一种戊糖片球菌Z-1、戊糖片球菌细菌素Z-1及戊糖片球菌细
菌素Z-1的生产方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及一种戊糖片球菌Z-1、戊糖片球菌细菌素Z-1及戊糖片球菌细菌素Z-1的生 产方法,属于食品
微生物领域。
背景技术
[0002] 乳酸菌作为世界公认的食品级微生物，其在食品工业中已得到广泛应用。乳酸菌细菌素 是乳酸菌生长代谢产生有抑菌活性的蛋白或多肽类物质。乳酸菌细菌素具有抑菌谱广、在人 体内无残留、能作为天然
防腐剂等优点而倍受国内外研究者的广泛关注。其中乳酸链球菌素 (Nisin)已广泛应用于食品工业中，但随着研究的深入，发现Nisin存在抑菌能
力不稳定、 抑菌谱窄、抑菌时效短等诸多不足，限制了其在食品防腐领域的应用，寻找应用范围广的新 型生物防腐剂已经成为食品防腐领域的研究热点之一。
[0003] 金华火腿是我国典型的传统
发酵肉制品，研究报道不同地区的金华火腿中微生物菌群均 具有较高的丰富度和多样性，蕴含丰富的发酵微生物，其中优势菌属包括葡萄球菌属 (Staphylococcus)、普氏菌属(Prevotella)和丙酸菌属(Propionibacterium)等，目前， 从金华火腿中筛选产细菌素乳酸菌的研究未见报道。
[0004] 为了获得高纯度的细菌素，首先需要将细菌素从无细胞发酵液中提取出来，细菌素的提 取方法有很多，根据细菌素自身的特性，提取的方法主要有超声破壁法、酸沉淀法、等电点 沉淀法、
微波法等。目前，常用的细菌素提取方法主要有
硫酸铵盐析法、
有机溶剂萃取法和 菌体
吸附法。溶剂萃取法和盐析沉淀法易造成
有机溶剂或重金属残留，且易降低细菌素活性、 且不利于后期的分离纯化。
[0005] 其次，需要将杂蛋白去除，由于乳酸菌代谢产生的抑菌物质比较复杂，甚至还包含很多 的未知成分，且不同乳酸菌代谢的抑菌物质不同，所使用的纯化方法也不尽相同。但所有细 菌素分离纯化的方法都是基于细菌素的自身性质，如带电性、分子量等。目前细菌素纯化的 方法多采用凝胶过滤色谱、离子交换层析、反相高效液相色谱等技术相结合进一步纯化，去 除其中大量杂质，从而提高细菌素样品的纯度。
[0006] 虽然国内外对不同来源的乳酸菌产细菌素研究较多，但在食品工业中实际应用较少，究 其原因是其中一些细菌素抑菌谱窄、抑菌效果不稳定。因此，充分利用我国金华火腿中的微 生物资源，筛选出新型产细菌素的乳酸菌，分离纯化出抑菌范围广、抑菌效果稳定的新型乳 酸菌细菌素，具有十分广阔的前景和价值。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于为了克服以上
现有技术的不足，目的之一提供一株具有广谱抑菌活性 的戊糖片球菌；目的之二在于提供该菌株所产细菌素的制备方法。
[0008] 本发明是由以下技术手段实现的：一种戊糖片球菌Z-1，其特征在于，一株戊糖片球菌 Z-1(Pediococcus pentosaceus)的保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2019年5月16日；保 藏编号为17820。
[0009] 一种戊糖片球菌细菌素Z-1，其特征在于，将戊糖片球菌Z-1发酵，得到细菌素，采用pH 吸附法对细菌素进行粗提，通过
纤维素DEAE-52离子交换层析柱和葡聚糖G-50分子筛对细菌 素进行分离纯化得到戊糖片球菌细菌素Z-1，经MALDI-TOF-MS分析确定戊糖片球菌细菌素的 分子量为8227.35Da。
[0010] 所述戊糖片球菌细菌素Z-1同时抑制
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
[0011] 所述戊糖片球菌细菌素Z-1抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的任一种或多种；
[0012] 其中，革兰氏阳性菌包括
植物乳杆菌、
清酒乳杆菌、弯曲乳杆菌、肠膜明串珠菌、腐生 葡萄球菌、乳酸乳球菌、单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌；
[0013] 革兰氏阴性菌包括鼠伤寒沙
门氏菌、波茨坦沙门氏菌、大肠杆菌。
[0014] 所述戊糖片球菌细菌素Z-1具有SEQ ID NO.1所示的
氨基酸序列。
[0015] 一种戊糖片球菌细菌素Z-1的生产方法，其特征在于，包括下列步骤：
[0016] (1)将保藏号为17820的戊糖片球菌Z-1(Pediococcus pentosaceus)以1％(v/v)的接种 量接种到无菌MRS液体培养基中，30℃恒温培养18-24h，然后在4℃条件下8000×g离心30min， 取其上清液用无菌0.22μm滤
膜过滤，得到无细胞发酵上清液；
[0017] (2)无细胞发酵上清液在70℃条件下
水浴30min，凉至室温，调至pH值6.0，磁力搅 拌使细菌素吸附于细胞表面，然后在4℃条件下8000×g离心30min，收集菌
体细胞，用50mM
磷酸钠缓冲液洗涤2次去除杂质，然后重新悬浮于100mM NaCl溶液中，调pH＝2.0，磁力搅 拌
解吸附，离心取上清，0.22μm滤膜过滤，取滤液进行
透析，经透析冻干之后得到细菌素粗 提物；
[0018] (3)细菌素粗提物按设定比例溶于缓冲液种，经过DEAE-52
纤维素柱洗脱和葡聚糖G-50 层析柱之后，得到成分均一、稳定的戊糖片球菌细菌素Z-1。
[0019] 步骤(3)中，所述的DEAE-52纤维素柱的径高比为1:15；
[0020] 所述的DEAE-52纤维素柱中细菌素的上样量为柱体积的5％，上样流速为1mL/min；
[0021] 所述的DEAE-52纤维素柱所用的体积分数为0-0.6M，
氯化钠水溶液的用量为柱体积的28 倍，流速为1mL/min。
[0022] 步骤(3)中，所述的葡聚糖G-50层析柱的径高比为1:23；
[0023] 所述的葡聚糖G-50层析柱的上样量为柱体积的5％；
[0024] 所述的葡聚糖G-50层析柱平衡和洗脱的流速均为1mL/min，收集方式为每3min收集一管， 在OD254 nm处测量吸光值。
[0025] 本发明的有益效果：
[0026] 本发明首次提供了一种产新型乳酸菌细菌素的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)Z-1 菌株。戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)Z-1分离自浙江金华传统火腿，是中国著名的传 统干腌肉制品，具有悠久的食用历史，因此戊糖片球菌发酵所产的细菌素应用到食品工业安 全系数高。
[0027] 戊糖片球菌所产细菌素对多种革兰氏阳性细菌、阴性菌均具有很高的抑菌活性，具有广 谱抑菌活性，可用于制备抗菌或/和防腐产品，延长食品的保质期。同时戊糖片球菌 (Pediococcus pentosaceus)Z-1所产的细菌素，性质比较稳定，在pH 2-10的范围内，110℃ 以下均有较好的抑菌作用；此外，这个细菌素可以被所测试的所有蛋白酶，包括胃蛋白酶、 蛋白酶K、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等快速
水解而完全失去活性，因此该细菌素产品随食品摄 入人体后，不会在体内残留产生不利影响而导致人体的抗药性增强，有利于其在食品工业的 应用。
[0028] 本发明先采用菌体吸附法对细菌素进行粗提，采用DEAE-52离子柱和葡聚糖凝胶G-50分离 纯化细菌素，其对细菌素得纯度可以达到96％以上，且细菌素的纯化率可达到50％以上。具 有简便、快速、成本低等的优点。
[0029] 本发明采用的戊糖片球菌是被公认为GRPS，已经在食品工业中得到了广泛的应用，而戊 糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)Z-1所产的细菌素属于天然抗菌肽，具有较高的安全性， 可作为食品防腐剂和
抗菌剂而应用于食品和医药领域，具有良好的应用前景。
[0030] 综上，本发明公开了一种戊糖片球菌Z-1、戊糖片球菌细菌素Z-1及戊糖片球菌细菌素 Z-1的生产方法。戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)Z-1的菌种保藏编号为(CGMCC NO.17820)，该菌株从浙江金华传统火腿中分离得到，其能够在MRS培养基里发酵产生一种 新型的细菌素，新型细菌素通过两步纯化方式最后经鉴定得到。本发明提供的细菌素可抑制 食品中其他常见的革兰氏阳性细菌、阴性菌，同时对热及pH稳定，可以被蛋白酶降解，因 此安全性较高，不会在人体内残留，可作为食品防腐剂和抗菌剂而应用于食品和医药领域。 整个工艺过程操作方便，能耗低，具有良好的应用前景。
附图说明
[0031] 图1是细菌素样品图。
[0032] 图2是DEAE-52分离纯化细菌素图。
[0033] 图3是DEAE-52分离纯化各成分抑菌活性图。
[0034] 图4是葡聚糖G-50分离纯化细菌素图。
[0035] 图5是葡聚糖G-50分离纯化各成分抑菌活性图。
[0036] 图6是戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)Z-1所产的细菌素MALDI-TOF-MS图。
[0037] 图7是戊糖片球菌素Z-1的酸
碱稳定性图。
[0038] 图8是戊糖片球菌素Z-1的
热稳定性图。
具体实施方式
[0039] 下面结合附图和具体
实施例对本发明做进一步解释：
[0040] 实施例1：
[0041] 产细菌素乳酸菌的筛选和鉴定；
[0042] 1.乳酸菌的分离纯化；在无菌操作的环境下，用经过高温灭菌的
镊子和
剪刀从传统自然 发酵火腿上三签点取样(大小：1cm×1cm×1cm)，剪碎后备用。采用无菌生理盐水适当稀释 样品，选取不同稀释度分别涂布MRS平板上，在
培养箱中37℃培养48h。再挑取符合要求 的单菌落进一步划线分离纯化，纯菌进行革兰氏
染色，进行
接触酶和
葡萄糖产气试验，筛选 的乳酸菌用无菌MRS液体培养基加20％甘油(W/V)-80℃保存。
[0043] 2.指示菌浓度的确定；
[0044] 将活化好的指示菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种于液体LB培养基中，30℃恒温培 养12h。将培养完成的菌悬液作为原液进行梯度稀释，取100μL稀释液涂布于PCA计数平板上， 利用稀释平板法计数。同时进行抑菌实验。根据抑菌圈直径、边缘整齐程度和清晰度，确定 指示菌的最佳浓度。
[0045] 3.具有抑菌效果的乳酸菌的初筛；
[0046] 将2次活化后的乳酸菌以1％(v/v)的接种量接种到无菌MRS液体培养基中，30℃恒温 培养18-24h，4℃，8000×g离心30min，取其上清液用无菌0.22μm滤膜过滤，得到无细胞 发酵上清液，利用双层琼脂平板法和
浊度法检测其抑菌活性。选取有抑菌效果的菌株进行复 筛。
[0047] 4.具有抑菌效果的乳酸菌的复筛；
[0049] 以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，乳酸乳球菌为阳性对照，pH＝6.0的乙酸和乳酸 为阴性对照。用0.1M和2M的无菌NaOH调发酵上清液pH＝6.0排除乙酸和乳酸的抑菌影响， 经过0.22μm滤膜过滤排除残留菌体细胞，得到无细胞上清液，用双层琼脂平板法做抑菌实验， 游标卡尺十字交叉法测量抑菌圈直径。
[0051] 过氧化氢抑菌浓度的确定：将2mL过氧化氢放入8mL无菌水试管中，进行梯度稀释， 使最终体积比浓度分别为2×10-1、2×10-2、2×10-3、2×10-4、2×10-5、2×10-6v/v，分别取100μL 做
牛津杯抑菌实验，确定本研究过氧化氢应采用的最佳抑菌浓度。
[0052] (3)酶解排除过氧化氢；
[0053] 将过氧化氢酶溶解于50mM的
磷酸盐缓冲中，加入无细胞发酵上清液最终浓度为5 mg/mL，37℃水浴反应2h后进行抑菌试验，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌；乳酸 乳球菌为阳性对照，以未经过氧化氢酶作用的发酵上清液和过氧化氢酶液为阴性对照，做抑 菌实验。
[0054] (4)抑菌物质的蛋白酶检测；
[0055] 将排除过氧化氢以后仍有抑菌效果的菌株作为继续试验的对象。分别用胰蛋白酶、木瓜 蛋白酶和蛋白酶K对排除有机酸和过氧化氢之后的菌株发酵上清液进行酶解实验。取发酵液 分别加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K，最终浓度为1mg/mL，且37℃水浴加热2h， 用牛津杯双层平板法法检测抑菌活性。
[0056] 表1产细菌素乳酸菌初筛结果
[0057]
[0058] 表2有机酸排除pH确定试验
[0059]
[0060] 表3有机酸排除试验结果
[0061]
[0062]
[0063] 表4不同浓度过氧化氢的抑菌效果
[0064]
[0065] 表5排除过氧化氢试验结果
[0066]
[0067] 表6蛋白酶检测试验结果
[0068]
[0069] 5.产细菌素乳酸菌的鉴定
[0070] 生理生化鉴定：根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》对筛 选出来的菌株进行革兰氏染色及生理生化特征鉴定。
[0071] 表7L5菌株的糖发酵鉴定结果
[0072]
[0073]
[0074] 6.菌株16S rDNA鉴定；
[0075] 对L5菌株应用16S rDNA进行测序鉴定，得到约1200bp的PCR扩增产物，条带明亮且单一， PCR产物送至上海生工
生物工程技术服务有限公司进行测序。将所测得的基因序列结果在 NCBI
网站中应用BLAST
软件在基因库中进行同源性搜索，目的菌株与戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus M58834.1的相似度最高为98％，其结果与生理生化鉴定一致，确认目的菌株为戊 糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，将其命名为戊糖片球菌Z-1(Pediococcus pentosaceus Z-1)。
[0076] 实施例2
[0077] 新型乳酸菌细菌素的鉴定；
[0078] 1.乳酸菌细菌素的提取：将活化后的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)Z-1以1％的接 种量将目的菌株
种子液接种于MRS液体培养基中，30℃培养20h。发酵液70℃水浴30min，凉 至室温，调至pH值6.0，磁力搅拌使细菌素吸附于细胞表面，4℃，8000×g，离心30min，收 集菌体细胞，用50mM磷酸钠缓冲液洗涤2次去除杂质，然后重新悬浮于100mM NaCl溶液中， 调pH＝2.0，磁力搅拌解吸附，离心取上清，0.22μm滤膜过滤，取滤液进行透析，冻干；即得 细菌素粗提物。
[0079] 2.乳酸菌细菌素的分离纯化：称取100mg冻干浓缩后的细菌素粗提物溶于50mLPBS缓冲 液中，过0.22μm膜并超声脱气，添加的样品体积约为柱体积的5％(5mL)。采用阶段洗脱的 方法，将恒流
泵的一端插入洗脱液体积要更换添加NaCl的磷酸盐缓冲液中，NaCl的添加量分 别为0.2、0.4、0.6M，收集流出液，每5min收集一管，洗脱速度为1mL/min，每管收集5min， 在245nm下检测蛋白吸收峰；在透析袋中装入20-30mL离子交换后收集的含蛋白的氯化钠溶 液，放入盛有蒸馏水的烧杯中，并用磁力搅拌器不断搅拌，
加速透析过程。透析48h，每6h 换一次水。透析后的样品进行冻干处理并根据牛津杯法测抑菌活性；收集经过DEAE-
52离子交 换层析分离出的抑菌活性组分，经透析除盐，
冷冻干燥之后，称取150mg溶于磷酸盐中，进 行Sephadex G-50凝胶色谱进行进一步分离。所用缓冲液为磷酸盐缓冲液，平衡和洗脱的流速 均为1mL/min，收集方式为每3min收集一管，在OD254 nm处测量吸光值，经透析除盐、冻干 后检测活性峰。经鉴定后，纯度为96.62％。
[0080] 3.乳酸菌细菌素的鉴定；
[0081] 将经过Tricine-SDS-PAGE
电泳纯化后的蛋白采用5800超高分辨飞行时间质谱仪进行 MALDI-TOF-MS分析(扫描范围1-500KDa)。离子源为基质辅助激光解吸电离(MALDI)， 离子加速
电压设为20KV，正离子线性高分子模式。测定其分子量为8227.35Da的小肽类物 质，其氨基酸序列为 MAITLKTELLDQKMTEVFDCSNDQTPLRDAMCNHVMDDNGHDTMKTIAEAKKWENMNDAE。
[0082] 实施例3
[0083] 新型乳酸菌细菌素的抗菌活性；
[0084] 1.戊糖片球菌素Z-1的酸碱稳定性。
[0085] 将纯化后得到的细菌素纯品与Nisin分别溶于PBS中形成蛋白溶液，最终蛋白浓度均为 0.9mg/mL。取0.5mL分装于离心管中，将其pH分别调节为2、3、4、5、6、7、8、9、10， 37℃水浴加热30min后，将pH调回中性。处理完毕后，以金黄色葡萄球菌为指示菌，取100 μL做抑菌圈实验，检测片球菌素Z-1和Nisin抑菌活性，用游标卡尺十字交叉法测量抑菌圈 直径。
[0086] 2.戊糖片球菌素Z-1的热稳定性
[0087] 将纯化后得到的细菌素纯品与Nisin分别溶于PBS中形成蛋白溶液，最终蛋白浓度均为 0.9mg/mL。取0.5mL分装于离心管中，将离心管按标记分别于
温度为50℃、60℃、70℃、 80℃、90℃、100℃、110℃(高压)的条件下处理30min。处理完毕后，置于室温备用。以 20℃为空白对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌，利用双层琼脂平板法检测戊糖片球菌素Z-1 和Nisin抑菌活性。
[0088] 3.戊糖片球菌素Z-1的酶敏感性试验
[0089] 分别将蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶等酶溶于缓冲液中，最终浓度为1mg/mL，并用 2M HCl和NaOH调至各个酶的最适反应pH值，如：胰蛋白酶(pH 7.6)、胃蛋白酶(pH 2.0)、 木瓜蛋白酶(pH 5.6)、脂肪酶酶(pH 5.6)和蛋白酶K(pH 8.7)等，以未加蛋白酶处理的 样品为对照，37℃水浴2h后，将pH调回中性，最终浓度为1mg/mL金黄色葡萄球菌为指 示菌，检测其抑菌活性。
[0090] 表8戊糖片球菌素Z-1的酶敏感性
[0091]
[0092]
[0093] 4.戊糖片球菌素Z-1的抑菌谱
[0094] 将纯化得到的细菌素分别选用表9所述的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌为指示菌株，测 定其抑菌活性。结果表明，戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)Z-1所产的细菌素对革兰 氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较好的抑菌效果。
[0095] 表9戊糖片球菌素Z-1的抑菌谱
[0096]
[0097] SEQ ID NO.1
[0098] MAITLKTELLDQKMTEVFDCSNDQTPLRDAMCNHVMDDNGHDTMKTIAEAKKWENMNDAE
[0099] 尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下， 可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于
权利要求的范 围，其包括所述每个因素的等同替换。
