一种复合微生物菌剂及其应用
阅读：310发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种复合微生物菌剂及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于猪 饲料 添加剂领域，尤其涉及一种复合 微 生物 菌剂及其应用。所述复合微生物菌剂，包括以下菌株的液体菌种：芽孢菌、放线菌、乳酸菌、 酵母 菌、肠球菌、光合菌。所述复合微生物 发酵 菌剂用于制备猪饲料添加剂。本发明的复合微生物菌剂可增加育肥猪胃、结肠和盲肠的度，增加胃和结肠的乳酸菌属的丰度，同时减少以艰难梭菌为主的有害梭菌的增殖，维护肠道结构功能，保证菌群平衡，促进生产性能提升，可作为饲料添加剂在生产中应用。，下面是一种复合微生物菌剂及其应用专利的具体信息内容。
1.一种复合微生物菌剂，其特征在于：包括以下菌株的液体菌种：芽孢菌、放线菌、乳酸菌、酵母菌、肠球菌、光合菌。
2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于：所述复合微生物发酵菌剂中各菌株的菌数含量均为1.25×108cfu/g以上。
3.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于：所述芽孢菌包括苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。
4.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于：所述放线菌包括衣氏放线菌、牛型放线菌、内氏放线菌。
5.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于：所述乳酸菌包括鼠李糖乳酸杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌。
6.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于：所述酵母菌包括酿酒酵母菌、产朊假丝酵母菌、毕赤酵母菌。
7.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于：所述肠球菌包括粪肠球菌。
8.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于：所述光合菌包括紫硫细菌、紫色非硫细菌、绿硫细菌。
9.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于：所述复合微生物菌剂还包括薏以仁，添加1-50g。
10.一种如权利要求1-9中任意项所述的复合微生物菌剂在制备猪饲料添加剂中的应用。
一种复合微生物菌剂及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 畜牧业生产中抗生素的滥用和超级耐药菌不断涌现，给畜牧业生产和我国食品安全带来很大危害。为促进畜牧业生产的发展和保障食品安全，应用微生物的功能性作用，开发具有安全高效的复合微生物菌剂，成为当前畜牧业生产的一种趋势。而依据猪的胃肠道微生物功能而开发的微生物菌剂，在生猪的养殖中应用广泛。很多的研究也证实添加微生物菌剂至饲料中，可明显减少哺乳仔猪、仔猪和育肥猪拉稀，同时可提高日增重并降低耗料增重比等。尽管之前的研究证实微生物菌剂不仅能改善断奶小猪的拉稀，还能改善育肥猪的生产性能。但实际生产中的应用还是较少。一方面是因为之前的研究添加菌剂相对单一，对生猪生产性能的改善相对有限，它的临床应用相对有限。另一方面，是因为微生物菌剂功能的发挥是多菌种相互配合的一个复杂系统，详细的作用机理尚待进一步揭示，这进一步限制了微生物菌剂在畜牧业生产中的应用。
发明内容
[0003] 本发明要解决的技术问题，在于提供一种复合微生物菌剂及其应用，可显著改善育肥猪的生产性能，增加肠道有益菌，同时改善胃肠道绒毛结构。
[0004] 本发明是这样实现的：
[0005] 本发明首先提供了一种复合微生物菌剂，包括以下菌株的液体菌种：芽孢菌、放线菌、乳酸菌、酵母菌、肠球菌、光合菌。
[0006] 进一步地：
[0008] 所述芽孢菌包括苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。
[0009] 所述放线菌包括衣氏放线菌、牛型放线菌、内氏放线菌。
[0010] 所述乳酸菌包括鼠李糖乳酸杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌。
[0011] 所述酵母菌包括酿酒酵母菌、产朊假丝酵母菌、毕赤酵母菌。
[0012] 所述肠球菌包括粪肠球菌。
[0013] 所述光合菌包括紫硫细菌、紫色非硫细菌、绿硫细菌。
[0014] 上述菌种可以由本领域技术人员通过常规菌种鉴定分离方法方便地从自然界分离得到的，或通过商业渠道公开购买。菌种根据现有常规方法培养。
[0015] 所述复合微生物菌剂还包括薏以仁，添加1-50g。
[0016] 薏苡仁，中药名。为禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.var.mayuen(Roman.)Stapf的干燥成熟种仁。
[0017] 本发明还提供了所述复合微生物发酵菌剂的应用，用于制备猪饲料添加剂。
[0018] 本发明具有如下优点：本发明的复合微生物菌剂可增加育肥猪胃、结肠和盲肠的度，增加胃和结肠的乳酸菌属的丰度，同时减少以艰难梭菌为主的有害梭菌的增殖，维护肠道结构功能，保证菌群平衡，促进生产性能提升，可作为饲料添加剂在生产中应用。附图说明
[0019] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0020] 图1为猪胃肠道结构及绒毛变化图。
具体实施方式
[0021] 实施例1
[0022] 1材料与方法
[0023] 1.1试验材料
[0024] 1.1.1试验动物
[0025] 育肥猪共300头，购自福建龙岩上杭某养殖公司，体重25±1.6kg。
[0026] 1.1.2复合微生物菌
[0027] 本实施例中的菌株采购自泉州华惠生物科技有限公司科技公司。根据现有常规方8
法培养，复合微生物菌剂是包括下述菌体并经发酵培养制成的液体菌剂，它包括1.25×10(cfu/g)以上的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、衣氏放线菌(Actinomyces israe-lii)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、紫硫细菌，并在1L菌液中添加10g薏以仁。
法培养，复合微生物菌剂是包括下述菌体并经发酵培养制成的液体菌剂，它包括1.25×10(cfu/g)以上的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、衣氏放线菌(Actinomyces israe-lii)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、紫硫细菌，并在1L菌液中添加10g薏以仁。
[0028] 1.2试验方法
[0029] 1.2.1试验处理设置
[0030] 饲养地点在福建龙岩上杭某养殖公司进行在常规的水泥面养殖猪舍，平均气温22℃，养殖周期90d。育肥猪300头，随机分成2组，每组15个重复，每个重复10头。试验组饲喂添加复合微生物菌活菌饲料，对照组饲喂常规的饲料。正式饲喂试验前7d进行预试验。饲喂管理按照自由采食方法进行，提供充足清洁饮水，每天一次猪舍清扫，定时观察记录猪的采食、体重、粪便、精神状况，常规疫苗接种。
[0031] 1.2.2饲料的基础日粮、营养成分及制备
[0032] 将复合菌液按1:12.5的体积比例添加至玉米粉，在25～38℃密闭发酵 5-7d，得到发酵玉米。实验组按基础原料组成配方：发酵玉米16kg，玉米粉634kg，豆粕280kg，麦30kg，预混料40kg进行混匀饲喂。对照组则按基础原料组成配方：玉米粉650kg，豆粕280kg，麦30kg，预混料40kg 混匀饲喂。试验饲料的原料基础日粮及其营养成分见表1。
[0033] 表1基础日粮及营养成分
[0034]
[0035]
[0036] 1.3生产性能指标测定
[0037] 试验前，对所有猪进行称重，然后添加复合菌饲养至170日龄，并分别在15、30、60、90d进行称重、统计采食量，并计算每日头均增重、头均耗料以及耗料增重比，分析复合菌对育肥猪生产性能的影响。
[0038] 1.4肠道绒毛结构测定
[0039] 饲喂试验结束后，选择36头体重相近且生长状况良好、未发生过消化道疾病的育肥猪，空腹处死，取0.25cm的胃、结肠、盲肠，放入多聚甲醛固定，经酒精脱水，二甲苯透明，然后将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中浸蜡、包埋；再将包埋好的组织块切片，然后脱蜡、至水、染色；染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明；将已透明的切片滴上树胶，盖上盖玻片封固；待树胶略干后镜检。
[0040] 1.516S rRNA基因测序
[0041] 1.5.1微生物组总DNA提取和目标片段PCR扩增
[0042] 实验中和实验结束时，通过安乐死处理实验组和对照组猪，分别取处死猪的胃和结肠粘液进行微生物组总DNA提取，然后通过1％琼脂糖凝胶电泳验证提取DNA的纯度，同时运用紫外分光光度方法对提取的胃和结肠的粘液的DNA进行定量。接着再根据肠道微生物序列中的保守片段设计一对引物，对肠道微生物的基因可变区(单个或连续的多个)或特定基因片段进行PCR扩增。
[0043] 1.5.2扩增产物纯化和定量
[0044] PCR扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行切胶回收，回收采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒。参照电泳初步定量结果，将PCR扩增回收产物进行荧光定量，荧光试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为Microplate reader(BioTek，FLx800)。根据荧光定量结果，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合。
[0045] 1.5.3测序文库制备和高通量测序
[0046] 采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit试剂盒制备测序的基因文库。将验证合格的测序文库进行梯度稀释，根据按相应比例混合文库，混合后再采用碱变性为单链进行上机测序；使用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)和MiSeq测序仪进行2×300bp的双端测序。
[0047] 1.6数据的分析
[0048] 首先进行初步筛查高通量测序的原始下机数据的序列质量；再按照引物和Barcode信息，将通过质量初筛的序列，分配入对应样本，并去除嵌合体；然后采用OTU归并划分获得的序列，然后根据每个OTU的代表序列进行序列的分类地位鉴定以及系统发育学分析；接着再根据OTU在不同样本中的丰度分布，对每个样本的多样性水平进行评估，并根据样本的稀疏曲线来评估测序深度；随后根据不同分类水平的分析各样本(组)并检验组间各自的统计学意义；再通过α和β多变量统计学分析工具，分析不同样本间及组间的菌群结构差异及与相关的物种差异；接着再根据各样本物种的组成分布，构建互作关联网络；此外，根据微生物肠道菌群的基因测序结果，预测各样本的菌群相关代谢功能。
[0049] 2.结果与分析
[0050] 2.1复合微生物菌剂对育肥猪生产性能的影响
[0051] 如表2所示，试验组的育肥猪在15d平均日增重较对照组提高0.118kg，料肉比降低0.212(P<0.05)；30天平均日增重较对照组提高0.012kg，料肉比降低0.08试验组的育肥猪在60天平均日增重较对照组提高0.026kg，料肉比降低0.331(P<0.05)；试验组的育肥猪在
90天平均日增重较对照组提高0.024kg，料肉比降低0.107(P<0.05)。结果表明，在育肥猪日粮中添加复合菌有提高育肥猪日增重，降低料肉比的作用，一定程度上减少了饲料的添加。
90天平均日增重较对照组提高0.024kg，料肉比降低0.107(P<0.05)。结果表明，在育肥猪日粮中添加复合菌有提高育肥猪日增重，降低料肉比的作用，一定程度上减少了饲料的添加。
[0052] 表2添加复合菌对育肥猪生产性能的影响
[0053]
[0054]
[0055] 注：同行数据后所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
[0056] 2.2胃肠道结构及绒毛变化
[0057] 如图1所示，添加复合菌组的猪胃壁纵肌层和横肌层较厚；胃绒毛、结肠绒毛和盲肠绒毛较完整和长。而对照组的胃壁纵肌层和横肌层较薄，绒毛较短。其中结肠的绒毛明显比添加复合菌的短。
[0058] 2.3胃和结肠的微生组成结构
[0059] 试验结束时，各采集18只育肥猪的胃液和结肠的粘液进行16S rRNA 基因测序。结果：试验组的育肥猪的胃粘液属水平的乳酸菌丰度(平均 67.81％)比试验组高(13.54％)(P<0.05)，胃粘液属水平的艰难梭菌属(4.51％) 比对照低(5.55％)，差异显著(P<0.05)。结肠粘液属水平的乳酸菌丰度(平均6.51％)比试验组高(3.17％)，差异显著(P<0.05)，结肠粘液属水平艰难梭菌属(2.32％)比对照低(3.73％)，差异显著(P<0.05)。结果表明，在育肥猪日粮中添加复合菌有促进乳酸菌属丰度，降低艰难梭菌属丰度的作用。
[0060] 3讨论
[0061] 3.1饲喂复合微生物菌对育肥猪生产性能的影响
[0062] 育肥猪生产性能的改善，主要体现在日增重增加、耗料增重比的下降等多个方面。本实施例结果表明，饲用复合微生物菌明显增加日增重，降低耗料增重比。此外，从15d开始，一直持续到90d，育肥猪的日增重明显增加，耗料增重比也明显降低。本发明采用的复合菌剂包括了6大类菌，充分考虑到育肥猪胃肠道的不同位置和不同菌群分布。尽管之前很多的研究报道，都证实微生物菌的添加功效，但极少考虑不同位置的胃肠道菌群差异，因此很多研究结果与实际应用存在一定差异。而本实施例充分考虑胃肠道不同位置菌群分布不同，通过复合菌添加，让不同的菌定植于不同位置，从而保证了外来菌群能够有效影响内在菌群平衡。从结果看，添加复合菌剂的效果确实持续存在。
[0063] 3.2饲喂复合微生物菌对胃肠道绒毛结构影响
[0064] 胃肠道绒毛结构影响营养物质的消化吸收，添加微生态制剂是否能改善生产性能，首要考察其对胃肠道绒毛结构生长是否有促进作用。本实施例比较分析添加复合菌剂组胃、结肠和盲肠的肠道形态及绒毛的长短。结果发现，添加复合菌组结肠和盲肠的绒毛比对照组长。此外，本实施例也发现，饲喂复合微生物菌的育肥猪的胃壁肌层较厚，绒毛长度比对照组长。从胃动力学上可知，胃壁肌层厚度越厚，越有利于饲料在胃里的初级消化。而胃的绒毛长度可延长营养物质在胃壁的滞留时间，同时也延长微生物在胃壁的作用时间，进一步促进了营养物质在胃里的消化吸收，从而对生产性能进行改善。
[0065] 3.3饲喂复合微生物菌对育肥猪肠道微生物的影响
[0066] 育肥猪肠道微生物是宿主营养物质消化和吸收的关键，对宿主免疫及疾病等起着重要的调控作用。同时肠道微生物菌群结构又受到宿主胃肠道内环境以及日粮、品种、外界环境等的影响。本实施例中添加的复合微生物菌剂，明显增加胃和结肠的乳酸菌属的丰度。胃里的乳酸菌不仅可促进乳糖、蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收，产生B族维生素等大量有益物质；同时还可增加肠道有益菌群，改善胃肠道功能，恢复肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，维护宿主健康；还可抑制腐败菌的繁殖，消解腐败菌产生的毒素，清除肠道垃圾等。因此，胃、结肠的乳酸菌属的丰度增加起到了改善育肥猪生产性能的作用。
[0067] 此外，本实施例也证实，添加复合益生菌可减少艰难梭菌为主的有害梭菌的增殖。有害梭菌的减少可促进菌群平衡，维护肠道结构功能，提高营养物质的消化吸收，从而改善生产性能。
[0068] 4结论
[0069] 本发明的复合菌剂可增加育肥猪胃、结肠和盲肠的度，增加胃和结肠的乳酸菌属的丰度，同时减少以艰难梭菌为主的有害梭菌的增殖，维护肠道结构功能，保证菌群平衡，促进生产性能提升，可作为饲料添加剂在生产中应用。
[0070] 虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
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