一种抗PD-1人源抗体
阅读：670发布：2024-01-11
专利汇可以提供一种抗PD-1人源抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域，特别是涉及一种抗PD-1人源 抗体 。本发明提供一种抗PD-1人源抗体，其抗体重链可变区的 氨 基酸序列为SEQ ID NO:2或其保守型变异序列，其抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4或其保守型变异序列。本发明所提供的抗PD-1人源抗体在 哺乳动物 细胞中具有较高的表达量，并且对PD-1具有明显的亲和 力 和抑制配体-受体结合的能力。，下面是一种抗PD-1人源抗体专利的具体信息内容。
1.一种抗PD-1人源抗体，其抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或其保守型变异序列，其抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4或其保守型变异序列。
2.如权利要求1所述的抗PD-1人源抗体，其特征在于，所述抗体是人源的。
3.如权利要求1所述的抗PD-1人源抗体，其特征在于，所述抗体为IgG1、IgG2或IgG4型抗体。
4.如权利要求1所述的抗PD-1人源抗体的衍生物，所述衍生物为所述抗PD-1人源抗体的片段、抗体/抗体片段-因子融合蛋白或抗体/抗体片段-化学偶联物。
5.如权利要求4所述的抗PD-1人源抗体的衍生物，其特征在于，所述抗PD-1人源抗体的片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv。
6.一种分离的DNA分子，编码权利要求1-3任一权利要求所述的抗PD-1人源抗体的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸。
7.一种构建体，含有如权利要求6所述的分离的DNA分子。
8.如权利要求7所述的一种构建体，其特征在于，由权利要求5所述的分离的DNA分子插入到表达载体的多克隆位点构建而成。
9.一种单克隆抗体的表达系统，由权利要求7-8任一权利要求所述的构建体转染到宿主细胞构建而成。
10.如权利要求1-3任一权利要求所述的抗PD-1人源抗体的制备方法，包括如下步骤：
在适合表达所述抗体的条件下，培养权利要求9所述的单克隆抗体的表达系统，从而表达出所述的单克隆抗体，纯化分离出所述的单克隆抗体。
11.如权利要求1-3任一权利要求所述的抗PD-1人源抗体在制备PD-1分子阻滞药物上的用途。
12.一种药物组合物，包括治疗有效量的所述抗PD-1人源抗体。
一种抗PD-1人源抗体
技术领域
背景技术
[0002] T细胞的活化是免疫系统发挥作用的重要步骤，不仅需要抗原递呈细胞(APC)所提供的第一信号，同时也受到共刺激信号(第二信号)的调节。共刺激信号是一类细胞表面的膜蛋白，起到协同调节T细胞增殖、活化及分化的作用。
[0003] 细胞程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)，也称CD279，是一种重要的免疫抑制分子，属于免疫球蛋白超家族CD28家族成员，分子量为50～55kD的I型跨膜糖蛋白。PD-1持续性表达在T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞以及骨髓细胞的表面。PD-1具有两个已知配体，PD-L1和PD-L2。目前，研究发现，PD-1与其配体PD-L1结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结CD8+T细胞的增生，而且PD-1还可以借由调节Bcl-2基因，控制淋巴结中抗原特异性T细胞的聚积。而阻断PD-1与PD-L1的结合，可以有效阻止T淋巴细胞抑制信号的产生，从而打破免疫系统对自身组织的外周免疫耐受，促进T淋巴细胞的活化与增殖，以及细胞因子表达。因此将PD-1为癌症免疫治疗的靶点，成为目前的一个研究热点。
[0004] 2011年百时美施贵宝上市了Yervoy(Ipilimumab)，作为首个免疫靶向药物被批准用于晚期黑色素瘤的治疗。Yervoy是一种抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的单克隆抗体，阻断CTLA-4与其配体B7的结合。该药单药有效率仅10％。最近，百时美施贵宝开发的针对PD-1的单克隆抗体Opdivo(Nivolumab)，其临床结果显示单药的疗效超过了Yervoy，有效率达到了35％，并对既往使用过Yervoy的患者同样有效。除了在转移性黑色素瘤的治疗上具有显著作用外，Opdivo还在结直肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌或肾癌等治疗上开展临床试验。
[0005] 因此研发新型的抗PD-1单克隆抗体，用于癌症的免疫治疗，使其具有更低的毒副作用，更佳的临床药效，成为目前的研究热点，也将给患者提供更多的药物选择。
发明内容
[0007] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种抗PD-1人源抗体，其抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或其保守型变异序列，其抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:4或其保守型变异序列。
[0008] 所述抗PD-1人源抗体可以是抗体的全长序列，也可以是抗PD-1人源抗体的片段，所述片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv等。
[0009] 优选的，所述抗PD-1人源抗体是人源的。
[0010] 更优选的，所述抗PD-1人源抗体为IgG1、IgG2或IgG4型抗体。
[0011] 本发明进一步提供所述抗PD-1人源抗体的衍生物，所述衍生物为PD-1人源抗体的片段、抗体/抗体片段-因子融合蛋白、抗体/抗体片段-化学偶联物；所述抗PD-1人源抗体的片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv等。
[0012] 所述抗体/抗体片段-因子融合蛋白具体为抗体-因子融合蛋白、或抗体片段-因子融合蛋白。
[0013] 所述抗体/抗体片段-化学偶联物具体为抗体-化学偶联物、或抗体片段-化学偶联物。
[0014] 本发明第二方面提供一种分离的DNA分子，编码所述抗PD-1人源抗体的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸。
[0015] 本发明第三方面提供一种构建体，含有所述分离的DNA分子。
[0016] 优选的，所述构建体由所述分离的DNA分子插入到表达载体的多克隆位点构建而成。
[0018] 更优选的，所述表达载体选自pHLX101、pEE14.4或pcDNA3.1中的一种或多种的组合。
[0019] 本发明第四方面提供一种单克隆抗体的表达系统，由所述构建体转染到宿主细胞构建而成。
[0020] 本发明中的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。
[0021] 优选的，所述宿主细胞选自中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary(CHO))细胞系，多种COS细胞系，HeLa细胞系，骨髓细胞系如SP2/0细胞系，NS0细胞系，YB2/0细胞系等，以及转化的B-细胞或杂交瘤细胞中的一种或多种的组合。
[0022] 本发明第五方面提供所述抗PD-1人源抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养所述的单克隆抗体的表达系统，从而表达出所述的单克隆抗体，纯化分离出所述的单克隆抗体。
[0023] 本发明中所用的宿主细胞均为现有技术，可通过商业途径直接获取，培养中所用的培养基亦为各种常规培养基，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0024] 本发明从单克隆培养的细胞株中筛选获取目的抗体的基因序列，用以构建真核表达载体，表达后即可重建抗体的活性，获得抗PD-1人源化单克隆抗体。
[0025] 本发明第六方面提供所述抗PD-1人源抗体在制备PD-1分子阻滞药物上的用途。
[0026] 优选的，所述制备PD-1分子阻滞药物上的用途具体为制备肿瘤治疗或肿瘤诊断类药物上的用途。
[0027] 更优选的，所述肿瘤选自黑色素瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌或肾癌。
[0028] 进一步优选的，所述肿瘤为晚期黑色素瘤。
[0029] 本发明第七方面一种药物组合物，包括治疗有效量的所述抗PD-1人源抗体。
[0030] 本发明的人源抗体可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物以所述人源抗体为活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羚基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用抑制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的人源抗体可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制剂进行给药。
[0032] 图1为表达并纯化得到的PD-1-His重组蛋白的SDS-PAGE分析。
[0033] 图2为表达并纯化得到的PD-1-AP-His重组蛋白的SDS-PAGE分析。
[0034] 图3为抗PD-1抗体的亲和力能力实验。
[0035] 图4为抗PD-1抗体的配体-受体结合抑制实验。
具体实施方式
[0036] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0037] 在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0038] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0039] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0040] 实施例1
[0041] 表达和纯化人PD-1胞外区重组蛋白PD-1-His
[0042] 合成人PD-1-AP-His融合基因(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，其中PD-1基因序列为SEQ ID NO:5，AP-His基因序列为SEQ ID NO:6，两段序列连接即为PD-1-AP-His融合基因，对于构建PD-1-His重组蛋白表达载体，设计正向和反向引物分别为：
[0043] 正向引物：
[0044] 5’-ATCCGCCGGCAAGCCGCCACCATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGG-3’(SEQ ID NO:7)；
[0045] 反向引物：
[0046] 5’-TCACTACGTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTGGAACTGGCCGGCTGGCCTGG-3’(SEQ ID NO:8)，用于扩增得到编码PD-1-His融合蛋白的基因，在基因的上下游分别引入限制性内切酶位点Ngo MIV和Sna BI，PCR条件为95℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min，DNA聚合酶为TAKARA公司产品。PCR产物经琼脂糖凝胶回收(回收试剂盒为Omega bio-tek公司产品)纯化后，加入限制性内切酶Ngo MIV和Sna BI进行酶切，酶切产物经DNA回收试剂(Omega bio-tek公司产品)纯化后与用相同限制性内切酶酶切的载体pHLX101(由上海复宏汉霖生物技术有限公司构建，参见中国专利201210211812.1)进行连接反应。连接产物转化到DH5α大肠杆菌，涂布在含有50μg/ml羧苄青霉素的2YT琼脂培养基上。将获得的阳性克隆在含有50μg/ml羧苄青霉素的2YT液体培养基中培养，经过Invitrogen公司测序验证后，用质粒大抽试剂盒(Omega bio-tek公司产品)提取阳性克隆质粒。
[0047] 利用Invitrogen公司的Neon系统，将线性化的阳性质粒DNA电转染至CHO细胞。转染后的CHO细胞进行稀释克隆化培养，在含有50μmol蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine，MSX)的94113培养基(IrvineScientific公司产品)中进行筛选，从而获得单克隆细胞系。将获得的单克隆细胞系在含有50μmol蛋氨酸亚氨基代砜的94113培养基中进行摇瓶培养，表达时间通常为7-14天，当活细胞密度低于30％时收获细胞培养液上清。将细胞培养液上清用镍亲和柱进行纯化，最终得到人PD-1胞外区重组蛋白PD-1-His(图1)。
[0048] 实施例2
[0049] 表达和纯化人PD-1胞外区重组蛋白PD-1-AP-His
[0050] 以实施例1中合成的PD-1-AP-His融合基因为模板，设计正向和反向引物分别为：5’-ATCCGCCGGCAAGCCGCCACCATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGG-3’(SEQ ID NO:7)和5’-TCACTACGTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCTGAACC-3’(SEQ ID NO:9)用于扩增得到编码PD-1-AP-His融合蛋白的基因，在基因的上下游分别引入限制性内切酶位点Ngo MIV和Sna BI，PCR条件为95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环，72℃延伸10min，DNA聚合酶为TAKARA公司产品。
[0051] PCR产物经琼脂糖凝胶回收(回收试剂盒为Omega bio-tek公司产品)纯化后，加入限制性内切酶Ngo MIV和Sna BI进行酶切，酶切产物经DNA回收试剂(Omega bio-tek公司产品)纯化后与用相同限制性内切酶酶切的载体pHLX101进行连接反应。连接产物转化到DH5α大肠杆菌，涂布在含有50μg/ml羧苄青霉素的2YT琼脂培养基上。将获得的阳性克隆在含有50μg/ml羧苄青霉素的2YT液体培养基中培养，经过Invitrogen公司测序验证后，用质粒大抽试剂盒(Omega bio-tek公司产品)提取阳性克隆质粒。
[0052] 利用Invitrogen公司的Neon系统，将线性化的阳性质粒DNA电转染至CHO细胞。转染后的CHO细胞进行稀释克隆化培养，在含有50μmol蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine，MSX)的94113培养基(IrvineScientific公司产品)中进行筛选，从而获得单克隆细胞系。将获得的单克隆细胞系在含有50μmol蛋氨酸亚氨基代砜的94113培养基中进行摇瓶培养，表达时间通常为7-14天，当活细胞密度低于30％时收获细胞培养液上清。将细胞培养液上清用镍亲和柱进行纯化，最终得到人PD-1胞外区重组蛋白PD-1-AP-His(图2)。
[0053] 实施例3
[0054] 抗PD-1人源抗体真核表达载体的构建和表达
[0055] 抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，本实施例中所使用的编码DNA序列为SEQ ID NO:1；
[0056] 抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，本实施例中所使用的编码DNA序列为SEQ ID NO:3；(重链和轻链可变区基因均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)[0057] 使用PCR反应对上述轻链可变区和重链可变区的编码DNA序列进行扩增，在抗体重链可变区和轻链可变区的基因两端引入适当的酶切位点，其中在抗体重链可变区基因5’端及3’端分别引入Ngo MIV和Sna BI酶切位点，正向和反向引物序列分别为：5’-ACCTGCCGGCAAGCCGCCACCATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTC-3’(SEQ ID NO:10)和5’-GCTCTACGTATCATTTACCTGGAGACAGGGAGAGGC-3’(SEQ ID NO:11)，在抗体轻链可变区基因5’端及3’端分别引入Ngo MIV和SnaB I，正向和反向引物序列分别为：5’-ACCTGCCGGCAAGCCGCCACCATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTC-3’(SEQ ID NO:10)和5’-GCATCTTACGTATTATTATGAACATTCCGTAAG-3’(SEQ ID NO:12)。采用PCR反应，条件为95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环，72℃延伸10min，DNA聚合酶为TAKARA公司产品。PCR扩增后，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化。轻链可变区基因加入限制性内切酶Ngo MIV和SnaB I进行酶切，重链可变区基因加入限制性内切酶Ngo MIV和Sna BI进行酶切，酶切后经DNA纯化试剂盒进行纯化，并与相同限制性内切酶消化的载体pHLX101。连接产物转化到DH5α大肠杆菌，涂布在含有50μg/ml羧苄青霉素的2YT琼脂培养基上。获得的阳性克隆在含有50μg/ml羧苄青霉素的2YT液体培养基中培养，经过Invitrogen公司测序验证后，用质粒大抽试剂盒提取阳性克隆质粒。
利用Invitrogen公司的Neon系统，将线性化的质粒DNA转染至CHO细胞。转染后的CHO细胞进行稀释克隆化培养，在含有50μmol蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine，MSX)的94113培养基(IrvineScientific公司产品)中进行筛选，从而获得单克隆细胞系。
利用Invitrogen公司的Neon系统，将线性化的质粒DNA转染至CHO细胞。转染后的CHO细胞进行稀释克隆化培养，在含有50μmol蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine，MSX)的94113培养基(IrvineScientific公司产品)中进行筛选，从而获得单克隆细胞系。
[0058] 将获得的单克隆细胞系在含有50μmol蛋氨酸亚氨基代砜的94113培养基中进行摇瓶培养，表达时间通常为7-14天，当活细胞密度低于30％时收获细胞培养液上清。利用羊抗人IgGFd(Meridian公司产品)以及辣根过氧化物酶标记的羊抗人轻链恒定区进行双夹心ELISA法检测表达上清中抗体的含量，以未转染上清作为阴性对照，人的IgG纯品作为标准品。实验结果显示，表达获得的目的蛋白可以被两个抗体识别，具有人IgG抗体特征，并且构建的人源抗体表达量在200～500μg/ml，具有较高的表达水平。采用Protein A亲和层析柱从细胞培养上清中分离纯化目的抗体。
[0059] 实施例4
[0060] 抗PD-1人源抗体功能鉴定
[0061] 抗体亲和力鉴定：将实施例1中制备得到的PD-1-His重组蛋白按2μg/ml(实施例1中制备)包被到酶标板中(工作体积30ul)，4℃静置过夜。用含有0.05％的Tween 20的PBS(PBST)洗3次。用0.1％的BSA室温封闭1小时。用PBST洗3次，将实施例3制备获得的抗体配制成200μg/ml浓度，并进行3倍梯度稀释，共8个梯度，每孔加入30μl，室温静置1小时。用PBST洗3次，加入30ul 1:4000稀释的偶联HRP的抗人Fc的酶标二抗(Millipore公司产品)，室温静置1小时。用PBST洗4次，加入TMB显色，并用2M的H2SO4终止反应。用酶标仪在450nm下读数。从结果可看出，筛选得到的抗体对PD-1具有明显的亲和力，而且其能力与阳性对照Nivolumab相近(图3)。
[0062] 配体-抗体结合抑制实验：将2μg/ml B7-H1(义翘神州公司产品)包被到酶标板中，4℃静置过夜。用PBST洗3次。用0.1％的BSA室温封闭1小时。用PBST洗3次，将实施例3制备获得的抗体配制成200μg/ml浓度，并进行3倍梯度稀释，共8个梯度，与实施例2制备得到的22.5μg/ml PD-1-AP-His按2:1混合，加入到酶标板中，室温静置1小时。用PBST洗4次，加入pNPP显色，用酶标仪在405nm下读数。从结果可以看出，筛选得到的抗体能抑制PD-1与其配体B7-H1的结合，而且其能力与Nivolumab相近(图4)。
[0063] PBS配方为：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)：0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。
[0064] 综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0065] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
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