂(例如，辛伐他汀)，GNKG186，放射疗法，骨髓移植，干细胞移植及其组合。
[0955] 用于组合治疗急性淋巴细胞性白血病(ALL)的合适治疗剂的例子包括但不限于：化学治疗剂(例如泼尼松龙、地塞米松、长春新碱、天冬酰胺酶、柔红霉素、环磷酰胺、阿糖胞苷、依托泊苷、硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、氯法拉滨、安那霉素脂质体、白消安、依托泊苷、卡培他滨、地西他滨、阿扎胞苷、托泊替康、替莫唑胺)，酪氨酸激酶抑制剂(例如BCR/ABL抑制剂(例如伊马替尼、尼洛替尼)， ON 01910.Na，多重激酶抑制剂(例如索拉非尼)，CD-20靶向剂(例如，利妥昔单抗)，CD52靶向剂(例如，阿伦单抗)，HSP90抑制剂(例如STA-9090)， mTOR抑制剂(例如依维莫司、雷帕霉素)，JAK-2抑制剂(例如INCB018424)， HER2/neu受体抑制剂(例如曲妥珠单抗)，蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)，甲氨蝶呤，天冬酰胺酶，CD-22靶向剂(例如，依帕妥珠单抗、诺妥珠单抗)，免疫疗法(例如自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，AHN-
12)，博纳吐单抗 (blinatumomab)，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如UCN-01)，CD45靶向剂(例如BC8)，MDM2拮抗剂(例如RO5045337)，免疫毒素(例如CAT-8015、 DT2219ARL)，
HDAC抑制剂(例如JNJ-26481585)，JVRS-100，紫杉醇或紫杉醇试剂，STAT3抑制剂(例如OPB-
31121)，PARP抑制剂(例如，韦利帕利布)， EZN-2285，放射疗法，类固醇，骨髓移植，干细胞移植或其组合。
12)，博纳吐单抗 (blinatumomab)，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如UCN-01)，CD45靶向剂(例如BC8)，MDM2拮抗剂(例如RO5045337)，免疫毒素(例如CAT-8015、 DT2219ARL)，
HDAC抑制剂(例如JNJ-26481585)，JVRS-100，紫杉醇或紫杉醇试剂，STAT3抑制剂(例如OPB-
31121)，PARP抑制剂(例如，韦利帕利布)， EZN-2285，放射疗法，类固醇，骨髓移植，干细胞移植或其组合。
[0956] 用于组合治疗急性髓细胞性白血病(AML)的合适治疗剂的例子包括但不限于化学治疗剂(例如阿糖胞苷、柔红霉素、伊达比星、氯法拉滨、地西他滨、伏沙罗辛、阿扎胞苷、氯法拉滨、利巴韦林、CPX-351、曲奥舒凡、依拉西滨、阿扎胞苷)，酪氨酸激酶抑制剂(例如BCR/ABL抑制剂(例如伊马替尼、尼罗替尼)， ON 01910.Na，多重激酶抑制剂(例如，米多牛磺酸、SU 11248、奎扎替尼、索拉非尼)，免疫毒素(例如，吉妥单抗)，DT388IL3融合蛋白，HDAC抑制剂(例如，伏立诺他、LBH589)，普乐沙福，mTOR抑制剂(例如，依维莫司),SRC 抑制剂(例如，达沙替尼)，HSP90抑制剂(例如STA-9090)，类维生素A(例如贝沙罗汀)，Aurora激酶抑制剂(例如BI 811283)，JAK-2抑制剂(例如 INCB018424)，Polo样激酶抑制剂(例如BI 6727)，森纳森，CD45靶向剂(例如BC8)，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如UCN-01)，MDM2拮抗剂(例如RO5045337)，mTOR抑制剂(例如依维莫司)，LY573636-钠，ZRx-101，MLN4924，来那度胺，免疫疗法(例如AHN-12)，二盐酸组胺，放射疗法，骨髓移植，干细胞移植及其组合。
[0957] 与本发明的组合物一起使用用于治疗多发性骨髓瘤(MM)的合适治疗剂的实例包括但不限于：化学治疗剂(例如美法仑、氨磷汀、环磷酰胺、阿霉素、氯法拉滨、苯达莫司汀、氟达拉滨、阿霉素、SyB L-0501)，沙利度胺，来那度胺，地塞米松，泼尼松，泊马利度胺，蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、卡非佐米、 MLN9708)，癌症疫苗(例如GVAX)，CD-40靶向剂(例如SGN-40、CHIR-12.12)，哌立福新，唑来膦酸，免疫疗法(例如MAGE-A3、NY-ESO-1、HuMax-CD38)， HDAC抑制剂(例如，伏立诺他、LBH589、AR-42)，阿普丁，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如PD-0332991、迪那昔布)，三氧化二砷，CB3304，HSP90 抑制剂(例如KW-2478)，酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂(例如西妥昔单抗)、多重激酶抑制剂(例如AT9283))，
VEGF抑制剂(例如贝伐单抗)，普乐沙福，MEK抑制剂(例如AZD6244)，IPH2101，阿托伐他汀，免疫毒素(例如BB-10901)，NPI-0052，放射免疫治疗药(例如，钇Y90替伊莫单抗)，STAT3 抑制剂(例如OPB-31121)，MLN4924，Aurora激酶抑制剂(例如EN MD-2076)， IMGN901，ACE-
041，CK-2抑制剂(例如CX-4945)，放射疗法，骨髓移植，干细胞移植及其组合。
VEGF抑制剂(例如贝伐单抗)，普乐沙福，MEK抑制剂(例如AZD6244)，IPH2101，阿托伐他汀，免疫毒素(例如BB-10901)，NPI-0052，放射免疫治疗药(例如，钇Y90替伊莫单抗)，STAT3 抑制剂(例如OPB-31121)，MLN4924，Aurora激酶抑制剂(例如EN MD-2076)， IMGN901，ACE-
041，CK-2抑制剂(例如CX-4945)，放射疗法，骨髓移植，干细胞移植及其组合。
[0958] 与本发明的组合物一起使用的用于治疗前列腺癌的合适治疗剂的实例包括但不限于，化学治疗剂(例如多西紫杉醇、卡铂、氟达拉滨)，阿比特龙，激素疗法(例如氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特、醋酸环丙孕酮、酮康唑、氨基谷氨酰胺、阿巴雷克斯、地加瑞克、亮丙瑞林、戈瑟瑞林、曲普瑞林、布塞林)，酪氨酸激酶抑制剂(例如双重激酶抑制剂(例如拉帕替尼)、多重激酶抑制剂(例如索拉非尼、舒尼替尼))，VEGF抑制剂(例如贝伐单抗)，TAK-700，癌症疫苗(例如BPX-101、PEP223)，来那度胺，TOK-001，IGF-1受体抑制剂(例如西妥木单
抗)，TRC105，Aurora A激酶抑制剂(例如MLN8237)，蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)，OGX-
011，放射免疫疗法(例如HuJ591-GS)，HDAC抑制剂(例如丙戊酸、SB939、LBH589)，羟氯喹，mTOR抑制剂(例如，依维莫司)，乳酸多维替尼，二吲哚基甲烷，依非韦伦，OGX-427，染料木黄酮，IMC-3G3，巴非替尼，CP-675,206，放射疗法，手术或其组合。
抗)，TRC105，Aurora A激酶抑制剂(例如MLN8237)，蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)，OGX-
011，放射免疫疗法(例如HuJ591-GS)，HDAC抑制剂(例如丙戊酸、SB939、LBH589)，羟氯喹，mTOR抑制剂(例如，依维莫司)，乳酸多维替尼，二吲哚基甲烷，依非韦伦，OGX-427，染料木黄酮，IMC-3G3，巴非替尼，CP-675,206，放射疗法，手术或其组合。
[0959] 组合疗法可以与一种或多种现有的癌症治疗方式组合施用，所述方式包括但不限于：手术；放射疗法(例如涉及设计放射场的三维适形放射疗法的外部束疗法，局部放射(例如定向到预选靶标或器官的放射)或聚焦放射)。聚焦放射可以选自立体定向放射手术、分
级立体定向放射手术和调强放射疗法。聚焦放射可以具有选自例如粒子束(质子)、钴60(光子)和线性加速器(x-射线)的放射源，例如，如WO2012/177624中所述，其通过整体引用并入本文。
级立体定向放射手术和调强放射疗法。聚焦放射可以具有选自例如粒子束(质子)、钴60(光子)和线性加速器(x-射线)的放射源，例如，如WO2012/177624中所述，其通过整体引用并入本文。
[0960] 放射治疗可以通过几种方法中的一种或多种方法组合施用，包括外部束疗法、内部放射疗法、植入放射、立体定向放射手术、全身放射疗法、放射疗法以及永久性或临时性间质近距离放射疗法。术语“近距离放射疗法”是指在肿瘤或其他增殖性组织疾病部位处或附近通过空间受限的放射活性物质插入体内进行递送的放射疗法。该术语旨在但不限于包
括暴露于放射活性同位素(例如，At-211、I-131、 I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-
212、P-32、以及Lu的放射活性同位素)。用作本公开的细胞调节剂的合适的放射源包括固体和液体。作为非限制性示例，放射源可以是放射性核素，例如作为固体源的I-125、I-131、Yb-169、Ir-192，作为固体源的I-125或其他发射光子、β粒子、伽马射线的放射性核素或其他治疗性射线。放射性物质也可以是由放射性核素的任何溶液制成的流体，例如，可以是I-
125或I-131的溶液，或使用包含固体放射性核素小颗粒(例如Au-198、Y-90) 的合适流体的浆液制备的放射性流体。此外，放射性核素可以嵌入凝胶或放射活性微球中。
括暴露于放射活性同位素(例如，At-211、I-131、 I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-
212、P-32、以及Lu的放射活性同位素)。用作本公开的细胞调节剂的合适的放射源包括固体和液体。作为非限制性示例，放射源可以是放射性核素，例如作为固体源的I-125、I-131、Yb-169、Ir-192，作为固体源的I-125或其他发射光子、β粒子、伽马射线的放射性核素或其他治疗性射线。放射性物质也可以是由放射性核素的任何溶液制成的流体，例如，可以是I-
125或I-131的溶液，或使用包含固体放射性核素小颗粒(例如Au-198、Y-90) 的合适流体的浆液制备的放射性流体。此外，放射性核素可以嵌入凝胶或放射活性微球中。
[0961] 7.治疗方法
[0962] 本发明还涵盖治疗受试者癌症的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的试剂(例如，治疗组合或多特异性抗原结合分子)，如上文和本文其他地方所广泛描述的。
[0963] 根据本发明，提出拮抗RANKL以及拮抗至少一种ICM的本发明试剂(例如，治疗组合和多特异性抗原结合分子)，可治疗性用于诊断出癌症或肿瘤后，或可预防性用于受试者发展为癌症或肿瘤之前。因此，本发明提供了拮抗RANKL和至少一种ICM的治疗组合、多特异性抗原结合分子和药物组合物，其用于(a)治疗癌症、(b)延缓癌症的进展、c)延长患有癌症患者的存活、或(d)刺激细胞介导的针对癌症的免疫反应。因此，本发明还提供了用于(a)治疗癌症、(b) 延缓癌症的进展、(c)延长患有癌症患者的存活、或(d)刺激细胞介导的针对癌症的免疫反应的方法。可以根据本发明的实践适当治疗的癌症包括黑色素瘤、乳癌、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜和子宫癌、胃或胃癌、胰腺癌、前列腺癌、唾液腺癌、肺癌、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌、直肠癌、结肠直肠癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆道肿瘤、头颈癌和鳞状细胞癌。
[0964] 可以基于患者已经诊断出的特定疾病、或者结合患者疾病的分期，建立针对任何给定受试者的具体的同时和/或顺序给药方案。例如，如果患者被诊断患有侵袭性较低的癌症或处于早期阶段的癌症，则该患者在同时施用抗RANKL试剂和之后的抗ICM试剂时、和/或顺序施用抗RANKL试剂和之后的抗ICM试剂时，可能具有增加的获得临床益处和/或免疫相
关反应的可能性。可选地，如果患者被诊断患有侵袭性较高的癌症或处于晚期阶段的癌症，则该患者对所述同时和/或顺序施用，可能具有降低的获得临床益处和/或免疫相关反应的
可能性，因此可建议应施用更高剂量的所述抗RANKL试剂和/或所述抗ICM试剂疗法，或者可能需要采取更具侵袭性的给药方案或试剂或组合疗法。一方面，抗RANKL抗原结合分子(例
如地诺单抗)的增加剂量水平将比针对特定适应症或个体的典型抗RANKL 试剂剂量(例如，
约0.3mg/kg、约1mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg kg、约25mg/kg、约30mg/kg)多约10、20、30、40、50、60、70、80、 90或95％，或抗RANKL试剂是比针对特定适应症或个体的典型剂量高约1.5、2、 2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10倍。在另一方面，抗ICM试剂的增加的剂量水平将比针对特定适应症或个体的典型抗PD-1试剂剂量(例如，约0.03 mg/kg、
0.1mg/kg、0.3mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg；
或约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约 8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约
14mg、约15mg 或约16mg)多约10、20、30、40、50、60、70、80、90或95％，或抗ICM试剂是用于特定适应症的典型剂量的约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9 或10倍。
关反应的可能性。可选地，如果患者被诊断患有侵袭性较高的癌症或处于晚期阶段的癌症，则该患者对所述同时和/或顺序施用，可能具有降低的获得临床益处和/或免疫相关反应的
可能性，因此可建议应施用更高剂量的所述抗RANKL试剂和/或所述抗ICM试剂疗法，或者可能需要采取更具侵袭性的给药方案或试剂或组合疗法。一方面，抗RANKL抗原结合分子(例
如地诺单抗)的增加剂量水平将比针对特定适应症或个体的典型抗RANKL 试剂剂量(例如，
约0.3mg/kg、约1mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg kg、约25mg/kg、约30mg/kg)多约10、20、30、40、50、60、70、80、 90或95％，或抗RANKL试剂是比针对特定适应症或个体的典型剂量高约1.5、2、 2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10倍。在另一方面，抗ICM试剂的增加的剂量水平将比针对特定适应症或个体的典型抗PD-1试剂剂量(例如，约0.03 mg/kg、
0.1mg/kg、0.3mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg；
或约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约 8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约
14mg、约15mg 或约16mg)多约10、20、30、40、50、60、70、80、90或95％，或抗ICM试剂是用于特定适应症的典型剂量的约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9 或10倍。
[0965] 例如，如果抗RANKL试剂和/或抗ICM试剂是生物试剂，则优选将其治疗有效量注射到受试者体内。所使用的实际剂量可以根据患者的需求和所治疗病症的严重性而变化。确
定特定情况下合适的起始剂量在本领域技术人员的知识范围之内，尽管治疗方案的分配将
受益于考虑的适应症和疾病的分期。尽管如此，应该理解，任何特定受试者的具体剂量水平和给药频率可以改变，并且取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、患者的种类、年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用方式和时间、排泄率、药物组合以及特定病症的严重性。优选的治疗受试者包括动物，最优选哺乳动物物种，例如人类，以及家畜动物例如狗、猫等患有癌症的患者。
定特定情况下合适的起始剂量在本领域技术人员的知识范围之内，尽管治疗方案的分配将
受益于考虑的适应症和疾病的分期。尽管如此，应该理解，任何特定受试者的具体剂量水平和给药频率可以改变，并且取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、患者的种类、年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用方式和时间、排泄率、药物组合以及特定病症的严重性。优选的治疗受试者包括动物，最优选哺乳动物物种，例如人类，以及家畜动物例如狗、猫等患有癌症的患者。
[0966] 8.试剂盒
[0967] 本发明的另一个实施方案是用于治疗受试者癌症的试剂盒。该试剂盒包含本文公开的任何药物组合物。
[0968] 为了在本发明的试剂盒中使用，药物组合物包含合适的治疗组合和/或多特异性抗原结合分子，并且任选地具有用于癌症治疗的说明书。试剂盒还可以包含用于每种药物
组合物的合适的储存容器(例如，安瓿、小瓶、试管等)和其他包括的试剂(例如缓冲液、平衡盐溶液等)，用于将药物组合物施用给受试者。药物组合物和其他试剂可以以任何方便的形式存在于试剂盒中，例如以粉末药物组合物的溶液形式存在。试剂盒可进一步包括包装容
器，该包装容器任选地具有一个或多个用于容纳药物组合物和其他任选试剂的隔室。
组合物的合适的储存容器(例如，安瓿、小瓶、试管等)和其他包括的试剂(例如缓冲液、平衡盐溶液等)，用于将药物组合物施用给受试者。药物组合物和其他试剂可以以任何方便的形式存在于试剂盒中，例如以粉末药物组合物的溶液形式存在。试剂盒可进一步包括包装容
器，该包装容器任选地具有一个或多个用于容纳药物组合物和其他任选试剂的隔室。
[0969] 为了可以容易地理解本发明并将其付诸实践，现在将通过以下非限制性实施例描述特定的优选实施方案。
[0970] 实施例
[0971] 实施例1
[0972] 共同阻断CTLA4和RANKL对肺转移的抑制取决于NK细胞和IFN-γ
[0973] 在携带实验性B16F10黑色素瘤肺转移的小鼠中，与用抗体单独或对照免疫球蛋白(cIg)治疗的小鼠相比，用仓鼠抗CTLA4(UC10-4F10)和大鼠抗RANKL (IK22/5)MAb组合治疗
的野生型(WT)小鼠表现出对转移的优越耐受性(图 1A)。在耗尽CD8+或NK细胞的野生型小
鼠或缺乏穿孔素或IFNγ的小鼠中确认了抗CTLA4和抗RANKL组合疗法的作用机制。如图1B
所示，该组合的功效依赖于NK细胞而不是CD8+ T细胞的存在，而IFNγ是关键的并且穿孔素在较小程度上起作用(图1C)。在用相同的抗CTLA4和抗RANKL组合疗法治疗后，对前列腺癌
RM-1实验性肺转移的有效控制，证实了对NK细胞的类似依赖性(图 1D)。
的野生型(WT)小鼠表现出对转移的优越耐受性(图 1A)。在耗尽CD8+或NK细胞的野生型小
鼠或缺乏穿孔素或IFNγ的小鼠中确认了抗CTLA4和抗RANKL组合疗法的作用机制。如图1B
所示，该组合的功效依赖于NK细胞而不是CD8+ T细胞的存在，而IFNγ是关键的并且穿孔素在较小程度上起作用(图1C)。在用相同的抗CTLA4和抗RANKL组合疗法治疗后，对前列腺癌
RM-1实验性肺转移的有效控制，证实了对NK细胞的类似依赖性(图 1D)。
[0974] 实施例2
[0975] 抗RANKL与CTLA4抗体IGG2A同种型的最佳协同作用
[0976] 鉴于已报道抗CTLA4的免疫球蛋白恒定区影响抗肿瘤活性(Selby等人，2013, Cancer Immunol.Res.,1(1)：32-42))，接下来，发明人评估了不同的抗CTLA4 抗体同种型如何与抗RANKL协同作用而抑制实验性B16F10肺转移(图2)。9D9 是已经产生多种同种型的
抗CTLA4克隆，包括小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b；而另一种同种型(IgG1-D265A)含有消除与所有Fcγ受体(FcγR)结合的突变(Selby 等人，2013同上)。如图2A所示，与抗CTLA4的仓鼠克隆(倒置的实心三角形) 相比，单独的抗CTLA4的IgG2a同种型(实心圆圈)对肺转移的抑制
作用更大，并且随着向任一抗CTLA4克隆添加抗RANKL，这种抑制作用进一步增强。类似地，用小鼠IgG2a抗CTLA4和抗RANKL组合治疗也观察到RM-1和LWT1肺转移的显著抑制(图2C)。
抗CTLA4克隆，包括小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b；而另一种同种型(IgG1-D265A)含有消除与所有Fcγ受体(FcγR)结合的突变(Selby 等人，2013同上)。如图2A所示，与抗CTLA4的仓鼠克隆(倒置的实心三角形) 相比，单独的抗CTLA4的IgG2a同种型(实心圆圈)对肺转移的抑制
作用更大，并且随着向任一抗CTLA4克隆添加抗RANKL，这种抑制作用进一步增强。类似地，用小鼠IgG2a抗CTLA4和抗RANKL组合治疗也观察到RM-1和LWT1肺转移的显著抑制(图2C)。
[0977] 有趣的是，与抗CTLA4-IgG2a同种型(实心圆圈)相比，单独的其他三种抗 CTLA4同种型(IgG2b(实心菱形)、IgG1(实心正方形)或IgG1-D265A(实心六边形))在抑制肺转移方
面不那么有效，因为与cIg治疗组(实心三角形)相比，它们没有导致显著抑制转移(图2B)。
然而，与cIg(实心三角形)相比，向仓鼠(空心倒三角形)或小鼠IgG2b(空心菱形)同种型抗
CTLA4添加抗RANKL 可以显著抑制肺转移。然而，用抗RANKL和抗CTLA4-IgG2a克隆治疗的组(空心圆圈)显著优于抗RANKL和抗CTLA4-IgG2b的组合(图2B)。总体而言，单独的抗RANKL治疗并不能显著抑制转移，尽管与特定的抗CTLA4同种型(尤其是IgG2a同种型)组合使用时，
可以显著改善转移的控制(图2A，B)。
面不那么有效，因为与cIg治疗组(实心三角形)相比，它们没有导致显著抑制转移(图2B)。
然而，与cIg(实心三角形)相比，向仓鼠(空心倒三角形)或小鼠IgG2b(空心菱形)同种型抗
CTLA4添加抗RANKL 可以显著抑制肺转移。然而，用抗RANKL和抗CTLA4-IgG2a克隆治疗的组(空心圆圈)显著优于抗RANKL和抗CTLA4-IgG2b的组合(图2B)。总体而言，单独的抗RANKL治疗并不能显著抑制转移，尽管与特定的抗CTLA4同种型(尤其是IgG2a同种型)组合使用时，
可以显著改善转移的控制(图2A，B)。
[0978] 实施例3
[0979] 抗-RANKL和抗-CTLA4抑制皮下B16F10黑色素瘤的生长
[0980] 接下来，在携带皮下B16F10黑色素瘤的小鼠中评估了RANKL和CTLA4双重阻断的功效，皮下B16F10黑色素瘤通常免疫原性较差(图3)。与肺转移模型相似，再次证实了组合治疗比单一疗法更好地抑制生长，尽管与抗CTLA4仓鼠同种型的组合作用并不显著。
[0981] 实施例4
[0982] 抗RANKL和抗CTLA4抑制皮下B16F10黑色素瘤的生长
[0983] 与肺转移模型相似，组合治疗再次依赖于抗体同种型，抗CTLA4-IgG2a同种型(图4A)而非仓鼠同种型(图3)，观察到显著的生长抑制。进行了七个独立合并实验的纵向分析，将抗CTLA4-IgG2a或抗CTLA4的FcR-非接合克隆 (IgG1-D265A)和/或抗RANKL与对照Ig进行
了比较(图4C)。总体而言，数据表明，与单一疗法或cIg相比，抗CTLA4-IgG2a与抗RANKL的组合显著抑制了肿瘤生长(图4C)。相反，抗CTLA4-IgG1-D265A和抗RANKL的组合优于cIg 治疗的组，但不优于任一种单一疗法的治疗(图4C)。类似地，与各个单一疗法治疗组相比，用含有抗CTLA4-IgG2a同种型的组合疗法治疗的小鼠终点肿瘤质量也显著降低。然而，与抗
CTLA4-IgG1-D265A单独治疗的小鼠相比，用包含抗 CTLA4-IgG1-D265A同种型的组合疗法
治疗的组中未观察到这种益处(图4B)。
了比较(图4C)。总体而言，数据表明，与单一疗法或cIg相比，抗CTLA4-IgG2a与抗RANKL的组合显著抑制了肿瘤生长(图4C)。相反，抗CTLA4-IgG1-D265A和抗RANKL的组合优于cIg 治疗的组，但不优于任一种单一疗法的治疗(图4C)。类似地，与各个单一疗法治疗组相比，用含有抗CTLA4-IgG2a同种型的组合疗法治疗的小鼠终点肿瘤质量也显著降低。然而，与抗
CTLA4-IgG1-D265A单独治疗的小鼠相比，用包含抗 CTLA4-IgG1-D265A同种型的组合疗法
治疗的组中未观察到这种益处(图4B)。
[0984] 实施例5
[0985] 肿瘤微环境中的RANKL和RANK表达
[0986] 接下来定义了RANKL和RANK在B16F10肿瘤微环境(TME)中的表达(图 5)。大部分肿瘤内的RANKL由一小部分T细胞表达，在较早的时间点(第9天) 表达更高，并且在肿瘤中的
表达高于脾脏，与CD4+T细胞相比，更多CD8+ T细胞在肿瘤中表达RANKL(图5A)。总体而言，约
20％的肿瘤浸润白细胞(TIL) 表达RANK(尽管范围可能相当大)，其中超过90％染色CD11b
(数据未显示)，表明肿瘤内RANK几乎仅由肿瘤浸润髓细胞表达。大约40％的肿瘤浸润巨噬
细胞 (TAM)、60％的MDSC和少量但不同比例(5-20％)的DC表达RANK(图4B)。用抗RANKL处理不会显著改变这些细胞类型上的髓样RANK表达(图5B)。最近，报道了在B16黑色素瘤模型
中，Ly6C低MHCII高肿瘤内巨噬细胞具有与炎性 M1亚型一致的RNA表达谱，而那些具有MHCII低/阴性
表达的细胞被认为具有免疫抑制性M2表型(De Henau等人，2016,Nature,539(7629)：
443-7)。值得注意的是，在发明人的B16F10模型中，与不表达RANK的那些细胞相比，较高比例的表达RANK的Ly6C/Ly6G(GR-1)低TAM具有阴性或低的MHCII表达，这表明表达RANK的TAM
群可能是比那些不表达RANK的TAM更具抑制性(数据未显示)。然而，抗RANKL治疗并未改变
+
CD11b 髓样TIL的比例，在B16F10 或RM-1皮下肿瘤中表达CD206(M2标记物)的TAM的比例
(数据未显示)。少于1％的表达RANKL或RANK细胞是CD45.2阴性的(表明体内任一肿瘤内表
达水平都可以忽略不计)，此外，当通过流式细胞术评估时，本研究中使用的所有肿瘤细胞系均为RANKL或RANK表达阴性(数据未显示)。
表达高于脾脏，与CD4+T细胞相比，更多CD8+ T细胞在肿瘤中表达RANKL(图5A)。总体而言，约
20％的肿瘤浸润白细胞(TIL) 表达RANK(尽管范围可能相当大)，其中超过90％染色CD11b
(数据未显示)，表明肿瘤内RANK几乎仅由肿瘤浸润髓细胞表达。大约40％的肿瘤浸润巨噬
细胞 (TAM)、60％的MDSC和少量但不同比例(5-20％)的DC表达RANK(图4B)。用抗RANKL处理不会显著改变这些细胞类型上的髓样RANK表达(图5B)。最近，报道了在B16黑色素瘤模型
中，Ly6C低MHCII高肿瘤内巨噬细胞具有与炎性 M1亚型一致的RNA表达谱，而那些具有MHCII低/阴性
表达的细胞被认为具有免疫抑制性M2表型(De Henau等人，2016,Nature,539(7629)：
443-7)。值得注意的是，在发明人的B16F10模型中，与不表达RANK的那些细胞相比，较高比例的表达RANK的Ly6C/Ly6G(GR-1)低TAM具有阴性或低的MHCII表达，这表明表达RANK的TAM
群可能是比那些不表达RANK的TAM更具抑制性(数据未显示)。然而，抗RANKL治疗并未改变
+
CD11b 髓样TIL的比例，在B16F10 或RM-1皮下肿瘤中表达CD206(M2标记物)的TAM的比例
(数据未显示)。少于1％的表达RANKL或RANK细胞是CD45.2阴性的(表明体内任一肿瘤内表
达水平都可以忽略不计)，此外，当通过流式细胞术评估时，本研究中使用的所有肿瘤细胞系均为RANKL或RANK表达阴性(数据未显示)。
[0987] 实施例6
[0988] 抗RANKL和抗CTLA4-IGG2A组合治疗的抗肿瘤功效是FcrRIV受体、IFNγ和CD8+ T细胞依赖性的。
[0989] 接下来，本发明人在皮下B16F10肿瘤模型中评估了抗RANKL与抗 CTLA4-IgG2a的组合功效对Fc受体以及效应淋巴细胞的存在和功能的依赖性(图 6)。与已知的抗CTLA4-
IgG2a的作用机理一致，在缺乏FcγRIV或FcEγR，而非 FcγRIII的小鼠中，针对B16F10与抗RANKL的组合活性消失(图6A)。尽管抗 CTLA4 MAb是FcγRIV依赖性的，但尚不清楚阻断
RANKL是否也有类似的需求。接下来，通过选择性耗尽各个亚群，来评估CD8+T细胞和NK细胞在通过抗 CTLA4-mIgG2a和抗RANKL以控制B16F10肿瘤生长中的作用(图6B)。当CD8+ T细胞
被耗尽时，组合治疗的抗肿瘤功效几乎被完全消除。相反，NK细胞的耗尽没有作用，证明了这种组合治疗对CD8+ T细胞的依赖性(图6B)。与在转移环境中观察到的结果相似，这种组
合治疗依赖于IFNγ-，但不依赖穿孔素(图6C)。通过使用缺乏转录因子Batf3的小鼠，也揭示了在这种组合治疗中交叉呈递CD8α+常规DC的重要作用；与WT治疗的小鼠相比，在这些小鼠中组合治疗的功效消失(图6D)。
IgG2a的作用机理一致，在缺乏FcγRIV或FcEγR，而非 FcγRIII的小鼠中，针对B16F10与抗RANKL的组合活性消失(图6A)。尽管抗 CTLA4 MAb是FcγRIV依赖性的，但尚不清楚阻断
RANKL是否也有类似的需求。接下来，通过选择性耗尽各个亚群，来评估CD8+T细胞和NK细胞在通过抗 CTLA4-mIgG2a和抗RANKL以控制B16F10肿瘤生长中的作用(图6B)。当CD8+ T细胞
被耗尽时，组合治疗的抗肿瘤功效几乎被完全消除。相反，NK细胞的耗尽没有作用，证明了这种组合治疗对CD8+ T细胞的依赖性(图6B)。与在转移环境中观察到的结果相似，这种组
合治疗依赖于IFNγ-，但不依赖穿孔素(图6C)。通过使用缺乏转录因子Batf3的小鼠，也揭示了在这种组合治疗中交叉呈递CD8α+常规DC的重要作用；与WT治疗的小鼠相比，在这些小鼠中组合治疗的功效消失(图6D)。
[0990] 实施例7
[0991] CTLA4和RANKL阻断后CD8+T细胞流入肿瘤
[0992] 为了进一步了解组合治疗的机制和CD8+T细胞的作用，在已经用抗CTLA4 (IgG2a)和抗RANKL的最佳组合疗法治疗的皮下B16F10肿瘤中评估了TIL的组成(图7)。当在肿瘤终
点评估时，与cIg或单一疗法治疗组相比，组合治疗中 CD45+TIL的比例显著增加(图7A)。相反，在用包含抗CTLA4-IgG1-D265A同种型的组合疗法治疗的小鼠中未观察到这种增加(数
据未显示)。组合疗法治疗组中CD45+TIL的增加主要是由于CD8+ T细胞的比例(图7B)和绝对数(图7C) 显著增加所致。再次，在包含9D9-IgG1-D265A同种型的组合治疗中没有看到这些变化(数据未显示)。
点评估时，与cIg或单一疗法治疗组相比，组合治疗中 CD45+TIL的比例显著增加(图7A)。相反，在用包含抗CTLA4-IgG1-D265A同种型的组合疗法治疗的小鼠中未观察到这种增加(数
据未显示)。组合疗法治疗组中CD45+TIL的增加主要是由于CD8+ T细胞的比例(图7B)和绝对数(图7C) 显著增加所致。再次，在包含9D9-IgG1-D265A同种型的组合治疗中没有看到这些变化(数据未显示)。
[0993] Treg(CD4+Foxp3+)的比例(作为肿瘤中CD4+T细胞的百分比)，在抗CTLA4-IgG2a单一疗法中降低(与报道的该同种型的作用机制一致(Selby等人， 2013,Cancer
Immunol.Res.,1(1)：32-42))，但是在添加抗RANKL抗体后没有进一步降低(图7D)。另外，在肿瘤的组合治疗中，CD11b+细胞上的FcγR-IV 表达没有进一步增加(数据未显示)，表明
TME中Treg耗尽的增加不能解释该组合的作用机理。在脾脏中，在治疗组之间未检测到Treg比例或数量的显著变化 (数据未显示)。总体而言，发明人得出结论，在这些模型中组合治疗的作用机制似乎不是由于更有效的Treg耗尽。
Immunol.Res.,1(1)：32-42))，但是在添加抗RANKL抗体后没有进一步降低(图7D)。另外，在肿瘤的组合治疗中，CD11b+细胞上的FcγR-IV 表达没有进一步增加(数据未显示)，表明
TME中Treg耗尽的增加不能解释该组合的作用机理。在脾脏中，在治疗组之间未检测到Treg比例或数量的显著变化 (数据未显示)。总体而言，发明人得出结论，在这些模型中组合治疗的作用机制似乎不是由于更有效的Treg耗尽。
[0994] 抗RANKL的另一潜在作用机制可能是T细胞增殖的增强。然而，与抗CTLA4 单一疗+
法相比，发明人在组合治疗组中未观察到表达Ki-67的CD8 T细胞的任何进一步的增加(图
7E)。这表明在组合治疗后在肿瘤中观察到的额外的CD8+ T 细胞可能是选择性CD8+ T细胞
募集的结果。因此，通过组合治疗流入的CD8+ T 细胞，加上缺乏抑制性免疫细胞如Treg或髓细胞的增加，可改变TME以支持抗肿瘤活性。实际上，当在早期时间点(第9天)(图7F)或在+
肿瘤终点(图7G) 测量时，注意到CD8 与Treg的比率显著增加。另外，组合治疗也显著增加了CD8+ T细胞与MDSC的比例(图7H)。重要的是，观察到的这些变化对肿瘤是特异性的，因为在这些荷瘤小鼠的脾脏中未观察到白细胞亚群比例的显著变化(数据未显示)。
法相比，发明人在组合治疗组中未观察到表达Ki-67的CD8 T细胞的任何进一步的增加(图
7E)。这表明在组合治疗后在肿瘤中观察到的额外的CD8+ T 细胞可能是选择性CD8+ T细胞
募集的结果。因此，通过组合治疗流入的CD8+ T 细胞，加上缺乏抑制性免疫细胞如Treg或髓细胞的增加，可改变TME以支持抗肿瘤活性。实际上，当在早期时间点(第9天)(图7F)或在+
肿瘤终点(图7G) 测量时，注意到CD8 与Treg的比率显著增加。另外，组合治疗也显著增加了CD8+ T细胞与MDSC的比例(图7H)。重要的是，观察到的这些变化对肿瘤是特异性的，因为在这些荷瘤小鼠的脾脏中未观察到白细胞亚群比例的显著变化(数据未显示)。
[0995] 实施例8
[0996] 抗RANKL和抗CTLA4疗法增加T细胞细胞因子的产生和多功能性
[0997] 发明人还评估了该组合免疫疗法如何在实验终点(第16天)对B16F10肿瘤中CD8和CD4+ T细胞产生的Th1细胞因子(IFNγ、TNF、IL-2)产生影响(图8)。 TNFα是离体刺激后最常见的产生的细胞因子，但与cIg或单一疗法单独相比，组合治疗后CD8+ T细胞产生的IFN
γ(图8A)和IL-2(数据未显示)中注意到显著差异。此外，组合治疗还增加了共表达IFNγ和IL-2(图8B)或IFNγ、IL-2和TNFα (图8C)的CD8+ T细胞。用CD4+ T细胞观察到相似的发现，特别是在产生的IFNγ的比例方面(图8D)。来自cIg治疗组的大多数CD8+ T细胞在刺激后不
产生细胞因子，而组合治疗产生具有最大多功能性的T细胞，单一疗法治疗组显示出中间表型(图8E)。组合治疗对细胞因子多功能性的影响是肿瘤特异性的，因为在荷瘤小鼠的脾脏T细胞中未观察到这些差异(数据未显示)。
γ(图8A)和IL-2(数据未显示)中注意到显著差异。此外，组合治疗还增加了共表达IFNγ和IL-2(图8B)或IFNγ、IL-2和TNFα (图8C)的CD8+ T细胞。用CD4+ T细胞观察到相似的发现，特别是在产生的IFNγ的比例方面(图8D)。来自cIg治疗组的大多数CD8+ T细胞在刺激后不
产生细胞因子，而组合治疗产生具有最大多功能性的T细胞，单一疗法治疗组显示出中间表型(图8E)。组合治疗对细胞因子多功能性的影响是肿瘤特异性的，因为在荷瘤小鼠的脾脏T细胞中未观察到这些差异(数据未显示)。
[0998] 实施例1-8的材料和方法
[0999] 细胞培养
[1000] 小鼠黑色素瘤细胞系B16F10(ATCC)和LWT1和前列腺癌细胞系RM-1如先前所述(Ferrari de Andrade等人，2014,Cancer Res,74：7298-7308)进行维持、注射和监测。纤维肉瘤细胞系MCA1956(源自MCA接种的C57BL/6野生型小鼠) 由Robert Schreiber(华盛顿大
学医学院，St Louis，美国密苏里州)友情提供。如所述(Dalezis等人，2012,In Vivo,26：
75-86)维持前列腺癌细胞系Tramp-C1，但是不包含脱氢异雄酮。所有细胞系均常规检测为
支原体阴性，但未常规进行细胞系鉴定。
学医学院，St Louis，美国密苏里州)友情提供。如所述(Dalezis等人，2012,In Vivo,26：
75-86)维持前列腺癌细胞系Tramp-C1，但是不包含脱氢异雄酮。所有细胞系均常规检测为
支原体阴性，但未常规进行细胞系鉴定。
[1001] 小鼠
[1002] C57BL/6野生型(WT)小鼠是在内部繁殖或从Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research购买。C57BL/6穿孔素缺陷型(pfp-/-)、干扰素缺陷型(IFNγ-/-)、 Fc受体缺陷型(FcγRIII、FcγRIV和FcεγR)、Batf3转录因子缺陷型(Batf3-/-)(如 Hildner等人，2008,Science,322：1097-1100中所述)和FoxP3-DTR(如Teng等人，2010,Cancer Res,
70：7800-7809中所述)的小鼠在QIMR Berghofer医学研究所(QIMRB)内部繁殖。所有小鼠均在6至16周龄之间使用。每次实验5至13 只小鼠的组用于实验性肿瘤转移测定和皮下
(s.c.)肿瘤生长。所有实验均由QIMRB 动物伦理委员会批准。
70：7800-7809中所述)的小鼠在QIMR Berghofer医学研究所(QIMRB)内部繁殖。所有小鼠均在6至16周龄之间使用。每次实验5至13 只小鼠的组用于实验性肿瘤转移测定和皮下
(s.c.)肿瘤生长。所有实验均由QIMRB 动物伦理委员会批准。
[1003] 抗体
[1004] 纯化的抗小鼠抗RANKL(IK22/5；大鼠IgG2a，如Kamijo S.等人，2006,Biochem Biophys Resh Commun,347：124-132中所述)、抗CTLA4(UC10-4F10，仓鼠IgG) 和对照抗体(仓鼠Ig，1-1或大鼠IgG2a，2A3)是在内部生产的或从BioXcell(West Lebanon,NH)购买的。
抗CTLA4克隆9D9(如所示为不同同种型)和对照抗体 1D12(小鼠IgG2a)由Bristol-Myers
Squibb(加利福尼亚州旧金山)提供。如所示施用抗体以耗尽NK细胞(抗-asialoGM1，Wako)
或抗CD8β(53.5.8，BioXcell)。
抗CTLA4克隆9D9(如所示为不同同种型)和对照抗体 1D12(小鼠IgG2a)由Bristol-Myers
Squibb(加利福尼亚州旧金山)提供。如所示施用抗体以耗尽NK细胞(抗-asialoGM1，Wako)
或抗CD8β(53.5.8，BioXcell)。
[1005] 皮下肿瘤模型
[1006] 为了形成B16F10(1×105)、RM-1(5×104)、MCA1956(1×106)或TRAMP-C1 (1×106)肿瘤，皮下接种细胞进入雌性(B16F10、MCA1956)或雄性(RM-1、 TRAMP-C1)小鼠的腹侧。如肿瘤接种后第3-12天所示，开始治疗性抗体治疗，每2-4天给予最多4个剂量。用数字卡尺在两个维度上测量肿瘤，肿瘤大小表示为平均值±SEM。
[1007] 实验性肺转移模型
[1008] 对指定小鼠品系尾静脉静脉内注射B16F10、RM-1或LWT1的单细胞悬液。在第14天收获肺，并在解剖显微镜下计数表面肿瘤结节。如所示进行抗体治疗，其中在相对于肿瘤接种的第-1、0和2天施用抗CTLA4和/或抗RANKL MAb。在相对于肿瘤接种的第-1、0和7天如所指示施用抗体以耗尽CD8+ T细胞或NK细胞。
[1009] 流式细胞术
[1010] 在两个时间点处死荷瘤小鼠：第9天或终点(由于肿瘤达到伦理终点大小而终止实验时)。收集肿瘤、引流淋巴结(腹股沟)和脾脏并记录湿重。如先前所述(Teng等人，2010，见上文)，从指定的器官产生单细胞悬液。
[1011] 使用以下抗体(来自Biolegend,eBioscience,BD)：CD4-BV605(RM4-5)、 CD8-BV711(53-6.7)、CD11b-BV650(M1/70)、CD11b-PE(M1/70)、CD11c-PE (N418)、纯化的CD16.2(9E9)随后是山羊抗仓鼠FITC、CD206-AF647和 CD206-PECy7(C068C2)，以及Zombie Aqua
活/死染料；TCRβ-PerCP-Cy5.5 (H57-597)、CD45.2-A780(104)、Ly6C/Ly6G(GR-1)-EF450(RB6-8C5)、 MHCII-APC(M5/114.15.2)、CD265(RANK)-PE(R12-31)；RANKL-AF647 (IK22/
5)。对于细胞内细胞因子染色(ICS)，用细胞刺激混合物(Cell Stimulation Cocktail)(1/
1000)(eBioscience)刺激细胞4小时。然后将细胞如上所述进行表面染色，然后用Cytofix/Cytoperm(BD)固定/透化，并用IFNγ-AF488(Biolegend)、 TNFα-PE(BD)和IL-2-Pacific Blue(Biolegend)进行染色。
活/死染料；TCRβ-PerCP-Cy5.5 (H57-597)、CD45.2-A780(104)、Ly6C/Ly6G(GR-1)-EF450(RB6-8C5)、 MHCII-APC(M5/114.15.2)、CD265(RANK)-PE(R12-31)；RANKL-AF647 (IK22/
5)。对于细胞内细胞因子染色(ICS)，用细胞刺激混合物(Cell Stimulation Cocktail)(1/
1000)(eBioscience)刺激细胞4小时。然后将细胞如上所述进行表面染色，然后用Cytofix/Cytoperm(BD)固定/透化，并用IFNγ-AF488(Biolegend)、 TNFα-PE(BD)和IL-2-Pacific Blue(Biolegend)进行染色。
[1012] 对于细胞内转录因子染色，如上所述对细胞进行表面染色，然后按照制造商的说明使用Foxp3/转录因子染色缓冲液组(eBioscience)固定并透化，并用 FoxP3-EF450或
FoxP3-AF488(FJK-16s)和Ki67-EF450(Sol 185)(eBioscience) 染色。首先在活的单一
CD45.2+门控上进行所有免疫细胞分析。将T细胞定义为 TCRβ+NK1.1-。NK细胞定义为TCRβ-NK1+。DC定义为CD11c+MHCII高细胞。肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)被定义为CD11b+F4/80+非DC细胞。MDSC定义为 CD11b+、Ly6C/Ly6G(GR-1)hi、非TAM、非DC细胞。为了确定样品中的绝对计数，在将样品在流式细胞仪上运行之前，立即添加液体计数珠(BD Biosciences)。所有数据均在Fortessa 4(BD)流式细胞仪上收集，并使用FlowJo v10软件(Tree Star，Inc.)进行分析。
FoxP3-AF488(FJK-16s)和Ki67-EF450(Sol 185)(eBioscience) 染色。首先在活的单一
CD45.2+门控上进行所有免疫细胞分析。将T细胞定义为 TCRβ+NK1.1-。NK细胞定义为TCRβ-NK1+。DC定义为CD11c+MHCII高细胞。肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)被定义为CD11b+F4/80+非DC细胞。MDSC定义为 CD11b+、Ly6C/Ly6G(GR-1)hi、非TAM、非DC细胞。为了确定样品中的绝对计数，在将样品在流式细胞仪上运行之前，立即添加液体计数珠(BD Biosciences)。所有数据均在Fortessa 4(BD)流式细胞仪上收集，并使用FlowJo v10软件(Tree Star，Inc.)进行分析。
[1013] 统计分析
[1014] 使用GraphPad Prism软件进行统计分析。对于列分析，使用Brown-Forsythe 检验评估均等方差。如果不显著，则使用单因素方差分析与Dunn多重比较进行。在各组之间非均等方差的情况下，酌情采用Kruskal-Wallace分析与Sidak或Dunnett 多重比较。对于纵向
肿瘤生长分析，仅对实验内小鼠采用治疗组随机效应模型。当P值小于0.05时，数据被认为具有统计学显著性。
肿瘤生长分析，仅对实验内小鼠采用治疗组随机效应模型。当P值小于0.05时，数据被认为具有统计学显著性。
[1015] 实施例9
[1016] 共同阻断RANKL和PD-1-PD-L1的相互作用抑制肺转移
[1017] 抗RANKL和抗PD-1(图9A-B)或抗RANKL和抗PD-L1(图9C-D)的组合在黑色素瘤(B16F10)或前列腺癌(RM 1)的肺转移模型中导致对转移的优越耐受性。
[1018] 实施例10
[1019] 共同阻断RANKL和PD-1抑制皮下肿瘤的生长
[1020] 为了从实验性转移模型扩展这些结果，接下来评估了双重阻断RANKL和PD-1 在携带皮下肿瘤的小鼠中的功效。在PD-1敏感性细胞系MC38和PD-1中等反应细胞系CT26(两个
结肠癌模型)中，添加抗RANKL增强了抗PD-1的功效(图 10A-B)。当在较晚的时间点开始针
对更确定的肿瘤进行治疗时，维持了针对CT26 的组合功效(数据未显示)。
结肠癌模型)中，添加抗RANKL增强了抗PD-1的功效(图 10A-B)。当在较晚的时间点开始针
对更确定的肿瘤进行治疗时，维持了针对CT26 的组合功效(数据未显示)。
[1021] 实施例11
[1022] 抗RANKL抑制皮下肿瘤生长的能力取决于BATF3，而不取决于Fc受体的表达
[1023] 一些免疫调节抗体的功效包括通过抗体依赖性细胞毒性耗尽表达抗原的细胞 (Dahan等人，2015,Cancer Cell,28(3)：285-295)，或者靶向抗原的激动活性(Dahan等人，
2016,Cancer Cell,29(6)：820-831)。这两个过程都需要肿瘤微环境中Fc受体的参与。另
外，某些抗体(例如，抗CD137、抗PD-L1)的抗肿瘤功效需要存在CD103+Batf3依赖性树突状细胞(Sánchez-Paulete等人，2016,Cancer Discov.6(1)：71-9)。因此，为了了解抗RANKL的作用机制，在基因靶向的小鼠中测试了抗RANKL功效对Fc受体或BatF3依赖性树突状细胞的
依赖性。向 C57Bl/6或基因靶向的小鼠组皮下注射MCA1956纤维肉瘤细胞(1×106)。在相对
于肿瘤接种的第3、7、11和15天用抗RANKL(IK22/5，200μg腹膜内)或cIg (1-1，200μg腹膜内)治疗小鼠。抗RANKL MAb IK22/5在MCA1956皮下肿瘤中作为单一疗法表现出功效(图
11)。在缺乏FcεRγ的小鼠中保留了抗RANKL 的抗肿瘤功效。这与抗RANKL的作用机制是一致的，该机制是通过阻断RANKL 与其受体RANK的结合而发生，并且不通过耗尽表达RANKL的细胞而起作用。相反，在缺乏BatF3的小鼠中，抗RANKL IK22/5的抗肿瘤功效消除，表明
+
CD103 DC介导的交叉呈递的重要作用。这些数据与作用机理一致，其中抗RANKL破坏肿瘤
微环境中表达RANK的髓细胞(例如树突状细胞、MDSC或巨噬细胞)和表达RANKL的细胞(例如
淋巴细胞、淋巴结细胞或其他基质成分)之间的免疫抑制或耐受原轴。
2016,Cancer Cell,29(6)：820-831)。这两个过程都需要肿瘤微环境中Fc受体的参与。另
外，某些抗体(例如，抗CD137、抗PD-L1)的抗肿瘤功效需要存在CD103+Batf3依赖性树突状细胞(Sánchez-Paulete等人，2016,Cancer Discov.6(1)：71-9)。因此，为了了解抗RANKL的作用机制，在基因靶向的小鼠中测试了抗RANKL功效对Fc受体或BatF3依赖性树突状细胞的
依赖性。向 C57Bl/6或基因靶向的小鼠组皮下注射MCA1956纤维肉瘤细胞(1×106)。在相对
于肿瘤接种的第3、7、11和15天用抗RANKL(IK22/5，200μg腹膜内)或cIg (1-1，200μg腹膜内)治疗小鼠。抗RANKL MAb IK22/5在MCA1956皮下肿瘤中作为单一疗法表现出功效(图
11)。在缺乏FcεRγ的小鼠中保留了抗RANKL 的抗肿瘤功效。这与抗RANKL的作用机制是一致的，该机制是通过阻断RANKL 与其受体RANK的结合而发生，并且不通过耗尽表达RANKL的细胞而起作用。相反，在缺乏BatF3的小鼠中，抗RANKL IK22/5的抗肿瘤功效消除，表明
+
CD103 DC介导的交叉呈递的重要作用。这些数据与作用机理一致，其中抗RANKL破坏肿瘤
微环境中表达RANK的髓细胞(例如树突状细胞、MDSC或巨噬细胞)和表达RANKL的细胞(例如
淋巴细胞、淋巴结细胞或其他基质成分)之间的免疫抑制或耐受原轴。
[1024] 实施例12
[1025] RANK和PD-L1在肿瘤浸润髓细胞中的共表达
[1026] 鉴于上述MCA1956肿瘤中抗RANKL的机制数据，在肿瘤微环境中RANKL 的潜在作用是通过作用于BatF3依赖性树突状细胞，该树突状细胞可表达RANKL 受体、RANK。对于阻断两个免疫抑制通路的双特异性抗体，在相同细胞类型上共表达靶抗原是有利的，因为功能
性是靶细胞固有的。在单个细胞类型上共表达靶抗原还可能由于肿瘤内更高的细胞选择
性，而要求(proscribe)双特异性模式在肿瘤微环境内更多的细胞或组织特异性作用，而外周毒性则更低。替代地或另外，阻断在两个不同细胞上反式表达的两个免疫抑制通路的双
特异性抗体也可能是有利的，因为可以同时抑制两个不同的免疫抑制机制。
性是靶细胞固有的。在单个细胞类型上共表达靶抗原还可能由于肿瘤内更高的细胞选择
性，而要求(proscribe)双特异性模式在肿瘤微环境内更多的细胞或组织特异性作用，而外周毒性则更低。替代地或另外，阻断在两个不同细胞上反式表达的两个免疫抑制通路的双
特异性抗体也可能是有利的，因为可以同时抑制两个不同的免疫抑制机制。
[1027] 因此，作为双特异性靶向RANK和PD-L1或在髓室上其他抗原的基本原理，通过流式细胞术分析了这些因子在肿瘤浸润髓细胞上的表达。将MCA1956细胞(1 ×106细胞/小鼠)
3
皮下注射到WT C57BL/6小鼠中。允许肿瘤未经任何处理下生长 22天，直到达到约50mm 。收集肿瘤并产生单细胞悬液，并如上所述进行流式细胞术。CD11c+/MHCII+树突状细胞(DC)的流式细胞术分析表明100％的RANK 阳性DC也表达PD-L1和CD103(图12A)。在分离自MCA1956
皮下肿瘤的肿瘤浸润巨噬细胞(门控在CD11b+，F4/80+)上进行了类似的分析。该分析表明，有52％的肿瘤浸润CD11b+/F480+细胞共表达RANK和CD206，而仅7％的RANK 阴性CD11b+/
F480+表达CD206(图12B)。
3
皮下注射到WT C57BL/6小鼠中。允许肿瘤未经任何处理下生长 22天，直到达到约50mm 。收集肿瘤并产生单细胞悬液，并如上所述进行流式细胞术。CD11c+/MHCII+树突状细胞(DC)的流式细胞术分析表明100％的RANK 阳性DC也表达PD-L1和CD103(图12A)。在分离自MCA1956
皮下肿瘤的肿瘤浸润巨噬细胞(门控在CD11b+，F4/80+)上进行了类似的分析。该分析表明，有52％的肿瘤浸润CD11b+/F480+细胞共表达RANK和CD206，而仅7％的RANK 阴性CD11b+/
F480+表达CD206(图12B)。
[1028] 总之，在缺乏BatF3的小鼠中，抗RANKL IK22/5 MAb的抗肿瘤功效被消除，这表明CD103+树突状细胞(DC)介导的交叉呈递起重要作用。这些数据与作用机理一致，其中抗
RANKL破坏表达RANK的髓细胞(例如树突状细胞或巨噬细胞)和表达RANKL的细胞(如淋巴细
胞、淋巴结细胞或其他基质成分)之间肿瘤微环境中的免疫抑制或耐受原性轴。来自肿瘤的CD11c+/MHCII+DC的流式细胞术分析表明，100％的RANK阳性DC也表达PDL-1和CD103。相似的分析表明，在RANK阳性肿瘤浸润巨噬细胞上显著富集CD206表达。对于阻断两个免疫抑制通路的双特异性抗体，由于功能性是靶细胞固有的，因此在相同细胞类型上共表达靶抗原是
有利的。在单个细胞类型上共表达靶抗原还可能由于肿瘤内更高的细胞选择性，而要求
(proscribe)双特异性模式在肿瘤微环境内更多的细胞或组织特异性作用，而外周毒性则
更低。替代地或另外，阻断在两个不同细胞上反式表达的两个免疫抑制通路的双特异性抗
体也可能是有利的，因为可以同时抑制两个不同的免疫抑制机制。
RANKL破坏表达RANK的髓细胞(例如树突状细胞或巨噬细胞)和表达RANKL的细胞(如淋巴细
胞、淋巴结细胞或其他基质成分)之间肿瘤微环境中的免疫抑制或耐受原性轴。来自肿瘤的CD11c+/MHCII+DC的流式细胞术分析表明，100％的RANK阳性DC也表达PDL-1和CD103。相似的分析表明，在RANK阳性肿瘤浸润巨噬细胞上显著富集CD206表达。对于阻断两个免疫抑制通路的双特异性抗体，由于功能性是靶细胞固有的，因此在相同细胞类型上共表达靶抗原是
有利的。在单个细胞类型上共表达靶抗原还可能由于肿瘤内更高的细胞选择性，而要求
(proscribe)双特异性模式在肿瘤微环境内更多的细胞或组织特异性作用，而外周毒性则
更低。替代地或另外，阻断在两个不同细胞上反式表达的两个免疫抑制通路的双特异性抗
体也可能是有利的，因为可以同时抑制两个不同的免疫抑制机制。
[1029] 总而言之，这些观察结果证明了肿瘤中RANK阳性DC上PD-L1表达的显著富集，并为顺式双特异性靶向这两种抗原提供了另外的理论基础。靶向PD-L1的模式已在肿瘤学中被
明确确认为检查点抑制剂疗法，并为抗RANK双特异性提供了合理的伴侣。此外，CD103和
CD206与RANK的高度共表达提示了靶向RANK 的双特异性模式的其他抗原伴侣。
明确确认为检查点抑制剂疗法，并为抗RANK双特异性提供了合理的伴侣。此外，CD103和
CD206与RANK的高度共表达提示了靶向RANK 的双特异性模式的其他抗原伴侣。
[1030] 实施例13
[1031] 抗RANKL和抗PD-1双抗体
[1032] 编码双特异性单链双抗体的DNA如下构建，并如图13A所示。具体而言，抗 RANKL抗体(例如地诺单抗)的可变重链通过5个氨基酸的接头与抗PD-1抗体的可变轻链连接，而该抗PD-1抗体的可变轻链又通过15个氨基酸的接头连接至抗PD-1抗体的可变重链，该抗PD-1
抗体的可变重链通过另一个5个氨基酸的接头连接至抗RANKL抗体的可变轻链。
抗体的可变重链通过另一个5个氨基酸的接头连接至抗RANKL抗体的可变轻链。
[1033] 在双特异性单链双抗体的示例性构建体中，RANKL抗体的可变重链(地诺单抗VH，其具有以下氨基酸序列：
[1034]经由第一接头 (SG4)连接
至抗PD-1抗体的可变轻链(纳武单抗VL，其具有以下氨基酸序列：
至抗PD-1抗体的可变轻链(纳武单抗VL，其具有以下氨基酸序列：
[1035]其又通过第二接头(SG4) 3连接至抗
PD-1抗体的可变重链(纳武单抗VH，其具有以下序列：
PD-1抗体的可变重链(纳武单抗VH，其具有以下序列：
[1036]其后是第三接头(SG4)和
抗RANKL抗体的可变轻链(地诺单抗VL，其具有以下氨基酸序列：
抗RANKL抗体的可变轻链(地诺单抗VL，其具有以下氨基酸序列：
[1037]
[1038] 将编码双特异性双抗体的DNA克隆到表达载体中(例如，pSecTag2/HygroA， Invitrogen)。然后使用标准方案扩增、提取和纯化所得的编码双特异性抗体的质粒。
[1039] 将表达质粒用LipfectAMINE-plus(Invitrogen)瞬时转染到人肾细胞系293T 中并进行培养。将上清液用0.22μm PVDF过滤器灭菌，并使用40％PEG20,000 溶液浓缩。使用HiTrap螯合HP柱(GE Healthcare)纯化浓缩的上清液。
[1040] 实施例14
[1041] 抗RANKL和抗PD-1三抗体
[1042] 如图13B所示，一对质粒是产生双特异性三抗体所必需的。具体而言，制备编码单链多肽的第一构建体，该单链多肽包含与人κ轻链恒定区融合的抗PD-1抗体的可变轻链，其通过氨基酸接头与抗RANKL抗体的可变重链连接。为了易于纯化，可以将标签(例如，his标签(His6))添加至单链多肽的C-末端。还制备了编码单链多肽的第二构建体，该单链多肽包含与人IgG2的恒定区1融合的抗 PD-1抗体的可变重链，其通过第一氨基酸接头连接至抗
RANKL抗体的可变重链，抗RANKL抗体的可变重链又通过第二氨基酸接头连接至抗RANKL抗
体的可变轻链连接。为了易于纯化，还可以将标签(例如，his标签(His6))添加至单链多肽的C末端。
RANKL抗体的可变重链，抗RANKL抗体的可变重链又通过第二氨基酸接头连接至抗RANKL抗
体的可变轻链连接。为了易于纯化，还可以将标签(例如，his标签(His6))添加至单链多肽的C末端。
[1043] 将这两个构建体克隆到两个单独的表达载体中，它们通常为质粒例如 pCAGGS的形式(De Sutter等人，1992,Gene 113,223-230)。然后扩增、提取和纯化得到的编码双特异性三抗体的质粒对，pCAGGS-FabL-scFv-His6和 pCAGGS-FabFd-scFv-His6。
[1044] 图13C显示了另一质粒对。在该实施方案中，制备编码单链多肽的第一构建体，该单链多肽包含与人κ轻链恒定区融合的抗RANKL抗体的可变轻链，其通过氨基酸接头与抗
PD-1抗体的可变重链连接。为了易于纯化，可以将标签(例如， his标签(His6))添加至单链多肽的C-末端。还制备了编码单链多肽的第二构建体，该单链多肽包含与人IgG2的恒定区1融合的抗RANKL抗体的可变重链，其通过第一氨基酸接头连接至抗PD-1抗体的可变重链，抗PD-1抗体的可变重链又通过第二氨基酸接头连接至抗PD-1抗体的可变轻链。图14中显示了
这种类型的示例性三抗体。
PD-1抗体的可变重链连接。为了易于纯化，可以将标签(例如， his标签(His6))添加至单链多肽的C-末端。还制备了编码单链多肽的第二构建体，该单链多肽包含与人IgG2的恒定区1融合的抗RANKL抗体的可变重链，其通过第一氨基酸接头连接至抗PD-1抗体的可变重链，抗PD-1抗体的可变重链又通过第二氨基酸接头连接至抗PD-1抗体的可变轻链。图14中显示了
这种类型的示例性三抗体。
[1045] 实施例15
[1046] 确定拮抗剂活性的测定法
[1047] RANKL和RANK配体-受体对在人和小鼠蛋白之间是交叉反应的，具有等同的检测到的结合和功能活性(Bossen等人，2006,J Biol Chem.,281(20)：13964-71)。可商购多种重组形式的RANKL和RANK，用于抗原和测定制备。RANKL和抗 RANK抗体都将选择性地结合RANK的CRD2和CRD3或全长RANK(即，包括 CRD1、2、3、4)。
[1048] TNF超家族配体/受体相互作用可通过ELISA进行评估(参见，例如，Schneider 等人，2014,Methods Enzymol.,545：103-25；Kostenuik等人，2009,J.Bone Miner Res.,24(2)：182-95)，其提供了RANKL或RANK拮抗剂的直接筛选。可以在用作破骨细胞前体的鼠RAW
264.7巨噬细胞培养物中监测RANKL和RANKL抑制剂的生物活性，该监测可以使用破骨细胞
生成(以及通过ELISA在条件培养基中产生TRAP5b)进行，如先前所述(Kostenuik等人，
2009,同上；Xu等人，2000, J.Bone Miner Res.,15(11)：2178-86)。这些测定法针对中等通量(例如384孔) 的筛选测定可适当进行调整。
264.7巨噬细胞培养物中监测RANKL和RANKL抑制剂的生物活性，该监测可以使用破骨细胞
生成(以及通过ELISA在条件培养基中产生TRAP5b)进行，如先前所述(Kostenuik等人，
2009,同上；Xu等人，2000, J.Bone Miner Res.,15(11)：2178-86)。这些测定法针对中等通量(例如384孔) 的筛选测定可适当进行调整。
[1049] 可以针对TNFR超家族的其他相关成员筛选抗RANK抗体的交叉反应性。在这方面可以使用基于流式细胞术或ELISA的筛选。
[1050] 在测定RANKL或RANK拮抗剂的拮抗活性时，优选消除也可能对RANK受体具有激动活性的任何RANKL或RANK拮抗剂。抗RANK抗体的激动活性的体外筛选，可以在RANK-Fas
Jurkat测定法中使用二价或单价抗体形式进行，例如，如Schneider等人(2014年，同上)和Chypre等人(2016,Immunol.Lett.,171：5-14) 所述。对针对相关的TNFR成员(EDAR)的抗体的分析表明，与不可知(agnostic) 活性的相关性不是抗体的亲和力，而是它们一旦结合后缓慢分离的能力(小的koff) (Kowalczyk-Quintas等人，2011,J.Biol.Chem.,286(35)：
30769-79)。类似地，对针对TNFR成员(FAS)的抗体的分析表明，受体亲和力和(激动剂)效力之间呈负相关(Chodorge等人，2012,Cell Death Differ.,19(7)：1187-95)。值得注意的
是，噬菌体筛选已鉴定出对其他TNFR成员(例如TRAILR)具有激动剂活性的scFv(Dobson等
人，2009,MAbs,1(6)：552-62)。
Jurkat测定法中使用二价或单价抗体形式进行，例如，如Schneider等人(2014年，同上)和Chypre等人(2016,Immunol.Lett.,171：5-14) 所述。对针对相关的TNFR成员(EDAR)的抗体的分析表明，与不可知(agnostic) 活性的相关性不是抗体的亲和力，而是它们一旦结合后缓慢分离的能力(小的koff) (Kowalczyk-Quintas等人，2011,J.Biol.Chem.,286(35)：
30769-79)。类似地，对针对TNFR成员(FAS)的抗体的分析表明，受体亲和力和(激动剂)效力之间呈负相关(Chodorge等人，2012,Cell Death Differ.,19(7)：1187-95)。值得注意的
是，噬菌体筛选已鉴定出对其他TNFR成员(例如TRAILR)具有激动剂活性的scFv(Dobson等
人，2009,MAbs,1(6)：552-62)。
[1051] 还可以在第二靶标(例如，PDL-1)的情况下以双特异性形式测试抗RANK 结合剂，以验证保留了结合和功能性RANKL拮抗阻断作用。例如，可以工程化细胞系以表达RANK(例
如，作为RANK-Fas嵌合体(Schneider等人，2014，同上))和人PD-L1，并且可以证实RANK拮抗剂活性。备选地，已经在RANK阳性破骨细胞前体上证实了PD-L1的表达(An等人，2016,
Blood,128(12)： 1590-603)，并且可以开发体外功能测定法来寻求(address)RANK和PD-L1结合剂的功能。破骨细胞形成将解释(address)RANK阻断，而PD-1结合或T细胞抑制可用于
解释PD-L1阻断。为了支持后者，An等人2016(同上)证明了抗PD-L1 增加了破骨细胞祖细胞培养物中的CTL活性。
如，作为RANK-Fas嵌合体(Schneider等人，2014，同上))和人PD-L1，并且可以证实RANK拮抗剂活性。备选地，已经在RANK阳性破骨细胞前体上证实了PD-L1的表达(An等人，2016,
Blood,128(12)： 1590-603)，并且可以开发体外功能测定法来寻求(address)RANK和PD-L1结合剂的功能。破骨细胞形成将解释(address)RANK阻断，而PD-1结合或T细胞抑制可用于
解释PD-L1阻断。为了支持后者，An等人2016(同上)证明了抗PD-L1 增加了破骨细胞祖细胞培养物中的CTL活性。
[1052] 可以使用二价或单价抗体形式进行抗RANK或抗RANKL抗体(RANKL拮抗剂)的体内活性，以在小鼠研究中寻求破骨细胞的拮抗作用。还可以进行用抗 RANK或抗RANKL抗体攻
击的小鼠的骨密度分析(使用X射线或DEXA)。备选地，可以通过每天监测血液离子钙或血清TRAP5b的分析，持续4天，来评估抗RANK或抗RANKL抗体对皮下注射人RANKL攻击的正常小鼠中高钙血症的作用。也可以在MCA1956肿瘤模型中(对于阳性对照抗RANKL MAb，如本文图 9所示)测试抗RANK或抗RANKL抗体(RANKL拮抗剂)对肿瘤的反应。RANKL 刺激(例如，RANKL的重组形式)和抑制作用(例如，重组OPG-Fc)的阳性对照可以容易地在体外和体内研究中获
得(Lacey等人，2012,Nat Rev Drug Discov.,11 (5)：401-19)。
击的小鼠的骨密度分析(使用X射线或DEXA)。备选地，可以通过每天监测血液离子钙或血清TRAP5b的分析，持续4天，来评估抗RANK或抗RANKL抗体对皮下注射人RANKL攻击的正常小鼠中高钙血症的作用。也可以在MCA1956肿瘤模型中(对于阳性对照抗RANKL MAb，如本文图 9所示)测试抗RANK或抗RANKL抗体(RANKL拮抗剂)对肿瘤的反应。RANKL 刺激(例如，RANKL的重组形式)和抑制作用(例如，重组OPG-Fc)的阳性对照可以容易地在体外和体内研究中获
得(Lacey等人，2012,Nat Rev Drug Discov.,11 (5)：401-19)。
[1053] 实施例16
[1054] 抗RANKL MAB的抗肿瘤功效不需要T调节细胞(TREG)
[1055] 先前的出版物已经报道了表达RANKL的Treg在表达RANK的乳癌小鼠模型中促进转移的作用(Tan等人，Nature 470(2011),548-553)，或通过皮肤 RANKL-RANK的相互作用在
抑制紫外线引起的皮肤炎症中的全身性Treg控制作用(Loser等人，Nat.Med 12(2006),
1372-1379)。为了进一步评估Treg在免疫疗法中抗RANKL的组合功效中的任何重要作用，采用了FoxP3-DTR小鼠模型。在这些小鼠中，白喉毒素受体(DTR)在foxp3基因座的控制下表
达，从而允许通过施用白喉毒素(DT)而条件性地且几乎完全耗尽Treg，从而增强抗肿瘤免
疫(Teng 等人，2010，同上)。观察到更大的B16F10黑色素瘤皮下肿瘤生长抑制的趋势(图
15A-C)，与DT单用相比，抗RANKL(IK22.5)治疗与DT组合给予时，治愈了更高比例的小鼠(图
15A-C)。另外，在用DT和抗RANKL治疗的FoxP3-DTR 小鼠中也观察到了皮下RM-1前列腺癌的生长抑制增强的相似趋势(图15D)。在终点对RM-1肿瘤进行的FACS分析显示，DT单独可使
Treg几乎完全耗尽，而抗 RANKL与DT组合时，注意到不会进一步耗尽Treg(图15E)。综上所述，这些模型中组合治疗的作用机制似乎不是由于更有效的Treg耗尽所致，在肿瘤内Treg 几乎完全耗尽的情况下，抗RANKL mAb的功效是完整的。事实上，与单独的DT 相比，在
FoxP3-DTR小鼠中观察到抗RANKL与DT诱导的Treg耗尽组合的额外功效，其中在终点处与
cIg相比，两个含有DT的臂均表现出>95％的Treg耗尽；因此，表明抗RANKL的作用机制并不是直接作用于Treg。
抑制紫外线引起的皮肤炎症中的全身性Treg控制作用(Loser等人，Nat.Med 12(2006),
1372-1379)。为了进一步评估Treg在免疫疗法中抗RANKL的组合功效中的任何重要作用，采用了FoxP3-DTR小鼠模型。在这些小鼠中，白喉毒素受体(DTR)在foxp3基因座的控制下表
达，从而允许通过施用白喉毒素(DT)而条件性地且几乎完全耗尽Treg，从而增强抗肿瘤免
疫(Teng 等人，2010，同上)。观察到更大的B16F10黑色素瘤皮下肿瘤生长抑制的趋势(图
15A-C)，与DT单用相比，抗RANKL(IK22.5)治疗与DT组合给予时，治愈了更高比例的小鼠(图
15A-C)。另外，在用DT和抗RANKL治疗的FoxP3-DTR 小鼠中也观察到了皮下RM-1前列腺癌的生长抑制增强的相似趋势(图15D)。在终点对RM-1肿瘤进行的FACS分析显示，DT单独可使
Treg几乎完全耗尽，而抗 RANKL与DT组合时，注意到不会进一步耗尽Treg(图15E)。综上所述，这些模型中组合治疗的作用机制似乎不是由于更有效的Treg耗尽所致，在肿瘤内Treg 几乎完全耗尽的情况下，抗RANKL mAb的功效是完整的。事实上，与单独的DT 相比，在
FoxP3-DTR小鼠中观察到抗RANKL与DT诱导的Treg耗尽组合的额外功效，其中在终点处与
cIg相比，两个含有DT的臂均表现出>95％的Treg耗尽；因此，表明抗RANKL的作用机制并不是直接作用于Treg。
[1056] 实施例17
[1057] 在肿瘤浸润淋巴细胞中，与RANKL和CTLA4的共表达相比，RANKL和 PD-1不同的共表达
[1058] 临床前结果表明，抗RANKL阻断可增强抗CTLA4 mAb的抗肿瘤功效或阻断 PD-1/PD-L1，但有证据表明，这是通过不同的机制发生的，这与所述的CTLA4与PD-1阻断的非重叠作用机制一致。例如，在从小鼠的CT26肿瘤分离的T细胞中，几乎所有的CD8+RANKL+ T细胞TIL(>90％)共表达PD-1；相比之下，少于40％的CD8+RANKL-T细胞TIL为PD-1阳性(图16A)。
此外，PD-1在CD8+RANKL+上的MFI至少是CD8+RANKL-T细胞上的3倍(图16B)，前者鉴定为PD-
1hi细胞。表达分析表明，与它们的RANKL-对应物相比，RANKL+CD8+T细胞中CTLA4 表达没有明显更高(图16C)。尽管富集了PD-1共表达，但鉴于表达RANKL的细胞通常更具增殖性并且
具有另一个免疫检查点CTLA4的低表达，因此CT26模型中RANKL+CD8+T细胞TIL的特征更符合激活的表型而非耗尽的表型。
此外，PD-1在CD8+RANKL+上的MFI至少是CD8+RANKL-T细胞上的3倍(图16B)，前者鉴定为PD-
1hi细胞。表达分析表明，与它们的RANKL-对应物相比，RANKL+CD8+T细胞中CTLA4 表达没有明显更高(图16C)。尽管富集了PD-1共表达，但鉴于表达RANKL的细胞通常更具增殖性并且
具有另一个免疫检查点CTLA4的低表达，因此CT26模型中RANKL+CD8+T细胞TIL的特征更符合激活的表型而非耗尽的表型。
[1059] 实施例18
[1060] 抗PD-1、抗CTLA4和抗RANKL抗体的三联疗法改善荷瘤小鼠的抗肿瘤反应和T细胞效应功能。
[1061] 鉴于PD-1和CTLA4的组合免疫检查点阻断(ICB)在某些临床情况下(例如晚期黑色素瘤)已成为新兴的治疗标准(Larkin等人，2015.N Engl J Med；373：23-3)，评估了添加抗RANKL是否可以进一步改善抗CTLA4和抗PD-1/抗PD-L1 组合疗法的抗肿瘤功效(图17)。首
先在抑制携带已确立的CT26肿瘤的WT小鼠中评估抗RANKL与使用较低剂量的抗PD-1(100μ
g)的组合(图17A)。向抗 PD-1中添加抗RANKL显著抑制肿瘤的生长，但是三重组合治疗比任何双重组合治疗显著抑制CT26荷瘤小鼠的生长，并且重要的是，向组合的抗CTLA4和抗PD-1 中添加抗RANKL改善肿瘤排斥率(图17A)。接下来，评估抗PD-L1组合上抗 RANKL以及组合上抗CTLA4或无抗CTLA4在抑制皮下CT26肿瘤生长中的功效 (图17B)。单独的抗PD-L1(类似于
抗RANKL和抗PD-1单一疗法具有最小的功效)，与之相比抗PD-L1和抗RANKL的组合显著抑制
肿瘤生长(图17B)。另外，抗PD-L1和抗RANKL与抗CTLA4的三重组合在抑制CT26皮下生长中
最有效；当将该三重组合与双ICB(抗PD-L1和抗CTLA4)特定比较时，存在小的但显著的差异(图17B)。最后，还在携带皮下Tramp-C1前列腺癌的自发TRAMP 转基因小鼠中评估了三重组合疗法(抗PD-1+抗CTLA4+抗RANKL)控制肿瘤生长的能力。在耐受内源肿瘤特异性T细胞的
情况下，与选择双重疗法和cIg相比，三重组合疗法在控制皮下肿瘤生长方面再次最为有
效，16只小鼠中有15只完全排斥其肿瘤(图17C)。三重组合疗法中观察到的肿瘤控制的增加与肿瘤浸润CD8+和CD4+ T细胞中Th1型细胞因子多功能性的显著增加有关，与抗CTLA4加上
抗 PD-1双重组合疗法相比，这体现于IFN-γ和TNFα的共表达。TIL效应功能的这种增加仅在肿瘤中观察到，而在三重组合疗法治疗的小鼠脾脏中则未观察到。
先在抑制携带已确立的CT26肿瘤的WT小鼠中评估抗RANKL与使用较低剂量的抗PD-1(100μ
g)的组合(图17A)。向抗 PD-1中添加抗RANKL显著抑制肿瘤的生长，但是三重组合治疗比任何双重组合治疗显著抑制CT26荷瘤小鼠的生长，并且重要的是，向组合的抗CTLA4和抗PD-1 中添加抗RANKL改善肿瘤排斥率(图17A)。接下来，评估抗PD-L1组合上抗 RANKL以及组合上抗CTLA4或无抗CTLA4在抑制皮下CT26肿瘤生长中的功效 (图17B)。单独的抗PD-L1(类似于
抗RANKL和抗PD-1单一疗法具有最小的功效)，与之相比抗PD-L1和抗RANKL的组合显著抑制
肿瘤生长(图17B)。另外，抗PD-L1和抗RANKL与抗CTLA4的三重组合在抑制CT26皮下生长中
最有效；当将该三重组合与双ICB(抗PD-L1和抗CTLA4)特定比较时，存在小的但显著的差异(图17B)。最后，还在携带皮下Tramp-C1前列腺癌的自发TRAMP 转基因小鼠中评估了三重组合疗法(抗PD-1+抗CTLA4+抗RANKL)控制肿瘤生长的能力。在耐受内源肿瘤特异性T细胞的
情况下，与选择双重疗法和cIg相比，三重组合疗法在控制皮下肿瘤生长方面再次最为有
效，16只小鼠中有15只完全排斥其肿瘤(图17C)。三重组合疗法中观察到的肿瘤控制的增加与肿瘤浸润CD8+和CD4+ T细胞中Th1型细胞因子多功能性的显著增加有关，与抗CTLA4加上
抗 PD-1双重组合疗法相比，这体现于IFN-γ和TNFα的共表达。TIL效应功能的这种增加仅在肿瘤中观察到，而在三重组合疗法治疗的小鼠脾脏中则未观察到。
[1062] 实施例19
[1063] TME中的独特变化可明显交叉调节抗RANKL和抗PD-1/PD-L1组合疗法，相对于抗-RANKL和抗-CTLA4组合疗法
[1064] 为了在CT26模型中寻求抗RANKL改善免疫检查点阻断(ICB)疗法的机制，评估了表达RANKL的CD8+ T细胞的比例(图18A)。在cIg治疗的小鼠中，约 5％表达RANKL，但在抗PD-1单一疗法后，该表达增加到超过10％。此外，RANKL 表达在gp70反应性CD8+ T细胞TIL亚群中富集(在cIg治疗的小鼠中几乎为 15％)，并且与抗PD-1单一疗法、抗CTLA4单一疗法或
cIg相比，接受双重ICB 的肿瘤中显著增加(图18B)。尽管与CD8+ T细胞TIL相比，较低比例的CD4+T 细胞TIL表达RANKL，抗PD-1类似地增加了RANKL表达(图18C)。通过上调RANKL表达的主要肿瘤内来源，施用抗PD-1可能引发TME对RANKL阻断的反应(图18A-C)，而抗CTLA4单
一疗法并未显著改变CD4+或CD8+ T细胞 TIL中的RANKL水平。观察到单独的抗PD-1(或组合
的抗PD-1+抗CTLA4)本身可以通过肿瘤浸润T细胞增加RANKL表达，而在单独抗CTLA4之后未
观察到 TIL中RANKL的增加，这表明与抗RANKL加抗CTLA4的组合相比，抗RANKL 加抗PD-1/
PD-L1的组合通过发生独特的机制实现抗肿瘤功效。尚不清楚为什么单独的抗CTLA4治疗不
能在本研究中改变RANKL表达水平。一种解释是基于观察到，RANKL通常在T细胞激活后早
期，特别是在致耐受的情况下被上调 (Hochweller等人，2005.Eur J Immunol 35：1086-
96)。
cIg相比，接受双重ICB 的肿瘤中显著增加(图18B)。尽管与CD8+ T细胞TIL相比，较低比例的CD4+T 细胞TIL表达RANKL，抗PD-1类似地增加了RANKL表达(图18C)。通过上调RANKL表达的主要肿瘤内来源，施用抗PD-1可能引发TME对RANKL阻断的反应(图18A-C)，而抗CTLA4单
一疗法并未显著改变CD4+或CD8+ T细胞 TIL中的RANKL水平。观察到单独的抗PD-1(或组合
的抗PD-1+抗CTLA4)本身可以通过肿瘤浸润T细胞增加RANKL表达，而在单独抗CTLA4之后未
观察到 TIL中RANKL的增加，这表明与抗RANKL加抗CTLA4的组合相比，抗RANKL 加抗PD-1/
PD-L1的组合通过发生独特的机制实现抗肿瘤功效。尚不清楚为什么单独的抗CTLA4治疗不
能在本研究中改变RANKL表达水平。一种解释是基于观察到，RANKL通常在T细胞激活后早
期，特别是在致耐受的情况下被上调 (Hochweller等人，2005.Eur J Immunol 35：1086-
96)。
[1065] 当检查浸润T细胞的表型时，观察到在将抗RANKL添加至抗PD-1后，与将抗RANKL添加至抗CTLA4疗法后相比，观察到TME的其他不同变化。先前的报道表明，肿瘤浸润PD-1hiT细胞对抗PD-1疗法不敏感并且表现出耗尽的表型。但是，某些免疫疗法，例如抗CD40可以降低PD-1hiT细胞上的PD-1水平，使它们重新对PD-1阻断敏感(Ngiow等人，2015,Cancer Res 75：
3800-11)。与此相符的是，尽管与cIg相比，抗PD-1单一疗法显著降低了PD-1的表达，但抗PD-1 加抗RANKL的施用进一步降低了gp70特异性CD8+T细胞TIL(图19A)以及未选择的CD8+
T细胞TIL中PD-1的表达。重要的是，单独添加抗CTLA4或添加抗 CTLA4与抗RANKL组合并没
有显著改变CD8+ T细胞TIL中的PD-1水平，表明用抗PD-1单一疗法和抗RANKL加抗PD-1组合
中观察到的PD-1表达的调节是独特的，但用抗CTLA4疗法并非如此。有趣的是，通过向抗PD-
1和抗RANKL中进一步添加抗CTLA4，并没有进一步降低gp70特异性CD8+ T细胞TIL引起的
PD-1 表达。
3800-11)。与此相符的是，尽管与cIg相比，抗PD-1单一疗法显著降低了PD-1的表达，但抗PD-1 加抗RANKL的施用进一步降低了gp70特异性CD8+T细胞TIL(图19A)以及未选择的CD8+
T细胞TIL中PD-1的表达。重要的是，单独添加抗CTLA4或添加抗 CTLA4与抗RANKL组合并没
有显著改变CD8+ T细胞TIL中的PD-1水平，表明用抗PD-1单一疗法和抗RANKL加抗PD-1组合
中观察到的PD-1表达的调节是独特的，但用抗CTLA4疗法并非如此。有趣的是，通过向抗PD-
1和抗RANKL中进一步添加抗CTLA4，并没有进一步降低gp70特异性CD8+ T细胞TIL引起的
PD-1 表达。
[1066] 另外，在CT26模型中评估了肿瘤的非淋巴CD45.2+组分中PD-L1(PD-1的配体)的表达(图19B)。与继发于ICB的适应性免疫耐受性一致，注意到单剂量抗PD-1后，此类表达PD-L1的细胞的比例略有增加，但是当抗RANKL与抗 PD-1一起给予时，这种比例会减低(图
19B)。抗CTLA4的添加不影响PD-L1 的表达(图19A-B)。这些结果表明，抗RANKL通过调节非淋巴TIL中免疫抑制性PD-L1的表达来改善抗PD-1或抗PD-1+抗CTLA4疗法，并且该机制不同
于抗RANKL和抗CTLA4的组合。
19B)。抗CTLA4的添加不影响PD-L1 的表达(图19A-B)。这些结果表明，抗RANKL通过调节非淋巴TIL中免疫抑制性PD-L1的表达来改善抗PD-1或抗PD-1+抗CTLA4疗法，并且该机制不同
于抗RANKL和抗CTLA4的组合。
[1067] 总而言之，这些数据表明，抗RANKL增强抗PD-1/PD-L1功效的机制与通过抗RANKL阻断增强抗CTLA4功效的机制不同。首先，这些数据表明，通过添加 RANKL阻断可以进一步提高抗PD-1和抗CTLA4的抗肿瘤功效，并且这三重组合疗法的抗肿瘤功效优于任何双重组
合。其次，抗RANKL与不同组合疗法的独特机制相互作用，可以通过抑制RANKL时引起的TME改变来解释，其将通过某些组合疗法进行独特地交叉调节。抗CTLA4的治疗不改变T细胞TIL上的RANKL 水平。因此，在通常RANKL表达较低的肿瘤(例如黑色素瘤等)中，交叉调节假设将预测抗PD-1的施用可能导致TME中RANKL的上调，从而导致增加的 RANKL信号传导，并引
发肿瘤对同时或随后的RANKL阻断的反应。先前已在临床前模型中证明，T细胞TIL超过阈值水平的PD-1表达可能导致对抗PD-1抗体的耐受性，并且使表达降低到该水平以下的策略
(如与其他免疫疗法组合)获得治疗益处(Selby等人，2013.Cancer Immunol Res 1：32-42；
Ngiow等人，2015, 同上)。在描述的CT26肿瘤分析中，双重抗RANKL和抗PD-1治疗的治疗敏感性与肿瘤微环境的有利变化相关，包括T细胞降低的PD-1表达和PD-L1表达的降低。单独
使用抗CTLA4 mAb治疗后未观察到肿瘤微环境的这些变化，这表明 CTLA-4和PD-1调节了非
重叠的作用机制，表明与抗RANKL的同时组合治疗通过不同的抑制途径和不同的机制发生。
合。其次，抗RANKL与不同组合疗法的独特机制相互作用，可以通过抑制RANKL时引起的TME改变来解释，其将通过某些组合疗法进行独特地交叉调节。抗CTLA4的治疗不改变T细胞TIL上的RANKL 水平。因此，在通常RANKL表达较低的肿瘤(例如黑色素瘤等)中，交叉调节假设将预测抗PD-1的施用可能导致TME中RANKL的上调，从而导致增加的 RANKL信号传导，并引
发肿瘤对同时或随后的RANKL阻断的反应。先前已在临床前模型中证明，T细胞TIL超过阈值水平的PD-1表达可能导致对抗PD-1抗体的耐受性，并且使表达降低到该水平以下的策略
(如与其他免疫疗法组合)获得治疗益处(Selby等人，2013.Cancer Immunol Res 1：32-42；
Ngiow等人，2015, 同上)。在描述的CT26肿瘤分析中，双重抗RANKL和抗PD-1治疗的治疗敏感性与肿瘤微环境的有利变化相关，包括T细胞降低的PD-1表达和PD-L1表达的降低。单独
使用抗CTLA4 mAb治疗后未观察到肿瘤微环境的这些变化，这表明 CTLA-4和PD-1调节了非
重叠的作用机制，表明与抗RANKL的同时组合治疗通过不同的抑制途径和不同的机制发生。
[1068] 实施例20
[1069] 抗-RANKL MAb最佳与免疫检查点阻断同时施用或在其后施用
[1070] 评估了相对于双重免疫检查点阻断(ICB)治疗(组合的抗PD-1和抗CTLA4 mAb治疗)的抗RANKL抗体治疗的最佳顺序。在结肠癌CT26的皮下生长抑制中比较了同时的抗体治
疗(肿瘤接种后第8、12、16、20天的抗体治疗)与顺序治疗(相当于第8、12或16、20天的抗体总剂量)。当抗RANKL mAb与双重ICB 治疗同时施用、或在其后施用时，可实现显著优越的生长抑制(图20)。与同时的抗RANKL单一疗法相比，抗RANKL之后施用双重ICB的顺序可以显著抑制肿瘤的生长；但是，此顺序的效率不如同时施用单独的双重ICB(图20)。
疗(肿瘤接种后第8、12、16、20天的抗体治疗)与顺序治疗(相当于第8、12或16、20天的抗体总剂量)。当抗RANKL mAb与双重ICB 治疗同时施用、或在其后施用时，可实现显著优越的生长抑制(图20)。与同时的抗RANKL单一疗法相比，抗RANKL之后施用双重ICB的顺序可以显著抑制肿瘤的生长；但是，此顺序的效率不如同时施用单独的双重ICB(图20)。
[1071] 为了寻求mAb治疗的最佳顺序，还测试了抗RANKL和抗PD-1组合在小鼠 3LL肺腺癌模型中的抗肿瘤功效。比较了同时mAb治疗与顺序治疗给出的等同总剂量mAb中的肿瘤生长
抑制活性。临床前数据表明，无论是同时治疗还是顺序治疗，抗RANKL和抗PD-1 mAb组合的疗效均优于单一疗法或对照Ig(图21)。与抗PD-1治疗之前使用抗RANKL治疗相比，在抗
RANKL治疗之前使用抗PD-1 治疗的顺序导致肿瘤体积更显著地降低(p<0.01)(图21)。抗
RANKL之后使用抗PD-1的顺序可显著抑制肿瘤生长，然而，该顺序不如抗RANKL和抗PD-1 的同时治疗有效。
抑制活性。临床前数据表明，无论是同时治疗还是顺序治疗，抗RANKL和抗PD-1 mAb组合的疗效均优于单一疗法或对照Ig(图21)。与抗PD-1治疗之前使用抗RANKL治疗相比，在抗
RANKL治疗之前使用抗PD-1 治疗的顺序导致肿瘤体积更显著地降低(p<0.01)(图21)。抗
RANKL之后使用抗PD-1的顺序可显著抑制肿瘤生长，然而，该顺序不如抗RANKL和抗PD-1 的同时治疗有效。
[1072] 综上所述，这些数据表明，在临床前模型中观察到的抗肿瘤功效通过组合 RANKL阻断和抗PD-1抗体(与每种抗体单独相比)而得到增强，而与顺序无关。然而，数据还表明，抗RANKL之后进行双重ICB(抗PD-1和抗CTLA4)的顺序或抗PD-1单独的疗效显著低于同时治
疗。因此，这些数据表明，抗-RANKL疗法的施用应当与抗PD-1/PD-L1或抗CTLA4(或两者)的组合治疗同时(或在其后) 进行。此外，数据表明抗RANKL组合抗PD-1/PD-L1或抗CTLA4(或
两者)同时治疗可比相继后期用抗RANKL的治疗实现更优异的抗肿瘤反应，这样的数据支持
了多特异性(例如，双特异性)抗体可同时阻断RANKL和PD-1、PD-L1和/或 CTLA4的潜在活
性。
疗。因此，这些数据表明，抗-RANKL疗法的施用应当与抗PD-1/PD-L1或抗CTLA4(或两者)的组合治疗同时(或在其后) 进行。此外，数据表明抗RANKL组合抗PD-1/PD-L1或抗CTLA4(或
两者)同时治疗可比相继后期用抗RANKL的治疗实现更优异的抗肿瘤反应，这样的数据支持
了多特异性(例如，双特异性)抗体可同时阻断RANKL和PD-1、PD-L1和/或 CTLA4的潜在活
性。
[1073] 实施例21
[1074] 用多特异性拮抗剂，RANKL和PD-1在细胞上的共表达作为共靶向RANKL 和PD-1的基本原理
[1075] 对于阻断两个免疫抑制通路的双特异性抗体，由于功能是靶细胞固有的，因此在相同细胞类型上共表达靶抗原是有利的。在单一细胞类型上共表达靶抗原还可能由于肿瘤
内更高的细胞选择性，而要求(proscribe)双特异性模式在肿瘤微环境内更多的细胞或组
织特异性作用，而外周毒性则更低。替代地或另外，阻断在两个不同细胞上反式表达的两个免疫抑制通路的双特异性抗体也可能是有利的，因为可以同时抑制两个不同的免疫抑制机
制。
内更高的细胞选择性，而要求(proscribe)双特异性模式在肿瘤微环境内更多的细胞或组
织特异性作用，而外周毒性则更低。替代地或另外，阻断在两个不同细胞上反式表达的两个免疫抑制通路的双特异性抗体也可能是有利的，因为可以同时抑制两个不同的免疫抑制机
制。
[1076] 因此，作为在TME中靶向RANKL和PD-1的多特异性拮抗剂的基本原理，应考虑这些因子在肿瘤浸润免疫细胞上的共表达。如上所述，已经在CT26肿瘤模型中描述了抗RANKL与抗PD-1组合的抗肿瘤功效和机理数据，并且在该模型中表征了RANKL和PD-1在T细胞TIL上
的共表达。例如，在从小鼠的CT26肿瘤分离的T细胞中，几乎所有的CD8+RANKL+ T细胞TIL(>
90％)共表达PD-1；相比之下，少于40％的CD8+RANKL-T细胞TIL为PD-1阳性(图16)。此外， PD-1在CD8+RANKL+上的MFI至少是CD8+RANKL-T细胞上的3倍，前者鉴定为PD1hi细胞(图16)。
举例来说，98.5％的肿瘤浸润CD8+RANKL+ T细胞表达 PD-1，而44％的CD8+RANKL-T细胞表达PD-1(图22)，表明TIL中RANKL/PD-1 共表达水平非常高。
的共表达。例如，在从小鼠的CT26肿瘤分离的T细胞中，几乎所有的CD8+RANKL+ T细胞TIL(>
90％)共表达PD-1；相比之下，少于40％的CD8+RANKL-T细胞TIL为PD-1阳性(图16)。此外， PD-1在CD8+RANKL+上的MFI至少是CD8+RANKL-T细胞上的3倍，前者鉴定为PD1hi细胞(图16)。
举例来说，98.5％的肿瘤浸润CD8+RANKL+ T细胞表达 PD-1，而44％的CD8+RANKL-T细胞表达PD-1(图22)，表明TIL中RANKL/PD-1 共表达水平非常高。
[1077] 实施例22
[1078] 四价抗RANKL/PD-1 FIT-IG构建体(地诺单抗+纳武单抗)的设计
[1079] 拮抗RANKL和至少一种ICM的多特异性抗体的一个实例可以构建为多特异性FIT-Ig抗体，其由两种抗体构成，一种与RANKL结合(mAb A)，一种与PD-1 结合(mAb B)。举例说明，第一抗原结合分子可以特异性结合人RANKL的区域，第二抗原结合分子可以特异性结合人PD-1的区域，并且优选地与人PD-1的细胞外结构域区域结合。适用于本发明的一种此类
抗RANKL mAb是地诺单抗。因此，在一些实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含完全人IgG2 mAb地诺单抗或其抗原结合片段。在一些相同的实施方案和其他实施方案中，抗RANKL抗原
结合分子包含如本文表1所示的CDR序列。在多特异性FIT-Ig抗体的具体实例中，第二抗原
结合分子可以至少包含选自纳武单抗、派姆单抗和匹立珠单抗的任何一种mAb的抗原结合
片段。适合与本发明一起使用的一种此类抗PD-1 mAb是纳武单抗。
抗RANKL mAb是地诺单抗。因此，在一些实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含完全人IgG2 mAb地诺单抗或其抗原结合片段。在一些相同的实施方案和其他实施方案中，抗RANKL抗原
结合分子包含如本文表1所示的CDR序列。在多特异性FIT-Ig抗体的具体实例中，第二抗原
结合分子可以至少包含选自纳武单抗、派姆单抗和匹立珠单抗的任何一种mAb的抗原结合
片段。适合与本发明一起使用的一种此类抗PD-1 mAb是纳武单抗。
[1080] 为了构建结合并拮抗RANKL和PD-1的四价、多特异性FIT-Ig分子，将地诺单抗的轻链(VL-CL)结构域与纳武单抗的重链(VH-CH1-CH2-CH3)在NH2-末端直接串联融合。第二构建体是地诺单抗的VH-CH1，第三构建体是纳武单抗的VL-CL。抗RANKL/PD-1 FIT-Ig分子的示意图示于图23A，抗RANKL/PD-1 FIT-Ig分子的 DNA构建体设计示于图23B。将所有三个DNA构建
体亚克隆到哺乳动物表达载体中，并且通过将亚克隆到哺乳动物表达载体中的所有三个
DNA构建体在 HEK-293细胞中瞬时转染，实现蛋白质生产。RANKL/PD-1 FIT-Ig分子的纯化
可以通过蛋白A纯化来实现。
体亚克隆到哺乳动物表达载体中，并且通过将亚克隆到哺乳动物表达载体中的所有三个
DNA构建体在 HEK-293细胞中瞬时转染，实现蛋白质生产。RANKL/PD-1 FIT-Ig分子的纯化
可以通过蛋白A纯化来实现。
[1081] RANKL/PD-1 FIT-Ig构建体#1的氨基酸序列：VL(地诺单抗)-CL(地诺单抗)-VH-CH1-CH2-CH3(纳武单抗)(655 aa)：
[1082]
[1083] 其中抗RANKL抗体(地诺单抗)轻链(US 7,364,736 B2)可变区(VL)的成熟氨基酸序列以大写文字显示，而恒定区(CL)以小写文字显示；抗PD-1抗体 (纳武单抗，WO2006/
121168)重链(VH-CH1-CH2-CH3)以粗体大写文字显示。
121168)重链(VH-CH1-CH2-CH3)以粗体大写文字显示。
[1084] RANKL/PD-1 FIT-Ig构建体#2的氨基酸序列：VH-CH1地诺单抗)(218 aa)：
[1085]
[1086] 其中抗RANKL抗体(地诺单抗)重链(US 7,364,736 B2)可变区(VH)的成熟氨基酸序列以大写文字显示，而恒定区(CH1)以小写文字显示。
[1087] RANKL/PD-1 FIT-Ig构建体#3的氨基酸序列：VL-CL(纳武单抗)(214 aa)：
[1088]
[1089] 其中抗PD-1抗体轻链(纳武单抗，WO2006/121168)可变区(VL)的成熟氨基酸序列以大写文字表示，而恒定区(CL)以小写文字表示。
[1090] 实施例23
[1091] 四价抗RANKL/CTLA4 FIT-IG构建体(地诺单抗+伊匹单抗)的设计
[1092] 可以拮抗RANKL和至少一种ICM的多特异性抗体的一个实例可以构建为多特异性FIT-Ig抗体，其由两种抗体构建，一种结合RANKL(mAb A)，一种结合 CTLA4(mAb B)。举例来说，第一抗原结合分子可以与人RANKL的区域特异性结合，第二抗原结合分子可以与人
CTLA4的区域特异性结合，优选与人CTLA4 的细胞外结构域的区域特异性结合。适用于本发明的一种此类抗RANKL mAb是地诺单抗。因此，在一些实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含完全人IgG2 mAb地诺单抗或其抗原结合片段。在一些相同的实施方案和其他实施方案
中，抗 RANKL抗原结合分子包含如本文表1所示的CDR序列。在多特异性FIT-Ig抗体的具体
实例中，第二抗原结合分子至少包含选自伊匹单抗和曲美木单抗的任何一种MAb的抗原结
合片段。适合与本发明一起使用的一种这样的抗CTLA4 mAb是伊匹单抗。
CTLA4的区域特异性结合，优选与人CTLA4 的细胞外结构域的区域特异性结合。适用于本发明的一种此类抗RANKL mAb是地诺单抗。因此，在一些实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含完全人IgG2 mAb地诺单抗或其抗原结合片段。在一些相同的实施方案和其他实施方案
中，抗 RANKL抗原结合分子包含如本文表1所示的CDR序列。在多特异性FIT-Ig抗体的具体
实例中，第二抗原结合分子至少包含选自伊匹单抗和曲美木单抗的任何一种MAb的抗原结
合片段。适合与本发明一起使用的一种这样的抗CTLA4 mAb是伊匹单抗。
[1093] 为了构建结合并拮抗RANKL和CTLA4的四价、多特异性FIT-Ig分子，将地诺单抗的轻链(VL-CL)结构域与伊匹单抗的重链(VH-CH1-CH2-CH3)在NH2-末端直接串联融合。第二构建体是地诺单抗的VH-CH1，第三构建体是伊匹单抗的VL-CL。抗RANKL/CTLA4 FIT-Ig分子的示意图示于图24A，抗RANKL/CTLA4 FIT-Ig分子的DNA构建体设计示于图24B。将所有三个DNA构
建体亚克隆到哺乳动物表达载体中，并且通过将亚克隆到哺乳动物表达载体中的所有三个
DNA构建体在 HEK-293细胞中瞬时转染，实现蛋白质生产。RANKL/CTLA4 FIT-Ig分子的纯化可以通过蛋白A纯化来实现。
建体亚克隆到哺乳动物表达载体中，并且通过将亚克隆到哺乳动物表达载体中的所有三个
DNA构建体在 HEK-293细胞中瞬时转染，实现蛋白质生产。RANKL/CTLA4 FIT-Ig分子的纯化可以通过蛋白A纯化来实现。
[1094] RANKL/CTLA4 FIT-Ig构建体#1的氨基酸序列：VL(地诺单抗)-CL(地诺单抗)-VH-CH1-CH2-CH3(伊匹单抗)(663aa)：
[1095]
[1096] 其中抗RANKL抗体(地诺单抗)轻链(US 7,364,736 B2)可变区(VL)的成熟氨基酸序列以大写文字显示，而恒定区(CL)以小写文字显示；抗CTLA4抗体(伊匹单抗，
US20150283234)重链(VH-CH1-CH2-CH3)以粗体大写文字显示。
US20150283234)重链(VH-CH1-CH2-CH3)以粗体大写文字显示。
[1097] RANKL/CTLA4 FIT-Ig构建体#2的氨基酸序列：VH-CH1地诺单抗(214aa)：
[1098] 该序列与用于上述RANKL/PD-1 FIT-Ig构建体#2的VH-CH1地诺单抗构建体相同(SEQ ID NO：277)。
[1099] RANKL/CTLA4 FIT-Ig构建体#3的氨基酸序列：VL-CL(伊匹单抗)(215 aa)：
[1100]
[1101] 其中抗CTLA4抗体轻链(伊匹单抗，US20150283234)可变区(VL)的成熟氨基酸序列以大写文字显示，恒定区(CL)以小写文字显示。
[1102] 实施例24
[1103] 四价抗RANKL/PD-L1 FIT-IG构建体(地诺单抗+阿特朱单抗)的设计
[1104] 拮抗RANKL和至少一种ICM的多特异性抗体的一个实例可以构建为多特异性FIT-Ig抗体，其由两种抗体构建，一种结合RANKL(mAb A)，一种结合PD-L1 (mAb B)。举例来说，第一抗原结合分子可以与人RANKL的区域特异性结合，第二抗原结合分子可以与人PD-L1的
区域特异性结合，优选与人PD-L1的细胞外结构域的区域特异性结合。适用于本发明的一种此类抗RANKL MAb是地诺单抗。因此，在一些实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含完全人IgG2 mAb地诺单抗或其抗原结合片段。在一些相同的实施方案和其他实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含如本文表1所示的CDR序列。在多特异性FIT-Ig抗体的具体实例中，第二
抗原结合分子至少包含选自杜鲁伐单抗(MEDI4736)、阿特朱单抗 (Tecentriq)、奥维单抗、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、 CA-170、GNS-1480和MPDL3280A中任何一种MAb的抗原结合片段，或其抗原结合片段。适合与本发明一起使用的一种这样的抗PD-L1 mAb是阿特珠单抗。
区域特异性结合，优选与人PD-L1的细胞外结构域的区域特异性结合。适用于本发明的一种此类抗RANKL MAb是地诺单抗。因此，在一些实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含完全人IgG2 mAb地诺单抗或其抗原结合片段。在一些相同的实施方案和其他实施方案中，抗RANKL抗原结合分子包含如本文表1所示的CDR序列。在多特异性FIT-Ig抗体的具体实例中，第二
抗原结合分子至少包含选自杜鲁伐单抗(MEDI4736)、阿特朱单抗 (Tecentriq)、奥维单抗、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、 CA-170、GNS-1480和MPDL3280A中任何一种MAb的抗原结合片段，或其抗原结合片段。适合与本发明一起使用的一种这样的抗PD-L1 mAb是阿特珠单抗。
[1105] 为了构建结合并拮抗RANKL和PD-L1的四价、多特异性FIT-Ig分子，将地诺单抗的轻链(VL-CL)结构域与阿特朱单抗的重链(VH-CH1-CH2-CH3)在NH2-末端直接串联融合。第二构建体是地诺单抗的VH-CH1，第三构建体是阿特朱单抗的 VL-CL。抗RANKL/PD-L1 FIT-Ig分子的示意图示于图25A，抗RANKL/PD-L1 FIT-Ig分子的DNA构建体设计示于图25B。将所有三个DNA构建体亚克隆到哺乳动物表达载体中，并且通过将亚克隆到哺乳动物表达载体中的所
有三个DNA构建体在HEK-293细胞中瞬时转染，实现蛋白质生产。抗RANKL/PD-L1 FIT-Ig分
子的纯化可以通过蛋白A纯化来实现。
有三个DNA构建体在HEK-293细胞中瞬时转染，实现蛋白质生产。抗RANKL/PD-L1 FIT-Ig分
子的纯化可以通过蛋白A纯化来实现。
[1106] RANKL/PD-L1 FIT-Ig构建体#1的氨基酸序列：VL(地诺单抗)-CL(地诺单抗)-VH-CH1-CH2-CH3(阿特朱单抗)(663 aa)：
[1107]
[1108]
[1109] 其中抗RANKL抗体(地诺单抗)轻链(US 7,364,736 B2)的可变区(VL) 的成熟氨基酸序列以大写文字显示，而恒定区(CL)以小写文字显示；抗PD-L1 抗体(阿特朱单抗，美国专利号8,217148)重链(VH-CH1-CH2-CH3)以粗体大写文字显示。
[1110] RANKL/PD-L1 FIT-Ig构建体#2的氨基酸序列：VH-CH1地诺单抗)：
[1111] 该序列与用于上述RANKL/PD-1 FIT-Ig构建体#2的VH-CH1地诺单抗构建体相同(SEQ ID NO：277)。
[1112] RANKL/PD-L1 FIT-Ig构建体#3的氨基酸序列：VL-CL(阿特朱单抗)(214aa)：
[1113]
[1114] 其中抗PD-L1抗体轻链(阿特朱单抗，美国专利号8,217148)的可变区(VL) 的成熟氨基酸序列以大写文字显示，而恒定区(CL)以小写文字显示。
[1115] 实施例25
[1116] 双特异性抗RANKL/PD-1抗体(IK22-5/RMP1-14)的构建
[1117] 通过将编码Fab的序列融合到人IgG1骨架上，产生异二聚体(双特异性)抗体，其与小鼠RANKL和小鼠PD-1结合。通过首先将互补KIH突变引入IgG重链的CH3结构域实现异二聚
体双特异性IgG抗体的组装。通过“CrossMab”方法促进所需的轻链/重链配对的结合(参见，例如，Schaefer等人，2011.Proc Natl Acad Sci U S A 108：11187-11192)，其中修饰双特异性抗体的一个Fab(Fab区)以“交换”轻链和重链之间的恒定区或恒定区和可变区。还将
D265A突变引入人IgG1 Fc 结构域以降低与Fc受体的结合并降低效应功能。使用这些技术
构建了双特异性抗 RANKL/PD-1抗体(也称为RMP1-14 CH-CL X IK22/5WT双特异性)，通过标准技术生产和纯化。此外，双特异性抗RANKL/PD-1抗体能够结合两个靶标并且在体外和体
内对RANKL和PD-1具有拮抗活性。
体双特异性IgG抗体的组装。通过“CrossMab”方法促进所需的轻链/重链配对的结合(参见，例如，Schaefer等人，2011.Proc Natl Acad Sci U S A 108：11187-11192)，其中修饰双特异性抗体的一个Fab(Fab区)以“交换”轻链和重链之间的恒定区或恒定区和可变区。还将
D265A突变引入人IgG1 Fc 结构域以降低与Fc受体的结合并降低效应功能。使用这些技术
构建了双特异性抗 RANKL/PD-1抗体(也称为RMP1-14 CH-CL X IK22/5WT双特异性)，通过标准技术生产和纯化。此外，双特异性抗RANKL/PD-1抗体能够结合两个靶标并且在体外和体
内对RANKL和PD-1具有拮抗活性。
[1118] 从编码抗RANKL IK22-5(Kamijo等人，2006.Biochem Biophys Res Commun. 347(1)：124-32)和抗PD-1 RMP1-14(Curran等人，2010.Proc Natl Acad Sci U S A 107(9)：
4275-80)的大鼠杂交瘤中获得mAb cDNA序列。按照 试剂(Ambion，目录号：15596-
026)的技术手册从杂交瘤细胞中分离总RNA。然后按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA合成试剂盒(Takara，目录号6110A)的技术手册，使用同种型特异性抗正义引物或通用引物将总RNA逆转录为cDNA。根据标准技术，根据快速扩增cDNA末端(RACE)的标准操作程序(SOP)扩
增VH 和VL的抗体片段。将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中，并进行DNA 测序。
提供了抗RANKL mAb IK22-5和抗PD-1 mAb RMP1-14的可变结构域和前导序列的氨基酸序
列(见下文)。使用NCBI核苷酸BLAST、IMGT/V Quest程序和NCBI IgBLAST算法实现对免疫球蛋白可变区的序列分析并确定框架区(FR) 和CDR。
4275-80)的大鼠杂交瘤中获得mAb cDNA序列。按照 试剂(Ambion，目录号：15596-
026)的技术手册从杂交瘤细胞中分离总RNA。然后按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA合成试剂盒(Takara，目录号6110A)的技术手册，使用同种型特异性抗正义引物或通用引物将总RNA逆转录为cDNA。根据标准技术，根据快速扩增cDNA末端(RACE)的标准操作程序(SOP)扩
增VH 和VL的抗体片段。将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中，并进行DNA 测序。
提供了抗RANKL mAb IK22-5和抗PD-1 mAb RMP1-14的可变结构域和前导序列的氨基酸序
列(见下文)。使用NCBI核苷酸BLAST、IMGT/V Quest程序和NCBI IgBLAST算法实现对免疫球蛋白可变区的序列分析并确定框架区(FR) 和CDR。
[1119] 大鼠单克隆抗体抗RANKL mAb IK22-5可变结构域的氨基酸序列：
[1120] 重链IK22-5：氨基酸序列(135aa)：
[1121] 前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[1122]
[1123] 轻链IK22-5：氨基酸序列(126aa)：前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[1124]
[1125] 大鼠单克隆抗体抗PD-1 mAb RMP1-14可变结构域的氨基酸序列：
[1126] 重链RMP1-14：氨基酸序列(138aa)
[1127] 前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[1128]
[1129] 轻链RMP1-14：氨基酸序列(131aa)
[1130] 前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[1131]
[1132] 实施例26
[1133] 双特异性抗RANKL/PD-1抗体的构建、生产和纯化
[1134] 为了产生能够结合RANKL和PD-1的多特异性抗原结合分子(双特异性抗 RANKL/PD-1抗体，也称为RMP1-14 CH-CL X IK22/5 WT双特异性)，使用“CrossMAb”技术，其中可通过修饰双特异性抗体的一个Fab(Fab区)、以“交换”轻链和重链之间的恒定或恒定和可变
区，来诱导所需的轻链/重链配对。其次，为了产生重链异二聚体的特定对，利用了两条重链的Fc结构域中的“旋钮入孔” (KiH)突变。合成编码大鼠单克隆抗体可变区(来自IK22-5和RMP1-14)的DNA 作为与人IgG1 Fc结构域的融合体。这种防止“不适当”轻/重链结合的技术被称为“CrossMab”技术，当与KiH技术组合使用时，可显著增强所需双特异性分子的表达(参见例如Schaefer等人，2011.Proc Natl Acad Sci U S A 108：11187-11192)。
区，来诱导所需的轻链/重链配对。其次，为了产生重链异二聚体的特定对，利用了两条重链的Fc结构域中的“旋钮入孔” (KiH)突变。合成编码大鼠单克隆抗体可变区(来自IK22-5和RMP1-14)的DNA 作为与人IgG1 Fc结构域的融合体。这种防止“不适当”轻/重链结合的技术被称为“CrossMab”技术，当与KiH技术组合使用时，可显著增强所需双特异性分子的表达(参见例如Schaefer等人，2011.Proc Natl Acad Sci U S A 108：11187-11192)。
[1135] 为了生成双特异性抗RANKL/PD-1抗体的CrossMab形式，将RMP1-14(抗 PD-1抗体)序列工程化为“CrossMabCH1-CL”，其中CH1和CL序列交换(称为 RMP1-14 CH-CL-hulgG1Fc)。抗RANKL抗体(IK22-5)的Fab区未改变(称为 IK22-5-huIgG1Fc WT)。通过将大的氨基酸(旋
钮)引入所需异二聚体的一条链中，并将小的氨基酸(孔)引入所需异二聚体的另一条链中
(也称为“旋钮入孔” (KIH)结构)，可以促进多肽链的异二聚化(参见，例如，Ridgeway等人，Protein Eng.9(1996),617-621以及Atwell等人，J.Mol.Biol.270(1997),677-681)。具体
而言，将“旋钮”突变(T366W)引入IK22-5-huIgG1Fc WT的CH3结构域，并将三个“孔”突变(T366S、L368A和Y407V)引入RMP1-14 CH-CL-huIgGlFc 的重链。另外，为了形成稳定的二硫桥并进一步增强异二聚化作用，引入了两个 Cys残基(“旋钮”上的S354C和“孔”侧上的
Y349C)。此外，还将D265A突变引入IK22-5-huIgG1Fc WT和RMP1-14 CH-CL-hulgG1Fc的人
IgG1 Fc结构域中。双特异性抗RANKL/PD-1抗体的示意图如图26所示。
钮)引入所需异二聚体的一条链中，并将小的氨基酸(孔)引入所需异二聚体的另一条链中
(也称为“旋钮入孔” (KIH)结构)，可以促进多肽链的异二聚化(参见，例如，Ridgeway等人，Protein Eng.9(1996),617-621以及Atwell等人，J.Mol.Biol.270(1997),677-681)。具体
而言，将“旋钮”突变(T366W)引入IK22-5-huIgG1Fc WT的CH3结构域，并将三个“孔”突变(T366S、L368A和Y407V)引入RMP1-14 CH-CL-huIgGlFc 的重链。另外，为了形成稳定的二硫桥并进一步增强异二聚化作用，引入了两个 Cys残基(“旋钮”上的S354C和“孔”侧上的
Y349C)。此外，还将D265A突变引入IK22-5-huIgG1Fc WT和RMP1-14 CH-CL-hulgG1Fc的人
IgG1 Fc结构域中。双特异性抗RANKL/PD-1抗体的示意图如图26所示。
[1136] 双特异性CrossMab抗RANKL/PD-1抗体的四条抗体链的氨基酸序列
[1137] IK22-5-huIgGlFc WT重链(465 aa)：
[1138] 前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-CH1-CH2-CH3(重链1)
[1139]
[1140] IK22-5-huIgGlFc WT轻链(232aa)：前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-CL
[1141]
[1142] RMP1-14 CH-CL-huIgG1Fc重链(473 aa)：前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-CL-CH2-CH3
[1143]
[1144]
[1145] RMP1-14 CH-CL- huIgG1Fc轻链(233 aa)：前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-CH1
[1146]
[1147] 为了产生重组双特异性抗体，将编码四条链中每条链的cDNA亚克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.4中，并根据标准技术大量制备转染级质粒。通过在无血清 ExpiCHO表达培
养基(Thermo Fisher Scientific)中生长的ExpiCHO-S悬浮细胞中瞬时表达而产生双特异
性抗体，其中四个表达质粒(编码RMP1-14 CH-CL-huIgG1Fc 和IK22-5-huIgG1Fc WT的重链
和轻链)为等摩尔比。将细胞(1L培养物体积)在轨道摇床上、在37℃，8％CO2下，在锥形瓶(Erlenmeyer Flasks，Corning Inc.) 中维持，并在转染后第14天将收集的细胞培养上清
液用于纯化。抗体滴度在常规 IgG1抗体的瞬时表达滴度的范围内。离心细胞培养肉汤，然后过滤。将过滤的上清液以1.0mL/分钟的速度上样至Monofinity A树脂预填充的柱1mL
(GenScript，目录号L00433-11)上。洗涤并用适当的缓冲液洗脱后，将洗脱的抗体级分合
并，并将缓冲液更换为PBS，pH7.2。蛋白质通过0.22μm过滤器灭菌，无菌包装并储存在-80℃。
养基(Thermo Fisher Scientific)中生长的ExpiCHO-S悬浮细胞中瞬时表达而产生双特异
性抗体，其中四个表达质粒(编码RMP1-14 CH-CL-huIgG1Fc 和IK22-5-huIgG1Fc WT的重链
和轻链)为等摩尔比。将细胞(1L培养物体积)在轨道摇床上、在37℃，8％CO2下，在锥形瓶(Erlenmeyer Flasks，Corning Inc.) 中维持，并在转染后第14天将收集的细胞培养上清
液用于纯化。抗体滴度在常规 IgG1抗体的瞬时表达滴度的范围内。离心细胞培养肉汤，然后过滤。将过滤的上清液以1.0mL/分钟的速度上样至Monofinity A树脂预填充的柱1mL
(GenScript，目录号L00433-11)上。洗涤并用适当的缓冲液洗脱后，将洗脱的抗体级分合
并，并将缓冲液更换为PBS，pH7.2。蛋白质通过0.22μm过滤器灭菌，无菌包装并储存在-80℃。
[1148] 为了测定分子量、产率和纯度，随后使用标准方案通过SDS-PAGE、蛋白质印迹和HPLC分析纯化的蛋白质。根据非还原条件下的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，检测到靶标蛋
白具有约80kDa、约100kDa和150kDa的估计分子量(计算的分子量145kDa)(如图27所示)。如所示，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，检测到抗体的重链和轻链具有约55kDa和约25kDa
的估计分子量。通过 SEC-HPLC估计的双特异性抗RANKL/PD-1抗体的纯度为85.86％，通过
A280测定的浓度为3.69mg/mL(消光系数：1.494)。
白具有约80kDa、约100kDa和150kDa的估计分子量(计算的分子量145kDa)(如图27所示)。如所示，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，检测到抗体的重链和轻链具有约55kDa和约25kDa
的估计分子量。通过 SEC-HPLC估计的双特异性抗RANKL/PD-1抗体的纯度为85.86％，通过
A280测定的浓度为3.69mg/mL(消光系数：1.494)。
[1149] 在悬浮ExpiCHO-S细胞培养物中表达后，通过标准蛋白A亲和色谱法以高纯度获得了双特异性抗RANKL/PD-1抗体，用于进一步的体外验证和体内测试。
[1150] 实施例27
[1151] 双特异性抗RANKL/PD-1抗体的体外表征
[1152] 与HEK-293上的muRANKL结合的双特异性抗RANKL/PD-1抗体(IK22-5/RMP1-14)
[1153] 为了表征双特异性抗RANKL/PD-1抗体结合在细胞上表达的RANKL的能力，进行了流式细胞术分析。通过编码muRANKL的cDNA瞬时转染的HEK-293细胞上测得的信号强度与未
转染的HEK-293细胞所获得的信号强度进行比较，确定相互作用的特异性。双特异性抗
RANKL/PD-1抗体未能识别未转染的HEK-293细胞，但结合表达muRANKL的细胞(图28)。双特
异性抗RANKL/PD-1抗体与 muRANKL的结合与在阳性对照muRANK-Fc中观察到的结合非常相
似(图28)。因此，RANKL/PD-1抗体以高亲和力特异性识别在细胞表面表达的muRANKL的细胞外结构域。
转染的HEK-293细胞所获得的信号强度进行比较，确定相互作用的特异性。双特异性抗
RANKL/PD-1抗体未能识别未转染的HEK-293细胞，但结合表达muRANKL的细胞(图28)。双特
异性抗RANKL/PD-1抗体与 muRANKL的结合与在阳性对照muRANK-Fc中观察到的结合非常相
似(图28)。因此，RANKL/PD-1抗体以高亲和力特异性识别在细胞表面表达的muRANKL的细胞外结构域。
[1154] 实施例28
[1155] 双特异性抗RANKL/PD-1抗体(IK22-5/RMP1-14)竞争与RANK-FC的结合
[1156] 在竞争测定法中使用重组muRANK-Fc(RANKL的高亲和力受体)测试了双特异性抗RANKL/PD-1抗体阻断配体结合的能力。用muRANKL瞬时转染HEK-293细胞，并在同种型对照
抗体(大鼠IgG2a和huIgG1)、阳性对照抗 muRANKL抗体(IK22-5大鼠IgG2a)和双特异性抗
RANKL/PD-1的存在下测试 RANK-Fc的结合。抗RANKL/PD-1双特异性抗体能够完全阻断
RANK-Fc与 muRANKL的结合，阳性对照抗RANKL抗体IK22-5也是如此(图29)。抗 RANKL/PD-1双特异性抗体在阻断RANK-Fc与RANKL结合方面表现出拮抗活性，IC50为2.6μg/mL，与对照抗RANKL mAb IK22-5(IC50为1.1μg/mL)观察到的相当。大鼠IgG2a和人IgG1同种型对照均未阻断RANK-Fc与RANKL的结合。
抗体(大鼠IgG2a和huIgG1)、阳性对照抗 muRANKL抗体(IK22-5大鼠IgG2a)和双特异性抗
RANKL/PD-1的存在下测试 RANK-Fc的结合。抗RANKL/PD-1双特异性抗体能够完全阻断
RANK-Fc与 muRANKL的结合，阳性对照抗RANKL抗体IK22-5也是如此(图29)。抗 RANKL/PD-1双特异性抗体在阻断RANK-Fc与RANKL结合方面表现出拮抗活性，IC50为2.6μg/mL，与对照抗RANKL mAb IK22-5(IC50为1.1μg/mL)观察到的相当。大鼠IgG2a和人IgG1同种型对照均未阻断RANK-Fc与RANKL的结合。
[1157] 实施例29
[1158] 双特异性抗RANKL/PD-1(IK22-5/RMP1-14)结合HEK-293细胞上异位 (ECTOPICALLY)表达的PD-1
[1159] 为了表征双特异性抗RANKL/PD-1抗体结合在细胞上表达的PD-1的能力，进行了流式细胞术分析。双特异性抗RANKL/PD-1双特异性抗体与muPD-1转染的HEK-293细胞特异性
结合，但不与未转染的HEK-293细胞结合(图30)。因此，RANKL/PD-1抗体以高亲和力特异性识别在细胞表面表达的muPD-1的细胞外结构域。
结合，但不与未转染的HEK-293细胞结合(图30)。因此，RANKL/PD-1抗体以高亲和力特异性识别在细胞表面表达的muPD-1的细胞外结构域。
[1160] 实施例30
[1161] 双特异性抗RANKL/PD-1抗体(IK22-5/RMP1-14)竞争与PD-L1-Fc的结合
[1162] 在竞争测定法中使用重组muPD-L1-Fc(PD-1的高亲和力配体)测试了双特异性抗RANKL/PD-1抗体阻断配体结合的能力。用muPD-1瞬时转染HEK-293细胞，并在同种型对照抗体(大鼠IgG2a和huIgG1)、阳性对照抗mu PD-1抗体 (RMP1-14大鼠IgG2a)和双特异性抗
RANKL/PD-1抗体的存在下测试PD-L1-Fc 的结合。抗RANKL/PD-1双特异性抗体能够阻断PD-
L1-Fc与muPD-1的结合，阳性对照抗PD-1抗体RMP1-14也是如此(图31)。抗RANKL/PD-1双特
异性抗体在阻断PD-L1-Fc与PD-1结合方面表现出拮抗活性，与对照抗PD-1 mAb RMP1-14
观察到的相当。大鼠IgG2a和人IgG1同种型对照均未阻断PD-L1-Fc与PD-1的结合。
RANKL/PD-1抗体的存在下测试PD-L1-Fc 的结合。抗RANKL/PD-1双特异性抗体能够阻断PD-
L1-Fc与muPD-1的结合，阳性对照抗PD-1抗体RMP1-14也是如此(图31)。抗RANKL/PD-1双特
异性抗体在阻断PD-L1-Fc与PD-1结合方面表现出拮抗活性，与对照抗PD-1 mAb RMP1-14
观察到的相当。大鼠IgG2a和人IgG1同种型对照均未阻断PD-L1-Fc与PD-1的结合。
[1163] 实施例31
[1164] 抗RANKL/PD-1双特异性抗体在基于细胞的功能测定法中的拮抗活性
[1165] 为了在基于细胞的功能测定法中评估双特异性抗RANKL/PD-1抗体的功能性抑制作用，测试了该抗体对体外破骨细胞生成的作用。体外TRAP+破骨细胞测定的方法基本上如所述(Simonet等人，1997.Cell 89(2)：309-19)。将来自正常 BL/6小鼠的骨髓(BM)细胞以
25000个细胞/孔的密度接种在96孔平底板中，在总体积200μL/孔的完全DMEM(10％FCS+PS+Glu)中，补充有50ng/mL的人重组CSF-1(Preprotech)。培养48小时后，将培养基替换为补充有50ng/mL人重组CSF-1和200ng/mL可溶性muRANKL(Miltenyi)的完全DMEM。用CSF-1和
RANKL培养细胞4天(有或没有抗体抑制剂)，然后计数TRAP+多核(超过三个核)破骨细胞。如前所述(Simonet等人，1997，同上)，通过TRAP细胞化学染色评估产生的破骨细胞。与阳性对照抗体IK22-5的作用相似，抗RANKL/PD-1双特异性抗体的添加，而不是对照人IgG的添加，以剂量依赖性方式抑制TRAP+多核细胞的形成(图32)。在100ng/mL的浓度下，抗RANKL mAb IK22-5和双特异性抗RANKL/PD-1抗体都完全阻断破骨细胞的形成。这些结果表明，抗
RANKL/PD-1双特异性抗体保留了体外对RANKL和破骨细胞分化的拮抗活性。
25000个细胞/孔的密度接种在96孔平底板中，在总体积200μL/孔的完全DMEM(10％FCS+PS+Glu)中，补充有50ng/mL的人重组CSF-1(Preprotech)。培养48小时后，将培养基替换为补充有50ng/mL人重组CSF-1和200ng/mL可溶性muRANKL(Miltenyi)的完全DMEM。用CSF-1和
RANKL培养细胞4天(有或没有抗体抑制剂)，然后计数TRAP+多核(超过三个核)破骨细胞。如前所述(Simonet等人，1997，同上)，通过TRAP细胞化学染色评估产生的破骨细胞。与阳性对照抗体IK22-5的作用相似，抗RANKL/PD-1双特异性抗体的添加，而不是对照人IgG的添加，以剂量依赖性方式抑制TRAP+多核细胞的形成(图32)。在100ng/mL的浓度下，抗RANKL mAb IK22-5和双特异性抗RANKL/PD-1抗体都完全阻断破骨细胞的形成。这些结果表明，抗
RANKL/PD-1双特异性抗体保留了体外对RANKL和破骨细胞分化的拮抗活性。
[1166] 实施例32
[1167] 肿瘤模型中双特异性抗RANKL/PD-1抗体的体内测试
[1168] 用双特异性抗RANKL/PD-1抗体共靶向RANKL和PD-1在抑制实验性肺转移方面优于单一疗法抗RANKL或抗PD-1
[1169] 为了测试双特异性抗RANKL/PD-1抗体对转移的控制作用，使用了携带实验性B16F10黑色素瘤肺转移的野生型(WT)小鼠。在第-1、0和2天(相对于肿瘤接种)用cIg(200μg腹膜内，重组Mac4人IgG1 D265A)、抗RANKL(100μg 腹膜内，重组IK22.5-人IgG1 D265A)、抗PD-1(100μg腹膜内，重组RMP1-14人 IgG1 D265A)、抗RANKL+抗PD-1(各100μg腹膜内)、和滴定剂量的抗 RANKL/PD-1双特异性(50至200μg腹膜内，人IgG1 D265A)治疗小鼠，如所述。与对照免疫球蛋白(cIg)治疗组相比，单独的抗RANKL或抗PD-1显示适度的功效，而用2种抗体(抗RANKL和抗PD-1)组合治疗或用双特异性抗RANKL/PD-1 抗体的治疗显著改善转移控制
(图33)。
(图33)。
[1170] 预期用双特异性抗体治疗对肺转移的体内抑制作用大于单独的任一抗体或抗 PD-1抗体和抗RANKL抗体的组合。双特异性抗RANKL/PD-1抗体显示剂量依赖性的肺转移负
荷降低，与单独的抗PD-1相比，100和200μg剂量组导致肺转移优异地减少(分别为*p＜
0.05，***p＜0.001)。与以每种抗体100μg给药的抗PD-1 抗体和抗RANKL抗体的组合治疗相比(即总抗体200μg)，用等同抗体剂量(200μg 双特异性抗RANKL/PD-1)的双特异性抗
RANKL/PD-1抗体的治疗在转移控制方面至少达到了等同改善(图33)。
荷降低，与单独的抗PD-1相比，100和200μg剂量组导致肺转移优异地减少(分别为*p＜
0.05，***p＜0.001)。与以每种抗体100μg给药的抗PD-1 抗体和抗RANKL抗体的组合治疗相比(即总抗体200μg)，用等同抗体剂量(200μg 双特异性抗RANKL/PD-1)的双特异性抗
RANKL/PD-1抗体的治疗在转移控制方面至少达到了等同改善(图33)。
[1171] 在携带实验性RM1前列腺癌肺转移的WT小鼠中，观察到了双特异性抗 RANKL/PD-1抗体的类似作用(图34)。在第-1、0和2天(相对于肿瘤接种)用 cIg(200μg腹膜内，人IgG1 D265A)、抗RANKL(100μg腹膜内，IK22.5人IgG1 D265A)、抗PD-1(100μg腹膜内，人IgG1 D265A)、抗RANKL+抗PD-1(各 100μg腹膜内)、抗RANKL-PD-1双特异性(100或200μg腹膜内，人IgG1 D265A) 治疗小鼠，如所述。与对照免疫球蛋白(cIg)治疗组相比，单独的抗RANKL或抗PD-1显示适度的功效，而用2种抗体(抗RANKL和抗PD-1)组合治疗或用双特异性抗RANKL/
PD-1抗体的治疗显著改善转移控制(图34)。
PD-1抗体的治疗显著改善转移控制(图34)。
[1172] 预期用双特异性抗体治疗对肺转移的体内抑制作用大于单独的任一抗体或抗 PD-1抗体和抗RANKL抗体的组合。双特异性抗RANKL/PD-1抗体显示剂量依赖性的肺转移负
荷降低，与单独的抗PD-1相比，200μg剂量组导致肺转移优异地减少(*****p＜0.0001)。与以每种抗体100μg给药的抗PD-1抗体和抗RANKL抗体的组合治疗相比(即总抗体200μg)，用等同总抗体剂量(200μg双特异性抗 RANKL/PD-1)的双特异性抗RANKL/PD-1抗体的治疗在
转移控制方面实现了等同改善(图34)。这些结果表明双特异性抗RANKL/PD-1抗体与用等同
剂量的抗 PD-1和抗RANKL MAb的组合治疗组相比，实现了等同的转移控制，表明双特异性
抗RANKL/PD-1具有优异的功效。
荷降低，与单独的抗PD-1相比，200μg剂量组导致肺转移优异地减少(*****p＜0.0001)。与以每种抗体100μg给药的抗PD-1抗体和抗RANKL抗体的组合治疗相比(即总抗体200μg)，用等同总抗体剂量(200μg双特异性抗 RANKL/PD-1)的双特异性抗RANKL/PD-1抗体的治疗在
转移控制方面实现了等同改善(图34)。这些结果表明双特异性抗RANKL/PD-1抗体与用等同
剂量的抗 PD-1和抗RANKL MAb的组合治疗组相比，实现了等同的转移控制，表明双特异性
抗RANKL/PD-1具有优异的功效。
[1173] 实施例33
[1174] 用双特异性抗RANKL/PD-1共靶向RANKL和PD-1抑制肺癌细胞系3LL的皮下肿瘤生长
[1175] 为了测试抗RANKL/PD-1双特异性抗体对皮下肿瘤生长的活性，使用了小鼠 3LL肺腺癌模型。在第8、12、16和20天(相对于肿瘤接种)，用cIg(400μg腹膜内，大鼠IgG2a)、抗RANKL(100μg腹膜内，IK22-5大鼠IgG2a)、抗PD-1 (100μg腹膜内，RMP1-14大鼠IgG2a)、抗RANKL+抗PD-1(IK22-5和RMP1-14 各100μg腹膜内)和滴定剂量的抗RANKL/PD-1双特异性
(100至400μg腹膜内，人IgG1 D265A)治疗小鼠，如所示。单独用抗RANKL mAb IK22-5的治疗对3LL 皮下肿瘤生长没有影响，然而，与对照免疫球蛋白(cIg)治疗组相比，单独的抗 PD-1显示适度功效。与cIg或单独的对照抗RANKL治疗相比，所有剂量的双特异性抗RANKL/PD-1
抗体均明显具有降低3LL皮下肿瘤生长的活性。200μg剂量的抗RANKL/PD-1抗体的抗肿瘤作用类似于用等同总剂量(200μg)两种抗体(抗 RANKL和抗PD-1，每种100μg)的组合治疗所观察到的作用(图35)。这些数据证实了双特异性抗RANKL/PD-1抗体在皮下肿瘤模型中的体内
功效。
(100至400μg腹膜内，人IgG1 D265A)治疗小鼠，如所示。单独用抗RANKL mAb IK22-5的治疗对3LL 皮下肿瘤生长没有影响，然而，与对照免疫球蛋白(cIg)治疗组相比，单独的抗 PD-1显示适度功效。与cIg或单独的对照抗RANKL治疗相比，所有剂量的双特异性抗RANKL/PD-1
抗体均明显具有降低3LL皮下肿瘤生长的活性。200μg剂量的抗RANKL/PD-1抗体的抗肿瘤作用类似于用等同总剂量(200μg)两种抗体(抗 RANKL和抗PD-1，每种100μg)的组合治疗所观察到的作用(图35)。这些数据证实了双特异性抗RANKL/PD-1抗体在皮下肿瘤模型中的体内
功效。
[1176] 实施例34
[1177] 用双特异性抗RANKL/PD-1共靶向RANKL和PD-1抑制结肠癌细胞系CT26 的皮下肿瘤生长
[1178] 在携带皮下CT26结肠肿瘤的小鼠中比较双特异性抗RANKL/PD-1抗体与抗 RANKL和抗PD-1抗体组合治疗的功效(图36)。在携带CT26肿瘤的小鼠中，抗RANKL或抗PD-1(100μg)作为单一疗法具有最小作用，但是当使用组合疗法 (抗RANKL加抗PD-1，各100μg)时，观察到已建立的肿瘤生长受到抑制(图 2A)。与cIg、单独的抗PD-1治疗或单独的对照抗RANKL治疗相比，100μg和 200μg剂量的双特异性抗RANKL/PD-1抗体明显降低了CT26的皮下肿瘤生长。对抗PD-1单一疗法缺乏反应表明该肿瘤对这种免疫疗法表现出一定的耐受性，并且
用单一试剂，双特异性抗RANKL/PD-1抗体的治疗克服了这种耐受性。预期用双特异性抗体
治疗对CT26肿瘤控制的体内抑制作用大于单独的抗体或抗PD-1抗体和抗RANKL抗体的组
合。200μg剂量的双特异性抗RANKL/PD-1抗体的抗肿瘤作用类似于在等同总剂量(200μg的两种抗体(抗RANKL和抗PD-1，每种100μg) 的组合治疗中观察到的(图36)。这些数据证实了双特异性抗RANKL/PD-1抗体在皮下肿瘤模型中的体内功效。
用单一试剂，双特异性抗RANKL/PD-1抗体的治疗克服了这种耐受性。预期用双特异性抗体
治疗对CT26肿瘤控制的体内抑制作用大于单独的抗体或抗PD-1抗体和抗RANKL抗体的组
合。200μg剂量的双特异性抗RANKL/PD-1抗体的抗肿瘤作用类似于在等同总剂量(200μg的两种抗体(抗RANKL和抗PD-1，每种100μg) 的组合治疗中观察到的(图36)。这些数据证实了双特异性抗RANKL/PD-1抗体在皮下肿瘤模型中的体内功效。
[1179] 实施例35
[1180] 用双特异性抗RANKL/PD-1共靶向RANKL和PD-1增强CT26肿瘤模型中抗CTLA4治疗的抗肿瘤功效
[1181] 本文呈现的结果表明，抗PD-1/PD-L1和抗CTLA4疗法、抗PD-1/PD-L1单一疗法或抗CTLA4单一疗法的抗肿瘤功效，可通过添加RANKL阻断被进一步提高。此外，这种三重组合疗法(抗RANKL加抗PD-1加抗CTLA4)的抗肿瘤功效优于任何双重组合。这些数据表明，抗RANKL增强抗PD-1/PD-L1功效的机制不同于用抗RANKL阻断增强抗CTLA4功效的机制。
[1182] 为了寻求抗RANKL/PD-1双特异性抗体(作为单一药物治疗)是否可以增强抗CTLA4 mAb的抗肿瘤功效，在携带皮下CT26结肠肿瘤的小鼠中，比较了双特异性抗RANKL/PD-1抗体(单独或与抗CTLA4组合)与单独的抗CTLA4治疗、抗CTLA4加抗PD-1组合治疗、或抗RANKL加
抗PD-1加抗CTLA4组合治疗(三重治疗疗法)的功效。在此模型中，用抗CTLA4的治疗可导致
肿瘤生长适度的降低，这种降低在添加抗PD-1(抗CTLA4加抗PD-1组合)后可得到提高(图
37)。将抗RANKL mAb添加到抗CTLA4加抗PD-1组合中(三重治疗疗法)，进一步改善肿瘤控
制。向抗CTLA4 mAb中添加抗RANKL/PD-1双特异性抗体降低肿瘤生长的程度当然比使用双
特异性抗RANKL/PD-1抗体或单独的抗CTLA4治疗所观察到的程度更大，并且与三重治疗(抗
RANKL加抗PD-1加抗CTLA4)相比改善了肿瘤控制(图37)。这些数据表明抗RANKL/PD-1(作为
单一药物治疗)增强抗CTLA4抗皮下肿瘤功效的能力。
抗PD-1加抗CTLA4组合治疗(三重治疗疗法)的功效。在此模型中，用抗CTLA4的治疗可导致
肿瘤生长适度的降低，这种降低在添加抗PD-1(抗CTLA4加抗PD-1组合)后可得到提高(图
37)。将抗RANKL mAb添加到抗CTLA4加抗PD-1组合中(三重治疗疗法)，进一步改善肿瘤控
制。向抗CTLA4 mAb中添加抗RANKL/PD-1双特异性抗体降低肿瘤生长的程度当然比使用双
特异性抗RANKL/PD-1抗体或单独的抗CTLA4治疗所观察到的程度更大，并且与三重治疗(抗
RANKL加抗PD-1加抗CTLA4)相比改善了肿瘤控制(图37)。这些数据表明抗RANKL/PD-1(作为
单一药物治疗)增强抗CTLA4抗皮下肿瘤功效的能力。
[1183] 实施例36
[1184] 用双特异性抗RANKL/PD-1共靶向RANKL和PD-1抑制乳癌细胞系AT3OVA的皮下肿瘤生长
[1185] 在携带皮下AT3OVA乳腺肿瘤的小鼠中比较双特异性抗RANKL/PD-1抗体与抗RANKL和抗PD-1抗体组合治疗的功效(图38)。在携带AT3OVA肿瘤的小鼠中，抗RANKL或抗PD-1
作为单一疗法具有最小作用，但是当使用组合疗法(抗RANKL加抗PD-1，各 )
时，观察到已建立的肿瘤生长受到抑制(图38)。与cIg、单独的抗PD-1治疗或单独的对照抗RANKL治疗相比， 和 剂量的双特异性抗RANKL/PD-1抗体明显降低了AT3OVA的
皮下肿瘤生长。对抗PD-1单一疗法缺乏反应表明该肿瘤对这种免疫疗法表现出一定的耐受
性，并且用单一试剂，双特异性抗RANKL/PD-1抗体的治疗克服了这种耐受性。预期用双特异性抗体治疗对AT3OVA肿瘤控制的体内抑制作用大于单独的抗体或抗PD-1抗体和抗RANKL抗
体的组合。200μg剂量的双特异性抗RANKL/PD-1抗体的抗肿瘤作用类似于在等同总剂量
(200μg的两种抗体(抗RANKL和抗PD-1，每种100μg)的组合治疗中观察到的(图38)。这些数据证实了双特异性抗 RANKL/PD-1抗体在皮下乳腺肿瘤模型中的体内功效。
作为单一疗法具有最小作用，但是当使用组合疗法(抗RANKL加抗PD-1，各 )
时，观察到已建立的肿瘤生长受到抑制(图38)。与cIg、单独的抗PD-1治疗或单独的对照抗RANKL治疗相比， 和 剂量的双特异性抗RANKL/PD-1抗体明显降低了AT3OVA的
皮下肿瘤生长。对抗PD-1单一疗法缺乏反应表明该肿瘤对这种免疫疗法表现出一定的耐受
性，并且用单一试剂，双特异性抗RANKL/PD-1抗体的治疗克服了这种耐受性。预期用双特异性抗体治疗对AT3OVA肿瘤控制的体内抑制作用大于单独的抗体或抗PD-1抗体和抗RANKL抗
体的组合。200μg剂量的双特异性抗RANKL/PD-1抗体的抗肿瘤作用类似于在等同总剂量
(200μg的两种抗体(抗RANKL和抗PD-1，每种100μg)的组合治疗中观察到的(图38)。这些数据证实了双特异性抗 RANKL/PD-1抗体在皮下乳腺肿瘤模型中的体内功效。
[1186] 本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用全文并入本文。
[1187] 本文任何参考文献的引用均不应解释为承认该参考文献可作为本申请的“现有技术”。
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