技术领域
[0001] 本
发明属于污染物检测领域，具体涉及一种有机磷检测的方法及其设备。
背景技术
[0002] 我国土地资源丰富，是一个农业生产大国。随着当代经济不断发展，科技不断地进步，为了减轻农民在劳作上的人
力，
农药的使用越来越普遍。其中，有机磷农药(Organophosphorus Pesticides，简称OPs)由于具有较高的有效性和持久性，是应用最广泛的农药品种之一。但是，由于农药的过量使用，未被有效利用的OPs大量残留在农产品、
土壤及
水体中，造成严重的环境污染问题。同时，OPs作为一种神经毒素，能够抑制中枢神经系统中乙酰胆
碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)的活性，阻碍乙酰胆碱(Acetylcholine，简称ACh)的催化
水解途径，造成乙酰胆碱的含量不断积累，进而阻断神经递质传递，进而对人体产生极大的危害。因此，除了防止农药的滥用而外，建立有效的OPs残留的检测方法对保护环境和维护人体健康都具有重大意义。
[0003] 在
现有技术中，OPs残留检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法、气色谱/质谱联用技术和酶联免疫法等。现代的仪器分析方法检测OPs，虽然具有较高的灵敏度和准确性，但存在样品预富集及预处理过程繁琐、分析时间长、成本高、仪器昂贵复杂等缺点，不能满足快速分析等要求。酶联免疫法检测虽然迅速高效，但检测成本高，不能对批量产品实时实地检测。亟需开发一种灵敏度高、检测迅速、特异性强、对样品无需特殊前处理的OPs检测方法，以满足对OPs残留检测的需求。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种有机磷检测的方法，本法利用有机磷农药的靶点分子乙酰胆碱酯酶制备酶
传感器，可实现对有机磷农药残留进行快速检测，该检测方法具有灵敏度高和特异性强等优点。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：
[0006] 一种有机磷检测的方法，包括以下步骤：
[0007] 步骤(1)包括待测组装液的配制：使用待测样品处理乙酰胆碱酯酶溶液，然后加入乙酰硫代胆碱溶液，经酶促反应后获得待测组装液；
[0008] 步骤(2)制备表面
覆盖有纳米金颗粒的纳米金
电极；
[0009] 步骤(3)包括待测组装电极的制备：使用待测组装液处理纳米金电极，使纳米金颗粒
吸附硫代胆碱，获得待测组装电极；
[0010] 步骤(4)包括电化学响应
信号的检测：使用循环
伏安法或者差分脉冲伏安法检测待测组装电极的电化学响应信号，并且使用含有
铁氰根离子的溶液作为浸泡待测组装电极的检测底液。
[0011] 采用上述技术方案，技术原理如下：
[0012] 硫代乙酰胆碱能够在乙酰胆碱酯酶存在的条件下水解产生硫代胆碱。在有机磷农药(或有机磷)存在的条件下，有机磷农药能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性，从而阻止硫代胆碱的产生。纳米金电极置于标准组装液或待测组装液中一段时间，使水解产生的硫代胆碱通过Au-S键，组装在纳米金电极表面。没有有机磷农药时，电极表面能够组装大量的硫代胆碱，存在有机磷农药时，硫代胆碱的组装量随着有机磷农药浓度的增加而下降。将组装了硫代胆碱的电极(标准组装电极或待测组装电极)置于含有较低离子强度的铁氰根离子溶液中进行电化学测定，此时硫代胆碱上的阳离子能够通过静电吸引而使铁氰根离子靠近电极表面，并使电极表面的电位梯度保持不变，从而在低离子浓度下产生较大的
电流值。因此，在电极表面组装的硫代胆碱的量越多，所测得的电化学信号越大。在检测有机磷农药时，有机磷农药的浓度越大，组装在电极表面的硫代胆碱的量越少，所测得的电化学信号越小，由此构建了一个信号减小型的电化学传感系统用于有机磷的检测。
[0013] 先使用使有机磷农药和乙酰胆碱酯酶充分作用，乙酰胆碱酯酶活性受到抑制(抑制程度与有机磷农药得浓度相关)，然后使乙酰胆碱酯酶与氯化乙酰硫代胆碱充分反映，生成硫代胆碱(硫代胆碱的生成量与乙酰胆碱酯酶活性程度相关)。再将生成的硫代胆碱组装到纳米金电极上，形成待测组装电极，通过检测待测组装电极上的电化学响应信号的变化，来获知待测样品中的有机磷的浓度信息，实现对有机磷的快速检测。
[0014] 有益效果：
[0015] (1)本检测方法结合了酶抑制法和
生物传感器法，将OPs检测的关键酶AChE和电化学检测方法结合，实现了对OPs的检测。
发明人发现并巧妙地利用了硫代胆碱与铁氰根离子的静电吸引作用，成功构建了一种简单高效、灵敏便捷、经济实惠的酶抑制电化学生物传感设备和检测方法，实现了对OPs类农药的高灵敏的测定。
[0016] (2)该方法具有线性范围好、
检测限低、准确度高和特异性好等优点。电化学传感技术以其相对简单的检测程序和方便的实验条件，为OPs类农药的残留量的检测提供了一种新的方法，在农副产品的现场检测中具有潜在应用前景。使用本法检测的甲基对硫磷(一种OPs)浓度范围为0.1μg/L-100μg/L，在此范围内，电化学响应信号OPs浓度的对数值呈线性关系，并且本法的检测限为0.046μg/L。由此可见，本检测方法和相应的设备具有线性范围广和检测限低的特点，可用于多种场景的现场检测。
[0017] (3)使用本法进行OPs的检测，不用对样品进行特殊前处理，无需特殊设备，样品制作方法简单。
[0018] (4)本检测方法的对有机磷类农药有较强的特异性和选择性，经实验验证，不做任何前处理的情况下非有机磷物质对本检测方法产生的干扰较小。
[0019] (5)现有技术中，利用AChE对OPs进行检测，通常都是将AChE固定在检测电极上，但是AChE作为一种大分子
蛋白质，被固定在电极上之后，其蛋白质构象受到影响，进一步导致了其催化活性的改变和不稳定，造成了检测结果的不准确。本技术方案未将AChE固定在电极上，而是通过电极吸附其催化产物硫代胆碱，来实现检测。硫代胆碱为稳定的小分子物质，使得检测结果更为准确。
[0020] 进一步，步骤(1)还包括标准组装液系列的配制；所述标准组装液系列包括若干标准组装液，标准组装液的配置方法为：使用含有机磷农药的标准溶液处理乙酰胆碱酯酶溶液，再加入乙酰硫代胆碱溶液，经酶促反应后获得标准组装液；所述标准溶液中的有机磷农药的浓度为已知，标准溶液的数量为若干，且有机磷农药在若干标准溶液中的浓度相异；
[0021] 步骤(3)还包括标准组装电极的制备：使用标准组装液处理纳米金电极，一个纳米金电极对应一份标准组装液，使纳米金颗粒吸附硫代胆碱，获得若干标准组装电极；
[0022] 步骤(4)还包括有机磷农药浓度的获取：使用
循环伏安法或者差分脉冲伏安法分别检测若干标准组装电极的电化学响应信号，并且使用含有铁氰根离子的溶液作为浸泡标准组装电极的检测底液；建立电化学响应信号和标准溶液中有机磷农药浓度的标准曲线；根据待测组装电极的电化学响应信号和标准曲线，获取待测样品溶液中有机磷农药的浓度。
[0023] 采用上述技术方案，利用标准组装液系列中OPs浓度的差异，找到OPs浓度和电化学信号之间的关系，绘制和建立反应电化学响应信号和标准溶液中有机磷农药浓度之间关系的标准曲线，通过标准曲线可以获知待测样品中的OPs的具体浓度数值，实现定量检测。
[0024] 进一步，在步骤(3)中，在35～40℃条件下，使用标准组装液或待测组装液处理纳米金电极的时长大于或等于30min。
[0025] 采用上述技术方案，采用上述组装时间和
温度，纳米金颗粒可以和硫代胆碱能够自发形成Au-S共价键，确保硫代胆碱分子能够充分组装到电极表面。时间过短，硫代胆碱的吸附不充分。
[0026] 进一步，在步骤(4)中，所述检测底液中的铁氰根离子由铁氰化
钾提供，且检测底液中还含有
氯化钾。
[0027] 采用上述技术方案，铁氰化钾为常用铁氰盐。
[0028] 进一步，在检测底液中，铁氰化钾的浓度为0.5mmol/L，氯化钾的浓度为1mmol/L。
[0029] 采用上述技术方案，上述浓度的氯化钾可以保证在对硫代胆碱修饰的电极进行电化学测定时，能够使硫代胆碱修饰前后的响应信号对比更加明显；上述浓度的铁氰化钾可以提供足够量的铁氰根离子以供硫代胆碱结合。
[0030] 进一步，在步骤(1)中，乙酰硫代胆碱溶液为氯化乙酰硫代胆碱溶液、碘化乙酰硫代胆碱溶液和溴化乙酰硫代胆碱溶液中的一种。
[0031] 采用上述技术方案，氯化乙酰硫代胆碱、碘化乙酰硫代胆碱和溴化乙酰硫代胆碱均为常规的乙酰硫代胆碱，易于获取且物化性质清楚。
[0032] 进一步，在步骤(4)中，使用循环伏安法时，扫描电位为-0.1～0.5V，电位扫描速度为50mV/s；使用差分脉冲伏安法时，扫描电位为-0.2～0.5V，脉冲周期为0.2s，脉冲振幅为0.025V，脉冲宽度为0.05s。
[0033] 采用上述技术方案，可获得待测组装电极或标准组装电极的电化学响应信号，电化学响应信号强度适中，有利于对OPs的准确检测。
[0034] 进一步，在步骤(2)中，纳米金电极的制备方法为：在粒径为0.05μm和0.3μm三
氧化二
铝抛光粉的辅助下，将玻
碳电极于抛光绒布上打磨，然后用超纯水清洗玻碳电极；将打磨并清洗后的玻碳电极进入到氯金
酸溶液中，使用恒电位法将氯金酸还原成纳米金颗粒，并使纳米金颗粒沉积在玻碳电极表面，获得纳米金电极。
[0035] 采用上述技术方案，可获得纳米金电极，制备方法简单，制备效率高。
[0036] 进一步，在步骤(1)中，标准组装液的配置方法为：在已知有机磷农药浓度的标准溶液中加入10μg/mL乙酰胆碱酯酶溶液，在37℃的条件下孵育至少30min，再加入10mmol/L氯化乙酰硫代胆碱溶液和pH值为8.4的
磷酸盐缓冲液，在37℃的条件下孵育至少20min后获得标准组装液；
[0037] 待测组装液的配置方法为：在待测样品中加入10μg/mL乙酰胆碱酯酶溶液，在37℃的条件下孵育30min，加10mmol/L入氯化乙酰硫代胆碱溶液和pH值为8.4的磷酸盐缓冲液，在37℃的条件下孵育20min后获得待测组装液。
[0038] 采用上述技术方案，第一次孵育过程，使有机磷农药和乙酰胆碱酯酶充分作用，第二次孵育过程，使乙酰胆碱酯酶与氯化乙酰硫代胆碱充分反映，生成硫代胆碱。
[0039] 进一步，一种有机磷检测的设备，包括电化学工作站，所述电化学工作站的
工作电极为表面沉积有纳米金颗粒层的玻碳电极，纳米金颗粒层外侧通过Au-S键组装有硫代胆碱。
[0040] 采用上述技术方案，在表面沉积有纳米金颗粒层的玻碳电极表面上通过Au-S键组装硫代胆碱，可通过电化学响应信号的强弱，实现对OPs的准确检测。
附图说明
[0041] 图1为
实施例1的不同OPs浓度所对应的DPV响应图。
[0042] 图2为实施例1的电化学响应值与OPs浓度关系之间的标准曲线。
[0043] 图3为对比例1的检测方法的选择性分析图。
[0044] 图4为实验例1的电极无目标物时组装前后对比图。
[0045] 图5为实验例1的电极有目标物时组装前后对比图。
[0046] 图6为实验例2的纳米金电极在不同离子浓度下的信号对比图。
[0047] 图7为实验例2的组装了硫代胆碱的纳米金电极在不同离子浓度下的信号对比图。
[0048] 图8为实验例3的纳米金电极在无OPs的组装液中，不同浸泡时间下的DPV响应图。
[0049] 图9为实验例3的不同组装时间和DPV响应信号之间的趋势图。
具体实施方式
[0050] 下面通过具体实施方式进一步详细说明：
[0051] 实施例1：
[0052] 1.电化学测定条件：
[0053] 整个实验过程均使用二次超纯水，用含有1mmol/L的KCl和0.5mmol/L K3[Fe(CN)6]的混合溶液作为检测底液；整个测定过程在传统的三电极体系构成的
电解池中进行，其中工作电极为玻碳电极(GCE，Φ＝3mm)或者是修饰过的玻碳电极(具体修饰方式见本实施例的后文)，
对电极为铂丝电极，
银氯化银电极(AgCl/Ag)为参比电极。用电化学工作站进行循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)的测定，具体参数为：CV的扫描电位为-0.1V～0.5V，电位扫描速度为50mV/s；DPV的扫描电位为-0.2V～0.5V，脉冲周期为0.2s，脉冲振幅为0.025V，脉冲宽度为0.05s。
[0054] 2.标准曲线的建立
[0055] 本步骤中所有溶液均用超纯水配制，具体如下：在1.5mL的离心管中加入25μL一系列不同浓度的OPs溶液(浓度序列为：0μg/L,0.1μg/L,0.3μg/L,0.6μg/L,1μg/L,3μg/L,6μg/L,10μg/mL,100μg/L，OPs具体使用的是甲基对硫磷标准品)，和25μL10μg/mL的AChE溶液，在37℃的条件下孵育30min(在本方案中，孵育30min以及30min以上均可保证OPs和AChE之间的反应充分)；然后再于离心管中加入50μL 10mmol/L的氯化乙酰硫代胆碱溶液和50μL PBS溶液(pH＝8.4)，在37℃的条件下孵育20min后备用(定义为标准组装液)(在本方案中，孵育
20min以及20min以上均可保证AChE充分催化氯化乙酰硫代胆碱生成硫代胆碱)。在本方案中，氯化乙酰硫代胆碱溶液可以用其他的乙酰硫代胆碱溶液代替，可以是碘化乙酰硫代胆碱溶液和溴化乙酰硫代胆碱溶液等。
[0056] 在0.3和0.05μm三氧化二铝(Al2O3)抛光粉的辅助下将玻碳电极于抛光绒布上打磨后，然后用超纯水将它清洗干净后，将电极浸入到10mL 1％的氯金酸(HAuCl4)溶液中在-0.2V电位下沉积30s，使玻碳电极表面沉积一层光亮、均匀的纳米金颗粒(AuNPs)，获得纳米金电极。
[0057] 将沉积金处理的玻碳电极(纳米金电极)浸没于标准组装液中，并在37℃条件下组装30min(37℃是最佳温度，在35～40℃的温度范围内，也可以保证顺利组装)，然后用超纯水清洗干净，并用
滤纸将多余的水擦拭干，获得标准组装电极。最后将组装后的电极置于5mL1mmol/L的KCl和0.5mmol/L的K3[Fe(CN)6]的溶液(检测底液)中进行CV或DPV测定，本实施例具体采用DPV测定。
[0058] 根据检测结果(图1，不同OPs浓度所对应的DPV响应图)，建立标准曲线(图2)，反应电化学响应信号和标准溶液中有机磷农药浓度之间的关系，经拟合，获得线性方程：I＝0.705lgc-2.95(r＝0.9912)，其中，c表示OPs的浓度(μg/L)，I表示检测到的电流值(μA)。由图1和2可知，在0.1μg/L-100μg/L浓度范围内，随着OPs浓度逐渐增高，还原峰电流的响应值逐渐降低。也就是说OPs浓度越高，OPs对AChE的活性抑制程度越强，电极上组装的硫代胆碱越少，使得电化学信号越小。电化学响应信号与OPs浓度的对数值呈线性关系，计算所得的检测限为0.046μg/L，由实验结果表明，测得的电化学信号跟目标物(OPs)的浓度成反比，由此可以说明该方法能够实现有机磷的高灵敏测定。
[0059] 实施例2
[0060] 本实施例使用实施例1建立的检测体系对样品进行检测。为了验证本方案在实际样品分析中的应用中的效力，本实施例使用白菜汁、苹果汁代替超纯水将甲基对硫磷配成不同浓度(0.1μg/L,1μg/L,10μg/L)的溶液，即待测样品是用白菜汁和苹果汁配制，而不是用超纯水，模拟了实际检测过程中OPs实际所处的液体环境。对上述6个样品进行了本方案的有机磷检测，并定量计算了OPs的检测浓度。检测过程为：使用待测样品溶液处理AChE溶液，然后再用处理后的AChE溶液与氯化乙酰硫代胆碱溶液反应，形成待测组装液。在1.5mL的离心管中加入25μL待测样品溶液和25μL 10μg/mL的AChE溶液，在37℃的条件下孵育30min(在本方案中，孵育30min以及30min以上均可保证OPs和AChE之间的反应充分)；然后再于离心管中加入50μL 10mmol/L的氯化乙酰硫代胆碱溶液和50μL PBS溶液(pH＝8.4)，在
37℃的条件下孵育20min后备用(定义为待测组装液)(在本方案中，孵育20min以及20min以上均可保证AChE充分催化氯化乙酰硫代胆碱生成硫代胆碱)。在本方案中，氯化乙酰硫代胆碱溶液可以用其他的乙酰硫代胆碱溶液代替，可以是碘化乙酰硫代胆碱溶液和溴化乙酰硫代胆碱溶液等。本实施例中纳米金电极的制备方法同实施例1，将沉积金处理的玻碳电极(纳米金电极)浸没于待测组装液中，并在37℃条件下组装30min(37℃是最佳温度，在35～
40℃的温度范围内，也可以保证顺利组装)，然后用超纯水清洗干净，并用滤纸将多余的水擦拭干，获得待测组装电极。最后将组装后的电极置于5mL 1mmol/L的KCl和0.5mmol/L的K3[Fe(CN)6]的溶液(检测底液)中进行CV或DPV测定，本实施例具体采用DPV测定，获得电流值(μA)数据，再根据实施例1中的线性方程计算待测样品溶液中OPs的浓度。本实施例中电化学测定条件同实施例1。
[0061] 结果如表1所示，这些实际样品(模拟)的检测结果的回收率在93.30％至107.0％之间，因此可以证明我们所构建的酶抑制电化学传感检测方法对检测农产品中的有机磷残留量具有较高的抗干扰能力和准确度。
[0062] 表1：样品中有机磷残留检测结果
[0063]
[0064] 对比例1：
[0065] 为了考察所构建的传感器对OPs的选择性，在相同的条件下(采用实施例1的标准曲线和样品检测方法)，分别用羟基苯
甲酸丙酯(PPB)、对苯二甲
酮(DBP)、阿特拉津(ATZ)、
抗坏血酸(AA)、内毒素(LPS)以及目标物OPs按照实验步骤进行干扰实验。如图3所示，所用的5种干扰物质的
电信号都较高，并且都与OPs空白组的电信号响应值较接近；而含有目标物甲基对硫磷(OPs＝1μg/L)的电信号较小，这说明了本实验方法对有机磷的检测具有特异性。图3中的字母标记分别表示：a为1μg/L OPs，b为50μg/L PPB，c为50μg/L DBP，d为50μg/L ATZ，e为50μg/L AA，f为50μg/L LPS，g为空白对照。本对比例的检测底液为1mmol/LKCl和0.5mmol/L K3[Fe(CN)6]的混合溶液。
[0066] 实验例1：检测方法的原理验证实验
[0067] 为了验证本发明的检测原理，沉积金后的电极(纳米金电极)按照实施例1(标准曲线的建立)装上硫代胆碱后(得组装电极)，将组装电极置于检测底液为1mmol/L KCl和0.5mmol/L K3[Fe(CN)6]的混合溶液中进行CV测定。图4中，曲线a为纳米金电极，曲线b为纳米金电极在无目标物(POs)的组装液中组装后电极(组装电极)，在检测底液中曲线b的电信号明显高于曲线a。没有OPs时，AChE催化氯化乙酰硫代胆碱水解，产生大量的硫代胆碱，通过Au-S键组装于电极表面，硫代胆碱可以促进的
电子传递，所以组装电极的电信号要高于纳米金电极。图5中，曲线a为沉积金处理电极(纳米金电极)，曲线b为加目标物OPs后的组装电极，在检测底液中曲线a与曲线b的电化学信号接近；这是由于OPs存在的条件下，OPs能够抑制AChE的活性，从而阻止硫代胆碱的产生。故电极表面上没有组装上硫代胆碱，其电化学信号值与纳米金电极的接近。综合图4和图5分析可知：没有目标物OPs的条件下，由于硫代胆碱能够促进电子传递，其组装电极电化学信号高于纳米金电极；有目标物OPs的条件下，组装电极电化学信号值与纳米金修饰的电极接近。由此可以证明OPs可以抑制AChE的活性，减少硫代胆碱的产生，从而减弱对电子传递的促进作用。
[0068] 实验例2：检测底液的离子浓度优化
[0069] 为了增加所构建传感器的性能，让组装硫代胆碱前后的信号对比更明显，对检测底液的离子浓度做了优化。如图6所示，随着检测底液中KCl浓度的下降，观察到AuNPs修饰的电极(纳米金电极)的氧化还原电流呈下降趋势，在检测底液KCl浓度为1mmol/L时，几乎没有观察到电流；但在图7可以观察到，在检测底液KCl浓度为1mmol/L时，组装了硫代胆碱后的电极的氧化还原电流明显高于AuNPs修饰电极(纳米金电极)的氧化还原电流值。而在检测底液KCl浓度为10mmol/L和100mmol/L的溶液中，电极组装前后的氧化还原电流响应值没有显著变化。实验结果说明，在检测底液KCl浓度为1mmol/L的条件下对硫代胆碱修饰的电极进行电化学测定，可以使硫代胆碱修饰前后的响应信号对比更加明显。因此在本发明中采用的最优检测底液为5mL 1mmol/L的KCl和0.5mmol/L K3[Fe(CN)6]的混合溶液。
[0070] 实验例3：硫代胆碱组装时间的优化
[0071] 纳米金颗粒和硫代胆碱能够自发形成Au-S共价键，由此可以将硫代胆碱组装到纳米金修饰的玻碳电极上。为了考察组装过程的最优条件，我们将经沉积金处理后的电极浸泡于无目标物(POs)的组装溶液中组装不同的时间，并在检测底液为5mL 1mmol/L的KCl和0.5mmol/L K3[Fe(CN)6]的混合溶液中进行DPV测定(如图8)；然后根据DPV的测定值作出硫代胆碱组装时间趋势图(如图9)。由图可知随着硫代胆碱组装时间的增加，电流响应值也在逐渐增大，最后在30min左右趋于平稳。因此，在本发明中我们采用硫代胆碱的组装时间为
30min，以确保硫代胆碱分子能够充分组装到电极表面。
[0072] 以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干
变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和
专利的实用性。本
申请要求的保护范围应当以其
权利要求的内容为准，
说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
