性发育异常相关基因捕获试剂盒及其应用
阅读：819发布：2020-05-12
专利汇可以提供性发育异常相关基因捕获试剂盒及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种性发育异常相关基因捕获 试剂 盒 及其应用。本发明所提供的性发育异常相关基因捕获试剂盒，通过对遗传性性发育异常患者的全外显子组或性发育异常相关基因组(分别占全基因组的1％和0.01％)进行目标区域测序分析，捕获的是 疾病 的大部分致病突变信息，具有所需样本量少、 费用 低、通量高的优势，能够检测更多的样本，促进了遗传性性发育异常新的致病变异的发现。本发明选取的性发育异常相关基因突变位点涵盖了中国人的常见热点突变以及其他非常见突变点。该试剂盒的高通量性可较全面的筛查人群中的性发育异常相关基因，对于提高人口 质量 和造福社会有重大意义。，下面是性发育异常相关基因捕获试剂盒及其应用专利的具体信息内容。
1.探针组合，由277条探针组成；所述277条探针依次为序列表的序列1至序列277所示的单链DNA分子。
2.如权利要求1所述的探针组合，其特征在于：所述277条探针均采用生物素标记。
3.引物探针组合，由277条探针和引物对组成；
每条探针由通用片段1、特异片段和通用片段2组成；
所述277条探针的特异片段依次如序列表的序列1至序列277所示；
所述引物对由上游引物和下游引物组成；
所述上游引物包括通用片段1；
所述下游引物包括通用片段2；
所述上游引物或所述下游引物采用生物素标记。
4.权利要求1或2所述的探针组合，或，权利要求3所述的引物探针组合的应用，为如下(b1)-(b8)中的至少一种：
(b1)构建性染色体异常相关基因捕获文库；
(b2)制备用于构建性染色体异常相关基因捕获文库的试剂盒；
(b3)检测性染色体异常相关基因；
(b4)制备用于检测性染色体异常相关基因的试剂盒；
(b5)检测性染色体异常相关基因位点突变情况；
(b6)制备用于检测性染色体异常相关基因位点突变情况的试剂盒；
(b7)辅助诊断性染色体异常相关基因引发的疾病；
(b8)制备用于诊断性染色体异常相关基因引发的疾病的试剂盒。
5.权利要求1至3任一所述的探针组合或引物探针组合和载体A或载体B在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(c1)-(c4)中的至少一种：
(c1)构建性染色体异常相关基因捕获文库；
(c2)检测性染色体异常相关基因；
(c3)检测性染色体异常相关基因位点突变情况；
(c4)辅助诊断性染色体异常相关基因引发的疾病。
所述载体A记载有方法A1和/或方法A2和/或方法A3；
所述载体B记载有方法B1和/或方法B2和/或方法B3；
所述方法A1为性染色体异常相关基因捕获文库的构建方法，包括如下步骤：
(d1)提取待测离体外周血样本的基因组DNA；
(d2)取步骤(d1)得到的基因组DNA，制备DNA文库；
(d3)将步骤(d2)制备得到的DNA文库与权利要求1或2所述的探针组合混合杂交，获得杂交产物；
(d4)将步骤(d3)获得的杂交产物进行富集，获得性染色体异常相关基因捕获文库；
所述方法A2为检测性染色体异常相关基因及其位点突变情况的方法，包括如下步骤：
(e1)取待测离体外周血样本，按照所述方法A1制备性染色体异常相关基因捕获文库；
(e2)将步骤(e1)制备得到的性染色体异常相关基因捕获文库进行高通量测序，对测序结果进行分析，得到性染色体异常相关基因位点突变情况；
所述方法A3为辅助性染色体异常相关基因引发的疾病的方法，包括如下步骤：
(f1)取待测患者的离体外周血样本，按照所述方法A1制备性染色体异常相关基因捕获文库；
(f2)将步骤(f1)制备得到的性染色体异常相关基因捕获文库进行高通量测序，对测序结果进行分析，得到性染色体异常相关基因位点突变情况；
(f3)根据步骤(f2)分析得到的性染色体异常相关基因位点突变情况，结合临床症状分析进行性染色体异常相关基因引发的疾病的辅助诊断；
所述方法B1为性染色体异常相关基因捕获文库的构建方法，包括如下步骤：
(g1)提取待测离体外周血样本的基因组DNA；
(g2)取步骤(g1)得到的基因组DNA，制备DNA文库；
(g3)以权利要求3中的277条探针的混合物为模板，采用权利要求3中的引物对进行PCR扩增，得到生物素标记的277条探针组合；
(g4)将步骤(g2)制备得到的DNA文库与步骤(g3)制备的的探针组合混合杂交，获得杂交产物；
(g5)将步骤(d4)获得的杂交产物进行富集，获得性染色体异常相关基因捕获文库；
所述方法B2为检测性染色体异常相关基因及其位点突变情况的方法，包括如下步骤：
(h1)取待测离体外周血样本，按照所述方法B1制备性染色体异常相关基因捕获文库；
(h2)将步骤(h2)制备得到的性染色体异常相关基因捕获文库进行高通量测序，对测序结果进行分析，得到性染色体异常相关基因位点突变情况；
所述方法B3为辅助性染色体异常相关基因引发的疾病的方法，包括如下步骤：
(i1)取待测患者的离体外周血样本，按照所述方法B1制备性染色体异常相关基因捕获文库；
(i2)将步骤(i1)制备得到的性染色体异常相关基因捕获文库进行高通量测序，对测序结果进行分析，得到性染色体异常相关基因位点突变情况；
(i3)根据步骤(i2)分析得到的性染色体异常相关基因位点突变情况，结合临床症状分析进行性染色体异常相关基因引发的疾病的辅助诊断。
6.含有权利要求1或2所述的探针组合的试剂盒甲，或，含有权利要求3所述的引物探针组合的试剂盒乙；所述试剂盒甲或所述试剂盒乙的用途为如下(c1)-(c4)中的至少一种：
(c1)构建性染色体异常相关基因捕获文库；
(c2)检测性染色体异常相关基因；
(c3)检测性染色体异常相关基因位点突变情况；
(c4)辅助诊断性染色体异常相关基因引发的疾病。
7.如权利要求6所述的试剂盒甲或试剂盒乙，其特征在于：
所述试剂盒甲或试剂盒乙还包括记载有权利要求5中所述的载体A或载体B；
和/或，
所述试剂盒甲或试剂盒乙包括文库构建所需的其他试剂。
8.权利要求5中所述的方法A1或方法B1。
9.权利要求8所述方法制备得到的性染色体异常相关基因捕获文库。
10.权利要求5中所述的方法A2或方法A3或方法B2或方法B3。
性发育异常相关基因捕获试剂盒及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 性发育和性分化是一个复杂而连续有序的过程，始于受精卵，止于青春期第二性征的成熟和完善，包括性别决定，性腺、内生殖管道和外生殖器的分化和发育。性腺的正常发育和分化由以下3方面因素决定：①性染色体(xY，XX)，决定个体的遗传性别，是性腺分化和发育的先天基础；②调节性器官宫内发育形成和分化的相关因子，这些因子的基因突变导致所表达蛋白的功能障碍可直接影响宫内性发育和分化；③正常下丘脑一垂体一性腺轴功能，包括激素分泌、合成以及靶器官对激素的正常反应，主要与生后性腺发育和成熟有关，功能障碍常导致青春期性发育不良。①和②方面的异常主要影响胎儿性腺和性器官的发育和分化，婴儿出生时呈现各种不同临床表型的性发育异常。据统计，性发育障碍患病率约为l：4500。不同病因所致的性发育障碍之治疗策略不同，且预后迥异。因此早期正确诊断和鉴别是儿科医师尤其是儿科内分泌医师必须面对的问题。
[0003] 性发育障碍是成因复杂、临床表型多样的一类疾病。不同病因可有相同或相似的临床表现，同一病因发生时间不同或影响程度不同所致的临床表型差异很大，给诊断带来一定困难。分子遗传学检测，尤其是可以确定突变信息的测序方法，可以直接锁定单基因遗传代谢病的基因改变根源，为治疗策略、预后以及患儿家庭生育二胎提供有效的参考信息。目标区域测序和全外显子测序、全基因组测序相比，可以在测更少数据量的情况下达到更好的目标区域测序深度，同时分析周期更短。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种性发育异常相关基因捕获试剂盒及其应用。
[0006] 所述277条探针均采用生物素标记。
[0007] 所述探针组合中，每条探针等摩尔混合。
[0008] 本发明还保护引物探针组合，由277条探针和引物对组成；
[0009] 每条探针由通用片段1、特异片段和通用片段2组成；
[0010] 所述277条探针的特异片段依次如序列表的序列1至序列277所示；
[0011] 所述引物对由上游引物和下游引物组成；
[0012] 所述上游引物包括通用片段1；
[0013] 所述下游引物包括通用片段2；
[0014] 所述上游引物或所述下游引物采用生物素标记。
[0015] 所述通用片段1如序列表的序列278所示。
[0016] 所述通用片段2如序列表的序列279所示。
[0017] 所述277条探针使用相同的通用片段。
[0018] 在本发明的实施例中，所述277条探针中，每条探针自5’端至3’端依次为通用片段1、特异片段和通用片段2。
[0019] 在本发明的实施例中，所述上游引物如序列表的序列278所示。所述下游引物如序列表的序列279所示。
[0020] 在本发明的实施列中，在上游引物的5’端进行生物素标记。
[0021] 本发明还保护所述的探针组合或引物探针组合的应用，为如下(b1)-(b8)中的任一种：
[0022] (b1)构建性染色体异常相关基因捕获文库；
[0023] (b2)制备用于构建性染色体异常相关基因捕获文库的试剂盒；
[0024] (b3)检测性染色体异常相关基因；
[0025] (b4)制备用于检测性染色体异常相关基因的试剂盒；
[0026] (b5)检测性染色体异常相关基因位点突变情况；
[0027] (b6)制备用于检测性染色体异常相关基因位点突变情况的试剂盒；
[0028] (b7)辅助诊断性染色体异常相关基因引发的疾病；
[0029] (b8)制备用于诊断性染色体异常相关基因引发的疾病的试剂盒。
[0030] 本发明还保护所述的探针组合或引物探针组合和载体A或载体B在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(c1)-(c4)中的至少一种：
[0031] (c1)构建性染色体异常相关基因捕获文库；
[0032] (c2)检测性染色体异常相关基因；
[0033] (c3)检测性染色体异常相关基因位点突变情况；
[0034] (c4)辅助诊断性染色体异常相关基因引发的疾病。
[0035] 所述载体A记载有方法A1和/或方法A2和/或方法A3；
[0036] 所述载体B记载有方法B1和/或方法B2和/或方法B3；
[0037] 所述方法A1为性染色体异常相关基因捕获文库的构建方法，包括如下步骤：
[0038] (d1)提取待测离体外周血样本的基因组DNA；
[0039] (d2)取步骤(d1)得到的基因组DNA，制备DNA文库；
[0040] (d3)将步骤(d2)制备得到的DNA文库与所述探针组合混合杂交，获得杂交产物；
[0041] (d4)将步骤(d3)获得的杂交产物进行富集，获得性染色体异常相关基因捕获文库；
[0042] 所述方法A2为检测性染色体异常相关基因及其位点突变情况的方法，包括如下步骤：
[0043] (e1)取待测离体外周血样本，按照所述方法A1制备性染色体异常相关基因捕获文库；
[0044] (e2)将步骤(e1)制备得到的性染色体异常相关基因捕获文库进行高通量测序，对测序结果进行分析，得到性染色体异常相关基因位点突变情况；
[0045] 所述方法A3为辅助性染色体异常相关基因引发的疾病的方法，包括如下步骤：
[0046] (f1)取待测患者的离体外周血样本，按照所述方法A1制备性染色体异常相关基因捕获文库；
[0047] (f2)将步骤(f1)制备得到的性染色体异常相关基因捕获文库进行高通量测序，对测序结果进行分析，得到性染色体异常相关基因位点突变情况；
[0048] (f3)根据步骤(f2)分析得到的性染色体异常相关基因位点突变情况，结合临床症状分析进行性染色体异常相关基因引发的疾病的辅助诊断；
[0049] 所述方法B1为性染色体异常相关基因捕获文库的构建方法，包括如下步骤：
[0050] (g1)提取待测离体外周血样本的基因组DNA；
[0051] (g2)取步骤(g1)得到的基因组DNA，制备DNA文库；
[0052] (g3)以上述277条探针的混合物为模板，采用以上所述的引物对进行PCR扩增，得到生物素标记的277条探针组合；
[0053] (g4)将步骤(g2)制备得到的DNA文库与步骤(g3)制备的的探针组合混合杂交，获得杂交产物；
[0054] (g5)将步骤(d4)获得的杂交产物进行富集，获得性染色体异常相关基因捕获文库；
[0055] 所述方法B2为检测性染色体异常相关基因及其位点突变情况的方法，包括如下步骤：
[0056] (h1)取待测离体外周血样本，按照所述方法B1制备性染色体异常相关基因捕获文库；
[0057] (h2)将步骤(h2)制备得到的性染色体异常相关基因捕获文库进行高通量测序，对测序结果进行分析，得到性染色体异常相关基因位点突变情况；
[0058] 所述方法B3为辅助性染色体异常相关基因引发的疾病的方法，包括如下步骤：
[0059] (i1)取待测患者的离体外周血样本，按照所述方法B1制备性染色体异常相关基因捕获文库；
[0060] (i2)将步骤(i1)制备得到的性染色体异常相关基因捕获文库进行高通量测序，对测序结果进行分析，得到性染色体异常相关基因位点突变情况；
[0061] (i3)根据步骤(i2)分析得到的性染色体异常相关基因位点突变情况，结合临床症状分析进行性染色体异常相关基因引发的疾病的辅助诊断。
[0062] 上述方法A2或方法B2中，所述“对测序结果进行分析，得到性染色体异常相关基因位点突变情况”的方法如下：
[0064] (2)完成步骤(1)后，用GATK软件去除PCR扩增产生的冗余序列。
[0065] (3)完成步骤(2)后，用GATK软件检测单核苷酸变异和插入缺失变异。
[0066] (4)完成步骤(3)后，利用ANNOVAR软件对步骤3得到的相关信息中所有的SNP 和INDEL进行注释，保留同时满足(a)和(b)的突变位点：
[0067] (a)突变reads数大于5且突变频率不小于30％的突变位点；
[0068] (b)在正常人数据库(例如千人基因组、ESP6599、EXAC和genomeAD)中频率小于 0.05的突变位点。
[0069] (5)完成步骤(4)后，删除同义突变并且HGMD数据库(人类基因突变数据库)中并未报道的突变位点。
[0070] (6)完成步骤(5)后，统计所有保留的突变位点并判断突变位点类型，如果突变位点的突变频率在30％-70％，则该突变位点为杂合突变。
[0071] 本发明还保护含有所述探针组合的试剂盒甲或含有所述引物探针组合的试剂盒乙；所述试剂盒甲或所述试剂盒乙的用途为如下(c1)-(c4)中的任一种：
[0072] (c1)构建性染色体异常相关基因捕获文库；
[0073] (c2)检测性染色体异常相关基因；
[0074] (c3)检测性染色体异常相关基因位点突变情况；
[0075] (c4)辅助诊断性染色体异常相关基因引发的疾病。
[0076] 所述试剂盒甲或试剂盒乙还包括所述载体A或载体B。
[0077] 所述试剂盒甲或试剂盒乙中还包括如下独立包装的各个组分中至少一种：
[0078] (A)富集缓冲液BL：包括人cot-1 DNA、鲑鱼精DNA、引物1和引物2；具体由30％-45％ (v/v)(如30％、35％、40％、45％)人cot-1 DNA、5％-25％(v/v)(如5％、10％、15％、
20％、25％)鲑鱼精DNA、0.2-1nmol/μl(如0.3nmol/μl、0.5nmol/μl、0.6nmol/μl、1nmol/μl) 引物1、0.2-1nmol/μl(如0.3nmol/μl、0.5nmol/μl、0.6nmol/μl、1nmol/μl)引物2和水组成；
所述引物1的核苷酸序列为序列280；所述引物2的核苷酸序列为序列281。
20％、25％)鲑鱼精DNA、0.2-1nmol/μl(如0.3nmol/μl、0.5nmol/μl、0.6nmol/μl、1nmol/μl) 引物1、0.2-1nmol/μl(如0.3nmol/μl、0.5nmol/μl、0.6nmol/μl、1nmol/μl)引物2和水组成；
所述引物1的核苷酸序列为序列280；所述引物2的核苷酸序列为序列281。
[0079] (B)富集缓冲液HY：包括NaCl、柠檬酸钠、BSA和Tween20；具体由1-1.5M(如 1M、1.25M、1.5M)NaCl、0.1-0.3M(如0.1M、0.125M、0.15M、0.3M)柠檬酸钠、0.08-0.12 g/100mL(如0.08、0.1、0.12)BSA、5％-9％(v/v)(如5％、6％、7％、8％、9％)Tween20和水组成。
[0080] (C)文库富集结合缓冲液：包括NaCl、EDTA和Tris-HCl缓冲液；具体由1M NaCl、 1mM EDTA和pH7.5、10mM的Tris-HCl缓冲液组成。
[0081] (D)洗涤缓冲液WB1：包括SDS和柠檬酸三钠缓冲液；其为质量体积比0.05-0.2％％的SDS溶液A；0.05-0.2％的SDS溶液A中的溶质为SDS，浓度为0.05-0.2％，溶剂为柠檬酸三钠缓冲液SSC；所述柠檬酸三钠缓冲液SSC由175g/L NaCl、88g/L柠檬酸三钠和水组成；缓冲液pH为7.4；
[0082] (E)洗涤缓冲液WB2：洗涤缓冲液WB2，包括SDS和10倍稀释的所述柠檬酸三钠缓冲液；其具体为质量体积比0.05-0.2％SDS溶液B；0.1％的SDS溶液B中的溶质为SDS，浓度为0.05-0.2％，溶剂为0.1×SSC；所述0.1×SSC为将所述柠檬酸三钠缓冲液SSC稀释10 倍，得到的溶剂；所述0.1×SSC的pH值为7.4。
[0083] (F)洗涤缓冲液WB3：洗涤缓冲液WB3,包括SDS和2倍稀释的所述柠檬酸三钠缓冲液；其具体为质量体积比0.1％SDS溶液C；0.1％的SDS溶液C中的溶质为SDS，溶剂为0.5 ×SSC；所述0.5×SSC为将所述柠檬酸三钠缓冲液SSC稀释2倍，得到的溶剂；所述0.1× SSC的pH值为7.4。
[0084] (G)文库富集洗脱液：0.1M的NaOH水溶液。
[0085] (H)中和缓冲液NE：pH值为pH7.5、1M的Tris-HCl缓冲液。
[0086] (I)PCR反应液：包括引物3和引物4；所述引物3的核苷酸序列为序列282，所述引物4的核苷酸序列为序列283，且所述引物3和所述引物4最后一位核苷酸均为硫代修饰；所述PCR反应液具体由浓度为1μL浓度为0.05U/μL的Phusion Hot Start II DNA Polymerase 和10μLPCR mixbuffer组成。PCR mixbuffer为含0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2mM dCTP、
0.2mM dGTP、5％(v/v)DMSO、2.5pmol引物3、2.5pmol引物4、4mM MgCl2、500mM KCl 和0.8％(v/v)Nonidet P40的水溶液。
0.2mM dGTP、5％(v/v)DMSO、2.5pmol引物3、2.5pmol引物4、4mM MgCl2、500mM KCl 和0.8％(v/v)Nonidet P40的水溶液。
[0087] 本发明还保护以上所述的方法A1或方法B1。
[0088] 以上任一所述方法A1或方法B1中，所述DNA文库与探针组合的杂交方法具体可为：将250ngDNA文库、10μl富集缓冲液BL、5μl生物素标记的探针组(探针浓度为100ng/μL)、 37μL预热的富集缓冲溶液HY(65℃预热，使用前充分震荡重悬沉淀)混合后进行PCR反应， PCR反应程序：95℃10分钟，65℃杂交22小时以上。
[0089] 以上任一所述方法A1或方法B1中，所述杂交产物进行富集方法具体可为：将杂交产物和PCR反应液混合进行PCR扩增。PCR扩增反应程序：98℃预变性30秒；98℃25秒,65℃ 30秒72℃30秒，15个循环；72℃5分钟；4℃1h。
[0090] 本发明还保护所述方法A1或方法B1制备得到的性染色体异常相关基因捕获文库。
[0091] 本发明还保护以上所述的方法A2或方法A3或方法B2或方法B3。
[0092] 以上任一所述性染色体异常相关基因为表1中所述的277种基因。
[0093] 本发明具有以下有益效果：
[0094] 1、本发明提供了可进行快速准确捕获性染色体异常相关基因序列的探针组，能够提高检测特异性，对捕获出目标区域的文库标本利用高通量测序技术使用HiSeq2000测序，通量高、准确度高、成本低。
[0095] 2、本发明灵敏度高，并由于该方法是以DNA文库的方式进行捕获测序，因此，样品DNA 的部分降解对最后的结果几乎不会产生影响，而过量的探针，保证了对目标片段的完全捕获，所以，即使可能出现的某些丰度较低的变异DNA也能被捕获并检测出来，其灵敏度相对于传统的Sanger测序要高出许多。为全面准确进行性染色体异常相关基因检测提供了更好的平台。
[0096] 本发明所提供的性发育异常相关基因捕获试剂盒，通过对遗传性性发育异常患者的全外显子组或性发育异常相关基因组(分别占全基因组的1％和0.01％)进行目标区域测序分析，捕获的是疾病的大部分致病突变信息，具有所需样本量少、费用低、通量高的优势，能够检测更多的样本，促进了遗传性性发育异常新的致病变异的发现。本发明选取的性发育异常相关基因突变位点涵盖了中国人的常见热点突变以及其他非常见突变点。该试剂盒的高通量性可较全面的筛查人群中的性发育异常相关基因，对于提高人口质量和造福社会有重大意义。
具体实施方式
[0097] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0098] 实施例1、检测性染色体异常相关基因的成套试剂与试剂盒制备
[0099] 一、性染色体异常相关基因捕获探针的设计和制备
[0100] 1、根据277种性染色体异常相关基因的全外显子序列进行设计并合成277条探针(对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计)。
[0101] 277条探针的每一条均由DNA片段1、探针片段、DNA片段2组成(每条探针自5’端至3’端依次为DNA片段1、探针片段和DNA片段2，277条探针中的DNA片段1相同，277 条探针中的DNA片段2相同)。DNA片段1的核苷酸序列为5’-GACTACATGGGACAT-3’。 DNA片段2的核苷酸序列为5’-GGAACCTACGACGTA-3’。277条探针中的探针片段如表1 所示。
[0102] 表1检测遗性染色体异常相关基因的探针信息
[0103]
[0104]
[0105]
[0106] 2、取步骤1制备的277条探针，按照如下方法进行生物素标记：
[0107] (1)将277条探针等摩尔混合后加至总体积为1.2mL的ddH2O中，取其中5μL作为模板，利用由通用引物F和通用引物R组成的通用PCR引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0108] 通用引物F：5’-GACTACATGGGACAT-3’(序列278)；通用引物F的5’末端具有生物素标记。
[0109] 通用引物R：5’-GGAACCTACGACGTA-3’(序列279)。
[0110] PCR扩增体系：DNA模板，5μl；通用引物F(25μM)，2μl；通用引物R(25μM)，2μl； MgCl2(50mM)，4μl；10x Platinum Taq缓冲液(Life Technologies)，5μl；dNTPs(每种10mM)， 4μl；Platinum Taq(5U/μl,Life Technologies)，1μl；H2O，27μl；总体积50μl。
[0111] PCR扩增条件：98℃，30s；(98℃，30s，60℃，25s，72℃，45s)35个循环；72℃，5min。
[0112] (2)将步骤(1)得到的PCR扩增产物采用MinElutePCR纯化试剂盒(Qiagen，货号：28006) 纯化，得到纯化产物；500ng纯化产物，用MyOne链酶亲和素磁珠(Invitrogen公司，货号： 35602)进行结合；然后将结合了纯化产物的磁珠加入至NaOH溶液处理，将没有生物素标记的互补链变性、洗脱下来；将处理后的磁珠用100℃的甲酰胺液体洗涤，使探针从磁珠上分离下来；最后用乙醇沉淀，得到生物素标记的成套探针。
[0113] 二、性发育异常相关基因捕获试剂盒的制备
[0114] 性发育异常相关基因捕获检测试剂盒，是通过检测性发育异常相关基因全基因组的突变来进行分子遗传学检测的试剂盒，该试剂盒包含的成分为:步骤一得到的生物素标记的探针组、富集缓冲液BL、富集缓冲液HY、文库富集结合缓冲液、洗涤缓冲液WB1、洗涤缓冲液WB2、洗涤缓冲液WB3、文库富集洗脱液、中和缓冲液NE和PCR反应液。
[0115] 富集缓冲液BL由人cot-1 DNA(Invitrogen,货号：15279011)、鲑鱼精DNA(Invitrogen, 货号：15634017)、引物1、引物2和水组成。人cot-1 DNA在富集缓冲液BL中的体积百分含量为35％，鲑鱼精DNA在富集缓冲液BL中的体积百分含量为15％，引物1在富集缓冲液BL 中的浓度为0.5nmol/μl，引物2在富集缓冲液BL中的浓度为0.5nmol/μl。
[0116] 引物1：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGATCT-3’(序列280)；
[0117] 引物2：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGC-3’(序列281)；
[0118] 富集缓冲液HY为含有1.25M NaCl、0.125M柠檬酸钠、0.1g/100mL BSA和5％(v/v) Tween20的水溶液。
[0119] 文库富集结合缓冲液为含有1M NaCl和1mM EDTA的pH7.5、10mM的Tris-HCl缓冲液。
[0120] 洗涤缓冲液WB1为含有0.1％(m/v)SDS的柠檬酸钠缓冲液。柠檬酸钠缓冲液为含175g/L NaCl和88g/L柠檬酸三钠的水溶液；pH值为7.4。
[0121] 洗涤缓冲液WB2为含有0.1％(m/v)SDS的柠檬酸钠缓冲液稀释液。柠檬酸钠缓冲液稀释液为1体积份柠檬酸钠缓冲液和9体积份水混合而成；pH值为7.4。
[0122] 洗涤缓冲液WB3为含有0.1％(m/v)SDS的柠檬酸钠缓冲液稀释液。柠檬酸钠缓冲液稀释液为5体积份柠檬酸钠缓冲液和5体积份水混合而成；pH值为7.4。
[0123] 文库富集洗脱液为浓度为0.1M的NaOH水溶液。
[0124] 中和缓冲液NE为pH值为pH7.5、1M的Tris-HCl缓冲液。
[0125] PCR反应液由浓度为1μL浓度为0.05U/μL的Phusion Hot Start II DNA Polymerase (Thermo，货号：F549S)和10μLPCR mixbuffer组成。PCR mixbuffer为含0.2mM dATP、 0.2mM dTTP、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、5％(v/v)DMSO、2.5pmol引物3、2.5pmol引物4、4mM MgCl2、500mM KCl和0.8％(v/v)Nonidet P40的水溶液。
[0126] 引物3：5’-AATGATACGGCGACCACCGAG-3’(序列282)；
[0127] 引物4：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’(序列283)。
[0128] 引物3和引物4自5’端最后一位核苷酸带有硫代修饰。
[0129] 实施例2、性发育异常相关基因捕获试剂盒的使用方法建立
[0130] 一、样本文库的制备
[0131] 1、经患者知情同意，提取待测患者外周血的基因组DNA。
[0132] 2、将步骤1得到的基因组DNA片段化至200-400bp的片段，采用NGS Fast DNA Library Prep Set for Illumina试剂盒(康为试剂，货号：CW2585M)进行建库，得到DNA基因文库。
[0133] 二、样本富集杂交
[0134] 1、制备杂交液
[0135] 杂交液(100μl)：250ng步骤一制备的DNA基因文库，10μl富集缓冲液BL，5μl步骤一得到的生物素标记的探针组(探针浓度为100ng/μL)，37μL预热的富集缓冲溶液HY(65℃预热，使用前充分震荡重悬沉淀)。
[0136] 2、杂交
[0137] 取步骤1制备的杂交液进行PCR反应。
[0138] PCR反应程序：95℃10分钟，65℃杂交22小时以上。
[0139] 3、纯化
[0140] (1)取1.5ml离心管，加入50ul MyOne磁珠(Invitrogen，货号：65002)，剧烈震荡至少5秒，短暂离心收集管壁的液体，将离心管放置在磁力架上静置1分钟后弃上清；
[0141] (2)取下离心管，加入50μl 1×文库富集结合缓冲液，剧烈震荡至少5秒，短暂离心收集管壁的液体，将离心管放置在磁力架上1分钟，保持离心管在磁力架上不动，弃上清液；重复该步骤3次；
[0142] (3)用100μl 2×文库富集结合缓冲液重悬沉淀，剧烈震荡至少5秒，将步骤2得到的杂交后的所有液体全部加入，震荡混匀，翻转仪上翻转30min；
[0143] (4)从翻转仪上拿下收集管，震荡离心，在磁力架上静置1min，弃去液体；
[0144] (5)加入500μl洗涤缓冲液WB1，震荡混匀，翻转仪上翻转15min；
[0145] (6)从翻转仪上拿下收集管，震荡离心，在磁力架上静置1min，弃去液体；
[0146] (7)加入500μl洗涤缓冲液WB3，震荡混匀，66℃、850rpm孵育10min，震荡离心，在磁力架上静置1min，弃去液体；
[0147] (8)重复步骤(7)三次，放置室温2min，震荡离心，放置磁力架静置1min，弃去上清；
[0148] (9)加入500μl洗涤缓冲液WB2，震荡离心，吸弃上清。
[0149] (10)加入17.5μl文库富集洗脱液，加完后立即盖盖，震荡混匀，翻转仪上翻转15min；
[0150] (11)震荡离心后，放置磁力架上静置1min，将澄清液转至一个干净的0.2ml管中，加入12.5μl中和缓冲液NE，震荡离心，得到30μl模板DNA。
[0151] 三、样本PCR扩增
[0152] 1、将步骤二制备的30μl模板DNA和30μl PCR反应液混合，再补水至总体系为100μl。将总体系进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0153] PCR扩增反应程序：98℃预变性30秒；98℃25秒,65℃30秒72℃30秒，15个循环；72℃5分钟；4℃1h。
[0154] 不同的纯化方法获得的产物浓度会有差别。根据不同的纯化方法，可是适当调整PCR的循环数。
[0155] 2、将步骤1得到的PCR扩增产物由DNA纯化回收试剂盒(CMpure)(康为试剂，货号：CW2508)纯化，得到纯化产物，将纯化产物由65℃预热的文库富集洗脱液17.5μl分两次洗脱，最终得到35μl捕获产物。
[0156] 3、将步骤2得到的捕获产物经1％琼脂糖凝胶电泳及NanoDrop测浓度并做定量PCR。
[0157] 四、测序及结果分析
[0158] 将步骤三得到的捕获产物通过Illumina HiSeq2000进行测序，得到测序数据并进行分析，确定是否捕获性发育异常相关基因或者确定具体的基因突变位点。
[0159] 分析方法如下：
[0160] (4)将测序得到的原始数据用cutadapt软件切除接头序列、低质量碱基(碱基质量低于 Q15)和短序列(长度小于40bp)，然后通过bwa软件比对到参考基因组hg19的相应位置。
[0161] (5)完成步骤(1)后，用GATK软件去除PCR扩增产生的冗余序列。
[0162] (6)完成步骤(2)后，用GATK软件检测单核苷酸变异和插入缺失变异。
[0163] (4)完成步骤(3)后，利用ANNOVAR软件对步骤3得到的相关信息中所有的SNP 和INDEL进行注释，保留同时满足(a)和(b)的突变位点：
[0164] (a)突变reads数大于5且突变频率不小于30％的突变位点；
[0165] (b)在正常人数据库(例如千人基因组、ESP6599、EXAC和genomeAD)中频率小于 0.05的突变位点。
[0166] (5)完成步骤(4)后，删除同义突变并且HGMD数据库(人类基因突变数据库)中并未报道的突变位点。
[0167] (6)完成步骤(5)后，统计所有保留的突变位点并判断突变位点类型，如果突变位点的突变频率在30％-70％，则该突变位点为杂合突变。
[0168] 实施例3、测序效果验证
[0169] 经患者知情同意，取2例染色体异常相关基因的患者外周血样本，按照实施例2的方法进行检测。
[0170] 结果表2所示。结果证实99％以上原始短序列都能被比对回目标区域的参考序列，捕获效率在35％以上，目标区域的平均测序深度大于250X，完全满足一般遗传疾病诊断的要求。
[0171] 表2数据分析结果
[0172]
[0173] 实施例4、临床诊断实例
[0174] 经患者知情同意，采用实施例2的方法对5例遗传代谢病及其相关综合征患者的外周血样本做出分子遗传学诊断分析。结果如表3所示。
[0175] 表3分子遗传学诊断分析结果
[0176]
[0177]
[0178] 患儿(编号1)(浙江大学医学院附属儿童医院)，男，八个月，因阴茎短小伴尿道下裂入院治疗，怀疑为性发育障碍。利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血样本后发现SRD5A2 基因的复合杂合突变：c.680G>A和c.59T>C。检测患儿父母样本后确定SRD5A2突变c.680G>A 来自母亲，SRD5A2突变c.59T>C来自父亲。已知SRD5A2的c.680G>A和c.59T>C均为有报道的致病性隐性遗传突变，因此这种复合杂合突变可以导致苯丙酮尿症，这与阴茎短小，尿道下裂的临床表型相符。
[0179] 患儿(编号2)(浙江大学医学院附属儿童医院)女，15岁10个月，因性分化异常入院，怀疑性发育障碍疾病。利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血样本后发现CHD7基因的突变 c.1969dupA，经患儿父母验证确定父母均不携带此突变，为自发突变。由于CHD7基因是显性遗传，并且该突变属于移码突变，杂合突变会引起相应的疾病表型。CHD7基因突变对应的疾病是CHARGE综合征和Kallmann综合征5型，这和患者的临床表型相符。
[0180] 患儿(编号3)(浙江大学医学院附属儿童医院)男，2岁8个月，因两性畸形，尿道下裂入院，怀疑性发育障碍疾病。利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血样本后发现AR基因的突变c.2515C>G，经患儿父母验证确定母亲携带此突变。由于AR基因位于X染色体上，且 c.2515C>G为已报道的雄激素不敏感综合征致病突变，该突变会引起相应的疾病表型，这和患者的临床表型相符。
[0181] 患儿(编号4)(浙江大学医学院附属儿童医院)男，7岁1个月，因小阴茎入院，怀疑性发育障碍疾病。利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血样本后发现FGFR1基因的突变 c.1722G>C和c.1664-1G>T，经患儿父母验证确定父母均不携带此两个突变，为自发突变。由于FGFR1基因为显性遗传，杂合突变即可致病，该患者突变会引起Kallmann综合征2型相应的疾病表型，这和患者的临床表型相符。
[0182] 患儿(编号5)(浙江大学医学院附属儿童医院)男，5岁8个月，因阴茎短小入院，怀疑性发育障碍疾病。利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血样本后发现PROKR2基因的突变 c.337T>C，经患儿父母验证确定母亲携带此突变。由于PROKR2基因为显性遗传，杂合突变即可致病，且该位点为已报道会引起Kallmann综合征3型相应的疾病表型，这和患者的临床表型相符。
[0183] 上述结果表明，本发明提供的用于性染色体异常检测的探针组及试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点。与sanger测序相比，本发明通量高，效率高，灵敏度高，先用探针杂交捕获到目的基因，再用PCR扩增的方法增加目的基因的量。
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